CN111514056B - 一种具有促进黑色素生成作用的多肽组合物及其应用 - Google Patents

一种具有促进黑色素生成作用的多肽组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有促进黑色素生成作用的多肽组合物及其应用，属于美容多肽技术领域，该组合物包含α‑MSH仿生肽和前黑色素生成剂。所述多肽组合物还可以添加能够提高cAMP水平的多肽和/或促进酪氨酸酶基因表达的活性组分和/或具有抗氧化作用的活性组分和/或具有促进毛发生长作用的多肽。本发明的多肽组合物通过不同活性成分的复配，作用于不同靶点，全方位发挥协同增效作用，显著促进黑色素生成，可用于使毛发白转黑，使皮肤变成褐色和/或防止紫外线照射引起的损害。

Description

一种具有促进黑色素生成作用的多肽组合物及其应用
技术领域
本发明属于美容多肽技术领域，具体涉及一种具有促进黑色素生成作用的多肽组合物及其应用。
背景技术
脊椎动物毛发的生长包括毛干的生长以及黑色素的合成，这个过程需要毛囊干细胞与黑色素干细胞协同作用。毛囊隆突区内黑色素干细胞是毛发着色的来源细胞。毛囊中的黑色素细胞随着毛囊的生长周期的循环不断发生增殖和分化，参与到整个毛囊周期性循环过程。黑色素细胞在周期循环中不同时期具有不同的功能。处于生长期的黑色素细胞可以合成黑色素，通过黑色素细胞的树突结构以黑素小体的形式转运至周围表皮和生长期毛基质角朊细胞中去，使皮肤、毛发着色，还能有效抵抗自由基和活性氧对皮肤DNA的损伤；而退行期和静止期的黑色素细胞不能合成黑色素，不能为皮肤和毛发着色，随着生长周期的循环进入生长期，作为黑色素细胞的储存库，可以为生长期毛囊提供黑色素干细胞，进而分化为成熟的黑色素细胞，继续为生长期的毛发着色，使人们拥有乌黑的头发。
白发症(Canities)是指头发全部或部分变白的疾病，可分为先天性白发和后天性白发两种。先天性白发往往有家族史，受遗传因素的影响较大，治疗时较困难，而后天性白发治疗相对容易，因此现代医学对后天性白发的关注较多。白发的病因与发病机理复杂，现代医学研究认为，可能与遗传、衰老、疾病、氧化损伤等导致的黑色素干细胞衰老、黑色素细胞减少等有关。
白发症受到世界各国消费者的广泛关注，然而目前市场上销售的头发色素沉着产品大多都不能从根本上解决头发变白问题，而是人为地将头皮以上露出的毛干部分暂时着色的染色剂。
通过促进黑色素生成可以在源头上使毛发白转黑，改善白发症，也可防止皮肤因紫外线照射引起的损害。当皮肤受到外界刺激或者紫外线照射，α-促黑色素细胞激素(α-MSH)生成增加。α-MSH作用于黑色素皮质素受体1(MC1-R)，活化腺苷酸环化酶，环磷酸腺苷(cAMP)增加，促进小眼畸形相关转录因子(MITF)的表达，增加酪氨酸酶合成，黑色素生成增加。黑色素的存在及其向角质层的转移会产生自然的色泽，还可以保护深层皮肤免受紫外线的有害影响。α-MSH是含有十三个氨基酸残基的多肽，α-MSH仿生肽同样具备色素沉着和深层保护方面的功能。通过模拟α-MSH，这类多肽可促进黑色素生成，具有DNA保护和修复以及抗炎作用，而且活性多肽与机体同源，具有明确的序列及作用机制，安全性高，从而具有广阔的市场前景。
因此，开发一种能够模拟α-MSH功能，从源头上促进黑色素的生成，多靶点发挥作用，促进白发转黑，防止皮肤紫外损伤的多肽组合物产品具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明人通过大量实验研究，结果发现，通过α-MSH仿生肽和前黑色素生成剂结合使用，多靶点发挥作用，可以明显地促进黑色素的生成，在此基础上，进一步添加能够提高cAMP水平的多肽和/或促进酪氨酸酶基因表达的活性组分和/或具有抗氧化作用的活性组分和/或具有促进毛发生长作用的多肽，可以更加显著地促进黑色素生成，可用于使毛发白转黑，使皮肤变成褐色和/或防止紫外线照射引起的损害，由此完成了本发明。
因此，本发明要解决的技术问题是提供一种具有促进黑色素生成作用的多肽组合物，所述组合物能够发挥协同作用，多靶点、全方位地显著促进黑色素生成，从而可应用于使毛发白转黑，使皮肤变成褐色和/或防止紫外线照射引起的损害。
本发明所述一种具有促进黑色素生成作用的多肽组合物，包含：
(1)α-MSH仿生肽，选自一种或几种以下多肽，包括但不限于：乙酰基六肽-1、棕榈酰四肽-20；
(2)前黑色素生成剂，选自一种或几种以下组分，包括但不限于：酪氨酸、乙酰酪氨酸、油酰酪氨酸；
其中，各成分质量百分浓度为0.0001％-5％。
所述多肽组合物还可以添加能够提高cAMP水平的多肽，所述能够提高cAMP水平的多肽包括但不限于棕榈酰三肽-40，所述多肽的质量百分浓度为0.0001％-5％。
所述多肽组合物还可以添加促进酪氨酸酶基因表达的活性组分，选自一种或几种以下物质，包括但不限于：二苯乙烯苷、芝麻素，各成分质量百分浓度为0.0001％-5％。
所述多肽组合物还可以添加具有抗氧化作用的活性组分，选自一种或几种以下物质，包括但不限于：蛇床子素、黄芩苷，各成分质量百分浓度为0.0001％-5％。
所述多肽组合物还可以进一步添加具有促进毛发生长作用的多肽，所述具有促进毛发生长作用的多肽选自一种或几种以下多肽：生物素三肽-1、肉豆蔻酰五肽-17、肉豆蔻酰六肽-16、乙酰基四肽-3、三肽-1铜，各成分质量百分浓度为0.0001％-5％。
本发明所述多肽组合物可以是乙酰基六肽-1和乙酰酪氨酸的组合；棕榈酰四肽-20和乙酰酪氨酸的组合；棕榈酰四肽-20、乙酰基六肽-1和乙酰酪氨酸的组合；乙酰基六肽-1、乙酰酪氨酸和棕榈酰三肽-40的组合；棕榈酰四肽-20、乙酰酪氨酸和棕榈酰三肽-40的组合；棕榈酰四肽-20、乙酰酪氨酸和二苯乙烯苷的组合；乙酰基六肽-1、乙酰酪氨酸、棕榈酰三肽-40和二苯乙烯苷的组合；棕榈酰四肽-20、乙酰酪氨酸、棕榈酰三肽-40和二苯乙烯苷的组合；乙酰基六肽-1、乙酰酪氨酸、棕榈酰三肽-40和蛇床子素的组合；乙酰基六肽-1、乙酰酪氨酸、棕榈酰三肽-40、二苯乙烯苷和蛇床子素的组合；乙酰基六肽-1、乙酰酪氨酸、棕榈酰三肽-40、二苯乙烯苷、蛇床子素和生物素三肽-1的组合。
本发明所述的具有促进黑色素生成作用的多肽组合物的剂型包括但不限于精华液、胶囊、冻干粉、乳剂、霜剂、凝胶、面膜或敷料。
本发明所述的具有促进黑色素生成作用的多肽组合物可以应用于护理毛发和/或皮肤的化妆用组合物中。
所述护理毛发包括使毛发白转黑。
所述护理皮肤包括使皮肤变成褐色和/或防止紫外线照射引起的损害。
为了更有利于理解本发明，将黑色素生成的途径及上述组合物中各活性成分的作用机制说明如下：
1、黑色素生成的途径
当皮肤受到外界刺激或者紫外线照射，阿片促黑皮质激素原(pro-opio-melano-cortin，POMC)随之产生。POMC是一条大肽链，通过剪切可以产生α-促黑色素细胞激素(α-MSH)。α-MSH是一种重要的调节黑色素生成的胞外因子，通过与黑色素细胞表面的黑色素皮质素受体1(MC1-R)结合，活化腺苷酸环化酶(AC)。腺苷酸环化酶(AC)的激活可以提高细胞内cAMP的水平，形成胞内信号。高浓度的cAMP可以使蛋白激酶A(PKA)释放出有活性的催化亚基，从而使cAMP响应元件结合蛋白(CREB)磷酸化和活化。CREB转录因子与cAMP响应元件(CRE)相互作用，刺激小眼畸形相关转录因子(MITF)的表达，进而增加酪氨酸酶基因的表达，促进酪氨酸酶合成，从而促进黑色素合成，使毛发或皮肤颜色变深。在黑色素的合成过程中，酪氨酸酶扮演着重要的角色。在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸转变为多巴醌，多巴醌继续氧化生成多巴和多巴色素。多巴也是酪氨酸酶的底物之一，在酪氨酸酶的作用下，多巴被氧化后再次生成多巴醌，多巴醌的氧化产物多巴色素再经一系列的反应最终生成黑色素。黑色素随着新陈代谢到达毛发皮质或皮肤表面，从而导致毛发或皮肤表面颜色加深。黑色素是在黑色素细胞的黑素小体内合成的，而活性氧(ROS)会损伤黑色素细胞，从而影响黑色素的合成。因此，通过激活或增强黑色素形成过程中的任一步骤，如通过α-MSH类似物激动MC1-R，增加酪氨酸酶的底物，提高cAMP水平，促进酪氨酸酶基因表达，或者通过减少黑色素细胞的氧化损伤，这些均能促进黑色素的生成，从而使毛发白转黑，使皮肤变成褐色和/或防止紫外线照射引起的损害。
此外，针对毛发，在上述原理的基础上，增加具有促进毛发生长作用的多肽，可以使毛发更快地由白转黑。
2、活性成分的作用机制
乙酰基六肽-1(Acetyl Hexapeptide-1)，是一种α-MSH的仿生肽，对MC1-R具有亲和力，可通过与MC1-R结合促进黑色素生成，因此可作为一种自然的光保护因子和炎症调节剂。同时，可以促进黑色素从黑色素细胞转移到角质形成细胞，因此可以促进毛发或皮肤的着色。
棕榈酰四肽-20(Palmitoyl Tetrapeptide-20)，一种α-MSH仿生肽，能够经由刺激MC1-R而促进黑色素生成并减少氧化应激作用。
酪氨酸及其衍生物。L-酪氨酸(L-Tyrosine，CAS号：60-18-4)，是黑色素的可溶性前体，在酪氨酸酶的催化下，经一系列反应而生成黑色素，可作为补充黑色素的原料。乙酰酪氨酸(N-acetyl-L-tyrosine，CAS号：537-55-3)、油酰酪氨酸(N-Oleoyltyrosine，CAS号：147732-57-8)均是酪氨酸的衍生物，作用机制与酪氨酸类似，同样可作为前黑色素生成剂。
棕榈酰三肽-40(Palmitoyl Tripeptide-40)，可以诱导cAMP产生，从而刺激黑色素合成，在不经紫外线照射的情况下能够增加人体黑色素细胞的黑色素含量。
二苯乙烯苷(CAS号：82373-94-2)，是何首乌的活性成分，可以上调cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化表达水平，诱导酪氨酸酶重要转录因子MITF的激活，促进酪氨酸酶基因的表达，提高酪氨酸酶的活性，从而促进黑色素的合成。
芝麻素(CAS号：607-80-7)，可以上调cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化表达水平，诱导酪氨酸酶重要转录因子MITF的激活，促进酪氨酸酶基因的表达，从而促进黑色素的合成。
蛇床子素(CAS号：484-12-8)，是蛇床子的活性成分，对细胞内ROS水平有抑制作用，能减少因氧自由基作用引起的毛囊及黑色素细胞损伤，有利于黑色素生成。
黄芩苷(CAS号：21967-41-9)，是黄芩的活性成分，可以抗氧化损伤，对氧化受损和紫外线损伤的黑色素细胞有保护作用，从而增加黑色素的生成。
生物素三肽-1(Biotinoyl Tripeptide-1，CAS号：299157-54-3)，可以促进胶原蛋白IV和层粘连蛋白5的合成，延缓毛囊衰老，促进毛发生长。
肉豆蔻酰五肽-17(Myristoyl Pentapeptide-17)，刺激角蛋白基因的表达，促进角质蛋白生成，从而促进毛发生长。
肉豆蔻酰六肽-16(Myristoyl Hexapeptide-16)，作用机理同肉豆蔻酰五肽-17，都是刺激角蛋白基因的表达，从而达到促进毛发生长的目的。
乙酰基四肽-3(Acetyl Tetrapeptide-3，CAS号：827306-88-7)，刺激真皮毛乳或毛囊周围成纤维细胞生成Ⅲ型胶原蛋白、层粘连蛋白等基质蛋白和Ⅶ型胶原蛋白，使毛囊更加饱满健康，有助于毛发生长。
三肽-1铜(Copper Tripeptide-1，铜肽)，可以促进胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖(GAGs)大量生成，还可以促进毛发生长因子的表达，延长毛囊生长期，具有促进毛发生长的作用。
本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：针对黑色素生成的途径，结合各活性成分的作用机制，本发明通过α-MSH仿生肽激动MC1-R，促进黑色素生成；通过前黑色素生成剂作为补充黑色素的原料，增加黑色素合成量；在此基础上，添加能够提高cAMP水平的多肽，进而刺激MITF的表达，增加酪氨酸酶的活性，最终增加黑色素合成；添加促进酪氨酸酶基因表达的活性组分，从而促进黑色素的合成；添加具有抗氧化作用的活性组分，保护黑色素细胞免受氧化损伤，也可增加黑色素含量；还可以进一步添加具有促进毛发生长作用的多肽，使毛发能够更加快速地由白转黑；采用不同活性成分复配，作用于不同靶点，全方位发挥协同增效作用，显著促进黑色素生成，可用于使毛发白转黑，使皮肤变成褐色和/或防止紫外线照射引起的损害。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例、测试例对发明作详细的说明，然而，应当理解的是，这些实施例、测试例仅用作说明目的，并且不旨在限制本发明的范围。
测试例1对小鼠黑色素瘤细胞B16F10黑色素生成的影响
1.1试剂与材料
左旋多巴(L-DOPA)、DMEM培养基、胰酶、MTT、Triton X-100、NaOH、DMSO、96孔板。
1.2仪器
酶标仪(MD)、CO2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)、生物倒置显微镜(重庆光电)。
1.3细胞株
小鼠B16F10黑素瘤细胞株，购自中国科学院昆明细胞库。
1.4待测样品
给药组：10ppm的乙酰基六肽-1溶液、10ppm的棕榈酰四肽-20溶液、10ppm的乙酰酪氨酸溶液、10ppm的棕榈酰三肽-40溶液、10ppm的二苯乙烯苷溶液、10ppm的棕榈酰四肽-20和乙酰酪氨酸混合溶液(5ppm+5ppm)、10ppm的棕榈酰四肽-20、乙酰基六肽-1和乙酰酪氨酸混合溶液(2.5ppm+2.5ppm+5ppm)、10ppm的棕榈酰四肽-20、乙酰酪氨酸和棕榈酰三肽-40混合溶液(5ppm+2.5ppm+2.5ppm)、10ppm的棕榈酰四肽-20、乙酰酪氨酸和二苯乙烯苷混合溶液(5ppm+2.5ppm+2.5ppm)、10ppm的棕榈酰四肽-20、乙酰酪氨酸、棕榈酰三肽-40和二苯乙烯苷混合溶液(2.5ppm+2.5ppm+2.5ppm+2.5ppm)。
对照组：PBS空白对照。
1.5测试方法
1.5.1细胞增殖实验
取同一传代细胞，将细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板，每孔180μL细胞悬浮液，待细胞贴壁后，加入待测样品20μL，各设置5个复孔，作用48～72h后，加入MTT试剂20μL反应4h后，酶标仪570nm测OD值。
细胞活性(％)＝给药组OD值/对照组OD值×100％
1.5.2细胞酪氨酸酶活性测定
B16F10细胞接种于96孔板，每孔5000个细胞/180μL，贴壁24h。取出96孔板，加待测样品，继续培养72h，各设置5个复孔。
用pH值6.8的PBS溶液配制1％Triton X-100溶液，备用。
取出96孔板，吸弃培养基，分别用100μL PBS洗涤两次，向每孔加入100μL 1％Triton X-100溶液，-80℃裂解30min细胞，随后室温融化使细胞完全裂解，37℃预热10min后，每孔加入100μL 10mmol/L L-DOPA，在37℃下反应2h，检测475nm处吸光度值A。
酪氨酸酶相对活性(％)＝A给药组/A对照组×100％
1.5.3黑色素合成量的测定
B16F10细胞接种于6孔板，接种密度为25000个/孔，24h贴壁后，换液，加待测样品，继续培养72～96h。每一样品重复测试3次。
采用NaOH裂解法测定黑色素合成量。培养结束后，弃上清并用PBS洗涤，用0.25％的胰酶消化细胞，吹打成细胞悬液，取100μL细胞计数，其余细胞悬液离心(1000r/min，5min)，弃去上清后，加入150μL 1mol/L NaOH溶液(含10％DMSO)裂解细胞，80℃水浴30min～2h，充分裂解细胞和溶解黑色素颗粒，将各组细胞溶出物转移至96孔板中，每孔加100μL，用酶标仪在405nm处测定吸光度值A，计算黑色素合成率。
黑色素合成率(％)＝A给药组/A对照组×100％
1.6测试结果
1.6.1测试样品对B16F10细胞增殖的影响
将1.5.1步骤测得的OD值按上述细胞活性的公式计算后，得到同一浓度下不同样品对B16F10细胞增殖的影响，结果见表1。
表1测试样品对B16F10细胞增殖的影响
Figure BDA0002509891600000081
由表1中结果可知，相对于空白对照组，各给药组没有造成小鼠B16F10黑素瘤细胞的活性下降，表明各给药组在实验浓度下对B16F10细胞没有毒性。
1.6.2测试样品对B16F10细胞酪氨酸酶活性的影响
将1.5.2步骤测得的吸光度值按上述酪氨酸酶相对活性公式计算后，得到同一浓度下不同样品对B16F10细胞酪氨酸酶活性的影响，结果见表2。
表2测试样品对B16F10细胞酪氨酸酶(Tyr)活性的影响
Figure BDA0002509891600000091
注：**表示给药组与空白对照组相比差异显著，p<0.01。***表示给药组与空白对照组相比差异极为显著，p<0.001。
由表2结果可知，经给药组处理后，小鼠B16F10黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性均大幅提高，与空白对照组相比差异显著。相对于单独使用乙酰基六肽-1、棕榈酰四肽-20、乙酰酪氨酸、棕榈酰三肽-40、二苯乙烯苷，在活性成分浓度保持一致的条件下，上述不同作用机制的活性成分结合使用，可以使B16F10细胞酪氨酸酶的活性更高，而且随着活性成分种类的增多，酪氨酸酶的活性增加得更加明显，说明不同活性成分之间具有显著的协同作用，从不同作用靶点出发增强酪氨酸酶的活性，从而可以更加明显地促进黑色素生成。
1.6.3测试样品对B16F10细胞内黑色素含量的影响
将1.5.3步骤测得的吸光度值按上述黑色素合成率公式计算后，得到同一浓度下不同样品对B16F10细胞内黑色素含量的影响，结果见表3。
表3测试样品对B16F10细胞内黑色素含量的影响
Figure BDA0002509891600000101
注：*表示给药组与空白对照组相比具有统计学差异，p<0.05。**表示给药组与空白对照组相比差异显著，p<0.01。***表示给药组与空白对照组相比差异极为显著，p<0.001。
由表3结果可知，经给药组处理后，小鼠B16F10黑素瘤细胞内黑色素合成率均出现较大提高，表明给药样品能够促进黑色素生成。相对于单独使用乙酰基六肽-1、棕榈酰四肽-20、乙酰酪氨酸、棕榈酰三肽-40、二苯乙烯苷，在活性成分浓度保持一致的条件下，当上述活性成分中的至少两种结合使用时，能够发挥协同增效作用，而且随着活性成分种类的增多，小鼠B16F10黑素瘤细胞内黑色素合成率更高，说明不同活性成分之间的协同作用更加显著，从不同作用靶点出发更加明显地促进黑色素生成。
测试例2测试样品对H2O2诱导下B16F10细胞活性的影响
2.1细胞株
小鼠B16F10黑素瘤细胞株，购自中国科学院昆明细胞库。
2.2待测样品
100ppm的蛇床子素、100μmol/L H2O2
2.3测试分组
测试分为4组：蛇床子素组；H2O2组；蛇床子素+H2O2组，100ppm的蛇床子素预处理24h后使用100μmol/L H2O2刺激24h；空白对照组，正常培养基。
每组设置5个复孔，重复测试3次。
2.4测试方法
将细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板，置于37℃，5％CO2培养箱培养，待细胞贴壁后倒去培养基，加入蛇床子素样品进行预处理，H2O2组、空白对照组仅添加正常培养基，继续培养24h。倒去培养基，蛇床子素+H2O2组、H2O2组分别加入新鲜配制的H2O2培养基，蛇床子素组、空白对照组仅添加正常培养基，分别培养24h。之后每孔分别加入MTT试剂20μL反应4h后，酶标仪570nm测OD值。
细胞活性(％)＝给药组OD值/对照组OD值×100％
2.5测试结果
将测得的OD值按上述细胞活性的公式计算后，得到测试样品对H2O2诱导下B16F10细胞活性的影响，结果见表4。
表4测试样品对H2O2诱导下B16F10细胞活性的影响
Figure BDA0002509891600000111
注：*表示蛇床子素+H2O2组与H2O2组相比具有统计学差异，p<0.05。
由表4中结果可知，相对于空白对照组，蛇床子素组没有造成小鼠B16F10黑素瘤细胞的活性下降，表明蛇床子素在实验浓度下对B16F10细胞没有毒性。
当使用100μmol/L H2O2处理后，小鼠B16F10黑素瘤细胞的活性明显下降，表明H2O2对B16F10细胞造成了氧化损伤。当使用100ppm的蛇床子素预处理后，可以显著缓解H2O2引起的损伤作用，恢复小鼠B16F10黑素瘤细胞的活性，表明蛇床子素能减少因氧自由基作用而引起的黑色素细胞损伤，保持黑色素细胞活性，从而有利于黑色素生成。
实施例 制备实施例1-7的组合物
实施例1-7组合物的处方配比(质量百分比)如下：
编号 原料名称 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6 实施例7
1 纯化水 加至100 加至100 加至100 加至100 加至100 加至100 加至100
2 吐温80 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
3 司盘80 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
4 乙醇 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
5 氢化卵磷脂 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
6 辛酸/癸酸甘油三脂 7.00 7.00 7.00 7.00 7.00 7.00 7.00
7 棕榈酰乙基己酯 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
8 戊二醇 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
9 己二醇 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
10 三乙醇胺 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
11 棕榈酰四肽-20 - 0.08 - - - - -
12 乙酰基六肽-1 0.16 0.08 0.08 0.05 0.05 0.05 0.03
13 乙酰酪氨酸 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
14 棕榈酰三肽-40 - - 0.08 0.01 0.01 0.01 0.01
15 二苯乙烯苷 - - - 0.10 - 0.05 0.05
16 蛇床子素 - - - - 0.10 0.05 0.05
17 生物素三肽-1 - - - - - - 0.02
实施例1-7组合物的制备方法：
1、将处方量的5、8、9加入纯化水中，加热至80℃，作为水相；
2、将处方量的2、3、6、7加入另一容器内，加热至80℃，作为油相；
3、将油相加入水相，搅拌均质5-10分钟，制成乳液混合相I，然后冷却降温至40℃；
4、将11、12、14、16、17用4溶解完全，13、15用预留的纯化水溶解完全，加入混合相I，并用10调节pH至5.0-6.0，搅拌均匀，制成混合相II；
5、将混合相II用高压均质机均质3-10分钟，即成。
对比例制备对比例1-7的组合物
对比例1-7组合物的处方配比(质量百分比)如下：
编号 原料名称 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6 对比例7
1 纯化水 加至100 加至100 加至100 加至100 加至100 加至100 加至100
2 吐温80 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
3 司盘80 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
4 乙醇 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00
5 氢化卵磷脂 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
6 辛酸/癸酸甘油三脂 7.00 7.00 7.00 7.00 7.00 7.00 7.00
7 棕榈酰乙基己酯 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
8 戊二醇 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00
9 己二醇 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
10 三乙醇胺 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
11 乙酰基六肽-1 1.16 - - - - - -
12 乙酰酪氨酸 - 1.16 - - - - -
13 棕榈酰四肽-20 - - 1.16 - - - -
14 棕榈酰三肽-40 - - - 1.16 - - -
15 二苯乙烯苷 - - - - 1.16 - -
16 蛇床子素 - - - - - 1.16 -
对比例1-7组合物的制备方法：
1、将处方量的5、8、9加入纯化水中，加热至80℃，作为水相；
2、将处方量的2、3、6、7加入另一容器内，加热至80℃，作为油相；
3、将油相加入水相，搅拌均质5-10分钟，制成乳液混合相I，然后冷却降温至40℃；
4、将11、13、14、16用4溶解完全，12、15用预留的纯化水溶解完全，加入混合相I，并用10调节pH至5.0-6.0，搅拌均匀，制成混合相II；
5、将混合相II用高压均质机均质3-10分钟，即成。
测试例3组合物减少白发比例的临床测试
3.1受试者
选取140名男性受试者，年龄在30岁以上，患有头发早白问题。随机分为14组，平均每组10人。
3.2测试样品
实施例1-7、对比例1-7，其中对比例7是空白对照，作为安慰剂使用。
3.3测试方法
进行双盲测试。0天时，在选定位置统计白发百分比。使用测试样品，每天1次，并按摩头皮至吸收，持续使用4个月。之后在相同面积区域进行计数，统计白发百分比，由此计算使用各测试样品4个月后的白发减少比例，以评价测试样品使白发转黑的效果。
3.4测试结果
持续使用4个月后，各测试样品减少白发比例的临床测试结果见下表5。
表5测试样品使用4个月后的白发减少比例
Figure BDA0002509891600000151
由表5中数据可知，相对于对比例7(安慰剂)，在活性成分存在的条件下，实施例1-7及对比例1-6在使用4个月后，各组受试者的白发比例均出现不同程度的减少，表明各组活性成分能够促进黑色素生成，使白发转黑。比较实施例1与对比例1、对比例2的测试结果，在相同活性成分浓度下，使用4个月后，实施例1受试者的白发减少比例更大，与0d相比白发比例减少了21.74％，表明实施例1能够更加明显地促进黑色素生成，实施例1使白发转黑的效果优于对比例1及对比例2，说明不同作用机制的活性成分结合使用，可以发挥协同作用，达到更优的白发转黑效果。同理，通过比较其他实施例及对比例可知，相对于活性成分单独使用，结合使用至少两种不同作用靶点的活性成分，可以更加明显地减少白发比例，发挥协同增效作用，而且随着活性成分种类的增多，使用4个月后，相应受试者的白发减少比例更大，说明不同活性成分可以从不同的作用靶点发挥功效，各活性成分之间具有显著的协同作用，从而可以达到更优异的使白发转黑效果，并且当具有促进黑色素生成作用的成分与具有促进毛发生长作用的成分结合使用时(实施例7)，受试者的白发减少比例最大，说明通过毛发生长与黑色素合成的协同作用，可以更加迅速有效地使白发转黑。
测试例4组合物对加速、强化和延长皮肤的褐色的效果
4.1受试者
选取130名受试者，年龄在20-40岁之间。随机分为13组，平均每组10人。
4.2测试样品
实施例1-6、对比例1-7，其中对比例7是空白对照，作为安慰剂使用。
4.3测试仪器
MPA9皮肤多功能测试仪(德国CK公司)
4.4测试原理
通过比较各测试样品使用前后的皮肤色度参数(L*)值变化，计算色度变化百分比，将色度变化百分比与安慰剂的结果比较，根据色度变化百分比下降的幅度评价测试样品对加速、强化和延长皮肤的褐色的效果。
皮肤色度参数(L*)：是指与纯白参照物对比，受测体所观测到的亮度值，其中L*(亮度)即指从纯黑(L＝0)到纯白(L＝100)的亮度范围。
4.5测试方法
测试前，先检测0d的皮肤L*值，然后在受试者前臂使用测试样品，并在其另一前臂上使用安慰剂。一天两次，连续使用28天。
测试开始的两周，在经控制的条件下，使双臂暴露于UVA照射，每周三次。
在UVA照射7d后以及最后一次照射后14d(即测试28d后)使用多功能测试仪，检测受试者前臂皮肤L*值。
4.6测试结果
将UVA照射7d后测得的数值与0d相比，分别计算各组的皮肤色度变化百分比。将实施例1-6、对比例1-6的色度变化百分比与安慰剂的结果比较，分别计算各组相对于安慰剂的皮肤色度变化百分比下降幅度，结果见下表6。
表6各组相对于安慰剂的皮肤色度变化百分比下降幅度(UVA照射7d)
Figure BDA0002509891600000171
由表6中数据可知，相对于对比例7(安慰剂)，在活性成分存在的条件下，通过UVA照射7d后，实施例1-6及对比例1-6各组受试者前臂的皮肤色度变化百分比下降幅度均出现不同程度的增加，表明各组活性成分能够促进黑色素生成，从而加速使皮肤变成褐色。比较实施例1与对比例1、对比例2的测试结果，在相同活性成分浓度下，通过UVA照射7d后，实施例1受试者前臂的皮肤色度变化百分比下降幅度更大，与安慰剂相比下降了37.24％，表明实施例1能够更加明显地促进黑色素生成，实施例1加速使皮肤变成褐色的效果优于对比例1及对比例2，说明不同作用机制的活性成分结合使用，可以发挥协同作用，更快地使皮肤变成褐色。同理，通过比较其他实施例及对比例可知，相对于活性成分单独使用，结合使用至少两种不同作用靶点的活性成分，可以更加明显地加速使皮肤变成褐色，发挥协同增效作用，而且随着活性成分种类的增多，UVA照射7d后，相应受试者前臂的皮肤色度变化百分比下降幅度更大，说明不同活性成分可以从不同的作用靶点发挥功效，各活性成分之间具有显著的协同作用，从而可以达到更优异的加速使皮肤变成褐色的效果。
同理，最后一次照射后14d(即测试28d后)，分别计算实施例1-6、对比例1-6相对于安慰剂的皮肤色度变化百分比下降幅度，结果见下表7。
表7各组相对于安慰剂的皮肤色度变化百分比下降幅度(28d)
Figure BDA0002509891600000181
由表7中数据可知，相对于对比例7(安慰剂)，在活性成分存在的条件下，最后一次照射后14d(即测试28d后)，实施例1-6及对比例1-6各组受试者前臂的皮肤色度变化百分比下降幅度仍然较大，表明虽然没有了UVA诱导处理，各组活性成分通过促进黑色素生成，可以强化和延长皮肤的褐色。比较实施例1与对比例1、对比例2的测试结果，在相同活性成分浓度下，最后一次照射后14d(即测试28d后)，实施例1受试者前臂的皮肤色度变化百分比下降幅度更大，与安慰剂相比下降了35.61％，表明实施例1能够更加明显地促进黑色素生成，实施例1强化和延长皮肤的褐色的效果优于对比例1及对比例2，说明不同作用机制的活性成分结合使用，可以发挥协同作用，能够更明显地强化和延长皮肤的褐色。同理，通过比较其他实施例及对比例可知，相对于活性成分单独使用，结合使用至少两种不同作用靶点的活性成分，可以更加明显地强化和延长皮肤的褐色，发挥协同增效作用，而且随着活性成分种类的增多，最后一次照射后14d(即测试28d后)，相应受试者前臂的皮肤色度变化百分比下降幅度更大，说明不同活性成分可以从不同的作用靶点发挥功效，各活性成分之间具有显著的协同作用，从而可以达到更优异的强化和延长皮肤的褐色的效果。
综上所述，本发明的组合物可以促进黑色素生成，加速、强化和延长皮肤的褐色的效果，皮肤表面的黑色素能吸收大部分紫外线，从而防止紫外线照射引起的皮肤急性和慢性损伤。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种具有促进黑色素生成作用的多肽组合物，其特征在于，包含：
（1）α-MSH仿生肽：乙酰基六肽-1，其质量百分浓度为0.03%-0.08%；
（2）前黑色素生成剂：乙酰酪氨酸，其质量百分浓度为1%；和
（3）能够提高cAMP水平的多肽：棕榈酰三肽-40，其质量百分浓度为0.01%-0.08%。
2.根据权利要求1所述的具有促进黑色素生成作用的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物还包含促进酪氨酸酶基因表达的活性组分：二苯乙烯苷，其质量百分浓度为0.05%-0.1%。
3.根据权利要求1所述的具有促进黑色素生成作用的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物还包含具有抗氧化作用的活性组分：蛇床子素，其质量百分浓度为0.05%-0.1%。
4.根据权利要求1所述的具有促进黑色素生成作用的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物还包含具有促进毛发生长作用的多肽：生物素三肽-1，其质量百分浓度为0.02%。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的具有促进黑色素生成作用的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物剂型选自精华液、胶囊、冻干粉、乳剂、霜剂、凝胶、或敷料。
6.根据权利要求1-5任一权利要求所述的具有促进黑色素生成作用的多肽组合物在制备用于护理毛发和/或皮肤的组合物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述护理毛发包括使毛发白转黑。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述护理皮肤包括使皮肤变成褐色和/或防止紫外线照射引起的损害。
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