CN111518771A - 共表达抗CD19嵌合抗原受体和Nur77抑制分子的转基因淋巴细胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种转基因淋巴细胞、一种构建体和一种治疗癌症的治疗组合物，该转基因淋巴细胞的细胞Nur77被沉默以及表达嵌合抗原受体。其中，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原CD19；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括CD28的胞内段以及CD3ζ链。该转基因淋巴细胞具有耐受能力强的特性，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其高表达CD19的肿瘤具有显著的定向杀伤作用。

Description

共表达抗CD19嵌合抗原受体和Nur77抑制分子的转基因淋巴 细胞及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种T淋巴细胞、一种慢病毒、一种转基因淋巴细胞、一种构建体和一种用于治疗癌症的治疗组合物。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)是指将识别肿瘤相关抗原(tumor associatedantigen,TAA)的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immune receptortyrosine-based activation motifs,ITAM,通常为CD3ζ或FcεRIγ)”在体外进行基因重组,生成重组质粒,再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞,使患者T细胞表达肿瘤抗原受体,转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞CAR T细胞在体内、外都具有对特定肿瘤抗原高度亲和性及对抗原负载细胞高效杀伤特性。CAR T细胞技术在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中均显示出良好的抗肿瘤效应。

使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞(CART)疗法上的近来进展提示，在利用免疫系统治疗B细胞恶性病和其它癌症方面显示出强大作用，其中所述CAR T疗法依赖于将T细胞重新定向于癌细胞例如B细胞恶性病上的合适细胞表面分子。鼠源CART19(即“CTL019”)的临床结果已经表现出有希望在罹患CLL的患者和儿童ALL中建立完全缓解。除了在遗传修饰T细胞上的嵌合抗原受体能够识别和破坏所靶向的细胞外，成功的治疗性T细胞疗法还需要具有增殖和长时间维持的能力、以及监控白血病细胞逃逸的能力。

但是，在目前CAR T生物治疗的临床研究也发现，T细胞的变异性质(无论这是无能(anergy)、抑制或是耗竭的结果)对CAR转化的T细胞的性能产生影响，而对此影响，本领域技术人员在目前可以施予的控制是有限的。

目前，减少CAR T细胞的耗竭是CAR T临床研究和治疗中亟待解决的重要问题。

发明内容

Nur77是孤儿核受体超家族的成员之一，作为转录因子参与了包括细胞增殖、分化、凋亡以及代谢和炎症等多种生物学调控过程。已有研究证实减少Nur77表达可以减少T细胞耐受。据此，发明人提出了一种提高CAR转化的患者T细胞持续存在并维持响应于CAR抗原的可能的解决办法，即在向T细胞转染抗CD19的嵌合抗原受体的同时也敲低T细胞中的Nur77的表达，以此减少T细胞耗竭，提高抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对肿瘤的抑制杀伤作用。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种T淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述T淋巴细胞的Nur77被沉默；以及表达嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原CD19；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括CD28的胞内段以及CD3ζ链。根据本发明的实施例，本发明实施例的T淋巴细胞具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，耐受性显著提高，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达CD19的肿瘤细胞具有显著的定向杀伤作用。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带下列核酸分子：编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带下列核酸分子：沉默Nur77的核酸分子，所述沉默Nur77的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQ ID NO：3～6的至少之一，优选，所述沉默Nur77的核酸分子的核苷酸序列为SEQ IDNO：3所示。

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：1)。

ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO：2)。

CCCGGCTCCTTCAAGTTCGAGGACTTGAATTCAAGTCCTCGAACTTGAAGGAGTT TTT(SEQ IDNO：3)。

CCCGGGATTGACAGTATCCTGGCCTTGAATTCAAGGCCAGGATACTGTCAATCTTTTT(SEQ ID NO：4)。

CCCGGTGGTGAAGGAAGTTGTCCGAAGAATTCTTCGGACAACTTCCTTCACCATTTTT(SEQ ID NO：5)。

CCCGGGCTACACAGGAGAGTTTGACAGAATTCTGTCAAACTCTCCTGTGTAGCTTTTT(SEQ ID NO：6)。

发明人发现，携带具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的慢病毒导入淋巴细胞后，对Nur77沉默效果更佳。

根据本发明的实施例，将本发明的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，耐受能力显著增强，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达CD19的肿瘤细胞具有显著的定向杀伤作用。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带含有SEQ ID NO：7或8所示的核苷酸序列。

表达CD19 CAR的核酸的核苷酸序列：

ttggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgatgtcgacgataagctttgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgggaattggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggaatttcgacatttaaatttaattaatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttccgatcacgagactagcctcgaggtttaaacgaattcatgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcactagtaaaattgtcgctcctgtcaaacaaactc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ID NO:7)

沉默Nur77的核酸的核苷酸序列：

gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttagtaccgggcccgctctagagatccgacgcgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataacttcgtatagcatacattatacgaagttatacatgtcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgttaaccccggctccttcaagttcgaggacttgaattcaagtcctcgaacttgaaggagtttttctcgagtactaggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaagaattcgtcgagggacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatacatgtttaagggttccggttccactaggtacaattcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgataccgtcgacctcgatcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggc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ID NO:8)。

发明人发现，将沉默Nur77的核酸分子和过表达CD19 CAR的核酸分子构建在一个慢病毒载体上，慢病毒包装效率会显著降低。根据本发明的实施例，沉默Nur77的载体用来表达shRNA的慢病毒载体pSicoR(SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列为携带shRNA的慢病毒载体pSicoR序列)，而表达CD19 CAR的载体是用于目的基因过表达的慢病毒载体pWPXLd(SEQID NO:7所示的核苷酸序列为携带表达CD19 CAR核酸的慢病毒载体pSicoR序列)，分别包装慢病毒后，同时感染T细胞，再筛选双阳性的T细胞，双阳性率可以达到70％以上。

根据本发明的实施例，将本发明的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，耐受能力显著增强，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强，尤其对高表达CD19的肿瘤细胞具有显著的定向杀伤作用。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述淋巴细胞Nur77被沉默；以及表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体能够与肿瘤抗原特异性结合；跨膜区；以及胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段，其中，所述抗体为单链抗体，所述肿瘤抗原为CD19。发明人惊奇的发现，细胞Nur77被沉默和表达抗CD19的嵌合抗原受体的淋巴细胞的耐受能力以及在肿瘤病人体内的对肿瘤细胞的特异性杀伤能力大大提高，尤其对高表达CD19的肿瘤细胞具有显著的定向杀伤作用。

根据本发明的实施例，上述转基因淋巴细胞还可以具有下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述淋巴细胞细胞表面Nur77被沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR和锌指核酸酶至少之一实现的。根据本发明的实施例，本发明实施例的淋巴细胞的Nur77的成功沉默，可显著提高本发明实施例的淋巴细胞耐受性，进一步提高了转基因淋巴细胞对肿瘤细胞的定向杀伤作用。

根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。本发明实施例的免疫共刺激分子胞内段的表达以及细胞Nur77的沉默的联合，使得本发明实施例的转基因淋巴细胞的耐受能力以及对肿瘤的定向杀伤作用更加显著。

根据本发明的实施例，所述淋巴细胞细胞Nur77被沉默是通过shRNA实现的。本发明实施例的shRNA具有高效、特异性的沉默Nur77的作用，Nur77的成功沉默，使得本发明实施例的转基因淋巴细胞在肿瘤病人体内的耐受能力得到进一步提高，配合嵌合抗原受体的抗原靶向性，使得本发明实施例的转基因淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤作用效果更加显著。

根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB或CD28的胞内段。本发明中的转基因淋巴细胞的嵌合抗原受体的免疫共刺激分子胞内段是CD28或者4-1BB的胞内段。根据本发明的实施例，免疫共刺激分子胞内段是CD28或者4-1BB的胞内段，进一步增强了本发明实施例的转基因淋巴细胞的定向杀伤作用。

根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是CD3⁺T淋巴细胞或自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞。本发明实施例的上述淋巴细胞的细胞Nur77被沉默，同时表达抗原特异性的嵌合抗原受体，如本发明的实施例的CD19抗原特异性的嵌合抗原受体，上述淋巴细胞的细胞免疫杀伤作用的靶向性更强，在肿瘤病人体内的耐受得到进一步提高，对肿瘤的定向杀伤作用效果更加显著。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子沉默Nur77。其中，所述嵌合抗原受体如前所述。根据本发明的实施例，本发明实施例的构建体成功导入本发明实施例的淋巴细胞后，可有效沉默细胞Nur77和表达抗原特异性的嵌合抗原受体，从而本发明实施例的淋巴细胞对肿瘤细胞，尤其是高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤作用更加显著。

根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，其特征在于所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置在前面所述的淋巴细胞中沉默细胞Nur77和表达所述嵌合抗原受体。根据本发明的实施例，成功设置了上述第一核酸分子以及第二核酸分子的淋巴细胞，其淋巴细胞的Nur77被成功沉默，同时在淋巴细胞表面成功表达了抗原特异性嵌合抗原受体，如本发明实施例的CD19特异性的嵌合抗原受体，其具有杀伤力更强和特异性更强的肿瘤杀伤效果。

根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。根据本发明的实施例，第一启动子以及第二启动子的引入，使得第一核酸分子以及第二核酸分子分别独立的表达，有效保证了嵌合抗原受体抗原靶向性的生物学作用及以有效沉默了Nur77，使得本发明实施例的淋巴细胞的靶向作用更强，对肿瘤的杀伤作用，尤其对高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤更加显著。

根据本发明的实施例，所述第一启动子、所述第二启动子分别独立地选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR，RSV启动子。根据本发明的实施例，本发明实施例的上述启动子具有启动效率高、特异性强的特点，从而保证了细胞Nur77的高效沉默和嵌合抗原受体的高效表达，从而本发明实施例的淋巴细胞的耐受和生存能力大大提高，对肿瘤的定向杀伤效果更加显著。

根据本发明的实施例，所述构建体的载体是非致病性病毒载体。非致病性病毒载体的引入大大提高了构建体在淋巴细胞中的复制和扩增效率，从而大大提高了细胞Nur77的沉默和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达，使得淋巴细胞耐受和生存能力大大提高，淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。

根据本发明的实施例，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中，病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，其基因组既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，从而可实现广谱而高效的感染效率，细胞Nur77高效沉默和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达，使得本发明实施例的淋巴细胞的耐受和生存能力大大提高，淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞，尤其对高表达CD19的肿瘤细胞的定向杀伤作用更加显著。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种制备前面所述的T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。所述构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中，实现了淋巴细胞的细胞Nur77被沉默和嵌合抗原受体的表达，从而本发明实施例的制备方法制备的转基因淋巴细胞或T淋巴细胞在肿瘤病人体内和体外的存活能力大大提高，转基因淋巴细胞或T淋巴细胞对肿瘤细胞，尤其是对高表达CD19的肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。

在本发明的第八方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述治疗组合物包括：上述构建体、慢病毒、T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现转基因淋巴细胞或T淋巴细胞的Nur77的沉默和嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，从而使得所得转基因淋巴细胞或T淋巴细胞具有显著的抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制，在肿瘤病人体外和体内的耐受和存活能力大大提高，转基因淋巴细胞或T淋巴细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强，本发明实施例的治疗癌症的治疗组合物对肿瘤细胞的靶向杀伤作用显著增强，尤其是对高表达CD19的肿瘤细胞的靶向杀伤作用显著增强。

根据本发明的实施例，上述治疗组合物还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述癌症包括选自造血系统恶性肿瘤和淋巴瘤的至少之一。上述肿瘤细胞具有CD19的特异性高表达，本发明实施例的治疗组合物可使淋巴细胞细胞Nur77的沉默和高效表达抗原特异性嵌合抗原受体，如本发明实施例的CD19抗原特异性嵌合抗原受体，在肿瘤的微环境中的存活能力大大提高，所得淋巴细胞或T淋巴细胞对高表达CD19的肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。

附图说明

图1是根据本发明实施例的Nur77 KD慢病毒的筛选实验结果图；

图2是根据本发明实施例的T细胞转染慢病毒后的GFP和Cherry阳性率示意图；

图3是根据本发明实施例的Nur77敲低的CD19 CAR T细胞与CD19 CAR T细胞中Nur77表达水平对比试验图；

图4是根据本发明实施例的Nur77 KD CD19 CAR T与对照组体外杀伤白血病细胞对比试验图；以及

图5是根据本发明实施例的Nur77 KD CD19 CAR T细胞组与对照组体内抑制白血病细胞效果对比图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

已有研究证实减少Nur77表达可以减少T细胞耐受。据此，我们提出一种提高CAR转化的患者T细胞持续存在并维持响应于CAR抗原的可能的解决办法，即在向T细胞转染CD19抗原同时也敲低T细胞中的Nur77的表达,减少T细胞耗竭，提高抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对肿瘤的抑制杀伤作用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，本发明公开的一种检测抗CD19的嵌合抗原受体T细胞对白血病细胞抑制作用的方法，包括如下步骤，(1)采用PEI法制备Nur77敲低的CD19嵌合抗原受体T细胞；(2)检查Nur77敲低的CD19嵌合抗原受体T细胞(Nur77KDCD19 CAR T)中Nur77的敲除效率及这种CAR T细胞的体外扩增水平；(3)将Nur77敲低的CD19嵌合抗原受体T细胞与白血病细胞按一定比例混合检测这种CAR T细胞的体外杀伤肿瘤的作用；(4)将Nur77敲低的CD19嵌合抗原受体T细胞植入荷瘤免疫缺陷小鼠中，通过流式细胞仪检测小鼠外周血中肿瘤细胞和CAR T细胞的比例。本发明的优点在于以抗CD19的嵌合抗原受体T细胞基础，进一步敲低Nur77基因的表达，减少T细胞的耗竭，促进CAR T细胞对肿瘤的抑制和杀伤作用。制备方法简单易行，检测手段准确高效，肿瘤杀伤结果切实可靠。

本专利采用PEI法制备Nur77敲低的CD19嵌合抗原受体T细胞(Nur77 KD CD19 CART)。制备方法如下：

(1)Nur77 KD和CD19慢病毒的制备：通过293T细胞包装慢病毒，具体操作如下：①用DMEM高糖培养基加10％FBS和1％双抗培养293T细胞至100mm培养皿，待293T细胞密度达80-90％时，换成DMEM高糖培养基加1％FBS和1％双抗培养2-6h后，用PEI将pWPXLd-CAR19-EGFP或pSicoR-Nur77 KD-Cherry或对照质粒pSicoR-Me-Cherry、pMD2.G和psPAX2三个质粒转化293T细胞，每个100mm培养皿转化5μg的pWPXLd-CAR19-EGFP或对照质粒pWPXLd-EGFP，1.25μg的pMD2.G和3.75μg的psPAX2，PEI为30ug；②转化后的48h和72h收集两次次上清，上清经500g离心后，通过0.45μm过滤器过滤后分别得到Nur77 KD-Cherry，CD19-GFP和对照病毒，收集备用；

(2)T细胞的分离纯化：通过Ficoll密度梯度法分离出血液中的单个核细胞。具体方法如下：将抽取人的新鲜静脉血液按照1:1用PBS稀释后与Ficoll按照3:1的比例加入45ml离心管中，500g,4℃，离心20min.小心收集中间细胞层，得到外周血单个核细胞。

(3)T细胞的活化增殖：①预先包被抗CD3 OKT-3和CD28抗体：用PBS将抗CD3和CD28抗体稀释成1μg/ml和1μg/ml，加入48孔板中，每孔0.3ml，4℃冰箱包被8h；②T细胞用含10％FBS和1％双抗的RPMI-1640培养基稀释至5x10⁶个/ml，将48孔板中的包被液吸掉，加入每孔1ml的含T细胞培养基，③将T细胞在37℃，5％CO2培养箱中刺激。

(4)T细胞的慢病毒转染：在T细胞刺激48h后，进行第一次感染，即小心吸除上清0.5ml,换上含8μg/ml polybrene的CD19-GFP和Nur77 KD-Cherry的慢病毒液，或者对照组加入CD19-GFP和Me-Cherry的慢病毒液。根据慢病毒滴度，MOI设为10。37℃，5％CO2培养箱培养6h后，换上新鲜的含300IU/mlIL-2的RPMI-1640培养基，37℃，5％CO2培养箱培养12h后，进行第二、三次感染。通过流式细胞仪检测GFP和Cherry呈双阳性，即说明得到了表达抗CD19且Nur77敲低的嵌合抗原受体T细胞。

进一步的，步骤(4)所制备Nur77敲低的CD19嵌合抗原受体T细胞(Nur77 KDCD19CAR T)中Nurr77的敲除效率可通过加入PMA和离子霉素(ionomycine)刺激CAR T细胞后检测细胞中Nur77的表达水平。具体如下，CAR T细胞计数后，向细胞培养液中加入PMA和离子霉素(ionomycine)在37℃，5％CO2培养箱中刺激3h，收集细胞并固定，细胞膜穿孔后，用Nur77抗体染色后，流式细胞仪检测Nur77 KD CD19 CAR T和CD19 CAR T中Nur77的表达水平。

进一步的，具有一定Nurr77的敲除效率的Nur77 KD CD19 CAR T细胞还可以在体外进行扩增：将40Gy辐照后的外周血单个核细胞与CAR T细胞按照100:1比例混合，加入含有30ng/ml OKT3 anti-CD3 antibody和3000IU/ml IL-2的RPMI-1640培养基，放入37℃，5％CO2培养箱培养。每2天进行一次半定量换液。通过该法可在5天内得到扩增100倍的CART细胞。

进一步的，可以检查Nur77 KD CD19 CAR T细胞体外肿瘤杀伤作用：这里所指的肿瘤细胞是指人急性淋巴细胞系白血病细胞株Nalm6。

进一步的，Nur77 KD CD19 CAR T细胞体外肿瘤杀伤作用具体方法如下：将Nur77KD CD19 CAR T和K19 CAR T两种CAR T细胞与Nalm6分别按照比例(21，20，2-1，2-2，2-3，2-4，2-5)混合，加入RPMI-1640培养基，放入37℃，5％CO2培养箱培养18h后，检测剩余Nalm6细胞的数量，比较两种CAR T细胞在体外肿瘤杀伤作用的差异。可见，当CAR T细胞与肿瘤细胞比例为21，20两种CAR T细胞具有较好的杀伤效果，肿瘤细胞数量减少在80％以上。当CAR T细胞与肿瘤细胞比例低于2^-3时两种CAR T细胞杀伤作用出现差异，其中当肿瘤细胞杀伤为50％时K19 CAR T与肿瘤细胞比例为2^-4而相同效应Nur77KD CD19 CAR T的只需要K19 CART的1/10。由此可以证明Nur77敲低的CD19 CAR T细胞在体外杀伤肿瘤细胞中比一般的CD19CAR T具有优势，尤其在肿瘤细胞多于CAR T细胞1000倍以上时，Nur77 KD CD19 CAR T的杀伤作用强于CD19 CAR T细胞。

进一步的，可以检查Nur77 KD CD19 CAR T细胞体内肿瘤杀伤作用：本专利使用的肿瘤模型动物为NOD-SCID小鼠，该种小鼠为一种免疫缺陷鼠，自身没有B、T细胞，存在NK细胞缺陷。所用的肿瘤细胞为人急性淋巴细胞系白血病细胞株Nalm6。

进一步的，Nur77 KD CD19 CAR T细胞体内肿瘤杀伤作用具体方法如下：给6周龄体重25±2g的NOD-SCID小鼠通过尾静脉注射肿瘤细胞2×10⁶个细胞/只，并将小鼠平均分为三组技，PBS对照组，Nur77 KD CD19 CAR T治疗组和K19 CAR T治疗组，各组称重。注射肿瘤后的第二天和第三天给小鼠分别尾静脉注射Nur77 KD CD19 CAR T和K19 CAR T细胞2×10⁶个细胞/只，对照组给予等体积PBS。小鼠肿瘤注射后每2天给各组小鼠称重，观察小鼠存活情况。

进一步的，当小鼠体重下降20％或肿瘤注射45后摘眼球取血并处死小鼠取出骨髓和脾脏，检测各组小鼠血液、脾脏和骨髓的肿瘤细胞和CAR T细胞的差异。

本发明采用上述方法获得由此可见，CD19 CAR T细胞敲低Nur77后体现出更好的体内外抑制肿瘤生长和杀死肿瘤的作用。由此可见我们制备的Nur77敲低的CD19嵌合抗原受体T细胞具有较好的生物治疗意义。

综上，本发明的有益效果：敲低抗CD19的嵌合抗原受体T细胞的Nur77有效提高抗CD19的嵌合抗原受体T细胞体内外抑制杀伤肿瘤的作用，并且Nur77敲低的抗CD19的嵌合抗原受体T细胞制备方法简单易行，质量可控，并且在体外可以进行大量扩增，能够达到临床使用数量。综上，本发明可为CAR T细胞免疫治疗提供新的思路，为CAR T临床治疗中的细胞耐受提供了新的可能性，是一种高效可控的CAR T细胞。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 敲除Nur77的CD19 CAR T(Nur77 KD CD19 CAR T)的制备

包括如下步骤:

(1)Nur77 KD慢病毒的筛选：通过293T细胞包装慢病毒，具体操作如下：①用DMEM高糖培养基加10％FBS和1％双抗培养293T细胞至100mm培养皿，待293T细胞密度达80-90％时，换成DMEM高糖培养基加1％FBS和1％双抗培养2-6h后，用PEI将pSicoR-Nur77 KD-Cherry(Nur77 KD的shRNA序列如SEQ ID NO:3～6所示，依次命名为Nur77 KD-1，Nur77 KD-2，Nur77 KD-3，Nur77 KD-4)或对照质粒pSicoR-Me-Cherry(命名为con)三个质粒转化293T细胞，每个100mm培养皿转化5μg的pSicoR-Me-Cherry或对照质粒pSicoR-Me-Cherry，1.25μg的pMD2.G和3.75μg的psPAX2，PEI为30ug；②转化后的48h和72h收集两次次上清，上清经500g离心后，通过0.45μm过滤器过滤后分别得到Nur77 KD-Cherry和对照病毒，收集去转染T细胞，发现SEQ ID NO：3所示的Nur77KD(Nur77 KD-1)的shRNA在沉默靶基因Nur77上效果最优，结果如图1所示)；

(2)Nur77 KD和CD19慢病毒的制备：通过293T细胞包装慢病毒，具体操作如下：①用DMEM高糖培养基加10％FBS和1％双抗培养293T细胞至100mm培养皿，待293T细胞密度达80-90％时，换成DMEM高糖培养基加1％FBS和1％双抗培养2-6h后，用PEI将pWPXLd-CAR19-EGFP或pSicoR-Nur77 KD-Cherry(Nur77 KD的shRNA序列如SEQ ID NO:3所示)或对照质粒pSicoR-Me-Cherry、pMD2.G和psPAX2三个质粒转化293T细胞，每个100mm培养皿转化5μg的pWPXLd-CAR19-EGFP或对照质粒pWPXLd-EGFP，1.25μg的pMD2.G和3.75μg的psPAX2，PEI为30ug；②转化后的48h和72h收集两次次上清，上清经500g离心后，通过0.45μm过滤器过滤后分别得到Nur77 KD-Cherry，CD19-GFP和对照病毒，收集备用；

(3)T细胞的分离纯化：通过Ficoll密度梯度法分离出血液中的单个核细胞。具体方法如下：将抽取人的新鲜静脉血液按照1:1用PBS稀释后与Ficoll按照3:1的比例加入45ml离心管中，500g,4℃，离心20min.小心收集中间细胞层，得到外周血单个核细胞。

(4)T细胞的活化增殖：①预先包被抗CD3 OKT-3和CD28抗体：用PBS将抗CD3和CD28抗体稀释成1μg/ml和1μg/ml，加入48孔板中，每孔0.3ml，4℃冰箱包被8h；②T细胞用含10％FBS和1％双抗的RPMI-1640培养基稀释至5x10⁶个/ml，将48孔板中的包被液吸掉，加入每孔1ml的含T细胞培养基，③将T细胞在37℃，5％CO2培养箱中刺激。

(5)T细胞的慢病毒转染：在T细胞刺激48h后，进行第一次感染，即小心吸除上清0.5ml,换上含8μg/ml polybrene的CD19-GFP和Nur77 KD-Cherry的慢病毒液，或者对照组加入CD19-GFP和Me-Cherry的慢病毒液。根据慢病毒滴度，MOI设为10。37℃，5％CO2培养箱培养6h后，换上新鲜的含300IU/mlIL-2的RPMI-1640培养基，37℃，5％CO2培养箱培养12h后，进行第二、三次感染。最后，通过流式细胞仪检测GFP和Cherry双阳性表示该T细胞仅能够表达CD19抗原的同时又有Nur77的敲低，见图2，Nur77 KD CD19 CAR T细胞占有比例为71.1％。

进一步的，步骤(5)所制备Nur77敲低的CD19嵌合抗原受体T细胞(Nur77 KDCD19CAR T)中Nurr77的敲除效率可通过加入PMA和离子霉素(ionomycine)刺激CAR T细胞后检测细胞中Nur77的表达水平。具体如下，CAR T细胞计数后，向细胞培养液中加入PMA和离子霉素(ionomycine)在37℃，5％CO2培养箱中刺激3h，收集细胞并固定，细胞膜穿孔后，用Nur77抗体染色后，流式细胞仪检测Nur77 KD CD19 CAR T和CD19 CAR T中Nur77的表达水平。由图3可知，Nur77的敲除效率可以达到29.2％。

进一步的，具有一定Nurr77的敲除效率的Nur77 KD CD19 CAR T细胞还可以在体外进行扩增：将40Gy辐照后的外周血单个核细胞与CAR T细胞按照100:1比例混合，加入含有30ng/ml OKT3 anti-CD3 antibody和3000IU/ml IL-2的RPMI-1640培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱培养。每2天进行一次半定量换液。通过该法可在5天内得到扩增100倍的CART细胞。

实施例2 Nur77敲低的抗CD19 CAR T细胞体外肿瘤杀伤

本实施例以人急性淋巴细胞系白血病细胞株Nalm6为例。具体步骤如下：

将Nur77 KD CD19 CAR T和CD19 CAR T两种CAR T细胞与Nalm6分别按照比例(2¹，2⁰，2^-1，2^-2，2^-3，2^-4，2^-5)混合，加入RPMI-1640培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱培养18h后，检测剩余Nalm6细胞的数量，比较两种CAR T细胞在体外肿瘤杀伤作用的差异。图4可见，当CART细胞与肿瘤细胞比例为2¹，2⁰两种CAR T细胞具有较好的杀伤效果，肿瘤细胞数量减少在80％以上。当肿瘤细胞杀伤为50％时CD19 CAR T与肿瘤细胞比例为2-1而相同效应Nur77KD CD19 CAR T的只需要CD19 CAR T的1/10。由此可以证明Nur77敲低的CD19 CAR T细胞在体外杀伤肿瘤细胞中比一般的CD19 CAR T具有优势，尤其在肿瘤细胞多于CAR T细胞100倍以上时，Nur77 KD CD19 CAR T的杀伤作用强于CD19CAR T细胞。

实施例3 Nur77敲低的抗CD19 CAR T细胞体内肿瘤杀伤

本实施例以人急性淋巴细胞系白血病细胞株Nalm6为例。使用的肿瘤模型动物为NOD-SCID小鼠，该种小鼠为一种免疫缺陷鼠，自身没有B、T细胞，存在NK细胞缺陷。具体实施步骤如下，给6周龄体重25±2g的NOD-SCID小鼠通过尾静脉注射肿瘤细胞2×10⁶个细胞/只，并将小鼠平均分为三组技，PBS对照组，Nur77 KD CD19 CAR T治疗组和CD19 CAR T治疗组，各组称重。注射肿瘤后的第二天和第三天给小鼠分别尾静脉注射Nur77 KD CD19 CAR T和CD19 CAR T细胞2×10⁶个细胞/只，对照组给予等体积PBS。小鼠肿瘤注射后每2天给各组小鼠称重，观察小鼠存活情况。当小鼠体重下降20％或肿瘤注射45后摘眼球取血并处死小鼠取出骨髓和脾脏，检测各组小鼠血液、脾脏和骨髓的肿瘤细胞和CAR T细胞的差异。

本发明采用上述方法获得由此可见，CD19 CAR T细胞在敲低Nur77后体现出更好的体内外抑制肿瘤生长和杀死肿瘤的作用。结果如图5所示。由此可见我们制备的Nur77敲低后的CD19嵌合抗原受体T细胞具有较好的生物治疗意义。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江帝格生物科技有限责任公司

<120> 共表达抗CD19嵌合抗原受体和Nur77抑制分子的转基因淋巴细胞及其用途

<130> PIDC3195870

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 489

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 嵌合抗原受体的氨基酸序列

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

325 330 335

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

340 345 350

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

355 360 365

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 2

<211> 1467

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 编码嵌合抗原受体的核酸分子的核苷酸序列

<400> 2

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300

gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420

ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480

ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540

gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600

agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660

tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720

tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780

acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 沉默Nur77的核酸分子的核苷酸序列

<400> 3

cccggctcct tcaagttcga ggacttgaat tcaagtcctc gaacttgaag gagttttt 58

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 沉默Nur77的核酸分子的核苷酸序列

<400> 4

cccgggattg acagtatcct ggccttgaat tcaaggccag gatactgtca atcttttt 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 沉默Nur77的核酸分子的核苷酸序列

<400> 5

cccggtggtg aaggaagttg tccgaagaat tcttcggaca acttccttca ccattttt 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 沉默Nur77的核酸分子的核苷酸序列

<400> 6

cccgggctac acaggagagt ttgacagaat tctgtcaaac tctcctgtgt agcttttt 58

<210> 7

<211> 11903

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表达CD19 CAR的核酸的核苷酸序列

<400> 7

ttggaagggc taattcactc ccaaagaaga caagatatcc ttgatctgtg gatctaccac 60

acacaaggct acttccctga ttagcagaac tacacaccag ggccaggggt cagatatcca 120

ctgacctttg gatggtgcta caagctagta ccagttgagc cagataaggt agaagaggcc 180

aataaaggag agaacaccag cttgttacac cctgtgagcc tgcatgggat ggatgacccg 240

gagagagaag tgttagagtg gaggtttgac agccgcctag catttcatca cgtggcccga 300

gagctgcatc cggagtactt caagaactgc tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc 360

gctggggact ttccagggag gcgtggcctg ggcgggactg gggagtggcg agccctcaga 420

tcctgcatat aagcagctgc tttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg 480

agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc 540

ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct 600

cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa 660

gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg 720

gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag cggaggctag 780

aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg 840

gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg 900

gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc 960

tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga 1020

tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac 1080

accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag 1140

caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt ggagaagtga 1200

attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca ccaaggcaaa 1260

gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt 1320

cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag 1380

acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 1440

acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa gaatcctggc 1500

tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct ctggaaaact 1560

catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc tggaacagat 1620

ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat 1680

acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattgga 1740

attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc tgtggtatat 1800

aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt ttgctgtact 1860

ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga cccacctccc 1920

aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag agagagacag 1980

agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat cgatgtcgac gataagcttt 2040

gcaaagatgg ataaagtttt aaacagagag gaatctttgc agctaatgga ccttctaggt 2100

cttgaaagga gtgggaattg gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac 2160

agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg 2220

cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg 2280

agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc 2340

cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg 2400

cccttgcgtg ccttgaatta cttccactgg ctgcagtacg tgattcttga tcccgagctt 2460

cgggttggaa gtgggtggga gagttcgagg ccttgcgctt aaggagcccc ttcgcctcgt 2520

gcttgagttg aggcctggcc tgggcgctgg ggccgccgcg tgcgaatctg gtggcacctt 2580

cgcgcctgtc tcgctgcttt cgataagtct ctagccattt aaaatttttg atgacctgct 2640

gcgacgcttt ttttctggca agatagtctt gtaaatgcgg gccaagatct gcacactggt 2700

atttcggttt ttggggccgc gggcggcgac ggggcccgtg cgtcccagcg cacatgttcg 2760

gcgaggcggg gcctgcgagc gcggccaccg agaatcggac gggggtagtc tcaagctggc 2820

cggcctgctc tggtgcctgg cctcgcgccg ccgtgtatcg ccccgccctg ggcggcaagg 2880

ctggcccggt cggcaccagt tgcgtgagcg gaaagatggc cgcttcccgg ccctgctgca 2940

gggagctcaa aatggaggac gcggcgctcg ggagagcggg cgggtgagtc acccacacaa 3000

aggaaaaggg cctttccgtc ctcagccgtc gcttcatgtg actccacgga gtaccgggcg 3060

ccgtccaggc acctcgatta gttctcgagc ttttggagta cgtcgtcttt aggttggggg 3120

gaggggtttt atgcgatgga gtttccccac actgagtggg tggagactga agttaggcca 3180

gcttggcact tgatgtaatt ctccttggaa tttgcccttt ttgagtttgg atcttggttc 3240

attctcaagc ctcagacagt ggttcaaagt ttttttcttc catttcaggt gtcgtgagga 3300

atttcgacat ttaaatttaa ttaatctcga cggtatcggt taacttttaa aagaaaaggg 3360

gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa 3420

actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttccgatcac gagactagcc 3480

tcgaggttta aacgaattca tgcttctcct ggtgacaagc cttctgctct gtgagttacc 3540

acacccagca ttcctcctga tcccagacat ccagatgaca cagactacat cctccctgtc 3600

tgcctctctg ggagacagag tcaccatcag ttgcagggca agtcaggaca ttagtaaata 3660

tttaaattgg tatcagcaga aaccagatgg aactgttaaa ctcctgatct accatacatc 3720

aagattacac tcaggagtcc catcaaggtt cagtggcagt gggtctggaa cagattattc 3780

tctcaccatt agcaacctgg agcaagaaga tattgccact tacttttgcc aacagggtaa 3840

tacgcttccg tacacgttcg gaggggggac taagttggaa ataacaggct ccacctctgg 3900

atccggcaag cccggatctg gcgagggatc caccaagggc gaggtgaaac tgcaggagtc 3960

aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc acatgcactg tctcaggggt 4020

ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct ccacgaaagg gtctggagtg 4080

gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat tcagctctca aatccagact 4140

gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca gtctgcaaac 4200

tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac tacggtggta gctatgctat 4260

ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca gcggccgcaa ttgaagttat 4320

gtatcctcct ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc atgtgaaagg 4380

gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt 4440

ggtggttggg ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt 4500

ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg 4560

ccgccccggg cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc 4620

ctatcgctcc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca 4680

gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa 4740

gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg 4800

cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa 4860

aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac 4920

caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgcacta gtaaaattgt 4980

cgctcctgtc aaacaaactc ttaactttga tttactcaaa ctggctgggg atgtagaaag 5040

caatccaggt ccagctagca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc 5100

catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg 5160

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gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga 5460

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ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 5880

cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 5940

tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 6000

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ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgaat ggtgcactct 7260

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aatatgtact acaaacttag tag 11903

<210> 8

<211> 7593

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 沉默Nur77的核酸的核苷酸序列

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agggccgccc ctacgagggc acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc 3600

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agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc 3780

aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc 3840

ccgtaatgca gaagaagacc atgggctggg aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg 3900

acggcgccct gaagggcgag atcaagcaga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg 3960

acgctgaggt caagaccacc tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca 4020

acgtcaacat caagttggac atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt 4080

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ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 7080

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Claims (20)

1.一种T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞的Nur77被沉默；

以及表达嵌合抗原受体，其中，

所述嵌合抗原受体包括：

胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原CD19；

跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；

胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括CD28的胞内段以及CD3ζ链。

2.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带下列核酸分子：

编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；以及

任选地，沉默Nur77的核酸分子，所述沉默Nur77的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQID NO：3～6的至少之一；

优选地，所述沉默Nur77的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQ ID NO：3的至少之一。

3.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带含有SEQ ID NO：7或8所示的核苷酸序列。

4.一种转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞细胞Nur77被沉默；以及表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：

胞外区，所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体能够与肿瘤抗原特异性结合；

跨膜区；以及

胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段，

其中，所述抗体为单链抗体，所述肿瘤抗原为CD19。

5.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞Nur77被沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR和锌指核酸酶至少之一实现的。

6.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。

7.根据权利要求5所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞细胞Nur77被沉默是通过shRNA实现的。

8.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB或CD28的胞内段。

9.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是CD3⁺T淋巴细胞。

10.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是自然杀伤细胞。

11.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是自然杀伤T细胞。

12.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括：

第一核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体；以及

第二核酸分子，所述第二核酸分子沉默Nur77，其中，所述嵌合抗原受体是如权利要求4、6、8任一项中所定义的。

13.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置在权利要求4～11任一项所述的淋巴细胞中表达所述嵌合抗原受体和沉默Nur77。

14.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，进一步包括：

第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及

第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。

15.根据权利要求14所述的构建体，其特征在于，所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。

16.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，所述构建体的载体是非致病性病毒载体。

17.根据权利要求12所述的构建体，其特征在于，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。

18.一种制备权利要求1所述的T淋巴细胞或者权利要求4～11任一项所述的转基因淋巴细胞的方法，其特征在于，包括：

将权利要求12～17任一项所述的构建体或者权利要求2或3所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。

19.一种用于治疗癌症的治疗组合物，其特征在于，包括：

权利要求12～17任一项所述的构建体、权利要求2或3所述的慢病毒、权利要求1所述的T淋巴细胞或者权利要求4～11任一项所述的转基因淋巴细胞。

20.根据权利要求19所述的治疗组合物，其特征在于，所述癌症包括选自造血系统恶性肿瘤和淋巴瘤的至少之一。

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