CN111511399A

CN111511399A - 制剂

Info

Publication number: CN111511399A
Application number: CN201880075625.0A
Authority: CN
Inventors: S·杜兰; A·J·耶茨
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2020-08-07
Also published as: CA3082832C; IL274719A; BR112020009866A2; RU2020120547A3; US11857625B2; CO2020006120A2; CA3082832A1; MY194682A; KR20200090829A; EP3713602A1; RU2020120547A; US20240123065A1; SG11202004601YA; JP6955632B2; AU2018371056A1; CL2020001307A1; WO2019101582A1; AR113534A1; GB201719447D0; US20210106683A1

Abstract

本发明涉及药用组合物，其包含结合IL‑17A和IL‑17F的抗体或其片段，以及甘氨酸、pH 4.6至5.5的乙酸盐缓冲液和聚山梨酯80的组合。

Description

制剂

发明领域

本发明涉及药用制剂的领域。更特别地，本发明涉及包含抗体、甘氨酸、乙酸盐缓冲液和聚山梨酯80的药用组合物。

发明背景

自重组DNA技术问世以来获得批准的生物制品的数目已经攀升，并且尽管该领域在生物制品的类型、所靶向的适应症和药物活性的机制基础方面保持生气勃勃，但是近年来基于抗体的疗法的批准在数量上已远远超过了其他生物制品的批准。

为了以患者友好的方式施行抗体疗法，施用的方式和时间是关键的。在其中患者依赖于药物来实现过上与健康个体所过的尽可能接近的生活的慢性疾病中，这些方面是尤其重要的。通常，需要长时间施用(可能与住院治疗一起)的药物不被认为是患者友好的。极力寻求的是在患者家里的舒适环境中执行的皮下施用。但是，当抗体需要在液体制剂(例如由患者以皮下方式和直接地施用的那些)中以高浓度配制时，会出现一大堆问题。

尽管抗体是相当稳定的分子，但是当储存一段时间时，可能会遭受化学和物理不稳定性。典型的化学不稳定性可以导致脱酰胺、水解、氧化、β-消除、二硫键交换或还原。物理不稳定性可以导致变性、聚集或沉淀。当抗体以高浓度储存在液体溶液中时，化学和物理不稳定性都远远更加明显。

但是，液体的高度浓缩的抗体水基制剂是特别复杂的；水作为反应物起作用或促进反应物的转移，从而导致化学降解和蛋白质不稳定性。在以高浓度配制抗体中不存在简单的通用实验方案，并且尽管稳定剂可以帮助减少不稳定性和聚集，但是它们以高浓度的存在可以影响最终药用制剂的其他物理化学特性，例如粘度和重量摩尔渗透压浓度。

避免聚集、沉淀或降解或者使其最小化仍然是一项特殊的挑战。聚集(有着可溶性物质和/或不溶性沉淀物的形成)是一个特别的问题。这可以引起各种问题例如聚集物的形成，其可以导致在施用后的免疫反应和/或在执行药用制剂的正确施用中的困难，例如通过引起递送装置的堵塞。

问题也可能会在制备高浓度的抗体期间出现，并且制剂的可加工性(如制剂在各种制备步骤(包括过滤)过程中表现如何、浊度外观和长期稳定性所看出来的)是药用制剂制备的非常重要的方面并且是有待克服的进一步障碍。

当抗体以高浓度进行配制时，在低抗体浓度下进行的研究经常不能很好地转换。取决于抗体的性质和必需的赋形剂，大规模的生产可能意外地受到影响。

毫无疑问地，成功的药用制剂是通过鉴定出所有这些因素的最佳组合来取得的。

鉴于以上所述，本领域中仍然存在提供治疗性抗体的进一步经改善的药用组合物的需要。

发明简述

本发明通过提供具有合适的物理化学特性的包含抗体或其抗原结合片段的药用组合物而解决了上面指出的需要。

下面的具体实施方案以在下文中的编号进行描述。

实施方案1：药用组合物，其包含：

a.大约80mg/ml至大约200mg/ml的抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ IDNO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的轻链可变区；

b.乙酸盐；

c.甘氨酸；

d.聚山梨酯80；并且

具有大约4.6至大约5.5或大约4.6至大约5.3的pH。

实施方案2：根据实施方案1的药用组合物，其包含大约120mg/ml至大约185mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段，优选地大约160mg/mL。

实施方案3：根据实施方案1或实施方案2的药用组合物，其中所述组合物包含大约0.01％至大约0.07％(w/v)的聚山梨酯80。

实施方案4：根据前述实施方案中任一项的药用组合物，其中所述组合物包含大约140mM至大约350mM的甘氨酸。

实施方案5：根据前述实施方案中任一项的药用组合物，其中所述组合物包含大约20mM至大约100mM的乙酸盐，优选地大约40mM至大约90mM的乙酸盐或大约50mM至大约90mM的乙酸盐。

实施方案6：根据前述实施方案中任一项的药用组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合人IL-17A和人IL17F。

实施方案7：根据前述实施方案中任一项的药用组合物，其中所述组合物包含：

a.大约120mg/mL至大约185mg/mL的抗体或其抗原结合片段；

b.大约20mM至大约100mM的乙酸盐，优选地大约40mM至大约90mM的乙酸盐或大约50mM至大约90mM的乙酸盐；

c.大约140mM至大约350mM的甘氨酸；

d.大约0.01％至大约0.07％(w/v)的聚山梨酯80；

其中所述组合物具有大约4.6至大约5.5或大约4.6至大约5.3的pH。

实施方案8：用于制备药用组合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

a.制备低浓度制剂，这通过将大约40mg/ml至大约50mg/ml的具有包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段与pH为大约4.6至大约5.5或大约4.6至大约5.3的包含甘氨酸和乙酸盐的缓冲溶液相组合来进行；

b.制备高浓度制剂，这通过将在a)中所获得的低浓度制剂的抗体或其抗原结合片段浓缩至大约120mg/ml至大约185mg/ml的浓度来进行；

c.向在b)中所获得的高浓度制剂添加聚山梨酯80；

d.任选地，在步骤c)之前，用pH为大约4.6至大约5.5或大约4.6至大约5.3的包含甘氨酸和乙酸盐的缓冲溶液调节所述抗体或其抗原结合片段的浓度。

实施方案9：根据实施方案8的方法，其中所述缓冲溶液包含大约20mM至大约100mM的乙酸盐，优选地大约40mM至大约90mM的乙酸盐或大约50mM至大约90mM的乙酸盐，和大约140mM至大约350mM的甘氨酸，并且其中在步骤c)中添加聚山梨酯80以给出大约0.01％至大约0.07％(w/v)的最终浓度。

实施方案10：通过实施方案8或实施方案9而获得的药用组合物。

实施方案11：根据实施方案10的药用组合物，其中所述组合物的pH为大约4.6至大约5.5或大约4.6至大约5.3。

实施方案12：容器，其包含根据实施方案1至7、10或11中任一项的药用组合物。

实施方案13：根据实施方案1至7、10或11中任一项的药用组合物，其用于在疗法中使用。

实施方案14：根据实施方案1至7、10或11中任一项的药用组合物，其用于在治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症中使用。

实施方案15：根据实施方案1至7、10或11中任一项的药用组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症。

实施方案16：用于在哺乳动物受试者中治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症的方法，所述方法包括施用根据实施方案1至7、10或11中任一项的药用组合物。

实施方案17：根据实施方案14的用于所述用途的药用组合物、根据实施方案15的用途或者根据实施方案16的方法，其中所述病理学病症选自由下列各项组成的组：关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、全身型幼年特发性关节炎(JIA)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、慢性阻塞性气道疾病、慢性阻塞性肺疾病、特应性皮炎、硬皮病、系统性硬化病、肺纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊椎炎、中轴型脊椎关节炎(axialspondyloarthritis)和其他脊椎关节病。

实施方案18：根据实施方案14的用于所述用途的药用组合物、根据实施方案15的用途或者根据实施方案16的方法，其中所述病理学病症选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊椎炎和中轴型脊椎关节炎。

发明详述

本发明基于聚山梨酯80和pH为大约4.6至大约5.5的包含乙酸盐缓冲液(作为缓冲试剂)和甘氨酸(作为两性离子)的缓冲溶液的组合，其用于制备浓度为80mg/ml至200mg/ml的抗体或其抗原结合片段(其具有包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的轻链可变区)的用于人使用的合适的药用组合物，而不影响药用组合物的可加工性和抗体的长期稳定性。来自发明人的一个发现是，根据本发明的药用组合物随时间是稳定的，特别是当储存于2-25℃时，如例如在2-8℃和25℃下所显示的。

术语“稳定的制剂”是指其中目的蛋白质(在此，抗体或其抗原结合片段)在储存后基本上保持其物理、化学和/或生物学特性的制剂。为了测量制剂中的蛋白质稳定性，各种分析方法都完全在技术人员的知识范围之内(参见实施例部分中的一些实施例)。典型地，在所选择的时间段(例如，3个月、6个月、12个月或更长)内在所选择的温度(例如-70℃、2-8℃、25℃、35℃或更高)下评估稳定性。由于抗体(一旦经配制)在施用给患者之前典型地储存在冰箱(典型地2-8℃)中或在室温(典型地15-25℃)下，因而重要的是，所述经配制的抗体至少在2-25℃下随时间是稳定的，如例如在2-8℃和25℃下所显示的。各种值可以用于得出关于在给定时间段内的稳定性的结论(与初始数据相比较)，例如(但并不限于)：1)抗体的单体形式的不超过10％的改变，2)高分子量种类(HMW或HMWS；在本文中也称为聚集体)的不超过5％的增加，3)低分子量种类(LMW或LMWS)的不超过10％的增加，或4)pH的不超过+/-0.3单位变化。

在本发明的所有实施方案中，“药用组合物”也可以称为“稳定的药用组合物”，而没有任何区别。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的药用组合物优选地包含80mg/ml至200mg/mL或者大约80mg/ml至大约200mg/mL，优选地120mg/ml至185mg/ml或者大约120mg/ml至大约185mg/ml，或者120mg/ml至180mg/mL或者大约120mg/ml至大约180mg/mL的所述抗体或其抗原结合片段，例如大约120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180mg/ml，更加优选地大约160mg/mL的所述抗体或其抗原结合片段。

在另一个实施方案中，根据本发明的药用组合物包含0.01％至0.07％(w/v)或者大约0.01％至大约0.07％(w/v)的聚山梨酯80，例如大约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％或0.07％(w/v)的聚山梨酯80。

在另一个实施方案中，根据本发明的药用组合物包含140mM至350mM或者大约140mM至大约350mM的甘氨酸。优选地，根据本发明的药用组合物包含160mM至300mM或者大约160mM至大约300mM的甘氨酸，例如大约160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mM的甘氨酸。在作为整体的本发明的情形下，甘氨酸不是缓冲试剂。的确，在大约4.6至大约5.5的pH下，甘氨酸是两性离子。作为两性离子，它具有与抗体或其抗原结合片段的疏水和亲水部分相互作用的能力，因此可能减少抗体或其抗原结合片段之间的自身相互作用，从而提供稳定化效应。

在另外一个实施方案中，根据作为整体的本发明的药用组合物包含大约20mM至大约100mM的乙酸盐，优选地大约40mM至大约90mM的乙酸盐，例如大约40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90mM的乙酸盐。备选地，根据作为整体的本发明的药用组合物包含大约50mM至大约90mM的乙酸盐，例如大约50、55、60、65、70、75、80、85或90mM的乙酸盐。在一个实施方案中，所述药用组合物包含大约55mM的乙酸盐。在作为整体的本发明的情形下，乙酸盐是缓冲试剂。可以使用任何类型的乙酸盐，例如乙酸钙、乙酸镁、乙酸钠或乙酸锌。优选地，使用乙酸钠。

优选地，根据本发明的药用组合物不包含任何糖(例如单糖、二糖或多糖)，也不包含多元醇。

在根据本发明的药用组合物中所包含的抗体或其抗原结合片段特异性地结合人IL-17A和IL-17F。

在本文中所使用的术语“特异性地结合人IL-17A和IL-17F”及等价物意指，所述抗体将会以足够的亲和力和特异性结合人IL-17A和IL-17F以取得在生物学上有意义的效应。所选择的抗体正常地将会具有对于人IL-17A和IL-17F的结合亲和力，例如，所述抗体可以以100nM至1pM的Kd值结合人IL-17A和IL-17F。抗体亲和力可以例如通过下述测定法来进行测定：基于表面等离子体共振的测定法，例如BIAcore测定法；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA’s)。在本发明的意义内，特异性地结合人IL-17A和IL-17F的抗体或其抗原结合片段也可以结合其他分子，例如cyno IL-17A和IL-17F，或者例如作为非限制性的例子，在将所述抗体或其抗原结合片段掺入到双或多特异性抗体中的情况下。特别地，本发明的抗体或其抗原结合片段不结合除了IL-17A、IL-17F之外的任何其他人IL-17同种型以及IL-17A和IL-17F异二聚体。

IL-17A(最初命名为CTLA-8)是促炎细胞因子，并且是已发现的IL-17家族的第一种IL-17。随后，鉴定出了该家族的5个另外的成员(IL-17B至F)。IL-17A和F具有大约55％氨基酸序列同源性，它们表达为同二聚体和异二聚体，通过受体IL-17R、IL-17RC或IL-17RA/RC传导信号，并且已经与许多自身免疫疾病相关联。

特异性地结合人IL-17A和IL-17F的抗体或其抗原结合片段优选地还中和人IL-17A和IL-17F。

在本文中所使用的术语“中和”是指抑制或大量地降低它所特异性地结合的分子的生物学效应的抗体。因此，表述“抗体中和人IL-17A和IL-17F”是指特异性地结合人IL-17A和IL-17F并且抑制或大量地降低其生物学效应(例如通过阻断IL-17A和IL-17F与其受体结合)的抗体。

在本文中所使用的术语“抗体”是指单克隆或多克隆抗体，并且不限于通过本领域中已知的重组技术而产生的重组抗体。

具有包含SEQ ID NO:1的可变重链和包含SEQ ID NO:2的可变轻链(如在表1中所显示的)的抗体或其抗原结合片段更详细地描述在WO2012095662(其内容通过提及而合并入本文)中。

术语“抗体”也指人源化抗体。人源化抗体是包含源自非人抗体的序列的抗体。对于大多数情况，人源化抗体是其中来自受者的高变区的残基被来自非人物种(供者抗体)例如小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类的高变区或互补性决定区(CDR)的残基替代的人抗体(受者抗体)，其具有所希望的特异性、亲和力和活性。在大多数情况下，在CDR之外即在构架区(FR)中的人(受者)抗体的残基另外还被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受者抗体中或在供者抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。人源化降低了非人抗体在人中的免疫原性，因此促进了应用抗体来治疗人类疾病。人源化抗体和用于产生它们的数种不同技术是本领域中熟知的。术语“抗体”还指人抗体，其可以作为人源化的备选方案而产生。例如，可能的是产生转基因动物(例如，小鼠)，其能够在免疫接种后在不产生内源鼠类抗体的情况下产生全套人抗体。例如，已经描述了，在嵌合和种系突变型小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变型小鼠中将会导致产生具有针对特定抗原的特异性的人抗体，在用所述抗原免疫接种携带人种系免疫球蛋白基因的转基因动物后。用于产生此类转基因动物的技术和用于从此类转基因动物中分离和产生人抗体的技术是本领域中已知的。备选地，在转基因动物(例如小鼠)中，仅将编码小鼠抗体的可变区的免疫球蛋白基因用相应的人可变免疫球蛋白基因序列进行替代。编码抗体恒定区的小鼠种系免疫球蛋白基因保持不变。以这种方式，在转基因小鼠的免疫系统中的抗体效应子功能并且因此B细胞发育是基本上不变的，这可以导致在体内抗原攻击后经改善的抗体应答。一旦已经从此类转基因动物中分离出编码特定的目的抗体的基因，就可以将编码恒定区的基因替代为人恒定区基因以便获得完全人的抗体。在本文中所使用的术语“抗体”还指无糖基化的抗体。

在本文中所使用的术语“其抗原结合片段”或其语法变化形式是指抗体片段。根据本发明的抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv、scFv片段，单链抗体，从抗体片段或抗体形成的双特异性、三特异性、四特异性或多特异性抗体，包括但不限于Fab-Fv或Fab-Fv-Fv构建体。上面所定义的抗体片段是本领域中已知的。

优选地，根据本发明的药用组合物包含(表1)：

1)包含具有SEQ ID NO:1中所定义的序列的重链和具有SEQ ID NO:2中所定义的序列的轻链的抗体；

2)包含具有SEQ ID NO:3中所定义的序列的重链和具有SEQ ID NO:4中所定义的序列的轻链的抗体；或者

3)包含与SEQ ID NO:3中所定义的序列的可变区具有至少80％同一性或相似性，优选地90％同一性或相似性的重链和与SEQ ID NO:4中所定义的序列的可变区具有至少80％同一性或相似性，优选地90％同一性或相似性的轻链的抗体。

表1

典型地，抗体分子可以通过下述方式来产生：在适合于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达出蛋白质的条件下培养包含编码抗体序列的载体的宿主细胞，并且分离所述抗体分子。

为了产生包含重链和轻链两者的产物，可以用两种载体(编码轻链多肽的第一载体和编码重链多肽的第二载体)来转染细胞系。备选地，可以使用单一载体，所述载体包括编码轻链和重链多肽的序列。

可以通过培养用一种或多种编码重组抗体片段的表达载体转染的真核宿主细胞来产生可以按照工业规模来制备的抗体或其抗原结合片段。所述真核宿主细胞优选地为哺乳动物细胞，更优选地中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

可以在任何将会支持其生长和重组蛋白质表达的培养基中培养哺乳动物细胞，优选地，所述培养基为没有动物来源的产品(例如动物血清和蛋白胨)的化学成分确定的培养基。存在可供本领域技术人员使用的不同的细胞培养基，其包含维生素、氨基酸、激素、生长因子、离子、缓冲液、核苷、葡萄糖或等价能源的不同组合(它们以合适的浓度存在)以使得细胞生长和蛋白质产生成为可能。可以在细胞培养循环期间的不同时间以合适的浓度在细胞培养基中包括另外的细胞培养基组分，其将会是本领域技术人员已知的。

哺乳动物细胞培养可以在任何合适的容器，例如摇瓶或生物反应器(其可以以补料分批方式或可以不以补料分批方式进行操作)中进行，取决于所要求的生产规模。这些生物反应器可以是搅拌釜反应器或气升式反应器。各种大规模生物反应器是可得的，其具有大于1,000L至50,000L，优选地5,000L至20,000L或至10,000L的容量。备选地，也可以使用较小规模的生物反应器(例如在2L和100L之间)来制备抗体或抗体片段。

抗体或其抗原结合片段典型地存在于在哺乳动物宿主细胞培养物(典型地CHO细胞培养物)的上清液中。对于其中目的蛋白质例如抗体或其抗原结合片段被分泌到上清液中的CHO培养物加工，所述上清液通过本领域中已知的方法来收集，典型地通过离心。

因此，抗体或其抗原结合片段产生方法包括在细胞培养之后和在蛋白质纯化之前的离心和上清液回收的步骤。在一个进一步的特别的实施方案中，所述离心为连续离心。为了避免疑问，上清液是指位于由于细胞培养物的离心而得到的沉降出的细胞上面的液体。

备选地，宿主细胞为原核细胞，优选地革兰氏阴性细菌。更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞。用于蛋白质表达的原核宿主细胞是本领域中熟知的(Terpe,K.Appl Microbiol Biotechnol72,211-222(2006))。所述宿主细胞为重组细胞，其已进行了遗传改造以产生目的蛋白质，例如抗体的抗原结合片段。重组大肠杆菌宿主细胞可以来源于任何合适的大肠杆菌菌株，包括MC4100、TG1、TG2、DHB4、DH5α、DH1、BL21、K12、XL1Blue和JM109。一个例子是大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)，一个通常用于重组蛋白质发酵的宿主菌株。抗体片段也可以通过培养经修饰的大肠杆菌菌株(例如，代谢突变型或蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株)来产生。

可以在任何将会支持大肠杆菌生长和重组蛋白质表达的培养基中培养大肠杆菌宿主细胞培养物(发酵物)。所述培养基可以是任何化学成分确定的培养基，例如在DuranyO等人(2004).Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphatealdolase in Escherichia coli.Process Biochem 39,1677-1684中所描述的。

大肠杆菌宿主细胞的培养可以在任何合适的容器例如摇瓶或发酵罐中进行，取决于所要求的生产规模。各种大规模发酵罐是可得的，其具有大于1,000升直至大约100,000升的容量。优选地，使用1,000至50,000升，更优选地1,000至25,000、20,000、15,000、12,000或10,000升的发酵罐。也可以使用较小规模的发酵罐，其具有0.5至1,000升的容量。

其他用于在体外获得人抗体的抗原结合片段的方法基于展示技术，例如噬菌体展示或核糖体展示技术，其中使用重组DNA文库，其至少部分地人工地产生或者从供者的免疫球蛋白可变(V)结构域基因储库产生。用于产生人抗体的噬菌体和核糖体展示技术是本领域中熟知的。人抗体也可以从分离的人B细胞产生，所述人B细胞用目的抗原离体免疫接种并且随后进行融合以产生杂交瘤，其然后可以就最佳人抗体来进行筛选。

本领域技术人员将会理解，抗体可以经历各种各样的翻译后修饰。这些修饰的类型和程度经常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可以包括在糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺中的变化。一种频繁的修饰是归因于羧肽酶的作用的羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如在Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所描述的)。因此，抗体重链的C-末端赖氨酸可以不存在。

根据作为整体的本发明的药用组合物具有大约4.6至大约5.5，例如4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5的pH。备选地，它具有大约4.6至大约5.3，例如4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2或5.3的pH。在本发明的所有实施方案中，除非另外指明，pH值在23-25℃下进行测量，并且它在±0.1或±0.2的pH单位之内。

本发明提供了用于制备药用组合物的方法，所述药用组合物包含具有包含SEQ IDNO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段。所述方法包括下列步骤：a)制备低浓度制剂，这通过将大约40mg/ml至大约50mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段与pH为大约4.6至大约5.5的包含甘氨酸和乙酸盐的缓冲溶液相组合来进行；和然后b)制备高浓度制剂，这通过将在a)中所获得的低浓度制剂中的抗体或其抗原结合片段浓缩至大约160mg/ml至180mg/ml的浓度来进行；和最后c)向在b)中所获得的高浓度制剂添加聚山梨酯80。任选地，在步骤c)之前，可以用包含甘氨酸和乙酸盐的缓冲溶液调节所述抗体或其抗原结合片段的浓度。

用于在根据本发明的药用组合物之内使用的另外的赋形剂包括但不限于，粘度增强试剂、填充剂、增溶剂或其组合。

本发明还提供了包含根据本发明的药用组合物的容器。特别地，所述容器可以(无任何限制)为包含所述药用组合物的小瓶、安瓿、试管、瓶子或注射器(例如预填充式注射器)。

所述容器可以是分部试剂盒(kit-of-parts)的一部分，所述分部试剂盒包含一个或多个包含根据本发明的药用组合物的容器，和递送装置例如注射器、预填充式注射器、自动注射器、无针装置、植入物或贴片，或者其他用于胃肠外施用的装置，和使用说明书。

在本发明的一个实施方案中，容器包含药用组合物，所述药用组合物包含：

a.大约80mg/ml至大约200mg/mL，备选地大约120mg/ml至大约185mg/ml的抗体或其抗原结合片段，其具有：

i.包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的轻链可变区；或

ii.包含SEQ ID NO:3的重链和包含SEQ ID NO:4的轻链；或

iii.与SEQ ID NO:3中所定义的序列的恒定区具有至少80％同一性或相似性，优选地90％同一性或相似性的重链和与SEQ ID NO:4中所定义的序列的恒定区具有至少80％同一性或相似性，优选地90％同一性或相似性的轻链；

b.乙酸盐；

c.甘氨酸；

d.聚山梨酯80，

其中所述组合物具有大约4.6至大约5.5的pH。

在本发明的一个优选的实施方案中，容器包含药用组合物，所述药用组合物包含：

a.大约160mg/mL的抗体或其抗原结合片段，其具有：

ii.包含SEQ ID NO:3的重链和包含SEQ ID NO:4的轻链；或

b.乙酸钠；

c.甘氨酸；

d.聚山梨酯80，

其中所述组合物具有大约4.6至大约5.5的pH。

也优选地，本发明提供了包含通过根据本发明的方法而获得的药用组合物的容器，所述方法包括下列步骤：

a.制备低浓度制剂，这通过将大约40mg/ml至大约50mg/ml的具有包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的轻链可变区的抗体或其抗原结合片段与pH为大约4.6至大约5.5的包含甘氨酸和乙酸盐的缓冲溶液相组合来进行；

b.制备高浓度制剂，这通过将在a)中所获得的低浓度制剂的抗体或其抗原结合片段浓缩至大约160mg/ml至180mg/ml的浓度来进行；

c.向在b)中所获得的高浓度制剂添加聚山梨酯80，优选地以大约0.01％至0.07％(w/v)；

d.任选地，在步骤c)之前，用包含甘氨酸和乙酸盐的缓冲溶液调节所述抗体或其抗原结合片段的浓度。

通过本发明的方法而获得且包含在容器中的药用组合物具有大约4.6至5.5的pH。

优选地，所述缓冲溶液包含大约20mM至大约100mM的乙酸盐，优选地大约40mM至大约90mM的乙酸盐，和大约140mM至350mM的甘氨酸。

根据本发明的药用组合物或液体药用制剂用于在疗法中使用。

在一个实施方案中，用于在疗法中使用的药用组合物包含80mg/mL至200mg/mL，优选地大约120mg/mL至185mg/mL的抗体或其抗原结合片段，乙酸盐、甘氨酸、聚山梨酯80，处于大约4.6至大约5.5的pH；

其中所述抗体或其抗原结合片段(当它可以适用时)包含：

1)包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的轻链可变区；或

2)包含SEQ ID NO:3的重链和包含SEQ ID NO:4的轻链；或

3)与SEQ ID NO:3中所定义的序列的恒定区具有至少80％同一性或相似性，优选地90％同一性或相似性的重链和与SEQ ID NO:4中所定义的序列的恒定区具有至少80％同一性或相似性，优选地90％同一性或相似性的轻链；

优选地，大约20mM至大约100mM的乙酸盐，大约140mM至大约350mM的甘氨酸，和大约0.01％至大约0.07％(w/v)的聚山梨酯80，处于大约4.6至大约5.5的pH。

在另一个实施方案中，用于在疗法中使用的药用组合物是通过根据本发明的方法来获得的，所述方法包括下列步骤：

根据本发明的药用组合物还用于在治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症中使用。

在一个实施方案中，用于在治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症中使用的药用组合物包含80mg/mL至200mg/mL，优选地大约120mg/mL至大约185mg/mL的抗体或其抗原结合片段，乙酸盐、甘氨酸、聚山梨酯80，处于大约4.6至大约5.5的pH；

其中所述抗体或其抗原结合片段(当它可以适用时)包含：

2)包含SEQ ID NO:3的重链和包含SEQ ID NO:4的轻链；或

在一个优选的实施方案中，用于在治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症中使用的药用组合物是通过根据本发明的方法来获得的，所述方法包括下列步骤：

c.向在b)中所获得的高浓度制剂添加聚山梨酯80，优选地以大约0.01％至大约0.07％(w/v)；

本发明还提供了所述药用组合物在制备用于治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症的药物中的用途，其中所述药用组合物包含大约80mg/mL至大约200mg/mL，优选地大约120mg/mL至大约180mg/mL的抗体或其抗原结合片段，乙酸盐、甘氨酸、聚山梨酯80，处于大约4.6至大约5.5的pH；

其中所述抗体或其抗原结合片段(当它可以适用时)包含：

2)包含SEQ ID NO:3的重链和包含SEQ ID NO:4的轻链；或

优选地，大约20mM至大约100mM的乙酸钠，大约140mM至大约350mM的甘氨酸，和大约0.01％至大约0.07％(w/v)的聚山梨酯80，处于大约4.6至大约5.5的pH。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了所述药用组合物在制备用于治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症的药物中的用途，其中所述药用组合物是通过根据本发明的方法来获得的，所述方法包括下列步骤：

本发明还考虑了用于在哺乳动物受试者中治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症的方法，所述方法包括施用药用组合物，所述药用组合物包含大约80mg/mL至大约200mg/mL，优选地大约120mg/mL至185mg/mL的抗体或其抗原结合片段，乙酸盐、甘氨酸、聚山梨酯80，处于大约4.6至大约5.5的pH；

其中所述抗体或其抗原结合片段(当它可以适用时)包含：

2)包含SEQ ID NO:3的重链和包含SEQ ID NO:4的轻链；或

优选地，大约20mM至大约100mM的乙酸盐，大约150mM至大约250mM的甘氨酸，和大约0.01％至大约0.07％(w/v)的聚山梨酯80，处于大约4.6至大约5.5的pH。

优选地，所述病理学病症选自由下列各项组成的组：感染(病毒、细菌、真菌和寄生虫)、与感染相关联的内毒素性休克、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、全身型幼年特发性关节炎(JIA)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、慢性阻塞性气道疾病(COAD)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性肺损伤、盆腔炎性疾病、阿尔茨海默病、克罗恩病、炎性肠病、肠易激惹综合征、溃疡性结肠炎、卡斯尔曼病、强直性脊椎炎、中轴型脊椎关节炎和其他脊椎关节病、皮肌炎、心肌炎、葡萄膜炎、眼球突出、自身免疫性甲状腺炎、佩罗尼病、腹部疾病、胆囊疾病、藏毛病、腹膜炎、银屑病、特应性皮炎、脉管炎、外科手术粘连、中风、自身免疫性糖尿病、I型糖尿病、莱姆关节炎、脑膜脑炎、免疫介导的中枢和周围神经系统的炎性病症例如多发性硬化和吉-巴综合征、其他自身免疫病症、胰腺炎、创伤(外科手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、纤维化病症(包括肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、硬皮病或系统性硬化病)、癌症(实体肿瘤例如黑素瘤、肝母细胞瘤、肉瘤、鳞状细胞癌、移行细胞癌、卵巢癌，和恶性血液病，特别是急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、胃癌和结肠癌)、心脏疾病(包括局部缺血性疾病例如心肌梗死以及动脉粥样硬化)、血管内凝血、骨吸收、骨质疏松症、牙周炎和胃酸过少。

更优选地，所述病理学病症选自由下列各项组成的组：关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、全身型幼年特发性关节炎(JIA)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、慢性阻塞性气道疾病、慢性阻塞性肺疾病、特应性皮炎、硬皮病、系统性硬化病、肺纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊椎炎、中轴型脊椎关节炎和其他脊椎关节病；和更加优选地，所述病理学病症选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊椎炎和中轴型脊椎关节炎。

更加优选地，所述病理学病症选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊椎炎和中轴型脊椎关节炎。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述药用组合物用于在治疗或预防类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊椎炎和中轴型脊椎关节炎中使用，并且包含大约160mg/mL的抗体或其抗原结合片段，乙酸盐、甘氨酸、聚山梨酯80，处于大约4.6至大约5.5的pH；

其中所述抗体或其抗原结合片段(当它可以适用时)包含：

2)包含SEQ ID NO:3的重链和包含SEQ ID NO:4的轻链；或

3)与SEQ ID NO:3中所定义的序列的恒定区具有至少80％同一性或相似性，优选地90％同一性或相似性的重链和与SEQ ID NO:4中所定义的序列的恒定区具有至少80％同一性或相似性，优选地90％同一性或相似性的轻链。

在另一个优选的实施方案中，所述药用组合物用于在治疗或预防类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊椎炎和中轴型脊椎关节炎中使用，其中所述药用组合物是通过根据本发明的方法来获得的，所述方法包括下列步骤：

根据本发明的药用组合物可以以治疗有效量进行施用。在本文中所使用的术语“治疗有效量”是指对于治疗、改善或预防所靶向的疾病、病症或状况来说或者对于展示出可检测的治疗性、药理学或预防性效应来说所需要的治疗试剂(即，抗体)的量。对于任何抗体或其抗原结合片段，所述治疗有效量可以最初在细胞培养测定法中或者在动物模型中(通常在啮齿类、兔、狗、猪或灵长类中)进行估计。动物模型也可以用于测定合适的浓度范围和施用途径。然后，此类信息可以用于确定对于在人中施用来说有用的剂量和途径。

用于人受试者的精确的治疗有效量将会取决于疾病状态的严重度，受试者的总体健康，受试者的年龄、体重和性别，膳食，施用的时间和频次、药物组合、反应敏感性和对于疗法的耐受/应答。该量可以通过常规实验来进行测定，并且在临床医生的判断力之内。通常，抗体的治疗有效量将会是0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg或1mg/kg至100mg/kg。

对于上述疾病和/或病症的治疗，合适的剂量将会取决于例如待采用的具体抗体、接受治疗的受试者、施用方式以及正在治疗的状况的性质和严重度而变化。在一个特别的实施方案中，根据本发明的药用组合物通过静脉内或皮下途径来进行施用。当通过静脉内注射进行施用时，它可以作为推注注射或作为连续输注来进行施用。根据本发明的任何一个实施方案的药用组合物也可以通过肌内注射来进行施用。所述药用组合物可以通过使用注射器、注射装置例如自动注射器、无针装置、植入物和贴片来进行注射。

本发明的液体药用制剂以一次或在一系列治疗中适当地施用给患者，并且可以在从诊断以后的任何时间施用给患者；它可以作为单独的治疗或者与在治疗在本文前面所描述的状况中有用的其他药物或疗法相联合地来进行施用。

所述抗体或其抗原结合片段可以为在所述液体药用制剂中的唯一活性成分。备选地，所述抗体或其抗原结合片段可以与一种或多种其他在治疗上有活性的成分相组合地(例如，同时地、顺次地或分开地)进行施用。在本文中所采用的活性成分是指在适宜的剂量下具有药理学效应(例如治疗效应)的成分。在一些实施方案中，在所述药用组合物中的所述抗体或其抗原结合片段可以伴随有通过相同或不同的施用途径进行施用的其他活性成分(包括其他抗体或非抗体成分)，以治疗其他炎性疾病或自身免疫疾病。在一个实施方案中，向受试者同时地或依次地(之前和/或之后)施用其他抗体成分(例如抗-TNF抗体)或非抗体成分(例如小分子药物分子)。

现在，将会通过实施例并参考在附图中所图解说明的实施方案来进一步描述本发明。

实施例

缩写

抗-IL-17A/F Ab：具有在表1的SEQ ID NO:3和4中所定义的序列的抗IL-17A和IL-17F抗体；AFT：加速冷冻/解冻；BPP：生物制品中试工厂(Biologics Pilot Plant)；CCPS：细胞培养工艺科学；CEX-HPLC：阳离子交换色谱法-高压液相色谱法；cIEF：毛细管等电聚焦；DSL：动态光散射；DFS：差异扫描荧光测定法；DPS：下游工艺科学；DTT：二硫苏糖醇；FZT：冷冻/解冻；HMW：高分子量；HPLC：高压液相色谱法；HSC：高通量自相互作用色谱法；IAA：碘乙酰胺；ICE：成像毛细管电泳；LMW：低分子量；MW：分子量；NP：不可得；PCR：聚合酶链反应；PEG：聚乙二醇；PES：聚醚砜；PS20：聚山梨酯20；PS80：聚山梨酯80；PTFE：聚四氟乙烯；PVDF：聚偏1,1-二氟乙烯；RH：相对湿度；％RSD：％相对标准偏差；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；s：秒；SEC：大小排阻色谱法；SEC-HPLC：大小排阻色谱法-高压液相色谱法；SIC：自相互作用色谱法；Trp：色氨酸；WFI：注射用水；w/v：重量/体积。

实施例1：添加物筛选

初始的筛选研究通过下述方式来进行：探询不同的添加物对于1mg/mL的抗-IL-17A和抗-IL-17F抗体的影响，这通过用SIC测定B22(第二维里系数)值，并选择具有最大成功可能性的前5种制剂(HSC^TM Technology)。正的B22值暗示那种添加物可以帮助更有效地减轻可以导致在包含抗-IL-17A/F Ab的制剂中的聚集和其他类型的降的蛋白质-蛋白质相互作用。

筛选了不同的添加物。鉴定出返回最高B22值而同时不损害抗体的构象稳定性的最高等添加物。从最好的9种添加物和3种缓冲液系统的可能组合的不完全析因设计中产生了总共36种制剂，并且通过HSC^TM Technology(Soluble Therapeutics^TM)测量了所得的B22值。

从这36种制剂的分析中，预测了5种制剂(表2)并通过SIC进行了验证(数据未显示)。在表2中，M表示测量出的B22值，和C表示计算出的B22值。

表2

实施例2：高浓度抗体对于表现最好的制剂的效应

将用1mg/ml的抗-IL-17A/F Ab在实施例1中进行的研究的结果随后在大约160mg/ml的抗-IL-17A/F Ab的浓度下进行验证，并且发现不是代表性的。

在该筛选中所包括的制剂为(表3)：

表3

通过使用具有MWCO为30kDa的PES膜的vivaflow 50盒浓缩在20mM组氨酸、250mM山梨醇pH 6.0中的88.7mg/mL的抗-IL-17A/F Ab。观察到抗体损失，并且为了解释该预测的损失，在通过使用包含Sephadex G-25介质的PD10柱将该缓冲液交换为适宜的制剂缓冲液之前，将抗体浓缩直至175mg/mL。

在缓冲液交换后，使用适宜的制剂缓冲液(表3-制剂1-6)将最终制剂调节至160mg/mL；所述量是可忽略的并且不影响缓冲液组分的浓度。在该调节后，将PS20加入到制剂2和4中以分别达到0.00044％和0.00022％(w/v)的最终含量，并且将苄醇加入到制剂3中以达到0.1％(w/v)的最终含量。

在层流通风橱下，将制剂1-6转移到2mL 96深孔平板中，然后亚等分到二十个无菌的96-孔半区平板(80μL/孔)中。还将1mL的每种制剂也转移到无菌的用经Flurotec涂覆的Westar橡胶塞和Tru-Edge Flip off密封盖密封的2mL Schott I型玻璃小瓶中以用于初始测试。

如下储存平板(表4：a：2ml Schott小瓶–保留在96-孔平板中；b：仅对于制剂1；c：对于制剂2-6；d：对于制剂2-6，该测量在5周时进行)

表4

通过使用Cryomed受控速率冷冻机冷冻/解冻所述制剂五次来施加冷冻/解冻应力，对于低速率冷冻/解冻实验(FZT)，冷冻和解冻速率设置在0.5℃/分钟，和对于加速速率冷冻/解冻实验(AFT)，冷冻和解冻速率设置在2℃/分钟。在每种情况下，将冷冻机的探针插入到包含具有与样品相似的粘度的水/甘油溶液的另一个平板的孔中。对于制剂1，在4周后在5℃下进行FZT分析，而对于制剂2-6，在8周后在5℃下进行FZT分析。对于制剂1，在1周后在5℃下进行AFT分析，和对于制剂2-6，在5周后在5℃下进行AFT分析。

目视评估

通过使用Epson Scanner Expression v750 Pro J221A型在颜色(1200dpi，24比特，无图像处理)和灰度(1200dpi，16比特，无图像处理)下扫描平板。自动化目视检查扫描通过使用Molecular Devices M5平板阅读器来进行，其中进行1点孔扫描，测量在600nm下的吸光度。

通过目视检查，对于所有时间点和条件，制剂1总是看起来比所有其余制剂更浑浊。通过A600，在所有条件下，制剂1和2看起来显示出在600nm下的吸光度的增加(表8)，但是该增加是较小的。在FZT和AFT应力后，制剂1显示出在600nm下的吸光度的增加(表5)，在AFT应力后增加较不明显。

表5

通过在280nm下的UV的蛋白质浓度测定

用经过滤的去离子水将样品稀释至20mg/mL的标称浓度，然后稀释至0.5mg/mL的标称浓度。通过使用在280nm下的吸光度并与标准曲线相组合来测定浓度，这在平底UV透明96-孔平板中以1.56mL/(mg*cm)的消光系数通过使用Molecular devices M5平板阅读器(样品体积：100μL)来进行。

在该研究的过程中在该数据中未能观察到明显的下降或增加趋势(表6A)。

表6A

pH测量

在23-25℃下在Mettler Toledo S47 pH计上测定pH。在测量之前不进行稀释。

对于储存于5℃的样品，在该研究的过程中，关于所有制剂的pH值都在初始值的0.2pH单位之内(表6B)。

表6B

A：没有样品剩余在平板中；b：制剂1不得不重新制备，损害了在T12时的时间收集

对于制剂3，初始值比单独的缓冲液的值高0.14，这暗示在该缓冲液中抗体驱使pH值向上。制剂1和4，尽管pH在初始值的0.2pH单位之内，但看起来存在显示出分别在2和3个月内逐渐增加的趋势，这在其他制剂中未观察到。对于储存于25℃的样品，在该研究的过程中，关于制剂2、3、5和6的pH值在0.2pH单位之内，其中制剂2、5和6由于在T12时没有剩余的样品而不能被测定。对于储存于25℃的样品，对于制剂1和4，从T04向前，在25℃和35℃下可以观察到pH的显著增加，这暗示样品的降解或污染。对于储存于35℃的样品，制剂2、5和6展示出在初始值的0.2pH单位之内的pH，其中对于制剂6在T08时观察到偏离趋势的值。由于对于制剂2和5在T12时没有样品剩余用于测量，因而关于随时间的pH增加的可能性无法得出结论，因为值仍然在初始值的0.2pH单位之内。制剂3在T12时显示出pH的异常增加。

大小排阻色谱法

通过使用具有96-孔平板自动取样器的Agilent 1200系列HPLC对于在经过滤的流动相(0.2M磷酸钠pH7.0)中稀释至5mg/mL的样品等分试样进行分析。分析如下来进行：

·样品载量：50μL(250μg)，以5mg/mL

·柱子：Tosoh BioScience TSK Gel G3000 SWXL,

5μm,7.8x300 mm(部件号：8541)

·洗脱剂A：0.2M磷酸钠，pH7.0

·流速：1mL/分钟

·检测：UV(波长：280nm，分辨率：8nm，参照：关)

·柱温：25℃

·样品温度：4℃

·梯度：等度

·最大压力：70巴

·运行时间：15分钟

·后时间：5分钟。

使用Empower 2软件来进行数据分析。

在表7中显示了关于制剂1-6的通过SEC的HMW种类的％增加，相比于参考制剂DS(在20mM组氨酸、250mM山梨醇、0.02％聚山梨酯80(pH 6.0)中的80mg/ml的抗-IL-17A/FAb)和DP(与DS相同但是包装在玻璃小瓶中)而言。

对于储存于5℃的样品，在12周后，制剂2、4、5和6显示出与DS和DP制剂相似的降解程度，其中制剂3显示出比DS和DP制剂更高的聚集增加。对于制剂2、3、5和6，片段的产生是最小的(数据未显示)。

对于储存于25℃的样品，制剂3是最好的表现者，但是所有制剂都比DS和DP制剂表现差。所有制剂都显示出制剂的片段化水平的增加(数据未显示)。制剂2显示出在12周内％HMW种类的降低和片段化的显著增加。

对于储存于35℃的样品，制剂6是最好的表现者，但是所有制剂都比DS和DP制剂表现差。所有制剂都显示出片段化水平的增加(数据未显示)。

表7

iCE

通过使用Protein Simple iCE3系统来进行成像毛细管电泳。分析如下来进行：

用经过滤的去离子水将制剂1-6稀释至20mg/mL的标称浓度，然后稀释至2mg/mL的浓度(使用通过A280测定的浓度)。分析在处于0.2mg/mL(处于2mg/mL的样品在主混合物中的1/10稀释)的样品上进行。制备具有下列组分的主混合物(表8)：

表8

聚焦参数如下：在1500伏特下1分钟，随后为在3000伏特下6分钟。

结果报告在表9A(％酸性种类)和表9B(％碱性种类)中。在5℃下，横跨所有条件和制剂均未能观察到％酸性种类的显著变化，值都在2-3％之内。

对于储存于25℃的样品，在12周内对于所有制剂都可以观察到％酸性种类的增加，其中制剂1和4显示出显著的增加。该观察结果很可能与在初始混合后在那2种制剂中所观察到的pH增加有关。

对于储存于35℃的样品，在初始混合后和随后的时间点对于所有制剂都观察到％酸性种类的显著增加，其中制剂4在12周内显示出最大增加。冷冻/解冻应力不影响在任何制剂中的酸性种类的％。

关于％碱性种类，在5℃下，横跨所有制剂和时间点均未观察到显著变化。

对于储存于25℃的样品，制剂3、5和6显示出随时间的％碱性种类的略微增加，其中制剂1和4显示出碱性种类的更显著的增加(大约2.5％)。

对于储存于35℃的样品，所有制剂都显示出％碱性种类的增加，其中制剂3显示出最低的增加。冷冻/解冻应力不影响在任何制剂中的碱性种类的％。

表9A

a：不可得

b：没有样品剩余以待测试表9B

a：不可得

b：没有样品剩余以待测试

固有荧光

在100μL的来自处于0.5mg/mL抗体的每种制剂的样品上进行分析。该方法基于Trp的固有的荧光特性。已知Trp当在280nm下激发并屏蔽开水时，在340nm下强烈地发荧光；暴露于水的Trp微弱地发荧光。该特性可以用于评估蛋白质的稳定性，当蛋白质开始解折叠时，被屏蔽的Trp暴露于水，从而导致荧光减小，当蛋白质聚集时，更多的Trp被屏蔽，荧光应当增加。该方法在平底96-孔不透明黑色荧光平板中进行，通过使用Molecular Devices M5平板阅读器(从顶部读取，没有摇动)，以280nm的激发波长和310nm至370nm的发射波长，6次闪烁/读取。空白平板为水，并且参考标准为0.5mg/mL的5x参考标准。将结果相对于参考标准就浓度进行标准化，并且报告为响应因子(表11)，其中使用下面的计算：

((FLU/浓度)/FLU参考标准)*100

在5℃下，在12周内，制剂2和3显示出比制剂4、5和6更少的响应因子增加，这暗示对于制剂2和3，所述分子较不易于聚集(表10)。对于所有制剂2-6，在T04时存在显著增加，这在其他条件下也观察到。对此的可能解释可以是在1个月后在所有制剂2-6中的增加的聚集易感性，这将会是可逆的(非共价聚集)，因为对于随后的时间点，该效应不明显得多。但是，由于该效应横跨所有条件是相似的并且我们期望在较低的温度下看见较小的效应，因而该观察结果看起来是一个逸出值，因为在T04时的所有测量都是较高的。这也可能与制备或测量中的误差有关。

在25℃下，在12周内，相比于制剂3、4、5和6而言，制剂2显示出最少的响应因子增加，这暗示对于该制剂，所述分子较不易于聚集。

在35℃下，在12周内，相比于制剂3、5和6而言，制剂2和4显示出最少的响应因子增加，这暗示对于制剂2和4，所述分子较不易于聚集。

在慢的和快的冷冻/解冻应力后，制剂2、4和6显示出比制剂3和5更少的响应因子增加，这暗示对于制剂2、4和6，所述分子较不易于聚集。

在制剂1的情况下，在慢的和快的冷冻/解冻应力后以及在所有条件下在12周后响应因子下降，这可能与在该制剂中蛋白质的解折叠有关。

要注意的是，并不知道在哪个点响应因子的改变幅度变得显著以便区分制剂。因此，难以仅基于固有荧光来判断制剂的性能，因为它不与SEC数据相关。

表10

动态光散射

在没有聚山梨酯80或蔗糖(其中那些赋形剂是制剂的一部分)的适宜的经过滤的缓冲液中稀释至大约5mg/mL的样品等分试样上进行分析，其中使用具有96-孔平板自动取样器的Malvern APS Zetasizer。分析如在表11上所示的那样来进行，具有90°的散射角和0.5μm的大小范围上限。

表11

参数	大小标准(60μm)	蛋白质样品
			材料	胶乳	蛋白质
溶剂	水	水
			温度	25℃	25℃
平衡时间	120秒	120秒
			取样速度	缺省	缺省
清洁	大力洗涤<sup>a</sup>	大力洗涤<sup>a</sup>
			测量持续时间	自动	自动
测量次数	3	5
			对于大颗粒的延长的持续时间	-	是
弛豫时间乘数	-	1000000
			自动衰减选择	是	是
数据处理	通用目的	蛋白质分析

a：冲洗溶剂：经过滤的去离子水；洗涤溶剂：1M NaOH

从DLS测量所考虑的参数为通过强度分布的％单体和％Pd(多分散性)。％单体严格地说不是单体，因为DLS不能区别分子，除非它们具有至少6倍于单体的大小。％Pd给出所述分布是否是单分散的指示；但是，该技术可能不能检测二聚体种类。根据制造商的印刷资料，具有小于23％的％Pd的分布为单分散，具有小于28％的％Pd的分布为近似单分散，和具有大于28％的％Pd的分布为多分散。

在初始温度下，通过强度分布的％单体对于所有制剂都是低的(低于大约80％)(数据未显示)，除了制剂1(高于90％)。在整个研究自始至终，在5℃下，对于制剂2-6，该值为大约82-98％，除了制剂3，对于其观察到的值为大约66-68％。在25℃下，制剂1、3和4是表现最差的制剂，其中对于制剂1和3在T初始后和对于制剂4在T04后，通过强度的％单体变化至低于80％的值。在35℃下，制剂1、3和4是表现最差的制剂，其中在初始时间点后通过强度的％单体变化至≤80％的值。对于制剂5，该变化在T04后出现。

关于％Pd，在5℃和25℃下，横跨所有条件和制剂均未能观察到真正的趋势，其中所有值都低于23％，这意味着单分散分布。在35℃下，即使％Pd低于23％，也可以横跨所有制剂观察到增加趋势。

差异扫描荧光测定法

该方法通过使用Applied BioSystem 7500快速实时PCR恒温箱通过Thermofluor来进行。该方法的基础是当蛋白质经历温度增加时，它们开始解折叠。向蛋白质添加染料(所述染料在水性环境中被猝灭，但在非极性环境中不被猝灭)，并且当解折叠发生时，所述染料结合至暴露的疏水区并发射荧光响应，其被PCR恒温箱的检测器所检测到。蛋白质的不同区域具有不同的热稳定性，因此将会在不同的温度下解折叠。已知解折叠发生时所处的温度为热变性的中点。温度越高，在特定环境中蛋白质的热稳定性就越高。

使用适宜的制剂缓冲液将所有样品稀释至0.12mg/mL。制备四重重复制备物。因为不知道聚山梨酯20、PEG3350和苄醇的效应，因此进行下面的测量：

将制剂1稀释在具有和没有PEG3350的制剂缓冲液中进行测量。

将制剂2和4稀释在具有和没有PS20的制剂缓冲液中进行测量。

将制剂3稀释在具有和没有苄醇的制剂缓冲液中进行测量。

将制剂5和6在其各自的制剂缓冲液中进行测量。

通过将2μL的1000X Protein Thermal Shift染料与250μl的去离子水相混合以获得8X Protein Thermal Shift染料溶液来制备染料溶液。

用于该测定法的样品制备如在表12A中所示。

表12A

组分	体积(μL)
		Protein Thermal Shift缓冲液	5
处于0.12mg/mL的样品	12.5
		8X Protein Thermal Shift染料	2.5

在Applied Biosystems MicroAmp Fast Optical 96-孔平板中制备三重重复样品，并且用Applied Biosystems MicroAmp Optical粘合膜密封。使用Protein ThermalShift软件来进行数据分析。仅Tm2可以被自动测定。Tm1通过使用温谱图的一阶导数来手工进行估计。

为了能够通过DSF来区分制剂，Tm的差异需要大于2℃(表12B)。结果表明：至少通过DSF，所有制剂是相似的。

表12B

制剂	Tm1<sup>a</sup>	Tm2<sup>b</sup>
			1	70-72	74.5
2	70-72	75.0
			3	70-72	75.2
4	70-72	74.7
			5	70-72	75.2
6	70-72	75.2

a：一阶导数肩；b：一阶导数主峰

重量摩尔渗透压浓度

使用制造商的实验方案，在Advanced Micro-Osmometer Model 3320上通过凝固点下降法来进行分析。以三次重复测量样品。制剂1和6低于240mOsm/kg，其不适合皮下注射(表13)。

表13

制剂	以mOsm/kg表示的重量摩尔渗透压浓度
		1	168
2	255
		3	251
4	408
		5	391
6	173

粘度

通过使用稳态传感流量扫描(steady state sensing flow sweep)方法，使用TAInstruments DHR-1流变仪在76μL样品等分试样上进行分析。所使用的几何学为20mm,1.99°锥体，其具有包含去离子水的溶剂捕集器以减少在测量期间材料的蒸发。对于稳态传感流量扫描方法，对于所有在其之处达到稳态的点将粘度进行平均(接受标准：点之间小于或等于5％RSD)。

稳态传感流量扫描

温度：25℃

浸泡时间：10秒

扫描：对数式

剪切速率：2.9-287.9s^-1

点/十倍程(points per decade)：5

稳态传感：是

最大平衡时间：180s

取样周期：25s

％容差：5

连续范围：3

受控速率：电机模式自动

数据获取：‘保存点显示’

步骤终止：无

除了制剂6，所有制剂都被认为是合适的(表14)。

表14

a：失败

结论

SEC和DLS已被鉴定为区分测定法。

考虑在5℃下的SEC，制剂3在12周内显示出增加的聚集率，然而B22值与制剂4和5相似。而且，具有比制剂4、5和6(2.8-2.9)更高的B22值(3.5)的制剂2并不比制剂4、5和6表现得好，而具有负的B22(其与导致较高聚集倾向的蛋白质-蛋白质净吸引是同义的)的制剂6与制剂2、4和5表现相似。考虑DLS，当储存于5℃时，制剂6看起来行为最好，而制剂3表现最差。

已知蛋白质自缔合主要与胶体稳定性相关，而部分解折叠的中间物的形成主要与构象稳定性相关。但是，这2种聚集途径有时难以区分。相对B22值经常并不指示聚集趋势，因为在不同的溶液条件中可以获得相似的B22值，无论不同的聚集趋势或条件，其中所测量的B22是更负的，其显示出更小的聚集倾向(Bajaj,H.,Sharma,V.K和Kalonia,D.S.,2004,Biophys.J.87(6),4048-4054)。

在本文中所例示的抗-IL-17A/F Ab的情况下，使用B22值的筛选方法不与处于160mg/mL的该分子的聚集行为相关。这可能归因于下述事实：聚集的机制在1mg/mL和160mg/mL下是不同的；或者蛋白质自缔合的倾向并不是主要支配该分子的降解/聚集的那种。

另外，制剂1和6低于240mOsm/kg阈值，具有低于这样的值的重量摩尔渗透压浓度的制剂不适合于皮下注射；因此在进一步的长期稳定性评价中不包括它们。由于在12周内的聚集率，制剂3也被排除。

实施例3：聚集研究1

为了评估根据本发明的抗-IL-17A/F抗体的HMW种类形成的动力学，在2种制剂缓冲液中：

A：20mM组氨酸，250mM山梨醇，pH6.0，和

B：55mM乙酸钠，220mM甘氨酸，pH5.0，

以4种不同浓度(80、120、160和200mg/mL)的抗体和聚山梨酯80(0.02％、0.03％、0.04％和0.05％，取决于抗体的浓度)，在具有许多时间点的3个月内，在3种储存条件(5℃、25℃/60％RH和35℃/75％RH)下通过HMW种类形成的SEC进行了研究。

根据本发明的抗-IL-17A/F抗体以大约88mg/mL在20mM组氨酸、250mM山梨醇pH6.0的原始缓冲液中，因此仅对于没有聚山梨酯80的缓冲液B通过使用具有PES膜和30kDa的MWCO的Vivaflow 50盒进行缓冲液交换。进行三轮2个体积的制剂缓冲液B。

将在制剂缓冲液A和B中的抗体浓缩至120mg/ml、160mg/ml和200mg/mL的标称靶值。用适宜的缓冲液调节不在靶值的5％之内的浓度值。使用SoloVPE(与Cary50分光光度计相连接的来自C.Technologies的Variable Path Extension系统)，在280nm处以1.56的消光系数测量浓度。

通过使用具有0.22μm PVDF膜的Steriflip管无菌过滤所有所制备的制剂，除了处于200mg/mL的制剂B外，其中在PVDF膜被堵塞后使用PES膜。在处于200mg/mL的制剂A中的样品更容易地通过使用PVDF膜过滤器进行过滤，而在处于200mg/mL的制剂B中的样品更容易地通过使用PES膜过滤器进行过滤。

向所有制剂加入适宜量的聚山梨酯80以便获得在表5中所列出的值。这在层流通风橱中进行。

表15

制剂	PS80浓度(％w/v)
		处于80mg/mL的制剂A和B	0.02
处于120mg/mL的制剂A和B	0.03
		处于160mg/mL的制剂A和B	0.04
处于200mg/mL的制剂A和B	0.05

对于在每种浓度下的每种制剂准备三个具有1mL填充容量的2ml小瓶。在每个时间点，将小瓶转移到层流通风橱中并，且取2×10μl等分试样/样品用于通过SEC的分析，随后为密封小瓶并放置在适宜的储存条件下。到最后一个时间点顶部空间的减小将不会影响该研究的结果，因为取自从1个小瓶的总体积仅为260μL。储存在5℃、25℃/60％RH和35℃/75％RH下在初始时间、1、2、3、4、5、7、10、14、18、28、42、56和84天时进行。仅对于处于160mg/ml的制剂B进行在168天时的进一步测量。

大小排阻色谱法

样品载量：50μL(250μg)，以5mg/mL

柱子：Tosoh BioScience TSK Gel G3000 SWXL,

5μm,7.8x300 mm

洗脱剂A：0.2M磷酸钠，pH7.0

流速：1mL/分钟

检测：UV(波长：280nm，分辨率：8nm，参照：关)

柱温：25℃

样品温度：4℃

梯度：等度

最大压力：70巴

运行时间：15分钟

后时间：5分钟。

使用Empower 2软件来进行数据分析。

在表16和17中所报告的聚集率是指对于每种制剂的平均月比率增加，基于在3个月后或在6个月后所测量的聚集，相比于在T0时的而言。

在所有浓度下，制剂B是表现最好的制剂，具有在5℃下随时间的较低的聚集率(表16)。另外，在6个月后，以160mg/mL的抗-IL-17A/F Ab浓度的具有55mM乙酸钠、220mM甘氨酸、0.04％(w/v)PS80 pH 5.0的制剂显示出与DP制剂或与在5℃下在20mM组氨酸、250mM山梨醇、0.02％(w/v)PS80 pH 6.0中以80mg/mL的抗-IL-17A/F Ab浓度的制剂在3个月后的比率相似的聚集率(表16)。在5℃下没有显著的随时间的％LMW种类增加(数据未显示)。

表16

在25℃下，对于每种浓度，制剂A和B展示出相当的随时间的聚集率(表17)。但是，制剂B在25℃下显示出略微更高的随时间而片段化的倾向，这导致在25℃下对于所有浓度，制剂A是表现更好的制剂(数据未显示)。特别地，在25℃下，以160mg/mL的在55mM乙酸钠、220mM甘氨酸、0.04％(w/v)PS80 pH5.0中的在本文中所例示的抗-IL17A/F抗体展示出比当以80mg/mL在20mM组氨酸、250mM山梨醇、0.02％(w/v)PS80 pH6.0中进行配制时略微更高的聚集率(表17)。当与DP和DS(按照实施例2进行制备的)相比较时，这两种制剂在160mg/mL和200mg/mL下都显示出较高的聚集率，而在80mg/ml和120mg/mL下，制剂B显示出与DP和DS材料相似的聚集率。

表17

在35℃下，在所有浓度下，制剂A随时间表现更好，具有较低的聚集和片段化比率(表18显示了％HMW种类)。特别地，在40℃下，处于160mg/mL的制剂A展示出与处于80mg/mL的DP相似的聚集率(数目未显示)。DS和DP如在实施例2中那样进行制备。

表18

实施例4：聚集研究2

鉴于在5℃和25℃/60％RH下由具有160mg/ml的抗-IL-17A/F抗体的制剂B所显示的聚集率均高于DS和DP材料(如在实施例2中所制备的)，进行第二个聚集研究以通过使用非老化的抗-IL-17A/F抗体来验证第一个研究(实施例3)的结果。在3种储存条件(5℃、25℃/60％RH、35℃/75％RH)下，以4种不同抗体浓度(80mg/ml、120mg/ml、160mg/ml和200mg/mL)，只调研了在具有0.02％、0.03％、0.04％或0.05％(w/v)PS80(PS80浓度取决于抗体浓度)的55mM乙酸钠、220mM甘氨酸(pH5.0)中的制剂。

如采用聚集研究1那样，使用SEC来调研在3个月内的样品。在3个月后，处于160mg/mL的制剂仍然是可以在长期稳定性评价中考虑的良好表现者，因此还在6个月时测试了该制剂。缓冲液和小瓶的制备、储存和SEC方法学如对于实施例3所描述的。

在表19B、20B和21B中所报告的聚集率是指对于每种制剂的平均月比率增加，基于在3个月后或在6个月后所测量的聚集，相比于在T0时的而言。

聚集研究2的结果确认了在5℃(表19A，％HMW种类和％LMW种类–表19B，研究1和2的聚集率比较)、25℃/60％RH(表20A，％HMW种类和％LMW种类–表20B，研究1和2的聚集率比较)和35℃/75％RH(表21A，％HMW种类和％LMW种类–表21B，研究1和2的聚集率比较)下的聚集研究1的结果。

表19A

表19B

表20A

表20B

在表19B、20B和21B中所显示的结果显示，在聚集研究2(用新鲜抗体材料进行的)中，聚集率和片段化比在聚集研究1中略微更低。

表21A

表21B

a：在40℃/75％RH下

实施例5：长期稳定性研究

考虑到所述两个聚集研究(实施例3和4)和在160mg/mL下的添加物筛选研究(实施例2)的结果，选择下面的制剂用于长期稳定性评价(表22)。所有制剂都包含160mg/ml的抗-IL-17A/F Ab(在本文中所例示的)并且还经历5轮的冷冻/解冻。

表22

在制剂制备期间，对于制剂A、B和C的缓冲液交换循环比制剂E花费更长的时间(对于制剂A-C，～90分钟，和对于制剂E，50分钟)。制剂A和B行为相似，并且在缓冲液交换和浓缩步骤这两者期间，这两种制剂都是混浊的。另外，对于这些制剂中的每一种的冲洗物是混浊的并且呈乳白色。制剂C在缓冲液交换和浓缩步骤期间也是混浊的。对于制剂D和E，没有值得注意的差异，虽然E看起来相比于其他制剂而言浓缩和过滤得最好。在6个月的时间段内在时间点0、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月处进行重量摩尔渗透压浓度(用PrecisionSystem Multi-Osmetter 2430进行测量)、粘度(用Anton Paar Automated MultiViscometer)、pH(Mettler Toledo SevenMulti)、目视外观、在280nm下的吸光度(Agilent8453分光光度计)、SDS-PAGE分析、cIEF(用Protein Simple iCE280系统进行测量，参见实施例2)、结合活性(用GE Healthcare Biacore T100系统进行测量)、通过光遮蔽的亚可见颗粒分析(来自Hach Lange的HIAC 9703系统)、CEX-HPLC和SEC-HPLC测量(粘度和重量摩尔渗透压浓度仅在时间点0处进行)。除非特别说明，所述方法如在实施例2中所描述的。在六个月时间点后，仅评价制剂D样品。对于所有制剂，使用1.0mL样品填充体积。对于冷冻/解冻研究，将所有制剂储存于-70℃≥12小时，然后储存于室温直至完全解冻(≥2小时)。将这重复总共5轮的冷冻/解冻。

粘度

通过使用Anton Paar Automated Multi Viscometer来测量粘度。在零时间测试制剂A至E的粘度值。所有制剂展示出从2.3至17.3cP变动的粘度值。在室温(大约25.00±0.01℃)下评价样品。

重量摩尔渗透压浓度

通过使用Precision Systems Multi-Osmetter 2430测量了重量摩尔渗透压浓度。不进行稀释。对于所有制剂在零时间测试了重量摩尔渗透压浓度。重量摩尔渗透压浓度值从316mOsm/kg至450mOsm/kg变动。

pH

通过使用Mettler Toledo sevenMulti pH计在25℃下测量了pH。不进行稀释。在每个数据点对于每种制剂测试了pH。在稳定性的前6个月期间，在每个时间点制剂A和B的pH为5.5±0.1，制剂C的pH为5.7±0.1，和制剂E的pH为6.2±0.2。在整个12个月稳定性自始至终，制剂D的pH为5.1。相比于零时间而言，对于在冷冻/解冻研究期间所评价的五种制剂中的任一种未观察到pH的变化。

外观

对于在稳定性的12个月期间的每个时间点(包括冷冻/解冻)，评价了关于每种制剂的外观。对于所有制剂，对于稳定性的前6个月，外观为“黄棕色的清亮溶液，无可见颗粒”。在4个月时间点后，测定外观为“清亮的黄色液体，无可见颗粒”。在所有制剂的外观中所观察到的变化可以归因于分析者变化性。如此，在稳定性的12个月期间在制剂之间不存在差异。

在280nm下的吸光度

通过使用Agilent 8453分光光度计来测定蛋白质浓度。按重量分析将样品在其各自缓冲液中稀释至0.5mg/mL。在分析每种制剂之前，通过使用制剂缓冲液来使系统成为空白。对于冷冻/解冻研究或者在12个月稳定性研究的过程中，未观察到清楚的趋势，这暗示在浓度中所观察到的任何变化均在该测定法的变化性之内。对于所述5种制剂中的任一种，未观察到一致的浓缩降低。

SDS-PAGE

使用具有3μg(非还原条件，具有IAA)或4μg(还原条件，具有DTT)/泳道加载的4-20％Tris-甘氨酸凝胶来进行SDS-PAGE分析。通过将样品在70℃下温育5分钟来进行变性。所使用的染色为胶体蓝。

对于所述制剂中的任一种，通过还原型SDS-PAGE的稳定性样品的分析未显示出在％重链(HC)+轻链(LC)方面的趋势(增加或降低)，除了对于加速和应力条件所进行的测量外。对于25℃/60％RH条件，在所有制剂中都观察到％HC+LC的降低，其中在40℃/75％RH下在所述制剂中观察到更大的降低。对于在那些条件下的制剂中的每一种，观察到新种类的形成。在冷冻/解冻研究期间，对于所评价的制剂中的任一种未观察到变化。

通过非还原型SDS-PAGE的稳定性样品的分析显示出横跨所有制剂和条件所观察到的％IgG的普遍降低。对于储存于25℃/60％RH和40℃/75％RH的制剂，观察到最大的％IgG降低。聚集物种类的形成在40℃/75％RH下在制剂D中是特别明显的。对于在冷冻/解冻研究期间所评价的制剂中的任一种未观察到变化。

cIEF

在稳定性的12个月期间，对于储存于-70℃和2-8℃的制剂的％主峰显示出很小至无的变化。对于所有储存于25℃/60％RH的制剂在％主峰面积中观察到降低，其中当在40℃/75％RH下储存制剂时，观察到更大的降低。该降低在制剂D中略微更高和在制剂E中略微更低。

对于所有制剂，在-70℃和2-8℃下在％酸性种类方面未观察到变化。对于储存于25℃/60％RH和40℃/75％RH的制剂观察到％酸性种类的增加。对于制剂D，在25℃/60％RH下观察到％酸性种类的略微更高的增加。在40℃/75％RH下，制剂B和D显示出％酸性种类的略微更高的增加，而制剂E显示出略微更低的增加。

对于储存于-70℃和2-8℃的制剂未观察到在％碱性种类方面的显著变化。在储存于25℃/60％RH的制剂中观察到略微增加，其中在储存于40℃/75％RH的制剂A中观察到％碱性种类的更加大的增加。在2个月时间点，由于毛细管问题，存在分辨率的损失，其对于所有制剂和条件引起％碱性种类的降低。对于所有时间点，在％碱性种类方面存在更大的变化性。

在冷冻/解冻制剂A至E中，未观察到在酸性种类、主要种类或碱性种类方面的变化。

Biacore

通过使用Biacore T100(GE Healthcare)来测量IL-17A和IL-17F的结合。所有实验在25℃下进行。将Affinipure F(ab’)₂片段山羊抗人IgG(Fc片段特异性的)(JacksonImmunoResearch,目录#109-006-098,批次#83295)通过胺偶联化学固定在CM5传感器芯片(Biacore AB,目录#BR1000-14,使用来自批次#10030608的不同芯片)上，至大约7000个应答单位(RU)的捕获水平。使用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,GE Healthcare)作为运行缓冲液，具有10μL/分钟的流速。将0.5μg/mL的抗体的每个样品的10μL注射用于捕获。将重组人IL-17A(R&D Systems,目录号317-ILB)和IL-17F(R&D Systems,目录号1335-IL)在所捕获的抗-IL17AF抗体上进行滴定，以分别从10nM至2.5nM和从10nM至1.25nM的二倍稀释，在30μL/分钟的流速下。通过40mM HCl的10μL注射和随后的5mM NaOH的5μL注射，以10uL/分钟的流速使表面再生。

按照标准程序，通过使用BIAevaluation软件(版本3.2)来分析双参考背景减去型结合曲线。从拟合算法来测定动力学参数(Biacore 1:1朗格缪尔结合拟合)。

在稳定性的前12个月内在结合活性方面未观察到趋势，这暗示K_D的变化在该测定法的变差之内。与1个月稳定性样品相平行地进行冷冻/解冻研究样品的评价。对于这些样品未观察到变化，并且K_D的轻微变化在该测定法的变差之内。

大小排阻色谱法

通过使用Agilent 1200系列系统在经过滤的洗脱剂A中稀释至1mg/mL的样品等分试样上进行SEC，具有下面的参数：

·样品载量：20μL(20μg)，以1mg/mL

·柱子：Tosoh BioScience TSK Gel G3000 SWXL,

5μm,7.8x300 mm(部件号：8541)

·洗脱剂A：0.05M Na₂HPO₄，0.25M NaCl pH7.2

·流速：0.5mL/分钟

·检测：UV(波长：280nm，分辨率：8nm，参照：关)

·柱温：20±5℃

·样品温度：6±2℃

·梯度：等度

·最大压力：70巴

·运行时间：35分钟。

对于所有制剂，在-70℃下在％主峰方面未观察到变化，和在2-8℃下观察到轻微变化。对于所有储存于25℃/60％RH的制剂，观察到％主峰的降低，和对于储存于40℃/75％RH的制剂观察到更加大的降低。总之，在25℃/60％RH下在稳定性的6个月内和在40℃/75％RH下在稳定性的3个月内，制剂D显示出％主峰的最大降低。

在所有储存于-70℃的制剂中在％HMW和％LMW种类方面未观察到显著变化。对于储存于2-8℃的制剂，存在％HMW的略微增加，但％LMW没有值得注意的变化。在稳定性的六个月内，相比于制剂C和E而言，对于制剂A、B和D来说聚集率是更低的。对于25℃/60％RH和40℃/75％RH条件，对于HMW和LMW种类两者都观察到增加。在25℃/60％RH下在6个月稳定性内和在40℃/75％RH下在3个月稳定性内，对于HMW和LMW种类两者，制剂D都显示出最大的增加。

对于在冷冻/解冻研究期间所评价的制剂中的任一种未观察到变化。

阳离子交换色谱法

通过使用Agilent 1100系统在洗脱剂A中稀释至1mg/mL的样品等分试样上进行CEX，具有下面的参数：

样品载量：20μL(20μg)

柱子：BioMAb,NP5,PK,4.6*250mm#Agilent 5190-2407

洗脱剂A：10mM磷酸钠pH6.0

洗脱剂B：10mM磷酸盐，1M NaCl，pH6.0

流速：1mL/分钟

波长：220nm带宽8nm/220nm带宽8nm，参考360nm带宽100，狭缝4nm

峰宽：0.1分钟(2s)

柱温：25℃

样品温度：4℃

梯度：

在12个月稳定性期间对于所有制剂和条件，对于-70℃或2-8℃条件％主峰面积没有变化。在25℃/60％RH下观察到降低，和在应力条件40℃/75％RH下，观察到更加大的降低。在25℃/60％RH下，所有制剂行为相似，在该测定法的变化性之内。在40℃/75％RH下，制剂A、B、C和D行为相似，其中制剂E显示出较少的降低。对于储存于-70℃和2-8℃的制剂，对于酸性种类和碱性种类的％面积在12个月研究内未变化。但是，对于储存于25℃/60％RH和40℃/75％RH的制剂的％主峰的降低主要相应于酸性种类的％面积的增加，而在碱性种类的％面积方面观察到较小的增加。所有制剂行为相似，在该测定法的变化性之内。CEX方法具有高的变化性–对于酸性种类为5％和对于碱性种类为9％。

对于冷冻/解冻应力样品，在％主峰面积、％酸性峰面积或％碱性峰面积方面未观察到变化。

HIAC

使用HACH Lange HIAC9703系统，通过将200μL的样品稀释到1000μL的WFI中来进行通过光遮蔽的亚可见颗粒分析。对于≥2、5、10和25μm的颗粒分析两次500μL抽取，并且将来自第二次抽取的数据就稀释度进行矫正(结果乘以5)并且报告为颗粒/mL。

在12个月的过程中，结果相当一致，其中差异由于在该测定法之内的变化性而产生。对于冷冻/解冻应力样品未观察到变化。

结论

当将样品储存于2-8℃条件时，仅SEC结果显示出制剂之间的任何区别。所有制剂都显示出相似的低的片段化水平，但是在该研究的过程中制剂A、B和D显示出最低的聚集，其中D展示出较低的初始水平的HMW种类。与处理观察结果相组合的SEC结果导致下述结论：鉴于制剂的保存期限是打算在5℃下的并且不在与在加速或应力研究中所使用的那些相似的条件下，那么制剂D在2-8℃下是最好的表现者，随后为制剂E，而且还鉴于处于160mg/ml的抗-IL-17A/F Ab的制剂D具有与处于80mg/ml的DP相当的特性谱和减少的处理问题这一事实。

实施例6：所选择的制剂的3个月制剂稳固性筛选研究

用来自SAS的JMP第11版统计学软件来产生使用具有3个中心点的部分析因设计的DoE。这是为了通过测试在12周内在2种条件5±3℃和25±2℃/60±5％RH下的主要效应和相互作用来初步筛选下面的制剂变量：

·乙酸盐浓度(55mM±20％)

·甘氨酸浓度(220mM±20％)

·聚山梨酯80浓度(0.04％±0.02％)

·pH(4.9±0.3)

·蛋白质浓度(160±15％)。

如在表23中所详细描述的那样，制备包含在本文中所例示的抗-IL17A/F抗体的制剂。增加制剂20以评价低蛋白质和赋形剂浓度对于稳定性的影响。通过对在没有PS80的在表23中所详细描述的适宜制剂中以50mg/mL的在本文中所例示的抗-IL17A/F抗体进行缓冲液交换来制备制剂。在将蛋白质浓度调节至在表23中所列出的靶浓度之前进行七轮。制剂20通过稀释制剂9来进行制备。使用PS80的10％储备溶液来加入到每种制剂中，以达到在表23中所详细描述的靶PS80浓度。

表23

在无菌过滤后，将1mL的每种制剂转移到用经Flurotec涂覆的Westar塞子和Tru-Edge Flip off密封盖密封的2mL Schott 1型玻璃小瓶中以用于初始测试以及在5±3℃和25±2℃/60±5％RH下的储存。

在T初始时测量在表23中所详细描述的pH和重量摩尔渗透压浓度，而在第4、8和12周(T12w)进行目视评估以及SEC和iCE。通过使用Agilent 1200系列系统在经过滤的洗脱剂A(0.05M Na₂HPO₄，0.25M NaCl pH7.2)中稀释至1mg/mL的样品等分试样上进行SEC，具有下面的参数：

·样品载量：20μL(20μg)，以1mg/mL

·柱子：Tosoh BioScience TSK Gel G3000 SWXL,

5μm,7.8x300 mm(部件号：8541)

·流速：0.5mL/分钟

·检测：UV(波长：280nm，分辨率：8nm，参照：关)

·柱温：20±5℃

·样品温度：6±2℃

·梯度：等度

·最大压力：70巴

·运行时间：35分钟。

使用Empower 3软件来进行数据分析。

对于所有制剂，在所有储存于5℃的制剂中在％LMW种类方面未观察到显著变化，但是当储存于25℃时，对于所有制剂都观察到增加。如所预期的，横跨所有制剂在12周内观察到％HMW种类的增加，其中储存于25℃的制剂显示出比储存于5℃的那些更明显的增加(表24)。

表24

用经过滤的去离子水将样品稀释至20mg/mL的标称浓度，然后稀释至2mg/mL的浓度。分析在处于0.2mg/mL(处于2mg/mL的样品在主混合物中的1/10稀释)的样品上进行。制备具有下列组分的主混合物(表25)。

表25

如在表26中所显示的，对于所有制剂，对于储存于5℃的制剂在％酸性种类和％碱性种类方面未观察到显著变化。关于％HMW种类，储存于25℃的制剂显示出比储存于5℃的那些更明显的％酸性种类和％碱性种类的增加(表26)。

表26

Claims

1.药用组合物，其包含：

a.大约80mg/ml至大约200mg/ml的抗体或其抗原结合片段，其具有包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:2的轻链可变区；

b.乙酸盐；

c.甘氨酸；

d.聚山梨酯80；并且

具有大约4.6至大约5.5的pH。

2.根据权利要求1的药用组合物，其包含大约120mg/ml至大约185mg/ml的所述抗体或其抗原结合片段，优选地大约160mg/mL。

3.根据前述权利要求中任一项的药用组合物，其中所述组合物包含大约0.01％至大约0.07％(w/v)的聚山梨酯80。

4.根据前述权利要求中任一项的药用组合物，其中所述组合物包含大约140mM至大约350mM的甘氨酸。

5.根据前述权利要求中任一项的药用组合物，其中所述组合物包含大约20mM至大约100mM的乙酸盐，优选地大约40mM至大约90mM的乙酸盐。

6.根据前述权利要求中任一项的药用组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合人IL-17A和人IL17F。

7.根据前述权利要求中任一项的药用组合物，其中所述组合物包含：

a.大约120mg/mL至大约185mg/mL的抗体或其抗原结合片段；

b.大约20mM至大约100mM的乙酸盐，优选地大约40mM至大约90mM的乙酸盐；

c.大约140mM至大约350mM的甘氨酸；

d.大约0.01％至大约0.07％(w/v)的聚山梨酯80；

其中所述组合物具有大约4.6至大约5.5的pH。

8.用于制备药用组合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

b.制备高浓度制剂，这通过将在a)中所获得的低浓度制剂的抗体或其抗原结合片段浓缩至大约160mg/ml至大约180mg/ml的浓度来进行；

c.向在b)中所获得的高浓度制剂添加聚山梨酯80；

9.根据权利要求8的方法，其中所述缓冲溶液包含大约20mM至大约100mM的乙酸盐，优选地大约40mM至大约90mM的乙酸盐，和大约140mM至大约350mM的甘氨酸，并且其中在步骤c)中添加聚山梨酯80至大约0.01％至大约0.07％(w/v)的最终浓度。

10.通过权利要求8或权利要求9而获得的药用组合物。

11.根据权利要求10的药用组合物，其中所述组合物的pH为大约4.6至大约5.5。

12.容器，其包含根据权利要求1至7、10或11中任一项的药用组合物。

13.根据权利要求1至7、10或11中任一项的药用组合物，其用于在疗法中使用。

14.根据权利要求1至7、10或11中任一项的药用组合物，其用于在治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症中使用。

15.根据权利要求1至7、10或11中任一项的药用组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症。

16.用于在哺乳动物受试者中治疗或预防由IL-17A和/或IL-17F介导的或者与增加的IL-17A和/或IL-17F水平相关联的病理学病症的方法，所述方法包括施用根据权利要求1至7、10或11中任一项的药用组合物。

17.根据权利要求14的用于所述用途的药用组合物、根据权利要求15的用途或者根据权利要求16的方法，其中所述病理学病症选自由下列各项组成的组：关节炎、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、全身型幼年特发性关节炎(JIA)、系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘、慢性阻塞性气道疾病、慢性阻塞性肺疾病、特应性皮炎、硬皮病、系统性硬化病、肺纤维化、克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊椎炎、中轴型脊椎关节炎和其他脊椎关节病。

18.根据权利要求14的用于所述用途的药用组合物、根据权利要求15的用途或者根据权利要求16的方法，其中所述病理学病症选自由下列各项组成的组：类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊椎炎和中轴型脊椎关节炎。