CN114181928A - 一种用于海洋石油污染修复的固定化菌剂 - Google Patents

一种用于海洋石油污染修复的固定化菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于海洋石油污染修复的固定化菌剂，属于生物修复技术领域。本发明用于海洋石油污染修复的固定化菌剂，包括PVA、改性海藻酸钠和膨润土；其中改性海藻酸钠由烯丙胺盐酸盐改性。改性海藻酸钠的改性方法包括如下步骤：取海藻酸钠加入水，搅拌至完全溶解后加热；氮气保护下加入过硫酸铵，搅拌后降温；加入烯丙胺盐酸盐，加入后升温至反应；反应结束后调节pH，使用水透析后冻干即得改性海藻酸钠。改性海藻酸钠可以克服海藻酸钠机械强度较低的问题，使得固定化菌剂机械强度增加，耐久性提高。制得的固定化菌剂传质能力好、降解原油能力强。

Description

一种用于海洋石油污染修复的固定化菌剂
技术领域
本发明涉及生物修复技术领域，具体涉及一种用于海洋石油污染修复的固定化菌剂。
背景技术
由于石油在世界各地的分布和消费的不均及海运的低廉，各国之间的石油运输主要以海洋运输为主。勘探及开采技术的不断进步，海洋的石油资源因被世界各国所重视。因人为因素及自然灾害等原因导致海洋溢油事件频繁发生。当这些意外事件发生时，上万吨的原油进入了海洋环境，造成了巨大的生态破坏。
石油在成份和相态上都是极为复杂的混合物，其中烃类主要是烷烃、环烷烃和芳香烃等，此外还有各种含有氮、氧、硫的有机化合物和铁、镍、铜、钒等微量金属元素。使用生物处理的方法修复石油污染是一个热门研究领域。生物处理主要有生物促进和生物强化这两种方式。前者是向污染环境中施加营养来促进土著微生物的生长，后者是向污染环境中添加石油降解菌以达到修复的目的生物修复方法具有高效经济、低成本、无污染的优点，是生态可持续发展的必要修复手段。
使用固定化微生物制备处理环境污染的菌剂是一个新兴的研究方向。固定化微生物的制备方法主要有吸附法、包埋法、包络法、共价法和交联法等，吸附法的固定化操作简单，条件温和，而且载体可以再生；但是细胞与载体之间的结合力较弱，微生物容易脱落，因此应用中的稳定性不好。交联法的优点是可以获得很高的细胞密度，但由于缺乏良好的机械强度而不能得到广泛的应用。共价法固定化微生物稳定性好，不易脱落，但限制了其活性，同时反应激烈，操作与控制复杂苛刻。包埋法有较好的综合性能，催化活性保留和存活力都比较高，且包埋在反应工程（包括反应器的设计、操作稳定性等）中应用灵活，因此，包埋法是目前制备固定化微生物较为理想的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种传质能力好、降解原油能力强的用于海洋石油污染修复的固定化菌剂；本发明的另一个目的在于提供一种增强固定化菌剂机械强度的改性海藻酸钠。
为达到上述发明目的，采用如下技术方案。
本发明公开了一种用于海洋石油污染修复的固定化菌剂，包括PVA、改性海藻酸钠和膨润土；其中改性海藻酸钠由烯丙胺盐酸盐改性。
PVA具有抗降解、性能稳定的特点，而海藻酸钠具有易于成型，适合微生物生长的特点，加入膨润土使其具有一定的溶胀性，增加固定化菌剂的孔隙，有利于微生物的附着和繁殖；改性海藻酸钠可以克服海藻酸钠机械强度较低的问题，使得固定化菌剂机械强度增加，耐久性提高。
优选地，改性海藻酸钠的改性方法包括如下步骤：取海藻酸钠加入水，搅拌至完全溶解后加热；氮气保护下加入过硫酸铵，搅拌后降温；加入烯丙胺盐酸盐，加入后升温至反应；反应结束后调节pH，使用水透析后冻干即得改性海藻酸钠。
优选地，海藻酸钠与烯丙胺盐酸盐的重量比为1-5:0.5-5。
优选地，改性海藻酸钠的改性方法包括如下步骤：
按重量份计，取1-5份海藻酸钠加入10-100份水，搅拌至完全溶解后加热至55-70℃；氮气保护下加入0.1-5份过硫酸铵，搅拌10-20min后降温至0-2℃；缓慢加入0.5-5份烯丙胺盐酸盐，加入后升温至65-80℃反应1-5h；反应结束后调节pH至中性，使用水透析24-60h后冻干即得改性海藻酸钠。
优选地，固定化菌剂的制备方法包括如下步骤：
取PVA、改性海藻酸钠、海水高温灭菌，灭菌后冷却，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土和海水；再次冷却，加入菌悬液混匀；混匀后滴加入硼酸和氯化钙混合液中，持续搅拌后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
将改性海藻酸钠与膨润土共同使用时，还能提高固定化菌剂对原油的吸附能力，从而进一步减少石油污染。
优选地，菌悬液包括海杆菌属（Marinobacter）和分歧杆菌属（Mycobacterium）的细菌。
在海洋环境中，具有石油降解特性细菌种群十分丰富，海杆菌属的细菌具有使用正构烷烃作为碳源生长的能力；分歧杆菌属为土壤中降解原油的常见菌种，亦可用于海洋石油污染修复；将海杆菌属和分歧杆菌属的细菌共同培养时出现一定协同作用，使得菌种存活率增加。制备固定化菌剂时使用的硼酸对菌种毒性较大，影响菌种存活率，而同时使用海杆菌属和分歧杆菌属的细菌时，可以提高存活率。
更优选地，菌悬液包括海杆菌属的Marinobacter aromaticivorans和分歧杆菌属的Hyphomonas adhaerens。
优选地，菌悬液的浓度为108-109CFU/mL。
更优选地，Marinobacter aromaticivorans菌悬液和Hyphomonas adhaerens菌悬液的重量比为8-10:1。
更优选地，菌悬液的制备方法包括如下步骤：
取甘油保藏的菌种在培养基中活化后恒温扩大培养至OD630=1-1.3，之后稀释至108-109CFU/mL，4℃保存备用。
优选地，培养基的配方包括：
琼脂、原油、NaCl2、MgSO4·7H2O、NH4NO3、KCl、KH2PO4、Na2HPO4、去离子水、微量元素混合液(CaCl2、FeCl3·6H2O、CuSO4、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O)。
优选地，PVA、改性海藻酸钠、膨润土、海水的重量比为30-60:10-30:5-10:800-1200。
优选地，固定化菌剂的制备方法包括如下步骤：
按重量份计，取PVA 30-60份、改性海藻酸钠10-30份、膨润土5-10份、海水800-1200份121℃灭菌，灭菌后冷却至75-90℃，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土和海水；再次冷却至35-45℃，加入80-120份菌悬液混匀；混匀后使用蠕动泵将混合液滴加入含2-3%氯化钙的饱和硼酸混合液中，持续搅拌12-36h后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
更优选地，固定化菌剂中还添加有吲哚-3-甲酸甲酯。在固定化菌剂中添加吲哚-3-甲酸甲酯可以增加菌种的乳化活性，有利于对石油的降解；此外，吲哚-3-甲酸甲酯和改性海藻酸钠同时使用时可以进一步提高菌种的存活率。
优选地，固定化菌剂的制备方法包括如下步骤：
按重量份计，取PVA 30-60份、改性海藻酸钠10-30份、膨润土5-10份、吲哚-3-甲酸甲酯1-5份、海水800-1200份121℃灭菌，灭菌后冷却至75-90℃，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土、吲哚-3-甲酸甲酯和海水；再次冷却至35-45℃，加入80-120份菌悬液混匀；混匀后使用蠕动泵将混合液滴加入含2-3%氯化钙的饱和硼酸混合液中，持续搅拌12-36h后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
本发明还公开了改性海藻酸钠在提高固定化菌剂机械强度中的用途。
本发明还公开了固定化菌剂在提高菌种存活率和/或降解原油中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明使用PVA、改性海藻酸钠、膨润土和菌悬液制备固定化菌剂，实验中对原油的降解率最高可达99%以上。经过改性的海藻酸钠可以提高固定化菌剂的机械强度，使固定化菌剂耐磨损，实验中磨损率在10%以下；膨润土不仅可以提高固定化菌剂的传质性能，与改性海藻酸钠配合使用还能提高固定化菌剂对原油的吸附量，吸附原油的质量可达固定化菌剂自身的4倍。本发明固定化菌剂的制备过程中还可以添加吲哚-3-甲酸甲酯，共同使用-3-甲酸甲酯与改性海藻酸钠可以提高菌种的存活率，实验中存活率达到90%以上，减少制备过程中使用硼酸对菌体的影响。
附图说明
图1为固定化菌剂的电镜扫描照片。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验所用原油饱和烷烃、多环芳烃、胶质、沥青质含量分别为24.25%、24.4%、45.6%、6.1%。
实施例1
固定化菌剂的制备
1、海藻酸钠的改性
取1g海藻酸钠加入20g水，搅拌至完全溶解后加热至60℃；氮气保护下加入0.1g过硫酸铵，搅拌10min后降温至0℃；缓慢加入0.8g 烯丙胺盐酸盐，加入后升温至70℃反应2.5h；反应结束后调节pH至中性，使用水透析48h后冻干即得改性海藻酸钠。
2、菌悬液的配制
分别取甘油保藏的Marinobacter aromaticivorans（保藏号CGMCC111015）和Hyphomonas adhaerens（保藏号ATCC43965）在培养基中活化后，25℃恒温扩大培养至OD630=1.2，之后稀释至109CFU/mL，取90g Marinobacter aromaticivorans菌悬液和10gHyphomonas adhaerens菌悬液混匀后4℃保存备用。
3、固定化菌剂的制备
取PVA 40g、改性海藻酸钠20g、膨润土7.5g、海水1000g高温灭菌，灭菌后冷却至80℃，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土和海水；再次冷却至40℃，加入100g菌悬液混匀；混匀后使用蠕动泵将混合液滴加入含3%氯化钙的饱和硼酸混合液中，持续搅拌24h后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
实施例2
固定化菌剂的制备
本实施例与实施例1的不同之处在于：
3、固定化菌剂的制备
取PVA 40g、改性海藻酸钠20g、膨润土7.5g、吲哚-3-甲酸甲酯3.2g、海水1000g高温灭菌，灭菌后冷却至80℃，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土和海水；再次冷却至40℃，加入100g菌悬液混匀；混匀后使用蠕动泵将混合液滴加入含3%氯化钙的饱和硼酸混合液中，持续搅拌24h后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
实施例3
固定化菌剂的制备
本实施例与实施例1的不同之处在于，不添加膨润土。
实施例4
固定化菌剂的制备
本实施例与实施例2的不同之处在于，不添加膨润土。
实施例5
固定化菌剂的制备
1、海藻酸钠的改性
取1g海藻酸钠加入10g水，搅拌至完全溶解后加热至55℃；氮气保护下加入0.1g过硫酸铵，搅拌10min后降温至0℃；缓慢加入0.2g 烯丙胺盐酸盐，加入后升温至65℃反应1h；反应结束后调节pH至中性，使用水透析24h后冻干即得改性海藻酸钠。
2、菌悬液的配制
分别取甘油保藏的Marinobacter aromaticivorans和Hyphomonas adhaerens在培养基中活化后，25℃恒温扩大培养至OD630=1.2，之后稀释至109CFU/mL，取80gMarinobacter aromaticivorans菌悬液和10g Hyphomonas adhaerens菌悬液混匀后4℃保存备用。
3、固定化菌剂的制备
取PVA 30g、改性海藻酸钠10g、膨润土5g、海水800g高温灭菌，灭菌后冷却至75℃，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土和海水；再次冷却至35℃，加入90g菌悬液混匀；混匀后使用蠕动泵将混合液滴加入含2%氯化钙的饱和硼酸混合液中，持续搅拌12h后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
实施例6
固定化菌剂的制备
本实施例与实施例5的不同之处在于：
3、固定化菌剂的制备
取PVA 30g、改性海藻酸钠10g、膨润土5g、吲哚-3-甲酸甲酯1g、海水800g高温灭菌，灭菌后冷却至75℃，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土和海水；再次冷却至35℃，加入90g菌悬液混匀；混匀后使用蠕动泵将混合液滴加入含2%氯化钙的饱和硼酸混合液中，持续搅拌12h后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
实施例7
固定化菌剂的制备
本实施例与实施例5的不同之处在于，不添加膨润土。
实施例8
固定化菌剂的制备
本实施例与实施例6的不同之处在于，不添加膨润土。
实施例9
固定化菌剂的制备
1、海藻酸钠的改性
取5g海藻酸钠加入100g水，搅拌至完全溶解后加热至70℃；氮气保护下加入5g过硫酸铵，搅拌20min后降温至2℃；缓慢加入1g 烯丙胺盐酸盐，加入后升温至80℃反应5h；反应结束后调节pH至中性，使用水透析60h后冻干即得改性海藻酸钠。
2、菌悬液的配制
分别取甘油保藏的Marinobacter aromaticivorans和Hyphomonas adhaerens在培养基中活化后，25℃恒温扩大培养至OD630=1.2，之后稀释至109CFU/mL，取100gMarinobacter aromaticivorans菌悬液和10g Hyphomonas adhaerens菌悬液混匀后4℃保存备用。
3、固定化菌剂的制备
取PVA 60g、改性海藻酸钠30g、膨润土10g、海水1200g高温灭菌，灭菌后冷却至90℃，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土和海水；再次冷却至45℃，加入110g菌悬液混匀；混匀后使用蠕动泵将混合液滴加入含3%氯化钙的饱和硼酸混合液中，持续搅拌36h后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
实施例10
固定化菌剂的制备
本实施例与实施例9的不同之处在于：
3、固定化菌剂的制备
取PVA 60g、改性海藻酸钠30g、膨润土10g、吲哚-3-甲酸甲酯5g、海水1200g高温灭菌，灭菌后冷却至90℃，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土和海水；再次冷却至45℃，加入110g菌悬液混匀；混匀后使用蠕动泵将混合液滴加入含3%氯化钙的饱和硼酸混合液中，持续搅拌36h后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
实施例11
固定化菌剂的制备
本实施例与实施例9的不同之处在于，不添加膨润土。
实施例12
固定化菌剂的制备
本实施例与实施例10的不同之处在于，不添加膨润土。
对比例1
固定化菌剂的制备
本对比例与实施例1的区别在于，使用未改性海藻酸钠代替改性海藻酸钠。
对比例2
固定化菌剂的制备
本对比例与实施例2的区别在于，使用未改性海藻酸钠代替改性海藻酸钠。
对比例3
固定化菌剂的制备
本对比例与实施例3的区别在于，使用未改性海藻酸钠代替改性海藻酸钠。
对比例4
固定化菌剂的制备
本对比例与实施例4的区别在于，使用未改性海藻酸钠代替改性海藻酸钠。
试验例1
固定化菌剂物理性能测定
一、机械强度测定
测定实施例1-4以及对比例1-4中制得的固定化菌剂的机械强度，具体步骤如下：
分别取实施例1-4以及对比例1-4中制得的固定化菌剂3g，加入含有3g 40目砂石的海水中，室温下120rpm振荡14d，振荡后计算固定化菌剂的磨损率，计算公式如下：
磨损率（%）=（固定化菌剂初始重量-固定化菌剂最终重量）/固定化菌剂初始重量
测定结果如表1所示。
表1 固定化菌剂磨损率
磨损率（%）
实施例1 9.2
实施例2 9.7
实施例3 7.3
实施例4 7.6
对比例1 19.4
对比例2 19.2
对比例3 18.1
对比例4 18.3
由表1可知，实施例中制得的固定化菌剂的磨损率均小于对比例中制得的固定化菌剂，说明相比于使用未改性海藻酸钠制备固定化菌剂，使用改性海藻酸钠制备的固定化菌剂机械强度更高，更加耐用；分别对比实施例1-4可知，实施例3和4的磨损率小于实施例1和2，这可能是由于制备过程中膨润土的加入使固定化菌剂的机械强度略有下降。
二、传质性能测定
测定实施例1-4以及对比例1-4中制得的固定化菌剂的传质性能，具体步骤如下：
分别取实施例1-4以及对比例1-4中制得的固定化菌剂3g，加入含有2滴红墨水的海水中，室温下120rpm振荡3h，使用分光光度计测定406nm处的吸光度，吸光度越高，传质性能越差。
表2 传质性能测定结果
吸光度
实施例1 0.094
实施例2 0.095
实施例3 0.117
实施例4 0.115
对比例1 0.325
对比例2 0.351
对比例3 0.426
对比例4 0.474
由表2可知，分别对比各个实施例和各个对比例可知，实施例1、2制得的固定化菌剂的传质能力好于实施例3、4；对比例1、2制得的固定化菌剂的传质能力好于对比例3、4；说明过程中添加有膨润土的固定化菌剂的传质能力更强；对比实施例1-4和对比例1-4可知，制备过程中使用改性海藻酸钠的固定化菌剂的传质能力稍好于使用未改性海藻酸钠的固定化菌剂。
三、微观结构观察
使用扫描电镜对实施例1中制得的固定化菌剂进行观察，电镜照片如图1所示。
由图可知固定化菌剂表面有很多孔洞，较为疏松，有利于菌的附着和生长以及海水中物质向固定化菌剂内部的扩散。
四、原油吸附能力测定
为准确测定固定化菌剂的原油吸附能力，按照实施例1-4以及对比例1-4中制备固定化菌剂所使用的方法，制备不含菌的吸附小球1-8，对其原油吸附能力进行测定，具体步骤如下：
分别取3g吸附小球，加入由50mL海水和5mL柴油配制成的混合液中，室温下200rmp进行振荡；每隔15min取出部分固定化菌剂，使用正己烷萃取柴油，称重后计算吸附率，计算公式为：
吸附率（%）=萃取柴油质量/取样吸附小球质量×100%
测定结果如表3所示。
表3 吸附小球原油吸附能力
吸附小球 吸附率（%）
1 407.5
2 408.7
3 211.4
4 207.3
5 201.2
6 200.4
7 196.4
8 187.3
由表3可知，吸附小球1和2的吸附能力最强，大约能吸附自身4倍重量的柴油，吸附率明显高于吸附小球3和4；说明在制备过程中同时添加改性海藻酸钠和膨润土，能够大幅提高原油吸附能力。吸附小球5和6的吸附率与吸附小球7和8的吸附率接近；说明在制备过程中同时添加海藻酸钠和膨润土，并不能够大幅提高原油吸附能力，而同时添加改性海藻酸钠和膨润土，能够明显提高原油吸附能力。
试验例2
固定化菌剂菌体存活率测定
测定实施例1-4以及对比例1-4中制得的固定化菌剂的菌体存活率，具体步骤如下：
分别取实施例1-4以及对比例1-4中制得的固定化菌剂1g作为样品，在无菌条件下粉碎后加入100mL石油培养基，120rpm振荡10min后3000rpm离心，取上清100μL涂布在固态原油培养基上，室温下培养至单克隆菌落出现，对单克隆菌落进行计数；使用菌悬液为阳性对照，取100μL涂布在固态原油培养基上，室温下培养至单克隆出现，对单克隆菌落进行计数；计算菌体存活率，计算公式如下：
存活率（%）=样品单克隆菌落数/阳性对照单克隆菌落数×100%
其中固态原油培养基配方为：琼脂150g，原油10g，NaCl2 4g，MgSO4·7H2O 7g，NH4NO3 1g，KCl 0.7g，KH2PO4 2g， Na2HPO4 3g，去离子水1000 mL，pH 7.4，1×105 Pa灭菌30min。补加微量元素混合液(CaCl2 0.02 mg/L，FeCl3·6H2O 0.5mg/L，CuSO4 0.005mg/L，MnCl2·4H2O 0.005mg/L，ZnSO4·7H2O 0.1mg/L)。
测定结果如表4所示。
表4 固定化菌剂菌体存活率
存活率（%）
实施例1 82.2
实施例2 96.1
实施例3 81.7
实施例4 95.8
对比例1 73.5
对比例2 72.4
对比例3 72.6
对比例4 73.1
由表4可知，实施例中制得的固定化菌剂的菌体存活率均高于对比例中制得的固定化菌剂，说明使用改性海藻酸钠有利于菌体的存活；实施例2中制得的固定化菌剂的菌体存活率最高，其次是实施例4中的菌体存活率，说明制备固定化菌剂的过程中同时使用改性海藻酸钠和吲哚-3-甲酸甲酯有利于提高菌体存活率；而对比例2和4中制得的固定化菌剂的菌体存活率与对比例1和3差别不大，说明制备固定化菌剂的过程中同时使用海藻酸钠和吲哚-3-甲酸甲酯有对提高菌体存活率没有明显效果。
试验例3
固定化菌剂原油降解率测定
测定实施例1-4以及对比例1-4中制得的固定化菌剂的原油降解率，具体步骤如下：
分别取实施例1-4以及对比例1-4中制得的固定化菌剂1g，加入100mL石油培养基，室温下120rmp振荡14d；振荡结束后，6000rmp离心，取上清使用二氯甲烷洗涤萃取，萃取后取二氯甲烷相减压浓缩并称重，得出未降解原油的质量，计算原油降解率。计算公式如下：
原油降解率（%）=（添加原油质量-未降解原油的质量）/添加原油质量×100%。
其中原油培养基配方为：原油10g，NaCl2 4g，MgSO4·7H2O 7g，NH4NO3 1g，KCl0.7g，KH2PO4 2g， Na2HPO4 3g，去离子水1000 mL，pH 7.4，1×105 Pa灭菌30 min。补加微量元素混合液(CaCl2 0.02 mg/L，FeCl3·6H2O 0.5mg/L，CuSO4 0.005mg/L，MnCl2·4H2O0.005mg/L，ZnSO4·7H2O 0.1mg/L)。
测定结果如表5所示。
表5 固定化菌剂原油降解率
原油降解率（%）
实施例1 86.6
实施例2 99.4
实施例3 75.5
实施例4 89.7
对比例1 74.8
对比例2 77.5
对比例3 60.4
对比例4 64.2
由表5可知，实施例的原油降解率普遍好于对比例；实施例2的原油降解率大于实施例1，实施例4的原油降解率大于实施例3，并且二者降解率提高幅度较大；而对比例2的原油降解率大于对比例1，对比例4的原油降解率大于对比例3，二者降解率提高幅度较小；说明吲哚-3-甲酸甲酯的加入提高了原油降解率，这可能是由于吲哚-3-甲酸甲酯的加入提高了菌的乳化活性；并且改性海藻酸钠与吲哚-3-甲酸甲酯共同使用提高了菌体存活率，因此实施例中的原油降解率提高幅度较大。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于海洋石油污染修复的固定化菌剂，包括PVA、改性海藻酸钠和膨润土；其中改性海藻酸钠为聚烯丙胺盐酸盐改性海藻酸钠。
2.如权利要求1所述的固定化菌剂，其特征在于，所述改性海藻酸钠的改性方法包括如下步骤：取海藻酸钠加入水，搅拌至完全溶解后加热；氮气保护下加入过硫酸铵，搅拌后降温；加入烯丙胺盐酸盐，加入后升温至反应；反应结束后调节pH，使用水透析后冻干即得改性海藻酸钠。
3.如权利要求2所述的固定化菌剂，其特征在于，所述海藻酸钠与烯丙胺盐酸盐的重量比为1-5:0.5-5。
4.如权利要求1所述的固定化菌剂，其特征在于，所述固定化菌剂的制备方法包括如下步骤：取PVA、改性海藻酸钠、海水高温灭菌，灭菌后冷却，混合PVA、改性海藻酸钠、膨润土和海水；再次冷却，加入菌悬液混匀；混匀后滴加入硼酸和氯化钙混合液中，持续搅拌后过滤出微球，洗涤即得固定化菌剂。
5.如权利要求1所述的固定化菌剂，其特征在于，所述菌悬液包括海杆菌属和分歧杆菌属的细菌。
6.如权利要求1所述的固定化菌剂，其特征在于，所述菌悬液的浓度为108-109CFU/mL。
7.如权利要求1所述的固定化菌剂，其特征在于，所述PVA、改性海藻酸钠、膨润土、海水的重量比为30-60:10-30:5-10:800-1200。
8.权利要求1中所述的改性海藻酸钠在提高固定化菌剂机械强度中的用途。
9.权利要求1中所述的固定化菌剂在提高菌种耐热性和/或降解原油中的用途。
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