CN111588860B - 一种能同时负载no和两性霉素b的球形pamam聚合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学工程材料领域，公开了一种能够同时负载NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物及其制备方法与应用。本发明装载一氧化氮和两性霉素B的阳离子聚合物，具体为球形的树枝状聚酰胺聚合物，其分子式如下所示；本发明选用球形的聚酰胺树枝状分子PAMAM作为NO供体，其球形结构的支链结构中含有大量的仲胺基团，有利于NO的高效负载。同时球形PAMAM外部的结构中含有大量伯胺基团，有利于两性霉素B的有效结合，实现NO和两性霉素B的高效负载。同时两性霉素B和NO产生协同作用使得该聚合物的抗菌效果比单独的负载两性霉素B或NO的效果均要好，为其在制备抗真菌药物的应用提供支持。

Description

一种能同时负载NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物及其制备 方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种能够同时负载NO和两性霉素B的球形树枝状PAMAM聚合物及其制备方法及应用。

背景技术

真菌侵袭是引起急慢性深部感染的重要诱因之一，例如复发性粘膜、皮肤或指甲的感染都源自于真菌的寄生，真菌感染类疾病在体质较弱和免疫力功能低下的群里中更为常见。自然界中约有600种真菌与人类疾病的发生息息相关，每年因真菌性疾病造成死亡人数高达135万。随着近年来真菌侵袭性感染机率的不断上升，为了针对不同种属真菌疾病进行治疗，越来越多的抗真菌药物面市。由于不同抗真菌药物的抗菌机理和抗菌效果各有侧重，为了获得更好的疗效而不免造成广谱抗生素的滥用，使得真菌耐药性呈不断增长的趋势。特别是由于免疫抑制剂和糖皮质激素的广泛使用、HIV感染、器官移植手术的开展、恶性肿瘤并发症引发的真菌感染极易发生，且深部真菌感染的发生率也不断增多，广谱抗真菌药物在临床上长期和反复的使用，使耐药菌株的发生率逐年上升，同种的抗真菌药物间还会产生交叉耐药性，真菌性感染的疾病越来越难以治愈，深部感染的病例急剧增加，严重威胁了人类的健康，在医学界引起越来越多的关注。

目前针对不同靶点治疗真菌感染的药物有几大类，市面上的抗真菌药物抗菌机理如下：(1)抑制或破坏真菌细胞膜中麦角甾醇的合成，改变细胞膜的通透性，从而抑制真菌的生长(2)通过可逆的抑制麦角固醇生物合成过程中的关键酶——角鲨烯环氧酶，使细胞内的角鲨烯不断累积从而阻断新固醇的合成，导致细胞坏死进而产生抑菌效果(3)通过抑制次麦角固醇在转化麦角固醇过程中的两个关键酶，使得细胞中次麦角固醇的累积，导致细胞膜结构和功能的损坏(4)与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，破坏细胞膜的完整结构，使细胞成分不可逆的外流从而造成真菌死亡(5)抑制真菌细胞壁上β-葡聚糖、几丁质、鞘磷脂的合成(6)抑制核酸、蛋白质、微管的生物合成。尽管常见的抗真菌药物作用机制已经得到明确的解释，但是高度的耐药性、较窄的抗菌谱、药物本身毒性伴随的一系列副反应等问题严重限制了其临床应用，因此开发出生物安全度高、耐药性低、疗效显著的抗真菌新药成为一个亟待解决的难题。

一氧化氮是一种内源性产生的双原子亲脂性气体，在防御病原体的感染方面有不可或缺的作用，它在体内可以参与免疫细胞的信号转导以及免疫细胞抵御细菌、真菌、病毒感染的生化反应。一氧化氮信号参与指导广泛的生化过程，它可以通过扩散作用穿过细胞膜，对入侵的病原体产生氧化和亚硝化的损伤，因此可以有效的发挥其抗菌效果。不同浓度的一氧化氮发挥两种方式的抗菌效果：低浓度下，一氧化氮作为促进免疫细胞生长和活性的信号分子；高浓度下，例如在嗜中性粒细胞的呼吸爆发期，一氧化氮共价结合DNA、蛋白质和脂质，从而抑制或杀死靶病原体。由于一氧化氮抗菌机理的特殊性，使其具有高效的抗菌性能以及极低的耐药性。

Boni等研究了一种用于治疗足癣的研究性外用一氧化氮释放水凝胶，临床实验证明该药物可以有效的将一氧化氮释放到特定的部位，局部治疗足癣效果明显且耐受性良好。(J Drugs Dermatol 2018，17(8)：888-893)Mitchell等研究报告了一种可以产生一氧化氮的益生菌粘合剂贴剂装置，并研究其在体外的抗微生物和抗真菌功效。该益生菌贴剂利用固定的乳酸菌，葡萄糖和亚硝酸盐的代谢活性来产生气态一氧化氮，利用该贴剂在特别设计的室中进行杀真菌测定，确定该材料产生的NO具有可杀死几种常见致病真菌的抑菌效力(Appl Microbiol Biotechnol 2010，87：509)。

NO在抗菌方面已经呈现出良好的抑制效果且几乎不会产生耐药，但NO的负载量和负载效率具有不稳定性，在体内的半衰期短、材料的安全性存疑等问题限制了其在临床治疗上的应用。因此设计一种球形的树枝状PAMAM聚酰胺-胺聚合物用于同时负载NO和抗真菌药物两性霉素B，通过控制PAMAM的结构实现灵活可控的NO和两性霉素B的负载，进而针对真菌感染实现精准有效的协同抵抗作用，成为一种生物相容性和稳定性良好的聚合物材料用于皮肤癣菌感染的治疗迄今为止尚未有报道。

发明内容

为了克服上述现有技术当中的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种能同时负载NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物。该聚合物的结构明确可控，具有较好的生物相容性，其树枝状结构展开的外部含有大量的仲胺基团和伯胺基团，因此具有高效的NO和两性霉素B负载能力，以及优异的抗真菌性能。

本发明的另一个目的在于提供所述能够同时负载NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物的合成方法。

本发明的另一个目的在于提供上述球形PAMAM聚合物同时负载NO和两性霉素B的方法。

本发明的另一个目的在于提供上述负载NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物在制备抗真菌药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方法实现：

一种能同时负载NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物，其分子式如下：

一种上述能同时负载NO和两性霉素B(Amphotericin B)的球形PAMAM聚合物的制备方法，包括以下操作步骤：

a、三胺(球形PAMAM核心)的合成：

将含有三乙醇胺的1，4-二氧六环溶液、强碱类催化剂与丙烯腈混合后进行加热反应得到三腈；然后将所得三腈溶解于甲醇再加入催化剂继续进行加热反应得到三酯；再将所得三酯溶于甲醇并加入乙二胺进行加热反应得到三胺；

b、1代球形树枝状聚酰胺-胺(PAMAM)的合成：

将所得三胺溶于甲醇后，与丙烯酸甲酯混合反应，得到0.5代的PAMAM单元；然后将其与乙二胺、甲醇混合反应，得到1代PAMAM基元(D1)；

c、3代球形树枝状聚酰胺-胺的合成：

以步骤b制备得到的1代PAMAM基元代替三胺，重复步骤b操作，得到2代PAMAM基元(D2)；再以2代PAMAM基元重复步骤b操作，得到3代球形的树枝状聚酰胺-胺。

步骤a中所述三乙醇胺、1，4-二氧六环的体积比为1：10～15；所述强碱类催化剂为KOH、NaOH中的至少一种；所述丙烯腈的体积为1，4-二氧六环体积的16％～18％；所述三腈、三酯与甲醇的质量比均独立地比为1：10～15。所述催化剂为强酸类催化剂或酯化反应催化剂；优选为浓硫酸或二氯亚砜。所述三次加热反应为微波加热，功率均独立地为180～350W，加热时间独立地为30～60min；优选的，所述三次微波辐照的功率依次为325W、520W、195W。

步骤b中所述三胺与丙烯酸甲酯的质量比为1：10～15；所述第一次混合反应时的时间为12～36h，所述0.5代的PAMAM单元与乙二胺的质量比为1：5～10；所述第二次混合反应时的时间为12～36h。

步骤c中，所述1代的PAMAM基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：20～30，1.5代的PAMAM基元与乙二胺的质量比为1：10～20，2代的PAMAM基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：40～60，2.5代的PAMAM基元与乙二胺的质量比为1：20～40。

一种上述球形PAMAM聚合物负载NO和两性霉素B的方法，包括以下步骤：

(1)将溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的两性霉素B与NHS·HCl和EDC混合均匀，再加入所述PAMAM继续混合，将所得混合溶液干燥后得到负载有两性霉素B的球形树枝状聚酰胺(PAMAM-AB)；

(2)将步骤(1)所得PAMAM-AB溶于有机溶剂，再加入甲醇钠继续溶解后通入NO气体，反应结束后得到同时负载有NO和两性霉素B的球形树枝状聚酰胺聚合物(PAMAM-AB/NONOate)。

步骤(1)中所述PAMAM、两性霉素B、EDC·HCl和NHS的摩尔比为1：1～12：1～12：1～12；所述的DMF的用量以10mL的DMF中对应加入1～5g的两性霉素B计；

步骤(2)中所述有机溶剂为无水甲醇和DMF的共混溶剂；优选的，所述无水甲醇与DMF的体积比为1：0.5～2。所述有机溶剂的用量以每10mL的无水甲醇对应加入1～2g的PAMAM-AB计；

步骤(2)中所述的甲醇钠与PAMAM-AB的摩尔比为1：400～500；

步骤(2)中所述的通入NO气体反应是指通入80psi～120psi的NO气体；所述通入NO气体后的反应温度为室温，反应时间为3～7天。

优选的，步骤(2)所述反应在进行前最好先用氮气排除反应容器内的空气，具体为用20psi～50psi的高纯氮气继续通入10min～20min以排除反应容器内的空气。步骤(2)中反应结束后，为安全起见，可以用20～50psi的高纯氮气将NO排出并继续维持30～60min后再打开反应釜。步骤(2)中所述得到PAMAM-AB/NONOate后还包括纯化的步骤，所述纯化是指将所得反应产物用无水乙醚沉降洗涤2～3次，然后过滤并在50～80℃的真空干燥箱中干燥12～48h即得最终产物；所述最终产物优选为被保存在-4～-20℃的干燥箱中。

一种负载有NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物，通过上述方法制备得到。

上述负载有NO和两性霉素B的球形树枝状聚酰胺聚合物(PAMAM-AB/NONOate)在制备新型抗真菌药物中的应用。

本发明和现有的技术相比，具有以下优点和有益效果：

(1)本发明选用球形树枝状聚酰胺分子作为NO的供体并同时负载抗真菌药物两性霉素B，其球形结构中大量的仲胺基团，不仅有利于NO的高效负载，同时球形PAMAM结构中大量的伯胺基团可以有效的负载两性霉素B，从而实现同时负载NO和抗真菌药物两性霉素B，达到NO和药物协同抗真菌的效果；

(2)球形树枝状的聚酰胺分子结构明确可控，可以调整接枝的代数从而调整亲核位点的数量，因此可以有效的实现NO的可控释放；

(3)材料表面电位呈现正电性质，因此有利于亲和细胞，增强其生物相容性；

(4)本发明制备的同时负载NO和两性霉素B的高分子聚合物具有协同作用，其抗菌效果明显优于单独负载NO和两性霉素B的材料。

附图说明

图1为实施例1所得球形树枝状聚酰胺PAMAM的红外光谱图；

图2为实施例7中PAMAM-AB/NONOate在不同时间下的NO累积释放量图；

图3为实施例12中不同材料对白色念珠菌的杀菌效果。图A代表未添加任何抗菌材料的空白对照组，图B代表实施例7所得PAMAM/NONOate与真菌共孵育后的实验组，图C代表实施例4所得PAMAM-AB与真菌共孵育后的实验组，图D代表实施例7所得PAMAM-AB/NONOate与真菌共孵育后的实验组。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明在制备各中间产物及目标产物时，优选的还需要进行提纯等操作；例如：步骤a中，制备三酯时，在得到粗产物后，可以对粗产物旋蒸后加入饱和碳酸钠调至pH为弱碱性，再经二氯甲烷萃取、MgSO₄干燥、旋蒸和柱层析纯化得到纯化后的三酯。制备三胺时，在得到粗产物后，可将所得粗产物经旋蒸和乙醚沉降后，再次旋蒸和柱层析纯化到纯化后的三胺。

步骤b中，制备0.5代的PAMAM单元时，在得到粗产物后，将所得产物经过旋转蒸发1～3h，30～50℃减压蒸馏15～60min，真空烘箱过夜，可得到纯化后的0.5代的PAMAM单元。同样，制备1代的PAMAM基元时也可进行相同的纯化操作。

本发明中所述室温为20～37℃；所属混合或混合均匀通过搅拌进行，而搅拌是为了是原料充分混合，因此不用对搅拌速度进行限定，本领域常规使用的搅拌速度均可；所述透析袋的截留分子量为2000-6000；

以下实施例所述干燥处理的丙烯酸甲酯、乙二胺、无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：将无水硫酸钠加入到丙烯酸甲酯中搅拌12～24小时，然后常压蒸馏，得到无水丙烯酸甲酯，所述无水硫酸钠的加入量以每500mL丙烯酸甲酯中加入1～2克计；将无水氢氧化钾加入到乙二胺中搅拌12～24小时，然后减压蒸馏，得到无水乙二胺，所述无水氢氧化钾的加入量以每500mL乙二胺中加入1～2克计；所述无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：将氢化钙加入到甲醇中，搅拌12～24小时，然后常压蒸馏，得到无水甲醇，所述氢化钙的加入量以每500mL甲醇中加入1～2克计。

实施例1

a、三胺(球形PAMAM核心)的合成：

在冰水浴的条件下将1g的三乙醇胺溶解于10mL的1，4-二氧六环溶剂中，再向其中加入3.6M KOH水溶液9mmoL并搅拌均匀，向其中逐滴加入1.6mL丙烯腈，325W微波辐照下加热回流30min，将产物经旋蒸和柱层析分离纯化得到三腈。冰水浴下将1g的三腈溶解于10mL甲醇溶液中，持续搅拌的条件下逐滴加入2mL浓硫酸，在520W微波辐照下加热回流30min，粗产物旋蒸后加入饱和碳酸钠调至pH为弱碱性，再经二氯甲烷萃取、MgSO4干燥、旋蒸和柱层析纯化得到三酯。冰水浴下将1g的三酯溶解于10mL甲醇溶液中，并添加过量的6mL乙二胺，与195W微波辐照下加热回流30min，所得粗产物经旋蒸和乙醚沉降后，再次旋蒸和柱层析纯化，得到PAMAM的三胺分子核；

b、1代球形树枝状聚酰胺(PAMAM)的合成：

冰水浴下将纯化的1g三胺溶解在10mL甲醇中，通入氮气使反应体系稳定后撤去氮气，继续在冰水浴下滴入丙烯酸甲酯，继续通入氮气15min，密封搅拌反应12h，所得产物经过旋转蒸发1h，30℃减压蒸馏15min，真空烘箱过夜，即得到0.5代的PAMAM单元；冰水浴下将上述单元1g溶解在10mL甲醇里，再滴入乙二胺的甲醇溶液中，通入氮气15min后密封搅拌反应12h，所得产物经过旋转蒸发1h，30℃减压蒸馏15min，真空烘箱过夜，得到1代的PAMAM基元(D1)；

所述丙烯酸甲酯溶液浓度为20wt％；所述滴加丙烯酸甲酯的时间为1h；0.5代PAMAM合成过程中三胺与丙烯酸甲酯的质量比为1：10，1代PAMAM合成过程中0.5代基元与乙二胺的质量比为1：5。

c、3代球形树枝状聚酰胺(PAMAM)的合成：

以步骤b制备得到的1代PAMAM基元代替乙二胺，重复步骤b操作，得到2代PAMAM基元(D2)；再以2代PAMAM基元重复步骤b操作，得到3代球形的树枝状聚酰胺；

所述3代PAMAM合成过程中1代基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：20，1.5代基元与乙二胺的质量比为1：10，2代基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：40，2.5代基元与乙二胺的质量比为1：20。

实施例2

a、三胺(球形PAMAM核心)的合成：

在冰水浴的条件下将1g的三乙醇胺溶解于10mL的1，4-二氧六环溶剂中，再向其中加入微量3.6M KOH水溶液9mmoL并搅拌均匀，向其中逐滴加入1.8mL丙烯腈，325W微波辐照下加热回流50min，将产物经旋蒸和柱层析分离纯化得到三腈。冰水浴下将1g的三腈溶解于10mL甲醇溶液中，持续搅拌的条件下逐滴加入3mL浓硫酸，在520W微波辐照下加热回流50min，粗产物旋蒸后加入饱和碳酸钠调至pH为弱碱性，再经二氯甲烷萃取、MgSO4干燥、旋蒸和柱层析纯化得到三酯。冰水浴下将1g的三酯溶解于10mL甲醇溶液中，并添加过量的8mL乙二胺，与195W微波辐照下加热回流50min，所得粗产物经旋蒸和乙醚沉降后，再次旋蒸和柱层析纯化，得到PAMAM的三胺分子核；

b、1代球形树枝状聚酰胺(PAMAM)的合成：

冰浴下将纯化的2g三胺溶解在20mL甲醇中，通入氮气使反应体系稳定后撤去氮气，继续在冰水浴下滴入丙烯酸甲酯，继续通入氮气30min，密封搅拌反应24h，所得产物经过旋转蒸发2h，50℃减压蒸馏30min，真空烘箱过夜，即得到0.5代的PAMAM单元；冰水浴下将上述单元2g溶解在20mL甲醇里，再滴入乙二胺的甲醇溶液中，通入氮气30min后密封搅拌反应24h，所得产物经过旋转蒸发2h，50℃减压蒸馏30min，真空烘箱过夜，得到1代的PAMAM基元(D1)；

所述丙烯酸甲酯溶液浓度为20wt％；所述滴加丙烯酸甲酯的时间为1.5h；0.5代PAMAM合成过程中乙二胺与丙烯酸甲酯的质量比为1：15，1代PAMAM合成过程中0.5代基元与乙二胺的质量比为1：10。

c、3代球形树枝状聚酰胺(PAMAM)的合成：

以步骤b制备得到的1代PAMAM基元代替乙二胺，重复步骤b操作，得到2代PAMAM基元(D2)；再以2代PAMAM基元重复步骤b操作，得到3代球形的树枝状聚酰胺；

所述3代PAMAM合成过程中1代基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：25，1.5代基元与乙二胺的质量比为1：15，2代基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：50，2.5代基元与乙二胺的质量比为1：30。

实施例3

a、三胺(球形PAMAM核心)的合成：

在冰水浴的条件下将1g的三乙醇胺溶解于15mL的1，4—二氧六环溶剂中，再向其中加入微量3.6M KOH水溶液10mmoL并搅拌均匀，向其中逐滴加入2.7mL丙烯腈，325W微波辐照下加热回流60min，将产物经旋蒸和柱层析分离纯化得到三腈。冰水浴下将1g的三腈溶解于15mL甲醇溶液中，持续搅拌的条件下逐滴加入3mL浓硫酸，在520W微波辐照下加热回流60min，粗产物旋蒸后加入饱和碳酸钠调至pH为弱碱性，再经二氯甲烷萃取、MgSO4干燥、旋蒸和柱层析纯化得到三酯。冰水浴下将1g的三酯溶解于15mL甲醇溶液中，并添加过量的10mL乙二胺，与195W微波辐照下加热回流60min，所得粗产物经旋蒸和乙醚沉降后，再次旋蒸和柱层析纯化，得到PAMAM的三胺分子核；

b、1代球形树枝状聚酰胺(PAMAM)的合成：

冰浴下将纯化的3g三胺溶解在30mL甲醇中，通入氮气使反应体系稳定后撤去氮气，继续在冰水浴下滴入丙烯酸甲酯，继续通入氮气30min，密封搅拌反应36h，所得产物经过旋转蒸发3h，50℃减压蒸馏60min，真空烘箱过夜，即得到0.5代的PAMAM单元；冰水浴下将上述单元3g溶解在30mL甲醇里，再滴入乙二胺的甲醇溶液中，通入氮气30min后密封搅拌反应36h，所得产物经过旋转蒸发3h，50℃减压蒸馏60min，真空烘箱过夜，得到1代的PAMAM基元(D1)；

所述丙烯酸甲酯溶液浓度为20wt％；所述滴加丙烯酸甲酯的时间为1.5h；0.5代PAMAM合成过程中乙二胺与丙烯酸甲酯的质量比为1：15，1代PAMAM合成过程中0.5代基元与乙二胺的质量比为1：10。

c、3代球形树枝状聚酰胺(PAMAM)的合成：

以步骤b制备得到的1代PAMAM基元代替乙二胺，重复步骤b操作，得到2代PAMAM基元(D2)；再以2代PAMAM基元重复步骤b操作，得到3代球形的树枝状聚酰胺；

所述3代PAMAM合成过程中1代基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：25，1.5代基元与乙二胺的质量比为1：15，2代基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：50，2.5代基元与乙二胺的质量比为1：30。

实施例4

将两性霉素B溶解于干燥后的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)室温搅拌1h后，加入实施例1得到的球形树枝状聚酰胺PAMAM继续反应12h，反应结束后将所得反应液用透析袋进行透析2天，冻干得到产物负载有两性霉素B的球形树枝状聚酰胺(PAMAM-AB)；

所述球形树枝状聚酰胺、两性霉素B、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1：1：1：1；所述的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的用量以每10mL中对应加入1g的两性霉素B计。

实施例5

将两性霉素B溶解于干燥后的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)室温搅拌2h后，加入实施例2得到的球形树枝状聚酰胺PAMAM继续反应24h，反应结束后将所得反应液用透析袋进行透析2天，冻干得到产物负载有两性霉素B的球形树枝状聚酰胺(PAMAM-AB)；

所述球形树枝状聚酰胺、两性霉素B、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1：6：6：6；所述的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的用量以每10mL中对应加入2.5g的两性霉素B计。

实施例6

将两性霉素B溶解于干燥后的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)室温搅拌3h后，加入实施例3得到的球形树枝状聚酰胺PAMAM继续反应24h，反应结束后将所得反应液用透析袋进行透析3天，冻干得到产物负载有两性霉素B的球形树枝状聚酰胺(PAMAM-AB)；

所述球形树枝状聚酰胺、两性霉素B、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1：12：12：12；所述的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的用量以每10mL中对应加入5g的两性霉素B计。

实施例7

将实施例1中得到的球形PAMAM和实施例4中冻干后得到的两性霉素B修饰的球形树枝状聚酰胺(PAMAM-AB)加入到干燥处理后的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂中，然后再加入甲醇钠继续溶解稳定30min后放置于高压反应釜密封，用氮气排除反应釜内的空气，然后通入NO气体室温下反应3天，反应结束后将所得反应产物取出纯化即得最终产物同时负载有NO和两性霉素B的球形树枝状聚酰胺聚合物(PAMAM-AB/NONOate)。

所述的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂是指无水甲醇和四氢呋喃的体积比为1：0.5；所述的混合溶剂的用量以每10ml的无水甲醇对应加入1g的两性霉素修饰的球形聚酰胺PAMAM计；所述的用氮气排除反应釜内的空气是指用20psi的高纯氮气维持反应釜10min以排除反应釜内的空气；所述的通入NO气体反应是指通入80psi的NO气体；所述的纯化是指将所得反应产物用无水乙醚沉降洗涤2次，然后过滤并在50℃的真空干燥箱中干燥12h即得最终产物；所述的甲醇钠与球形聚酰胺的摩尔比为1：400；

所述无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：500mL甲醇溶液中加入10g金属钠，回流得无水甲醇；所述用氮气排除反应釜内的空气时间以及用氮气排除反应釜内的一氧化氮气体时间为20min。

实施例8

将实施例5中冻干后得到的两性霉素B修饰的球形树枝状聚酰胺(PAMAM-AB)加入到干燥处理后的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂中，然后再加入甲醇钠继续溶解稳定60min后放置于高压反应釜密封，用氮气排除反应釜内的空气，然后通入NO气体室温下反应5天，反应结束后将所得反应产物取出纯化即得最终产物同时负载有NO和两性霉素B的球形树枝状聚酰胺聚合物(PAMAM-AB/NONOate)。

所述的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂是指无水甲醇和四氢呋喃的体积比为1：1；所述的混合溶剂的用量以每10ml的无水甲醇对应加入1.5g的两性霉素修饰的球形聚酰胺PAMAM计；所述的用氮气排除反应釜内的空气是指用40psi的高纯氮气维持反应釜10min以排除反应釜内的空气；所述的通入NO气体反应是指通入100psi的NO气体；所述的纯化是指将所得反应产物用无水乙醚沉降洗涤2次，然后过滤并在70℃的真空干燥箱中干燥24h即得最终产物；所述的甲醇钠与球形聚酰胺的摩尔比为1：450；

所述无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：500mL甲醇溶液中加入15g金属钠，回流得无水甲醇；所述用氮气排除反应釜内的空气时间以及用氮气排除反应釜内的一氧化氮气体时间为60min。

实施例9

将实施例6中冻干后得到的两性霉素B修饰的球形树枝状聚酰胺(PAMAM-AB)加入到干燥处理后的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂中，然后再加入甲醇钠继续溶解稳定60min后放置于高压反应釜密封，用氮气排除反应釜内的空气，然后通入NO气体室温下反应7天，反应结束后将所得反应产物取出纯化即得最终产物同时负载有NO和两性霉素B的球形树枝状聚酰胺聚合物(PAMAM-AB/NONOate)。

所述的无水甲醇和四氢呋喃共混溶剂是指无水甲醇和四氢呋喃的体积比为1：2；所述的混合溶剂的用量以每10ml的无水甲醇对应加入2g的两性霉素修饰的球形聚酰胺PAMAM计；所述的用氮气排除反应釜内的空气是指用50psi的高纯氮气维持反应釜20min以排除反应釜内的空气；所述的通入NO气体反应是指通入120psi的NO气体；所述的纯化是指将所得反应产物用无水乙醚沉降洗涤3次，然后过滤并在80℃的真空干燥箱中干燥48h即得最终产物；所述的甲醇钠与球形聚酰胺的摩尔比为1：500；

所述无水甲醇的制备方法按照以下操作步骤：500mL甲醇溶液中加入20g金属钠，回流得无水甲醇；所述用氮气排除反应釜内的空气时间以及用氮气排除反应釜内的一氧化氮气体时间为120min。

实施例10

取10mg实施例8所得PAMAM-AB/NONOate产物加入到10mL PBS缓冲液的透析袋内，两端扎口放入45mL离心管内，并向离心管内注入10mL PBS缓冲液。在37℃恒温摇床内，每隔一段时间取50μL注入到96孔板中。在酸性条件下，NO与重氮盐磺胺发生重氮反应，并生成重氮化合物，后者进一步与萘基乙烯基二胺发生耦合反应，生成一种红色偶氮化合物，故本实验采用Griess试剂方法来检测NO释放。

所述PBS缓冲液的制备：取19mL磷酸二氢钾(0.2mol/L)和81mL磷酸氢二钠(0.2mol/L)相互混合；所述每隔一段时间取其透析袋外的溶液100μL的时间间隔为：1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h，9h，12h，18h进行取点置于96孔板中，并依次滴加GriessⅠ，Ⅱ液后，溶液变为粉红色、玫瑰红色表示有亚硝酸盐还原，反应为阳性。在无光的条件下稳定15min后会观察到紫色或紫红色出现。然后用酶标仪测定其540nm处的吸收强度。图2为PAMAM-AB/NONOate在不同时间下的NO累积释放量图，从图2中可以看出PAMAM-AB/NONOate作为NO载体材料能够实现相对较高的NO负载量，通过制定亚硝酸钠标准曲线可以测得该PAMAM载体的最大NO释放量为1.19μmol/mg。

实施例11

取实施例1所得球形PAMAM通过溴化钾压片法进行红外光谱表征，结果如图1所示，对于1代的PAMAM而言，在3280.67cm-1是(ν-NH2-)的伸缩振动峰，在2937.06cm-1和2864.57cm-1处出现了两组吸收峰，它们分别是(ν-CH2-)的不对称伸缩振动和对称伸缩振动；而在1642.21cm-1和1557.43cm-1处的强吸收峰是酰胺键的特征吸收峰；在1469.16cm-1出现了(ν-CH2-)的弯曲振动吸收峰；1195.39cm-1和1115.03cm-1分别是伯胺和叔胺的伸缩振动。由于2代和3代分子与1代分子所含官能团的种类相同，只是支化带不同而已，所以三者的光谱图十分相似，因此我们的红外图证明了球形PAMAM的成功制备。

实施例12

称取实施例7所得PAMAM/NONOate，实施例4所得PAMAM-AB和实施例7所得PAMAM-AB/NONOate各1mg溶解于1mL生理盐水，并将浓度稀释到0.5mg/mL，每个实验组材料取500μL置于24孔板中，并向其中加入50μL OD600＝0.1的白色念珠菌菌悬液(菌种分离自临床样本)，在37℃150rpm的摇床里共孵育4小时，从每个孔中各取100μL混合液涂布于琼脂平板上过夜培养12小时，同时设置不加任何杀菌材料以生理盐水代替的空白对照组。不同材料的杀菌效果如图3所示，图A代表未添加任何抗菌材料的空白对照组，图B代表实施例7所得PAMAM/NONOate与真菌共孵育后的实验组，图C代表实施例4所得PAMAM-AB与真菌共孵育后的实验组，图D代表实施例7所得PAMAM-AB/NONOate与真菌共孵育后的实验组。对比相同浓度的PAMAM/NONOate、PAMAM-AB、PAMAM-AB/NONOate三种材料对于白色念珠菌的抑制效果，实施例7所得的NO和两性霉素B共负载的PAMAM-AB/NONOate材料显示出其他两个实验组更明显的抑菌效果，充分说明了同时负载抗真菌药物两性霉素B和NO的在抑制白色念珠菌方面展现出了“1+1>2”的协同作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种能同时负载NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物，其特征在于分子式如下：

;

所述能同时负载NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物通过以下操作步骤制备得到：

a、三胺的合成：

将含有三乙醇胺的1,4-二氧六环溶液、强碱类催化剂与丙烯腈混合后进行加热反应得到三腈；然后将所得三腈溶解于甲醇再加入催化剂继续进行加热反应得到三酯；再将所得三酯溶于甲醇并加入乙二胺进行加热反应得到三胺；

b、1代球形树枝状聚酰胺-胺的合成：

将所得三胺溶于甲醇后，与丙烯酸甲酯混合反应，得到0.5代的PAMAM单元；然后将其与乙二胺、甲醇混合反应，得到1代PAMAM基元；

c、3代球形树枝状聚酰胺-胺的合成：

以步骤b制备得到的1代PAMAM基元代替三胺，重复步骤b操作，得到2代PAMAM基元；再以2代PAMAM基元重复步骤b操作，得到3代球形的树枝状聚酰胺-胺。

2.一种权利要求1所述能同时负载NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物的制备方法，其特征在于，步骤包括权利要求1中的步骤a~c。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤a中所述三乙醇胺、1,4-二氧六环的体积比为1：10～15；所述强碱类催化剂为KOH和NaOH中的至少一种；

所述丙烯腈的体积为1,4-二氧六环体积的16％～18％；

所述三腈、三酯与甲醇的质量比均独立地比为1：10～15；

所述催化剂为强酸类催化剂或酯化反应催化剂；

三次加热反应为微波加热，功率均独立地为180～350W，加热时间独立地为30～60min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤b中所述三胺与丙烯酸甲酯的质量比为1：10～15；第一次混合反应时的时间为12～36h；所述0.5代的PAMAM单元与乙二胺的质量比为1：5～10；第二次混合反应时的时间为12～36h；

步骤c中，所述1代的PAMAM基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：20～30，1.5代的PAMAM基元与乙二胺的质量比为1：10～20，2代的PAMAM基元与丙烯酸甲酯的质量比为1：40～60，2.5代的PAMAM基元与乙二胺的质量比为1：20～40。

5.一种根据权利要求1所述球形PAMAM聚合物负载NO和两性霉素B的方法，包括以下步骤：

(1)将溶于N ,N-二甲基甲酰胺中的两性霉素B与NHS·HCl和EDC混合均匀，再加入所述PAMAM继续混合，将所得混合溶液干燥后得到负载有两性霉素B的球形树枝状聚酰胺；

(2)将步骤(1)所得负载有两性霉素B的球形树枝状聚酰胺溶于有机溶剂，再加入甲醇钠继续溶解后通入NO气体，反应结束后得到同时负载有NO和两性霉素B的球形树枝状聚酰胺聚合物；

步骤(2)中所述有机溶剂为无水甲醇和DMF的共混溶剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述PAMAM、两性霉素B、EDC·HCl和NHS的摩尔比为1：1～12：1～12：1～12；

所述的DMF的用量以10mL的DMF中对应加入1～5g的两性霉素B计。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的通入NO气体反应是指通入80psi～120psi的NO气体；所述通入NO气体后的反应温度为室温，反应时间为3～7天。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述有机溶剂的用量以每10mL的无水甲醇对应加入1～2g的PAMAM-AB计；

步骤(2)中所述的甲醇钠与PAMAM-AB的摩尔比为1：400～500。

9.根据权利要求5～8任一项所述方法制备得到的负载有NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物。

10.根据权利要求9所述负载有NO和两性霉素B的球形PAMAM聚合物在制备抗真菌药物中的应用。

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