CN112089888A - 一种甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架及其制备方法，所述细胞支架的组分包括甲壳素晶须和交联透明质酸，将甲壳素晶须超声分散于去离子水中，加入透明质酸搅拌均匀，将水溶液调节pH值至4.0～6.0后，经过交联反应，于磷酸盐缓冲液中透析，冷冻干燥得到甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架。本发明能增加支架材料的力学性能和抗降解能力，扩大透明质酸细胞支架的应用范围。

Description

一种甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架及制备方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种增强型的交联透明质酸细胞支架及其制备技术。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖两种结构单元交替连接而成的一种天然粘多糖，广泛存在于高等动物细胞外基质、结缔组织和生物器官中，因而具有良好的生物相容性和降解性能，是理想的组织工程支架材料。但是，通过交联透明质酸制备的支架材料，其机械强度、孔隙率等仍然不理想。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架及其制备方法，以增加支架材料的力学性能和抗降解能力，扩大了透明质酸细胞支架的应用范围。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架，其特征在于所述细胞支架的组分包括甲壳素晶须和交联透明质酸。
所述交联透明质酸是还原响应型交联透明质酸，优选为含过硫键的交联透明质酸。甲壳素晶须与交联前加入的原料透明质酸的质量比为0.01:100～30:100。
根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将甲壳素晶须超声分散于去离子水中，加入透明质酸搅拌均匀，将水溶液调节pH值至4.0～6.0后，经过交联反应，于磷酸盐缓冲液中透析，冷冻干燥得到甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架。
优选地，将甲壳素晶须超声分散于去离子水中，加入透明质酸搅拌均匀，将水溶液调节pH值至4.0～6.0后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌均匀后加入胱胺二盐酸盐水溶液，重调反应体系pH值为4.0～6.0，进行反应，于磷酸盐缓冲液中透析，冷冻干燥得到甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架。
本发明甲壳素晶须增强透明质酸细胞支架的制备方法，甲壳素晶须和未交联的透明质酸相混合，随后经过交联反应、冷冻干燥等工艺制备出细胞支架材料，该方法使得甲壳素晶须可以更加均匀的分散在透明质酸水凝胶中。
进一步地，该细胞支架材料具有良好的机械强度，包括抗拉强度、抗压强度和弹性模量。
进一步地，甲壳素晶须与透明质酸的质量比为0.01:100～30:100。
进一步地，反应温度维持在0～50℃，优选5～10℃。
进一步地，反应时间为12～144h，优选48～60h。
进一步地，透析时间为6～72h，优选24～36h。
甲壳素晶须(Chitin whiskers,CW)是以单晶形式存在的甲壳素纤维，发明人认为，由于晶粒排列规整且内部缺陷较少，所以模量较高，其横向模量和纵向模量分别高达15和150GPa，甲壳素晶须保留了甲壳素的结构和生物活性，具备可生物降解性、独特的抗菌性及良好的生物相容性，适宜用作增强材料。本发明通过加入甲壳素晶须来增强含双硫键的交联透明质酸，甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架材料具有更好的机械性能和抗降解能力；并且，通过改变甲壳素晶须悬液和交联透明质酸的配比即可获得不同机械强度、孔隙大小、抗降解性能的细胞支架。该细胞支架可用软骨再生、治疗白癜风、人工皮肤等组织工程支架中。
附图说明
图1为本发明实施案例1-3和对照组(不含甲壳素晶须的交联透明质酸支架材料)过程中，细胞支架释放透明质酸随时间的变化的折线图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架进行具体描述，但本发明并不限于这些实施例，该领域技术人员在本发明核心指导思想下做出的非本质改进和调整，仍然属于本发明的保护范围。
(一)、甲壳素晶须增强的细胞支架材料的制备
实施例1
(1)甲壳素晶须的制备：虾蟹壳破碎成粉末，分散在3M的浓硫酸中，甲壳素与浓硫酸溶液的混合比例为3％w/v，90℃的水浴中搅拌12h，去离子水稀释，离心去除上清，重复3次，将所得沉淀用去离子水重悬，转移至截留分子量为8000～14000Da透析袋中，充分透析至透析袋内悬液的pH为6.0，600W功率下超声处理10min使沉淀完全悬浮，将所得悬液7200rpm离心，冻干得甲壳素晶须；(参考文献：CN 110478523 A)
(2)甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架的制备：将0.01g的甲壳素晶须超声分散于去100mL的离子水中，加入1g透明质酸，将水溶液调节pH值为5.0后，依次加入0.5g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、0.3g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌均匀后6h，再加入胱胺二盐酸盐水溶液，重调反应体系pH值为5.0～6.0，10℃下搅拌反应60h，于pH＝7.0磷酸盐缓冲液中透析36h，在-80℃下冷冻干燥48h得到交联透明质酸细胞支架(第一组：1-1)。
实施例2
除将甲壳素晶须含量改为透明质酸质量的2％外，其他与实施例1相同(第二组：1-2)。
实施例3
除将甲壳素晶须含量改为透明质酸质量的5％外，其他与实施例1相同(第三组：1-3)。
实施例4
除不添加甲壳素晶须外，其他与实施例1相同(对照组)。
(二)、测定甲壳素晶须增强的交联透明质酸细胞支架的厚度及孔径
方法：将实施例1-4制成的支架材料剪取小块，用游标卡尺测定材料厚度，扫描电镜测试孔径。
结果表明，添加甲壳素晶须的支架材料的厚度、孔隙大小有一定的提升，而合适的孔隙大小有利于细胞生长所需营养物质的交换以及细胞的迁移和增殖。
表1：实施例1-4得到甲壳素晶须增强细胞支架的厚度及孔径
样品编号 质量比(CW:HA) 材料厚度(mm) 孔径(μm)
对照组 0：100 1.14±0.21 103±16
1-1 1：100 1.22±0.36 131±18
1-2 2：100 1.35±0.47 148±25
1-3 5：100 1.67±0.95 172±51
(三)、测定甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架的机械强度
方法：将实施例1-4得到的交联透明质酸支架材料剪取3cm×3cm的小片，用拉力机测量所得材料的拉伸性能。
结果表明，添加甲壳素晶须的支架材料的拉伸强度得到不同程度的提升，且甲壳素晶须含量越高，所得的支架材料机械强度越高。
表2：实施例1-4得到甲壳素晶须增强细胞支架的拉伸强度
样品编号 质量比(CW:HA) 拉伸强度(N)
对照组 0：100 8.2±0.8
1-1 1：100 14.2±1.3
1-2 2：100 16.2±1.4
1-3 5：100 20.2±1.9
(四)、测定甲壳素晶须增强的交联透明质酸细胞支架的膨胀率和吸水率
膨胀率测试方法：将实施例1-4所制备的交联透明质酸细胞支架剪取3cm×3cm的小片，加入30mL 0.9％的氯化钠溶液，置于37℃水浴放置2.5h，测量其长和宽，膨胀率即为溶胀后的长乘以宽与溶胀前的百分比。
吸水率测试方法：将实施例1-4所制备的交联透明质酸细胞支架剪取2×2cm的小片，称重，记为w1。加入20mL 37℃的0.9％氯化钠溶液，放置10min后用镊子取出，擦干表面多余的水分，称重，记为w2。吸水率即在一定的时间内支架材料吸收水分的重量与其自身重量的比值。
结果表明，添加甲壳素晶须没有降低支架材料的吸水率和溶胀率，并且少量增加了吸水率和溶胀率。
表3：实施例1-4得到甲壳素晶须增强细胞支架的吸水率和溶胀率
样品编号 质量比(CW:HA) 膨胀率(％) 吸水率(％)
对照组 0：100 98.5±4.6 56.9±3.1
1-1 1：100 100.5±3.5 58.3±1.8
1-2 2：100 101.5±2.7 59.5±2.5
1-3 5：100 102.8±6.5 61.2±2.7
(五)、测定甲壳素晶须增强的交联透明质酸细胞支架的细胞毒性
将实施例1-4所制备的交联透明质酸细胞支架分别按以下方法进行细胞毒性试验：
按医疗器械生物学评价:第5部分，体外细胞毒性试验，将所制得甲壳素晶须增强的细胞支架材料剪成碎片，于1mL细胞培养液中加入1g碎片，于37±2℃放置30h，用培养基稀释浸提液，得到一系列浸提稀释液作为供试液。随后，采用MTT法评定支架材料细胞毒性。
结果表明，甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架不具有细胞毒性，生物相容性良好。
表4实施例1-4得到甲壳素晶须增强细胞支架的细胞毒性
样品编号 质量比(CW:HA) 细胞毒性反应
对照组 0：100 0级
1-1 1：100 0级
1-2 2：100 0级
1-3 5：100 0级
(六)、测定甲壳素晶须增强的交联透明质酸细胞支架的降解性能
方法：将实施例1-4的支架材料裁剪成碎片，分别称取3份，每份10mg，加入2mM GSH的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)。置于37℃恒温水浴磁力搅拌，反应一段时间，对细胞支架裂解的游离透明质酸进行检测，取1mL上清液稀释进行糖醛酸含量测定。
结果如图1所示，表明在还原条件下细胞支架可以随着时间的延长逐步裂解，直到变为溶液状态，甲壳素晶须的加入使得支架材料的抗降解能力得到提升。因为对甲壳素晶须用量的调节可以一定程度根据需要调节材料的降解时间。
以上结果表明，本发明方法制备的甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架材料性能生物相容性良好，具有优秀的孔径、膨胀率和吸水率，并且由于甲壳素晶须的加入，支架的机械性能和抗降解能力明显提高。因此，本发明的细胞支架可用细胞工程、组织再生工程中。
上述实施例仅为说明本发明的原理，而非限制本发明。在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，但都将在本发明的保护之中。

Claims (7)

1.一种甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架，其特征在于所述细胞支架的组分包括甲壳素晶须和交联透明质酸。
2.一种甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将甲壳素晶须超声分散于去离子水中，加入透明质酸搅拌均匀，将水溶液调节pH值至4.0～6.0后，经过交联反应，于磷酸盐缓冲液中透析，冷冻干燥得到甲壳素晶须增强的透明质酸细胞支架。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于交联透明质酸是还原响应型交联透明质酸，优选为含过硫键的交联透明质酸。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，甲壳素晶须与透明质酸的质量比为0.01:100～30:100。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应温度维持在0～50℃，优选5～10℃。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应时间为12～144h，优选48～60h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，透析时间为6～72h，优选24～36h。
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