CN109705406A - 一种纳米甲壳素增强海藻酸钙水凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米甲壳素增强海藻酸钙水凝胶的制备方法。将纳米甲壳素与海藻酸钠溶液混合均匀，浸泡在CaCl2溶液中，得到网络结构均匀的水凝胶。作为海藻酸水凝胶的增强材料，可通过调控纳米甲壳素的含量来控制其孔径尺寸及力学强度。本发明提供的水凝胶具有良好的生物相容性、优异的力学性能，操作简单方便、成本低、安全毒性，适合大规模生产。在高端生物医用材料、组织器官修复替代材料等多领域具有广泛应用前景。

Description

一种纳米甲壳素增强海藻酸钙水凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种纳米甲壳素增强海藻酸钙水凝胶的制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术
据估算，全球超过2亿人患有骨质疏松、骨折、骨缺损等骨科症状。因此，借助支架或植入体引导骨组织再生是极具挑战性的医学难题。理想的生物支架应具备生物相容性和力学性能。单一组分材料很难满足所有要求，因此，多组分的复合凝胶成为骨组织再生领域的研究热点。
甲壳素，化学名称为β-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡聚糖，又名甲壳质或几丁质，是地球上存在量仅次于纤维素的多糖，广泛存在于虾蟹等甲壳动物及各类昆虫的表皮和乌贼贝类等软体动物的骨骼以及蘑菇和菌类的细胞壁中。甲壳素具有无毒抗菌性、良好的生物相容和生物降解性，被广泛用于多功能材料，特别是在生物医用材料，组织器官修复替代材料等领域展现出广阔的应用前景。甲壳素晶须或纳米纤维具有较高的长径比、比表面积大，模量高，同时保持了甲壳素生物活性。
海藻酸钠是一种天然高分子多糖，从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，储量丰富，有生物相容性好、可生物降解、无毒副作用，以及优异的吸湿性能、凝胶性能和生物活性，被广泛应用于生物医药、食品等领域。单纯的海藻酸钙凝胶强度不高，且较难与细胞相互作用。需要添加其它材料来增强其压缩强度，提高与细胞的粘附性。相比非生物相容的纳米粒子，甲壳素晶须或纳米纤维更适合作为生物材料的增强材料。同时，甲壳素晶须或纳米纤维的引入可促进成骨细胞在复合凝胶上的粘附和增殖。TEMPO氧化甲壳素后，甲壳素带负电，可以在水中与同样带负电的海藻酸钠共混，操作简单。因此，复合凝胶有望作为骨组织工程支架材料应用于组织工程领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米甲壳素增强海藻酸钙水凝胶的制备方法。制备过程简单，适合大规模生产。
本发明解决上述技术问题所采用的方案是：
一种纳米甲壳素增强海藻酸钙水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制质量分数为0.5-2wt％的纳米甲壳素水分散液；
(2)常温下，在步骤(1)所得分散液中加入海藻酸钠粉末搅拌溶解，使所得混合溶液中海藻酸钠的质量分数为1-3wt％；
(3)将步骤(2)所得混合溶液倒入模具中，在质量分数为0.5-3wt％的CaCl2溶液中浸泡固化；
(4)将步骤(3)所得水凝胶用蒸馏水浸泡洗净，即得纳米甲壳素/海藻酸钙复合水凝胶。
优选地，海藻酸钠与纳米甲壳素的质量比为1:2～6:1。
优选地，所得纳米甲壳素为由α-甲壳素或β-甲壳素采用TEMPO氧化法制备得到的甲壳素纳米晶须或甲壳素纳米纤维。
本发明还提供了一种纳米甲壳素/海藻酸钙复合水凝胶，采用上述的方法制备得到。
上述纳米甲壳素/海藻酸钙复合水凝胶应用于在骨组织工程支架材料领域时，所述海藻酸钠与纳米甲壳素的质量比为3:1～3:2。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1，本发明复合凝胶由天然多糖构筑，具有良好的生物相容性、降解性、无毒性，可潜在地应用骨组织工程支架。
2，本发明方法简单、反应温和、易操作、环境友好，适用于工业化生产。
3，本发明制备的水凝胶具有优异的力学性能，孔径均匀，预计该发明产品未来将在高端生物医用材料、骨组织工程支架材料等多领域得到广泛应用。
附图说明
图1为本发明实施例制得的纳米甲壳素/海藻酸钙复合水凝胶的实物图以及水凝胶的微观结构图，其中图a为实施例所得纳米甲壳素/海藻酸钙复合水凝胶的实物图，图b为对比例所得复合水凝胶实物的电镜图，图c为实例1实物的电镜图，图d为实例2实物的电镜图，图e为实例3实物的电镜图，图f为实例4实物的电镜图；
图2为本发明实施例制得的复合水凝胶的MTT细胞实验数据，选用MC3T3-E1细胞进行实验检测，空白control为PBS溶液；
图3为本发明实施例制得的复合水凝胶的细胞培养的共聚焦显微镜实验数据，选用MC3T3-E1细胞与材料进行培养，图中a、f、k分别为细胞在纯海藻酸钠水凝胶上培养24h、48h、72h的共聚焦显微镜图；b、g、i分别为细胞在实例1的水凝胶上培养24h、48h、72h的共聚焦显微镜图；c、h、m分别为细胞在实例2的水凝胶上培养24h、48h、72h的共聚焦显微镜图；d、i、n分别为细胞在实例3的水凝胶上培养24h、48h、72h的共聚焦显微镜图；e、j、o分别为细胞在在实例4的水凝胶上培养24h、48h、72h的共聚焦显微镜图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或者条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别声明，实施例中所用的技术手段为本领域人员所熟知的常规手段。
制备TEMPO氧化后的纳米甲壳素悬浮液
将1gα-甲壳素或β-甲壳素分散在100g蒸馏水中，依次加入0.016g 2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧化铝(TEMPO)和0.1g NaBr，搅拌溶解，滴加5mmol NaClO溶液，并用NaOH溶液维持反应体系的pH等于10，至不再消耗NaOH时用少量乙醇结束反应，用HCl溶液调节至中性，离心3次，收集沉淀，将沉淀分散在水中，超声即得α-甲壳素纳米晶须或β-甲壳素纳米纤维悬浮液，将所得的纳米甲壳素悬浮液浓缩成浓度为0.5～2wt％，4℃保存待用。
实施例1
取100g TEMPO氧化后的α-甲壳素纳米晶须悬浮液，浓度为1wt％，于室温下，加入3g海藻酸钠粉末，搅拌溶解。将混合液倒入模具，在3wt％CaCl2溶液中浸泡12h，使其充分凝胶化，再用蒸馏水多次浸泡洗净，得海藻酸钠与甲壳素纳米晶须质量比为3:1的复合水凝胶，记为SA/α-CN-1％，对所得复合水凝胶进行力学性能测试和微观结构表征，其压缩强度为2.09MPa，微观结构见图1c。
实施例2
取100g TEMPO氧化后的α-甲壳素纳米晶须悬浮液，浓度为2wt％，于室温下，加入3g海藻酸钠粉末，搅拌溶解。将混合液倒入模具，在3wt％CaCl2溶液中浸泡12h，使其充分凝胶，再用蒸馏水多次浸泡洗净，得海藻酸钠与甲壳素纳米晶须质量比为3:2的复合水凝胶，记为SA/α-CN-2％，对所得复合水凝胶进行力学性能测试和微观结构表征，其压缩强度为3.85MPa，微观结构见图1d。
实施例3
取100g TEMPO氧化后的β-甲壳素纳米纤维悬浮液，浓度为0.5wt％，于室温下，加入3g海藻酸钠粉末，搅拌溶解。将混合液倒入模具，在3wt％CaCl2溶液中浸泡12h，使其充分凝胶，再用蒸馏水多次浸泡洗净，得海藻酸钠与甲壳素纳米晶须质量比为6:1的复合水凝胶，记为SA/β-CN-0.5％，对所得复合水凝胶进行力学性能测试和微观结构表征，其压缩强度为1.83MPa，微观结构见图1e。
实施例4
取100g TEMPO氧化后的β-甲壳素纳米纤维悬浮液，浓度为1wt％，于室温下，加入3g海藻酸钠粉末，搅拌溶解。将混合液倒入模具，在3wt％CaCl2溶液中浸泡12h，使其充分凝胶，再用蒸馏水多次浸泡洗净，得海藻酸钠与甲壳素纳米晶须质量比为3:1的复合水凝胶，记为SA/β-CN-1％，对所得复合水凝胶进行力学性能测试和微观结构表征，其压缩强度为2.23MPa，微观结构见图1f。
对比例
3g海藻酸钠粉末加入到100g蒸馏水中，搅拌溶解。倒入模具，在3wt％CaCl2溶液中浸泡12h，使其充分凝胶，再用蒸馏水多次浸泡洗净，得纯海藻酸钙水凝胶，记为SA。
由力学性能测试结果及微观结构表征结果可以看出，对同一类型纳米甲壳素而言，随着其含量的增加，复合材料力学性能增加，孔径减小。但由于纳米甲壳素进一步浓缩后粘度很大，制备难度也随之提高，因此当采用α-甲壳素纳米晶须和β-甲壳素纳米纤维时，其加入量分别为2％和1％，能够获得较好的力学强度及较小的制备难度。
细胞毒性试验
将实施例1-4所得纳米甲壳素/海藻酸钙复合水凝胶及对比例所得纯海藻酸钙水凝胶放在装有MC3T3-E1细胞的PBS溶液中，室温下进行培养，并通过共聚焦显微镜观测细胞形貌。图2为水凝胶的MTT细胞毒性数据，通过数据可看出复合水凝胶的细胞数量都高于纯海藻酸钠水凝胶，表明甲壳素纳米纤维引入有效提高水凝胶的生物相容性。
图3为水凝胶的细胞形貌图。通过共聚焦显微镜数据可得出：随着细胞培养时间的增加，细胞在五种水凝胶上的数目都呈现增长趋势，表明材料的生物相容性较好；细胞培养48h和72h后复合凝胶上的细胞数目明显高于纯海藻酸钠水凝胶，且随着甲壳素纳米纤维量的提高，复合凝胶上的细胞数目也随之增加，表明甲壳素纳米纤维的加入有助于细胞在凝胶中的增殖、分化。其中，当β-甲壳素纳米纤维含量为1wt％时，72h后的细胞数目超过空白PBS溶液，增长最快。
以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种纳米甲壳素增强海藻酸钙水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制质量分数为0.5-2wt％的纳米甲壳素水分散液；
(2)常温下，在步骤(1)所得分散液中加入海藻酸钠粉末搅拌溶解，使所得混合溶液中海藻酸钠的质量分数为1-3wt％；
(3)将步骤(2)所得混合溶液倒入模具中，在质量分数为0.5-3wt％的CaCl2溶液中浸泡固化；
(4)将步骤(3)所得水凝胶用蒸馏水浸泡洗净，即得纳米甲壳素/海藻酸钙复合水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，海藻酸钠与纳米甲壳素的质量比为1:2～6:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所得纳米甲壳素为由α-甲壳素或β-甲壳素采用TEMPO氧化法制备得到的甲壳素纳米晶须或甲壳素纳米纤维。
4.一种纳米甲壳素/海藻酸钙复合水凝胶，其特征在于，采用权利要求1～3任一项所述的方法制备得到。
5.如权利要求4所述纳米甲壳素/海藻酸钙复合水凝胶在骨组织工程支架材料领域的应用，其特征在于，所述海藻酸钠与纳米甲壳素的质量比为3:1～3:2。
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