CN111534549A - 一种修复海洋溢油污染的固定化菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种修复海洋溢油污染的固定化菌剂，属于石油及石油产品污染的生物修复技术领域，包括调节物质2‑(4‑叔丁基‑2,6‑二甲基苄基)‑2‑咪唑啉盐酸盐，利用二甲氧基乙烷和3,5‑二羟基‑3‑甲基戊酸进行改性的聚乙烯醇。该固定化菌剂制备时所用聚乙烯醇的量较少，交联反应时间短，在保证较高的机械强度下，能够提高固定化效率和传质性能；能够抑制枯草芽孢杆菌spx基因的转录，提高srfA基因的转录水平，促进表面活性素的生成，提高对原油的乳化能力，进而提高对原油的降解率。

Description

一种修复海洋溢油污染的固定化菌剂
技术领域
本发明属于石油及石油产品污染的生物修复技术领域，具体涉及一种修复海洋溢油污染的固定化菌剂。
背景技术
近年来由于各种自然或人为原因，海洋溢油事故频发。溢油污染大大超出并严重破坏了海洋生态环境的自净能力，从而直接或间接对人们的生产和生活产生影响。寻求环境友好且低成本的溢油清除策略是当前海洋环境治理急需解决的问题。目前，已有众多用于缓解和治理原油污染的方法。其中传统的物理化学方法能够快速地消除溢油，但实际应用中往往只在溢油初期发挥较好的效果，且成本较高，并能造成二次污染。溢油生物修复方法是利用石油降解微生物的矿化作用使原油转化为CO2、H2O和自身生物量来清除污染海域的石油污物，与其它修复方式相比具有清洁、高效和低廉的优点，已成为最具发展潜力的溢油处理策略。然而，在实际生物修复应用中，很多问题需要克服解决，如添加微生物活性的维系、开放海域的冲刷稀释及土著微生物较弱的溢油生物修复能力等。面对以上问题，越来越多学者认为，微生物固定化技术是最好的解决途径。与施加游离微生物相比，微生物固定化技术具有以下优势：(1)因降解微生物高密度聚集,降解率提高；(2)生物降解稳定性及对各种稀释、捕食复杂环境的耐受性增强；(3)刺激微生物的生长繁殖及重复利用。
现有技术如授权公告号为CN 103923903 B的中国发明专利，公开了一种固定化微生物溢油修复剂的制备方法，步骤为：制备花生壳基活性碳；将花生壳基活性碳与种子菌液混合进行吸附直至吸附饱和，形成菌悬液；往上述菌悬液中加入30～40℃的已灭菌的海藻酸钠溶液，混匀后用注射器注入到一定浓度的CaCl2溶液分散成球，并交联12h～24h，得到固定化微生物微球；最后将得到的固定化微生物微球用生理盐水冲洗2～4遍，即为成品。该发明首次将生物基活性碳-改性花生壳添加至海藻酸钠-氯化钙包埋固定化载体中，提高制剂的机械强度和传质性，提高了微生物的活性及降解效率；同时成本低、工艺简单易操作，反应条件温和，制得的修复剂微生物不易泄漏，稳定性和重复利用性好，并且有较高的微生物活性和细胞容量，对石油烃的降解率可达75-92％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改性聚乙烯醇及其制备方法，该改性聚乙烯醇用于制备固定化菌剂时，能够减少聚乙烯醇的用量，缩短交联反应时间，在保证较高的机械强度下，提高固定化效率和传质性能。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种改性聚乙烯醇，上述改性聚乙烯醇的制备方法包括：取聚乙烯醇加热搅拌至完全溶解，加入3,5-二羟基-3-甲基戊酸，加入二甲氧基乙烷，75-80℃恒温水浴，磁力搅拌4-6h后，透析，冷冻干燥，再55-60℃真空干燥。优选地，上述聚乙烯醇：3,5-二羟基-3-甲基戊酸：二甲氧基乙烷(m/m)＝3-4:2-3:1-2。在二甲氧基乙烷存在下，3,5-二羟基-3-甲基戊酸上的羧基能够与聚乙烯醇的羟基发生酯化反应，引入两个羟基基团，用改性聚乙烯醇制备固定化菌剂时，两个羟基基团的存在提高了低浓度PVA在同质溶液内的分子间作用力，能够抵抗凝胶的自由流动，提高固定化微球内部交联聚合程度，同时在较短的交联反应时间内即可充分交联，具有较高的机械强度和成球性，并能够减少对细菌活性的损伤，且引入的疏水链及较低浓度的改性聚乙烯醇使得固定化菌体内部的孔状结构较为疏松，从而提高固定化效率、传质性能，进而提高对原油的降解率。
本发明的另一个目的在于提供一种修复海洋溢油污染的固定化菌剂及其制备方法，该固定化菌剂能够抑制枯草芽孢杆菌spx基因的转录，提高srfA基因的转录水平，促进表面活性素的生成，提高对原油的乳化能力，进而提高对原油的降解率。
提供2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐在提高枯草芽孢杆菌的生物表面活性剂产量中的用途。枯草芽孢杆菌合成的表面活性素(surfactin)是目前发现的最强生物表面活性剂，属于脂肽，能够将原油乳化成小液滴，并增大原油在水中的溶解度，能够增大菌与原油的有效利用面积，提高对原油的利用率。srfA是枯草芽孢杆菌surfactin代谢调节相关合成基因，在srfA转录过程中RNA聚合酶在ComA-P的协助下与srfA的-35区结合，以启动srfA基因的完全转录。然而ComA-P和spx蛋白与RNA聚合酶α亚基的C端发生相互作用的区域存在重叠区，spx蛋白能通过竞争性地占据RNA聚合酶α亚基C端与ComA-P发生相互作用的蛋白域，抑制srfA正常转录。加入2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐能够抑制枯草芽孢杆菌spx基因的转录，减少对RNA聚合酶α亚基C端与ComA-P发生相互作用的蛋白域的占据，提高srfA基因的转录水平，促进surfactin的生成，提高对原油的乳化能力，进而提高对原油的降解率。
提供一种固定化菌剂的制备方法，上述固定化菌剂的制备方法包括以下步骤：
S1、将上述改性聚乙烯醇、海藻酸钠、调节物质、活性炭灭菌后，在74-80℃恒温水浴下置于无菌海水溶解，得包埋材料胶体；
S2、冷却至38-41℃，加入上述包埋材料胶体的1/8-1/10体积的石油烃降解菌的种子菌液混匀，得到原料混合物；
S3、将上述原料混合物通过造粒装置滴入质量浓度2％的氯化钙的饱和硼酸溶液中，搅拌，交联反应5-8h后，得固定化菌剂；
上述包埋材料胶体中改性聚乙烯醇的质量浓度为2-6％，海藻酸钠的质量浓度为2-3％，活性炭的质量浓度为0.5-0.7％。
优选地，上述石油烃降解菌包括假交替单胞菌、枯草芽孢杆菌、副短短芽孢杆菌。
优选地，上述步骤S1中调节物质包括2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐。
优选地，上述步骤S1包埋材料胶体中2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐的质量浓度为0.02-0.03％。
提供一种石油烃降解菌固定化菌剂，上述石油烃降解菌固定化菌剂采用上述所述的固定化菌剂的制备方法进行制备。
提供一种固定化菌剂在修复海洋溢油污染中的用途。
提供一种3,5-二羟基-3-甲基戊酸、二甲氧基乙烷在提高固定化微球的传质性能中的用途，上述固定化微球的固定化载体材料包括聚乙烯醇。
本发明的有益效果为：
1)本发明通过利用二甲氧基乙烷和3,5-二羟基-3-甲基戊酸上的羧基对聚乙烯醇进行改性，用改性的聚乙烯醇制备固定化菌剂时，两个羟基基团的存在提高了低浓度PVA在同质溶液内的分子间作用力，能够抵抗凝胶的自由流动，提高固定化微球内部交联聚合程度，缩短交联反应时间，且引入的疏水链及较低浓度的改性聚乙烯醇使得固定化菌体内部的孔状结构较为疏松，在保证较高的机械强度下，提高固定化效率和传质性能；
2)本发明通过在固定化菌剂中加入2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐抑制枯草芽孢杆菌spx基因的转录，减少对RNA聚合酶α亚基C端与ComA-P发生相互作用的蛋白域的占据，提高srfA基因的转录水平，促进surfactin的生成，提高对原油的乳化能力，进而提高对原油的降解率。
附图说明
图1为本发明实施例1中改性聚乙烯醇和未改性聚乙烯醇的傅里叶红外光谱图；
图2为本发明实施例2中接枝率的测定结果；
图3为本发明试验例1中spx、srfA3基因的相对转录水平及surfactin含量的测定结果；
图4为本发明试验例2中固定化菌剂的破碎率、固定化效率、渗透率的测定结果；
图5为本发明试验例2中空白固定化微球的扫描电镜图；
图6为本发明试验例3中表面张力降低值和原油降解率的测定结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种改性聚乙烯醇的方法，包括：
取5.28g聚乙烯醇加入容积为500mL的圆底烧瓶，加入300mL水，在100℃磁力搅拌下加热至完全溶解，加入3.52g 3,5-二羟基-3-甲基戊酸，加入1.8g二甲氧基乙烷，80℃恒温水浴，磁力搅拌5h后，将产物装于截留分子量为14000Da的透析袋中透析48h，冷冻干燥后，在55℃下继续真空干燥，得改性聚乙烯醇。采用傅里叶变换红外光谱仪对改性聚乙烯醇和未改性聚乙烯醇进行红外光谱分析。改性聚乙烯醇和未改性聚乙烯醇的傅里叶红外光谱图见图1。
由图1可以看出，改性聚乙烯醇在1733cm-1出现了新的吸收峰，为酯键中C＝O双键伸缩振动的特征吸收峰，同时3523cm-1处醇-OH伸缩振动吸收峰增强，说明3,5-二羟基-3-甲基戊酸上的羧基与聚乙烯醇上的羟基发生酯化反应，引入了3,5-二羟基-3-甲基戊酸的两个羟基基团。
一种固定化菌剂的制备方法，包括：
实验用培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH值7.0-7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。
基础无机盐培养基(g/L)：NaCl 5，(NH4)2SO4 1，MgSO4·7H2O 0.25，NaNO3 2，KH2PO44，K2HPO4·3H2O 10，pH值7.0-7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。
原油降解(驯化)培养基：一定量的原油于100mL基础无机盐培养基中，pH值7.0-7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min。
复配菌株种子液的制备：1)活化：分别取实验室中的假交替单胞菌菌株、枯草芽孢杆菌菌株、副短短芽孢杆菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30℃120r/min条件下振荡培养2d；2)将活化后的菌株按照体积比1:1:1的比例进行复配，按照3％(v/v)的接种量接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30℃120r/min条件下振荡培养2d；3)将复配的混合菌株培养液按照10％(v/v)的接种量添加到含有2g/L原油的驯化培养基，在25℃120r/min条件下振荡培养7d，测定降解率；从中取出一些菌液作为种子菌液，按照3％(v/v)的接种量接种到另一个已灭菌的2g/L原油的驯化培养基中培养，如此重复，至降解率不再提高为止。
固定化菌剂的制备：将4g改性聚乙烯醇、2g海藻酸钠、0.02g 2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐、0.5g活性炭灭菌后，在78℃恒温水浴下置于100mL无菌海水溶解，得包埋材料胶体；冷却至40℃，加入10mL复配菌株种子液混匀，得到原料混合物；将原料混合物通过造粒装置滴入质量浓度2％的氯化钙的饱和硼酸溶液中，搅拌，交联反应6h后，得固定化菌剂。
实施例2：
对聚乙烯醇进行改性时未加入二甲氧基乙烷，其余部分和实施例1完全一致。对实施例1和实施例2得到的改性聚乙烯醇利用傅里叶红外光谱进行接枝率测定，接枝率的测定结果见图2。
由图2可以看出实施例2中3,5-二羟基-3-甲基戊酸上的的接枝率几乎为0，而实施例1中3,5-二羟基-3-甲基戊酸的接枝率达到16.8％以上，这说明，在二甲氧基乙烷存在时，3,5-二羟基-3-甲基戊酸上的羧基与聚乙烯醇上的羟基成功发生酯化反应，引入两个羟基，且反应率较高，未加入二甲氧基乙烷时，3,5-二羟基-3-甲基戊酸几乎无法接枝到聚乙烯醇上。
实施例3：
未对聚乙烯醇进行改性，其余部分和实施例1完全一致。
实施例4：
未对聚乙烯醇进行改性，改性聚乙烯醇用量为8g，其余部分和实施例1完全一致。
实施例5：
未对聚乙烯醇进行改性，改性聚乙烯醇用量为8g，交联时间为18h，其余部分和实施例1完全一致。
实施例6：
一种提高枯草芽孢杆菌的表面活性剂产量的方法，包括：
将实验室中的枯草芽孢杆菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30℃120r/min条件下振荡培养2d，活化菌种；将活化好的菌株培养液按照10％(v/v)的接种量添加到含有2g/L原油的的驯化培养基中，在25℃120r/min条件下振荡培养3d，测定降解率；从中取出一些菌液作为种子菌液，按照3％(v/v)的接种量接种到另一个已灭菌的2g/L原油的驯化培养基中培养，如此重复，至降解率不再提高为止。
将驯化后枯草芽孢杆菌种子菌液按照3％(v/v)的接种量接种至4.0g/L原油的原油降解培养基中，在25℃120r/min条件下振荡培养。
实施例7：
原油降解培养基中加入0.2g/L 2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐，其余部分和实施例6完全一致。
实施例8：
固定化菌剂中未加入2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐，其余部分和实施例1完全一致。
实施例9：
固定化菌剂中未加入2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐，其余部分和实施例5完全一致。
试验例1：
spx基因和srfA基因的转录水平检测：分别取1mL实施例6、实施例7培养7d的枯草芽孢杆菌，采用Trizol法提取总RNA。总RNA经Quanti Nova Reverse Transcription Kit试剂盒反转录后，作为模板进行定量PCR实验。采用2-ΔΔCT法进行差异表达倍数的计算。以16SrRNA基因作为内参，对spx基因和srfA功能基因片段(srfA3)进行定量分析，qPCR体系为20μL，包括10μL Sso Fast EvaGreen Supermix,0.4μL上下游引物，1μL模板cDNA和8.2μLRNase-free H2O。qPCR程序如下：95℃预变性2min，95℃5s，60℃15s，40个循环。每一个定量的基因做三个技术平行。
16S rRNA基因引物：16S-F：GACTTGAATTCATAAGTTAC；16S-R：GTAACCGTTCGGATGAACACC；
spx基因引物：Sp-F：TTATTAGGATGAGGAGCTGTGAAAG；Sp-R：CAGCACCTAATCAGATCACCCAC；
srfA3基因引物：Sr-F：CATAAKCCGAKCAATCCACKTTGAG；Sr-R：TCATGRAATGGCAYAGCTTGATGC-3’。
表面活性剂产量测定：
分别取实施例6、实施例7培养7d的菌液，剩余原油通过石油醚萃取出来，50ml经8000×g，4℃离心10min，得到的上清液用6M HCl条调节至pH 2.0，并置于4℃放置过夜。所得溶液经10000×g，4℃离心20min，小心弃去上清并保留沉淀。向所得沉淀中加入5mL纯甲醇，超声萃取20min至沉淀充分溶解。采用超高效液相色谱(UPLC)对培养基中的surfactin进行定量分析。采用Waters BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm particle)进行液相分离，其余液相参数同上，紫外检测波长为205nm。配置不同浓度梯度的surfactin甲醇标准溶液，根据峰面积与浓度的变化，制作surfactin标准曲线。再根据插入法，由待测样品相应出峰时间的峰面积，计算surfactin含量。spx、srfA3基因的相对转录水平及surfactin含量的测定结果见图3。
由图3可以看出，实施例7的spx基因的相对转录水平明显低于实施例6，而实施例7的srfA3基因的相对转录水平及surfactin含量明显高于实施例6，这说明，加入2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐能够抑制spx基因的转录，减少对RNA聚合酶α亚基C端与ComA-P发生相互作用的蛋白域的占据，提高srfA基因的转录水平，促进surfactin的生成。
试验例2：
对实施例1、实施例3、实施例4、实施例5中采用的方法制备固定化微球的过程进行观测，观测结果见表1。
表1不同制备方法的成球性
组别 成球性
实施例1 成球性好
实施例3 不成球，成薄片状
实施例4 能成球，但形状不规则
实施例5 成球性好
分别取实施例1、实施例4、实施例5中制备得到的固定化菌剂进行机械强度、微生物活性、传质性进行测试。
机械强度：分别取2g固定化菌剂放入含有等量沙石的50mL无菌海水中,25℃，130r/min摇床振荡，12d后记录破碎颗数并按公式计算破碎率：
破碎率＝[(d1-d2)/d1]×100％
式中，d1为实验初始时细菌固定化微球数，d2为实验结束时细菌固定化微球数。
固定化菌剂中微生物的活性测试：随机取制备好的固定化菌剂5颗，测量体积后在已灭菌的培养皿中捣碎，转移到含50mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡并用超声仪超声60min，以使菌充分溶出，取1mL于含9mL无菌水的西林瓶中即为10-1，依次进行梯度稀释，取105、106、107的稀释液0.lmL涂布在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个梯度平行三次，分别于35℃恒温培养箱中培养2d后计算活菌数。
理论包埋菌浓度(cell/mL)＝5mL种子菌液总活菌数/固定化微球总体积
实际包埋菌浓度(cell/mL)＝5颗固定化颗粒中的活菌数/5颗固定化颗粒体积
固定化效率(％)＝实际包埋菌浓度/理论包埋菌浓度
传质性的测试：将20个大小相近的微球浸入红墨水中，每隔5min取出一个微球，切薄片，测定微球被红墨水渗透的厚度，直到红墨水将微球完全染色为止，用微球完全被红墨水渗透所需时间表示渗透率。渗透率越小，传质性越好。固定化菌剂的破碎率、固定化效率、渗透率的测定结果见图4。
扫描电镜分析：采用实施例8、实施例9中的方法制备无细菌的空白固定化微球，分别将制得的空白固定化微球用戊二醛固定两个小时，再用10％、30％、50％、70％、80％、90％、100％的乙醇分别脱水半小时，经醋酸异戊二酯溶液浸泡半小时，然后用二氧化碳临界点干燥法干燥，切片、喷金，在扫描电镜下观察微球切面的微观结构。空白固定化微球的扫描电镜图见图5。
由表1可以看出，与实施例1相比，实施例3无法成球；由图4可以看出，实施例4制备的固定化菌剂破碎率明显较高，而实施例1、实施例8制备的固定化菌剂的破碎率与实施例5、实施例9相比无明显差别且均较低，在3％以下，且实施例1的渗透率明显低于实施例5，实施例1的固定化效果明显高于实施5，由图5可以进一步看出，与实施例9相比，采用实施例8的方法制备的空白固定化微球内部的孔状结构较为疏松，这说明，用接枝3,5-二羟基-3-甲基戊酸的聚乙烯醇制备固定化菌剂时，两个羟基基团的存在提高了低浓度PVA在同质溶液内的分子间作用力，能够抵抗凝胶的自由流动，提高固定化微球内部交联聚合程度，同时在较短的交联反应时间内即可充分交联，具有较高的机械强度和成球性，并能够减少对细菌活性的损伤，且引入的疏水链及较低浓度的改性聚乙烯醇使得固定化菌体内部的孔状结构较为疏松，从而提高固定化效率、传质性能。
试验例3：
海洋溢油的模拟修复实验：
人工海水的配置：NaCl 24g，MgSO4·7H2O 7.0g，NH4NO3 1g，KCl 7g，KH2PO4 2.0g，Na2HPO4 3.0g，微量元素液5mL(1000mL蒸馏水)。其中，微量元素液：MgSO4·7H2O 2g，CuSO40.5g，MnSO4 0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，CuCl2 0.5g，水500mL。
使用规格为0.6m×0.3m×0.4m(长×宽×高)的无顶盖玻璃箱进行模拟实验，每个玻璃箱添加25L人工海水、5g/L风化的原油，分别使用实施例1、实施例5、实施例8、实施例9制备的固定化菌剂，以3％(v/v)的接种量添加到玻璃箱中。在干燥通风的室内温度为25℃条件下模拟，在模拟过程中每12h使用一次曝气装置，以维持水中的溶解氧，同时也为了模拟海洋的潮汐运动。实验模拟在9月份，进行了7d。
乳化性能的测定：使用BZY-2型表面张力仪测定液面的表面张力降低值。
原油降解率的测定：对培养7d后的模拟海洋溢油培养基中的全部原油进行萃取，萃取所用试剂为脱芳后的石油醚(60-90℃)，通过测定原油的最大吸光度来确定最适吸收波长为225nm，采用紫外分光光度计法测定吸光度，并由标准曲线计算出待测原油浓度。每个样品平行三次，同时做空白。降解率的计算：
原油降解率(％)＝[(空白浓度C0-样品浓度Cn)/空白浓度C0]×100％
表面张力降低值和原油降解率的测定结果见图6。
由图6可以看出，使用实施例1的固定化菌剂的表面张力降低值和原油降解率均明显高于实施例5、实施例8、实施例9，使用实施例5的固定化菌剂的表面张力降低值和原油降解率均明显高于实施例9，这说明，加入2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐能够提高对原油的乳化能力，进而提高对原油的降解率；使用实施例1的固定化菌剂的原油降解率明显高于实施例5、实施例8、实施例9，使用实施例8的固定化菌剂的原油降解率明显高于实施例9，这说明，用接枝3,5-二羟基-3-甲基戊酸的聚乙烯醇制备固定化菌剂时，能够提高固定化效率、传质性能，进而提高对原油的降解率。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 浙江省海洋水产养殖研究所
<120> 一种修复海洋溢油污染的固定化菌剂
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacttgaatt cataagttac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaaccgttc ggatgaacac c 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttattaggat gaggagctgt gaaag 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcacctaa tcagatcacc cac 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cataakccga kcaatccack ttgag 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcatgraatg gcayagcttg atgc 24

Claims (9)

1.2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐在提高枯草芽孢杆菌的生物表面活性剂产量中的用途。
2.一种改性聚乙烯醇，其特征在于，所述改性聚乙烯醇的制备方法包括：取聚乙烯醇加热搅拌至完全溶解，加入3,5-二羟基-3-甲基戊酸，加入二甲氧基乙烷，75-80℃恒温水浴，磁力搅拌4-6h后，透析，冷冻干燥，再55-60℃真空干燥。
3.一种固定化菌剂的制备方法，其特征在于：所述固定化菌剂的制备方法包括以下步骤：
S1、将权利要求2所述的改性聚乙烯醇、海藻酸钠、调节物质、活性炭灭菌后，在74-80℃恒温水浴下置于无菌海水溶解，得包埋材料胶体；
S2、冷却至38-41℃，加入步骤S1中所述包埋材料胶体的1/8-1/10体积的石油烃降解菌的种子菌液混匀，得到原料混合物；
S3、将步骤S2中所述原料混合物通过造粒装置滴入质量浓度2％的氯化钙的饱和硼酸溶液中，搅拌，交联反应5-8h后，得固定化菌剂；
所述步骤S1包埋材料胶体中改性聚乙烯醇的质量浓度为2-6％，海藻酸钠的质量浓度为2-3％，活性炭的质量浓度为0.5-0.7％。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述石油烃降解菌包括假交替单胞菌、枯草芽孢杆菌、副短短芽孢杆菌。。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中调节物质包括2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S1包埋材料胶体中2-(4-叔丁基-2,6-二甲基苄基)-2-咪唑啉盐酸盐的质量浓度为0.02-0.03％。
7.一种石油烃降解菌固定化菌剂，其特征在于：所述石油烃降解菌固定化菌剂采用权利要求3-6任一项中所述的固定化菌剂的制备方法进行制备。
8.权利要求7所述的固定化菌剂在修复海洋溢油污染中的用途。
9.3,5-二羟基-3-甲基戊酸、二甲氧基乙烷在提高固定化微球的传质性能中的用途，其特征在于：所述固定化微球的固定化载体材料包括聚乙烯醇。
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