CN117138036A - 一种稳定的双特异性纳米抗体制剂 - Google Patents

一种稳定的双特异性纳米抗体制剂 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫学领域，涉及一种稳定的双特异性纳米抗体制剂，其包含有效量的抗IL‑4Rα/IL‑5的双特异性纳米抗体，以及醋酸盐缓冲系统；所述制剂具有5.0至5.3的pH，所述抗IL‑4Rα/IL‑5的抗体具有序列SEQ ID No.9或10的氨基酸序列或所述抗IL‑4Rα/IL‑5的抗体是由两个序列为SEQ ID No.9或10的融合蛋白配对形成的双价抗体。本发明的制剂在约25℃储存14天后少于5%的所述抗体形成聚集体；在约‑20℃储存30天后少于4%的所述抗体形成聚集体，因而双特异性纳米抗体在液体制剂中保持了结构的稳定性。

Description

一种稳定的双特异性纳米抗体制剂
技术领域
本发明涉及医药领域。更具体地，本发明涉及一种稳定的双特异性纳米抗体制剂。
背景技术
液体抗体制品具有短的贮存期限，可能因为储存期间化学和物理不稳定性而丧失抗体的生物学活性。化学不稳定性可能因为脱酰胺、外消旋、水解、氧化、β消除或二硫键交换造成，物理不稳定性可能因为抗体变性、聚集、沉淀或吸附造成。其中，已知聚集、脱酰胺和氧化是抗体降解的最常见原因(Wang等，1988，J.of parenteral Science&Technology42(增刊)：S4-S26；Cleland等，1993，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems 10(4)：307-377)。因此，对抗体的稳定液体制剂存在需求。
发明内容
本发明的目的是提供贮藏和递送时稳定的双特异性纳米抗体制剂。根据本发明，通过具有高特异性和结合力的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体与盐酸精氨酸、蔗糖、聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆188或其组合的复配，实现抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体稳定存在于制剂中。
一般而言，优选地是使用小体积的药物制剂用于皮下注射。
决定贮存期限的主要因素通常是副产物和降解产物的形成以及生物活性的丧失。本发明的制剂实现了这些需要的稳定性水平。
除足够的物理和化学稳定性之外，制剂还应当具有用于皮下应用的可接受的pH值和重量摩尔渗透压浓度。
本发明发现，稳定的抗体制剂是可以获得的，所述抗体制剂在保留长期贮藏期间的抗体活性，在合适的抗体浓度下避免聚集并具有合适的黏度方面具有有利特性。本发明在其最广泛的方面提供了包含有效量的针对抗体的药物制剂，以及缓冲系统及pH值。本发明的制剂是液体的，但是也适合于冷冻干燥并随后形成具有低的、相同的或更高的抗体浓度的液体制剂。
本发明的第一方面提供了一种稳定的双特异性抗体制剂，其包含有效量的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性纳米抗体，以及醋酸盐缓冲系统；所述制剂具有5.0至5.3的pH，所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体具有用于特异性结合IL-4Rα的第一抗原结合部分和用于特异性结合IL-5的第二抗原结合部分，第一抗原结合部分包括SEQ ID NO.1所示的CDR1、SEQ IDNO.2所示的CDR2和SEQ ID NO.3所示的CDR3；第二抗原结合部分包括SEQ ID NO.4所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2和SEQ ID NO.6所示的CDR3。
优选的，所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体具有如序列SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10或与SEQ ID NO.9或10具有80％的同源性的氨基酸序列或所述抗IL-4Rα/IL-5的抗体是由两个序列为SEQ ID NO.9或10的融合蛋白配对形成的双价抗体。
优选的，所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体是由两个序列为SEQ ID NO.9或10的融合蛋白配对形成的双价抗体。即，抗IL-4Rα/IL-5的抗体为由两个SEQ ID NO.9的融合蛋白通过Fc配对形成的双价抗体，或者抗IL-4Rα/IL-5的抗体为由两个SEQ ID NO.10的融合蛋白通过Fc配对形成的双价抗体。
接受配制的抗体优选为基本上纯的且理想地为基本上同质的(即不含污染蛋白质等)。“基本上纯的”抗体是指包含以组合物的总重量计，至少约90％重量，优选至少约95％重量抗体的组合物。“基本上同质的”抗体是指包含以组合物的总重量计，至少约99％重量的抗体的组合物。
编码所述抗IL-4Rα/IL-5双特异性抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12所示，或者编码所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性单域抗体与SEQ ID NO.11或SEQ IDNO:12的氨基酸序列具有至少80％序列同源性。
抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体包含两种形式，一种为如SEQ ID NO:9或10所示的单链Fc融合抗体，其包括三个部分：4E9V10-Fc段-2B3V2；4E9V10在氨基端(SEQ ID NO.9或10中第1-115位氨基酸)，Fc段为SEQ ID NO.9或10中的第116-356位氨基酸，2B3V2在羧基端(SEQ ID NO.9或10中第357-478位氨基酸)。
其中4E9V10和2B3V2分别为人源化单域抗体，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。其中SEQ ID NO.7(即4E9V10)由CN202010576200.7抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物中的单域抗体4E9的氨基酸序列经过人源化改造得到；其中SEQ ID NO.8(即2B3V2)由CN202010843501.1IL-5的结合分子及其制备方法和应用中的单域抗体2B3的氨基酸序列经过人源化改造得到。单域抗体2B3的人源化方法如CN202010843501.1IL-5的结合分子及其制备方法和应用中所述。
优选的，4E9V10结构为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，FR1氨基酸序列如SEQID NO.14所示，FR2氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，FR3氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，FR4氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
2B3V2结构为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，FR1氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，FR2氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，FR3氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，FR4氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。
单域抗体4E9的人源化方法为：人源化方法采用对基于大数据分析结果而构建的抗体框架区域突变文库进行高通量筛选的方法完成。详细步骤为：
(1)人源/驼源抗体数据的序列分析：对从NCBI网站批量下载的13873例Nb(Human)序列进行氨基酸偏好性分析，同时对本公司2000例单域抗体序列进行氨基酸偏好性分析，得到框架区各个位点氨基端比例数据；
(2)人源驼源综合加权分析：将上述源/驼源抗体序列统一按照IMGT编号规则进行编号并一一对应，结合上述两个物种中氨基酸比例分析结果，按照人源90％驼源10％的权重进行加权分析，统计出各个位点氨基酸加权后的比例，并由高到低排序；根据最终的加权结果，框架区单个位点仅保留所占比例>10％的氨基酸种类，并根据保留后比例综合为1的标准进行所占比例>10％氨基酸最终权重的计算，作为后续胺基酸定制文库的设计依据；
(3)氨基酸定制文库的方案设计：对待进行突变的单独位点，规定其>10％的氨基酸数目为n,规定其>10％中所占比例最高值与最低值的比值为V，对待进行突变的位点进行性质判断：若V≥3且n≤2则认为该位点属于“高集中度位点”，否则认为该位点属于“中低集中度位点”。依据此方法将定制氨基酸文库分为“高/中低集中度文库”两个分别进行氨基酸定制文库的构建，上述(2)中的最终权重即为文库中位点氨基酸种类及比例的参考依据。
(4)氨基酸定制文库的高通量筛选：
对未人源化的4E9构建人源化抗体文库，针对构建好的文库，分别用对应抗原进行淘选，并最终获得亲和力较高且人源化程度较高的抗体序列。
该Fc融合抗体实质为人的IgG的Fc段(可以源自人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4的Fc段，优选为源自人IgG4的Fc段)分别与抗IL-4Rα的人源化单域抗体以及抗IL-5的人源化单域抗体融合形成。
第二种是由两个相同的如SEQ ID NO:9或10所示的Fc融合抗体通过Fc段配对连接形成的双价抗体。
所述第一抗原结合部分(针对IL-4Rα的人源化单域抗体，例如前述的4E9V10)和第二抗原结合部分(针对IL-5的人源化单域抗体，例如前述的2B3V2)通过人IgG的Fc区进行连接；所述双特异性纳米抗体是由两个相同的单链Fc融合蛋白配对连接的双链抗体分子4E9V10-2B3V2(双链抗体分子为同源二聚体结构)，每个单链Fc融合蛋白分别由第一抗原结合部分、人的IgG的Fc区域及第二抗原结合部分构成。
在一些实施方案中，所述人IgG的Fc区域衍生自人的IgG4区域；所述Fc区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示或者与SEQ ID NO.13具有至少80％同源性，或者如SEQ IDNO.9的第116-356位氨基酸所示或者与SEQ ID NO.9的第116-356位氨基酸具有至少80％同源性。
其中，4E9V10-2B3V2包括4E9V10-2B3V2-1(其为双链抗体分子，由两条SEQ IDNO.9通过Fc配对形成，Fc配对指一条SEQ ID NO.9的Fc与另一条SEQ ID NO.9的Fc配对连接，SEQ ID NO.9对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.11)以及4E9V10-2B3V2-2(其为双链抗体分子，由两条SEQ ID NO.10通过Fc配对形成，Fc配对指一条SEQ ID NO.10的Fc与另一条SEQID NO.10的Fc配对连接，SEQ ID NO.10对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.12)。
在一些实施方案中，所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性单域抗体(又称作双特异性抗体、双特异性纳米抗体，简称为抗体)与选自SEQ ID NO：9或10的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性，并且能够特异性结合IL-4Rα及IL-5蛋白。
在一些实施方案中，所述编码IL-4Rα/IL-5的双特异性单域抗体的核苷酸与SEQID NO：11或12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同源性。
单域抗体(sdAb，也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区(单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3)。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。
在一项实施方案中，本发明还提供了包括约5.0至约5.3的pH范围的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包括5.0～5.1的pH范围的药物制剂，在另一项实施方案中，本发明提供了5.1至5.2的pH范围的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了5.2至5.3的pH范围的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包括约5.0、约5.1、约5.2的pH的药物制剂。
在一个实施方案中，本发明提供的稳定的双特异性抗体制剂其还包含
a)醋酸盐缓冲系统；
b)盐酸精氨酸；
c)蔗糖；
d)聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆188或其组合。
在一个实施方案中，所述醋酸盐缓冲系统为醋酸-醋酸钠缓冲系统。
在一个实施方案中，本发明还提供了包含浓度为约20mmol/L至约40mmol/L的醋酸-醋酸钠的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为20mmol/L至30mmol/L的醋酸-醋酸钠的药物制剂，在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为30mmol/L至40mmol/L的醋酸-醋酸钠的药物制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了包含浓度为约20mmol/L、约30mmol/L或约40mmol/L的醋酸-醋酸钠的药物制剂。在一个实施方案中，醋酸与醋酸钠的质量比为：(0.2～2)：(1～10)。在另一项实施方案中，醋酸与醋酸钠的质量比为：1：(1～6)。在另一项实施方案中，醋酸与醋酸钠的质量比为：1：2～5。
在一个实施方案中，本发明还提供了包含浓度为70-100mmol/L盐酸精氨酸的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为70mmol/L至80mmol/L的盐酸精氨酸的药物制剂，在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为80mmol/L至90mmol/L的盐酸精氨酸的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为90mmol/L至100mmol/L的盐酸精氨酸的药物制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了包含浓度为约70mmol/L、约80mmol/L、约90mmol/L或约100mmol/L的盐酸精氨酸的药物制剂。
在一个实施方案中，本发明还提供了包含浓度为80-120mmol/L蔗糖的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为80mmol/L至90mmol/L的蔗糖的药物制剂，在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为90mmol/L至100mmol/L的蔗糖的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为100mmol/L至110mmol/L的蔗糖的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为110mmol/L至120mmol/L的蔗糖的药物制剂。在另一个实施方案中，本发明提供了包含浓度为约70mmol/L、约80mmol/L、约90mmol/L、约100mmol/L、约110mmol/L或约120mmol/L的蔗糖的药物制剂。
在一个实施方案中，本发明还提供了包含浓度为约0.02％至约0.05％的聚山梨酯80或聚山梨酯20的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为0.02％至约0.03％的聚山梨酯80或聚山梨酯20的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为0.03％至约0.05％的聚山梨酯80或聚山梨酯20的药物制剂。在另一项实施方案中，本发明提供了包含浓度为约0.02％、约0.03％、约0.04％或约0.05％的聚山梨酯80或聚山梨酯20的药物制剂。
在一个实施方案中，本发明的制剂是等渗的。
在一个实施方案中，所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体以小于100mg/mL的量存在。
在一个实施方案中，所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体以60～72mg/mL的量存在。
在一个实施方案中，本发明提供的制剂含有60-70mg/mL的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体、20mmol/L醋酸-醋酸钠、100mmol/L盐酸精氨酸、80mmol/L蔗糖及0.05％(w/v)的聚山梨酯80，pH5.0-5.2。
在一个实施方案中，本发明提供的制剂含有60-70mg/mL的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体、20mmol/L醋酸-醋酸钠、100mmol/L盐酸精氨酸、80mmol/L蔗糖及0.02％(w/v)的聚山梨酯80，pH5.0-5.2。
在一个实施方案中，本发明提供的制剂含有60-70mg/mL的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体、40mmol/L醋酸-醋酸钠、70mmol/L盐酸精氨酸、100mmol/L蔗糖及0.03％(w/v)的聚山梨酯80，pH5.0-5.2。
在一个实施方案中，本发明提供的制剂溶液在约25℃维持所述双特异性抗体的单体纯度约14天。
在一个实施方案中，本发明提供的制剂溶液在约25℃储存14天后少于5％的所述抗体形成聚集体。
在一个实施方案中，本发明提供的制剂溶液在-20℃储存30天后少于4％的所述抗体形成聚集体。
在一个实施方案中，本发明的制剂进一步包含表面活性剂及“药物可接受的”赋形剂。
在一个实施方案中，本发明提供一种液体组合物，其包含有效量的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性纳米抗体，还包含
a)醋酸盐缓冲系统；
b)盐酸精氨酸；
c)蔗糖；
d)聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆188或其组合；
所述制剂具有5.0至5.3的pH；
所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性纳米抗体具有用于特异性结合IL-4Rα的第一抗原结合部分和用于特异性结合IL-5的第二抗原结合部分，第一抗原结合部分包括SEQ IDNO.1所示的CDR1、SEQ ID NO.2所示的CDR2和SEQ ID NO.3所示的CDR3；第二抗原结合部分包括SEQ ID NO.4所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2和SEQ ID NO.6所示的CDR3。
或者，所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性纳米抗体含有SEQ ID NO.9或10的氨基酸序列。
优选的，本发明还提供前述的液体组合物在制备稳定的双特异性纳米抗体制剂中的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了一种容器，其包括前述任意一项的稳定的双特异性纳米抗体制剂。
在一个实施方案中，所述容器是注射器或瓶子，所述的注射器或瓶子由玻璃、塑料或聚合材料中任意一种或几种制成。
在一个实施方案中，所述容器是预填装注射器。
在一个实施方案中，本发明提供了一种密封包装，其包括上述任一项所述的稳定的双特异性纳米抗体制剂或根据所述的容器。
在一个实施方案中，本发明提供了稳定的双特异性纳米抗体制剂在制备治疗疾病的药物中应用，所述疾病包括哮喘、过敏性皮炎、湿疹、关节炎、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、慢性阻塞性肺疾病、特应性皮炎、特发性肺纤维化、川崎病、镰状细胞病、格雷夫斯氏病、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核病和肾病、自身免疫疾病、含嗜酸性肉芽肿性多血管炎成人患者治疗、重度嗜酸性粒细胞性哮喘、高嗜酸性粒细胞综合征、慢性鼻窦炎伴鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病、未控制的慢性鼻窦炎不伴鼻息肉、变应性真菌性鼻窦炎、结节性痒疹、家族性冷荨麻疹、大疱性类天疱疮、变应性真菌性鼻-鼻窦炎、慢性诱导性寒冷性荨麻疹、花生过敏、花粉过敏、嗜酸性粒细胞性食管炎、瘢痕瘤、瘙痒症、变应性支气管肺曲霉病、季节性过敏性鼻炎。
在一个实施方案中，其中所述药物是通过静脉内或皮下途径给药的药物。
在一个实施方案中，本发明提供了利用上述的双特异性纳米抗体制剂治疗疾病的方法，所述疾病包括哮喘、过敏性皮炎、湿疹、关节炎、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、慢性阻塞性肺疾病、特应性皮炎、特发性肺纤维化、川崎病、镰状细胞病、格雷夫斯氏病、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核病和肾病、自身免疫疾病、含嗜酸性肉芽肿性多血管炎成人患者治疗、重度嗜酸性粒细胞性哮喘、高嗜酸性粒细胞综合征、慢性鼻窦炎伴鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病、未控制的慢性鼻窦炎不伴鼻息肉、变应性真菌性鼻窦炎、结节性痒疹、家族性冷荨麻疹、大疱性类天疱疮、变应性真菌性鼻-鼻窦炎、慢性诱导性寒冷性荨麻疹、花生过敏、花粉过敏、嗜酸性粒细胞性食管炎、瘢痕瘤、瘙痒症、变应性支气管肺曲霉病、季节性过敏性鼻炎。
在本发明的说明书中，术语按以下定义使用。
“治疗”是指治疗性处理(therapeutic treatment)和预防措施。需要治疗的包括已患有该疾病的以及要预防该疾病的。用于治疗的“哺乳动物”是指任何分类为哺乳动物的动物，包括但不限于人、家畜和农畜、以及动物园、竞赛或宠物动物，如狗、马、猫和牛。
在药理学意义上，在本发明的上下文，抗体的“治疗有效量”是指这样的量：对于可使用抗体有效治疗的病症，该量的抗体有治疗或预防效果。所述“病症”为任何可得益于抗体治疗的状况，包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使得哺乳动物易患所述病症的病理状态。在优选的实施方案中，“疾病”为涉及表达IL-4R或IL-5的疾病。
术语“蛋白质制剂”或“抗体制剂”是指以下形式的制剂，其容许活性成分的生物学活性明确地起效，且该制剂不包含其它将对接受该制剂的受试者有毒的成分。
“药物可接受的”赋形剂(载体，添加剂)是指可适当地给药于对象哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的赋形剂。例如，赋形剂浓度对于注射的可接受性也是重要的。
如本文所使用的，术语“表面活性剂”是指具有两亲结构的有机物质；即，它们由相反的溶解性倾向的基团所组成，通常是油溶性的烃链和水溶性的离子基团。取决于表面活性部分的电荷，可以将表面活性剂分类成阴离子活性剂、阳离子活性剂和分散剂用于各种药物组合物和生物材料制剂。
蛋白质制剂增加的黏度具有来自加工的负面影响，例如液体通过药物递送例如以高黏度递送给患者的可处理性，液体制剂不再能轻易地通过针管，这造成了患者的不适；注射持续时间；自动注射器的可利用性。此外，作为易于生产、贮藏和施用的前提，希望得到具有适当的低黏度的相对高浓度的抗体制剂。如本文中所用，术语“黏度”可以是“动力黏度”或者“绝对黏度”。通常，动力黏度表示为厘斯(centistokes；cSt)。动力黏度的SI单位是mm2/s，其是1cSt。绝对黏度表示为单位厘泊(centipoise；cP)。绝对黏度的SI单位是毫帕·秒(mPa.s)，其中1cP＝1mPa.s。
“稳定的”制剂是其中的蛋白质在储存时基本上保持其物理和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。现有技术中已知多种分析技术可用于测定蛋白质稳定性，在例如Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent LeeEd.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs(1991)和Jones，A.Adv.DrugDelivery Rev.10：29-90(1993)中对这样的技术进行了综述。稳定性可在选定的温度下以一段选定的时间进行测量。而且，该制剂在产品冷冻(例如冷却至-80℃)和解冻后是稳定的。
如果通过目视检查颜色和/或透明度，或通过UV光散射(其测定可见的聚集物)或大小排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)测定，显示蛋白质在聚集、沉淀和/或变性方面变化极少甚至没有变化，则该蛋白质在生物医药制剂中“保持其物理稳定性”。SEC测量可溶的聚集物，这些聚集物不一定是可见的聚集物的前体。如果蛋白质在给定时间点的化学稳定性使得该蛋白质被视为保持了其生物学活性(如下文定义)，则称该蛋白质在生物医药制剂中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可通过对蛋白质的经化学改变的形式进行检测和定量来加以评估。化学改变可包括大小修饰(例如剪切(clipping))，其可使用例如SEC、SDS-PAGE和/或基质辅助的(matrix-assisted)激光解吸离子化/飞行时间质谱法(MALDI/TOF MS)加以评估。其它类型的化学改变包括电荷(charge)改变(例如由于脱酰胺化而发生)，其可例如通过离子交换色谱来加以评估。
术语“等渗”是指感兴趣的制剂具有与人血基本相同的渗透压。在一个实施方案中，本发明的等渗制剂一般具有范围为327至335mOsm/kg的渗透压。等渗性可使用例如蒸气压或冰冻(ice-freezing)型渗透压计来测量。
如本文所述，“缓冲系统”是指经缓冲的溶液，其通过其酸-碱共轭成分的作用来阻止pH的变化。“防腐剂”是可包含在制剂中以实质性地减少其中的细菌作用的化合物，从而例如便于制备多用途的制剂。
如本文所用，术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同源性。
如本文所用，术语“Fc融合抗体”指利用基因工程技术将目标抗体的Fc段与某种具有生物学活性的功能蛋白分子融合而产生的新型蛋白。
相对于现有技术，本发明的抗体制剂能同时特异性结合IL-4Rα与IL-5，且与IL-4Rα、IL-5的结合力均较强；制剂在贮藏时抗体分子的浓度可达到60～72mg/mL，在约25℃储存14天后少于5％的所述抗体形成聚集体；在约-20℃储存30天后少于4％的所述抗体形成聚集体，因而双特异性纳米抗体在液体制剂中保持了结构的稳定性。
附图说明
图1为IL-4Rα/IL-5双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1阻断IL-4Rα与IL-4结合的实验结果(ELISA)。
图2为IL-4Rα/IL-5双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1阻断IL-5R与IL-5结合的实验结果(ELISA)。
图3为IL-4Rα/IL-5双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1中和IL-4诱导的TF-1增殖实验结果。
图4为IL-4Rα/IL-5双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1中和IL-13诱导的TF-1增殖实验结果。
图5为IL-4Rα/IL-5双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1中和IL-5诱导的TF-1增殖实验结果；
图6为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(4：1)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图7为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(4：1)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图8为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(3：1)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图9为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(3：1)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图10为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(2：1)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图11为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(2：1)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图12为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(1：1)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图13为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(1：1)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图14为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(1：2)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图15为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(1：2)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图16为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(1：3)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图17为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(1：3)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图18为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(1：4)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线；
图19为样品B(4E9V10-2B3V2-2)中和IL-4和IL-5(1：4)混合诱导TF-1增殖试验量效曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
抗IL-4Rα/IL-5蛋白的双特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建
针对4E9V10-2B3V2-1：
(1)通过序列合成的方式将密码子优化后的抗IL-4Rα的人源化单域抗体(4E9V10)的基因序列(SEQ ID NO.11的第1-345位核苷酸)或抗IL-5的人源化单域抗体(命名为2B3V2)的基因序列(SEQ ID NO.11的第1069-1434位核苷酸)分别合成至载体RJK-V4-3中(参考申请号为CN202010576200.7，发明名称为抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物的中国发明专利的方法获取)；
其中，载体RJK-V4-3，为本公司在invitrogen商业化载体pCDNA3.4(载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)的基础上融合了人源IgG4的重链编码序列中的Fc区段后改造而来的，即该载体包含了IgG4重链的铰链区(Hinge)CH2和CH3区。具体改造方案如下：
(1)选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI；
(2)在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点(MCS，Multiple Cloning Site)和6×His标签；
(3)使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增；
(4)使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和(3)中的重组DNA片段；
(5)将酶切后的载体和插入片段在T4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒；
所融合的人源IgG4的重链编码序列中的Fc区段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11中的第346-1068位核苷酸所示；
(2)将构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中，培养进行质粒大提，去除内毒素；
(3)将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；
(4)鉴定无误后，再构建抗IL-4Rα/IL-5蛋白的双特异性单域抗体的真核表达载体：具体操作是使用限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ将抗IL-4Rα抗体序列从其所在的真核表达载体上酶切下来并与具有相同限制性内切酶粘性末端的含抗IL-5的抗体序列的真核表达载体连接、转化、测序鉴定；测序正确的克隆进行质粒大提，去除内毒素；将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达。
抗IL-4Rα/IL-5蛋白的双特异性抗体(双特异性抗体每个单链的氨基酸序列如SEQID NO.9所示，对应的基因序列为SEQ ID NO.11)命名为4E9V10-2B3V2(具体为4E9V10-2B3V2-1)，其包括三个部分：4E9V10-Fc段-2B3V2；4E9V10在氨基端(SEQ ID NO.9中第1-115位，即SEQ ID NO.7)，Fc段为SEQ ID NO.9中的第116-356位，2B3V2在羧基端(SEQ ID NO.9中第357-478位，即SEQ ID NO.8)。
针对4E9V10-2B3V2-2：
(1)通过序列合成的方式将密码子优化后的抗IL-4Rα的人源化单域抗体(4E9V10)的基因序列(SEQ ID NO.12的第1-345位)或抗IL-5的人源化单域抗体(命名为2B3V2)的基因序列(SEQ ID NO.12的第1069-1434位)分别合成至载体中(参考申请号为CN202010576200.7，发明名称为抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物的中国发明专利的方法获取)；
其中，这里的载体与前述的RJK-V4-3基本相同，不同之处仅在于所融合的人源IgG4的重链编码序列中的Fc区段的核苷酸序列替换为SEQ ID NO.12中的第346-1068位核苷酸；
(2)将构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中，培养进行质粒大提，去除内毒素；
(3)将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；
(4)鉴定无误后，再构建抗IL-4Rα/IL-5蛋白的双特异性单域抗体的真核表达载体：具体操作是使用限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ将抗IL-4Rα抗体序列从其所在的真核表达载体上酶切下来并与具有相同限制性内切酶粘性末端的含抗IL-5的抗体序列的真核表达载体连接、转化、测序鉴定；测序正确的克隆进行质粒大提，去除内毒素；将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达。
抗IL-4Rα/IL-5蛋白的双特异性抗体(双特异性抗体每个单链的氨基酸序列如SEQID NO.10所示，对应的基因序列为SEQ ID NO.12)命名为4E9V10-2B3V2(具体为4E9V10-2B3V2-2)，其包括三个部分：4E9V10-Fc段-2B3V2；4E9V10在氨基端(SEQ ID NO.10中第1-115位，即SEQ ID NO.7)，Fc段为SEQ ID NO.10中的第116-356位(即SEQ ID NO.13)，2B3V2在羧基端(SEQ ID NO.10中第357-478位，即SEQ ID NO.8)。
实施例2
抗IL-4Rα/IL-5蛋白的双特异性单域抗体在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达，实验方法参考申请号为CN202010576200.7，发明名称为抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物的中国发明专利进行，分别表达得到双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1(样品A)、双特异性抗体4E9V10-2B3V2-2(样品B)。样品A、B均为双链抗体分子。
实施例3
抗IL-4Rα/IL-5蛋白的双特异性单域抗体在悬浮293F细胞中的表达，实验方法参考申请号为CN202010576200.7，发明名称为抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物的中国发明专利进行，分别表达得到双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1(样品A)、双特异性抗体4E9V10-2B3V2-2(样品B)。样品A、B均为双链抗体分子。
实施例4
抗IL-4Rα/IL-5蛋白的双特异性单域抗体的纯化，实验方法参考申请号为CN202010576200.7，发明名称为抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物的中国发明专利进行，分别得到双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1(样品A)、双特异性抗体4E9V10-2B3V2-2(样品B)。
以下所有实施例中的样品A、样品B均为相应重组载体在悬浮293F细胞中表达并通过实施例4纯化所得。
实施例5
双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1(样品A)的受体配体结合阻断检测
(1)用蛋白稀释液稀释受体蛋白(IL-4Rα或IL-5R)至1μg/ml，4℃包被过夜。
(2)洗板，用5％脱脂牛奶37℃封闭。
(3)将偶联生物素的配体蛋白(IL-4或IL-5)稀释至2倍的EC80浓度，将抗体稀释至2倍起始浓度，5倍梯度稀释，将配体蛋白和稀释后的抗体(dupilumab、4E9V10-2B3V2-1、4E9V0或2B3、reslizumab)以及hIgG按1：1转至新的配药板混匀。其中，4E9V0为CN202010576200.7抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物中的抗体4E9；2B3为CN202010843501.1IL-5的结合分子及其制备方法和应用中的单域抗体2B3(未经人源化改造)；本实施例及实施例6-8中所用reslizumab、dupilumab均为本公司自制的Tab，本实施例及实施例6-8中所用reslizumab制备方法如CN202010843501.1IL-5的结合分子及其制备方法和应用中所示，本实施例及实施例6-8中所用dupilumab制备方法如CN202010576200.7抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物中所示。
(4)洗板，将稀释后的配体蛋白/抗体混合物转至ELISA板，两复孔，37℃孵育。
(5)洗板，加入稀释后的Streptavidin[HRP]，37℃孵育。
(6)洗板，加入单组分TMB，室温避光显色。
(7)加入终止液，立刻用酶标仪读取OD450，作图计算EC50，以4E9V0、针对IL-5的非人源化单域抗体2B3、dupilumab(达必妥)、reslizumab(瑞替珠单抗)、hIgG作为对照，结果分别如表1和表2，图1和图2所示。
表1双特异性抗体阻断IL-4与IL-4Rα结合的EC50检测结果
4E9V0 4E9V10-2B3V2-1 dupilumab hIgG
EC50(nM) 4.447 3.653 4.321 2.038
表2双特异性抗体阻断IL-5与IL-5R结合的EC50检测结果
2B3 4E9V10-2B3V2-1 reslizumab hIgG
EC50(nM) 6.911 3.612 6.208 27387599489
结果显示，人源化后的双特异性抗体与非人源化抗体相比，在分别阻断IL-4/IL-4Rα或IL-5/IL-5R受体配体结合方面，其阻断效果没有降低，并具有略微优势，而与其对应的上市药物相对，其阻断能力基本相当，也具有略微优势。
实施例6
双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1(样品A)的IL-4或IL-13诱导TF1细胞增殖的检测
(1)将复苏后传代3-4次的TF-1细胞按10000个每孔铺入96孔板；
(2)将Tab、样品A配制为10μg/mL的溶液，并进行5倍梯度稀释；
(3)将梯度稀释好的Tab抗体(参考申请号为CN202010576200.7，发明名称为抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物的中国发明专利的方法获取)、样品A与专利号CN202010576200.7的增殖实验中获得的EC80浓度的IL-4或IL13(专利具体发明名称为抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物)按1:1混合，制成混合液；
(4)将上步骤中的混合液按细胞培养液的等体积加入细胞培养孔；
(5)孵育72h后，用发光法细胞活力检测试剂盒检测细胞活力；
(6)根据检测结果计算不同抗体中和IL-4或IL13诱导TF-1细胞增殖的EC50浓度。
检测结果如表3、表4和图3、4所示。
表3双特异性单域抗体中和IL-4诱导的TF-1细胞增殖实验结果
4E9V0 4E9V10-2B3V2-1 dupilumab hIgG
EC50(nM) 0.2812 0.2618 0.1297 0.3750
表4双特异性单域抗体中和IL-13诱导的TF-1细胞增殖实验结果
4E9V0 4E9V10-2B3V2-1 dupilumab hIgG
EC50(nM) 0.2291 0.2154 0.1783 0.1312
实施例7
人源重组IL-5蛋白诱导的TF1细胞增殖以及工具抗体(Tab)中和增殖实验。
A、人源重组IL-5蛋白诱导的TF1细胞增殖实验：
(1)将复苏后传代3-4次的TF-1细胞按10000个每孔铺入96孔板。
(2)将人源IL-5蛋白配置最高浓度为500ng/mL的溶液，并进行5倍梯度稀释。
(3)将梯度稀释好的IL-5蛋白溶液按细胞培养液的等体积加入细胞培养孔。
(4)孵育72h后，用发光法细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。
(5)根据检测结果计算IL-5诱导TF-1细胞增殖的EC80浓度，计算结果为2.96ng/mL。
B、Tab(reslizumab)中和人源IL-5诱导的TF1细胞增殖实验：
(1)将复苏后传代3-4次的TF-1细胞按10000个每孔铺入96孔板。
(2)将Tab配制为10μg/mL的溶液，并进行5倍梯度稀释。
(3)将梯度稀释好的Tab与增殖实验中获得的EC80浓度的IL-5按1:1混合，制成混合液。
(4)将混合液按细胞培养液的等体积加入细胞培养孔。
(5)孵育72h后，用发光法细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。
(6)根据检测结果计算Tab中和IL-5诱导TF-1细胞增殖的EC50浓度。
实施例8
人源化双特异性单域抗体4E9V10-2B3V2-1中和IL-5诱导TF1细胞增殖的检测。
(1)将复苏后传代3-4次的TF-1细胞按10000个每孔铺入96孔板；
(2)将Tab以及前述的4E9V10-2B3V2-1抗体配制为10μg/mL的溶液，并进行5倍梯度稀释；
(3)将梯度稀释好的Tab、4E9V10-2B3V2-1抗体与实施例7中获得的EC80浓度的IL-5蛋白按1:1混合，制成混合液；
(4)将混合液按细胞培养液的等体积加入细胞培养孔；
(5)孵育72h后，用发光法细胞活力检测试剂盒检测细胞活力；
(6)根据检测结果计算不同抗体中和IL-5诱导TF-1细胞增殖的EC50浓度，实验结果如表5和图5所示。
表5双特异性抗体中和IL-5诱导的TF-1细胞增殖实验结果
reslizumab hIgG 4E9V10-2B3V2-1 2B3
EC50(nM) 0.1221 0.1080 0.1753 0.3362
结果显示，人源化后的双特异性抗体与非人源化抗体相比在中和IL-5诱导的TF-1细胞增殖方面，其阻断效果没有降低，并具有略微优势，而与其对应的上市药物相对，其阻断能力基本相当。
实施例9
人源化双特异性抗体4E9V10-2B3V2-1的亲和动力学检测，步骤如下：
(1)SD缓冲液配制：取适量牛血清白蛋白和吐温20以1×PBS(pH7.4)溶解，使得牛血清白蛋白和吐温20质量(或体积)分数分别为0.1％和0.02％；将上述的4E9V10-2B3V2-1抗体用SD缓冲液配制成10μg/mL的浓度；
(2)抗原工作液配制：抗原先以SD缓冲液配制成200nM，再按2倍梯度稀释，共设置5个浓度梯度，除此之外再设置一个SD缓冲液的空白对照；
(3)再生液的配制：取适量浓度为0.1M的甘氨酸储备液，用去离子水稀释10倍，混匀，获得再生液；
(4)实验步骤：开启Octet 96及其配套电脑中Data Acquisiton软件，用擦镜纸取适量75％的乙醇清洁采集探头的底面和侧面，仪器预热15min以上；Sensor预湿：Sensor在实验开始前置于SD缓冲液中浸泡10分钟以上，待用，然后设定机器程序按照：基线→抗体→基线→结合抗原→解离抗原→再生传感器的步骤进行实验操作，实验结果如表6所示。
表6检测结果
结合抗原 KD(M) Ka(1/Ms) Ka Error Kd(1/s) Kd Error R2
4E9V10-2B3V2-1 IL-4Rα 2.33E-10 1.98E+05 1.24E+03 4.60E-05 6.73E-06 0.994
4E9V10-2B3V2-1 IL-5 6.63E-10 2.13E+05 1.29E+03 1.41E-04 5.84E-06 0.9905
结果显示，靶向IL-4Rα和IL-5的双特异性抗体与两个抗原分别进行亲和力测定，对应亲和力均在1nM以下。
实施例10
本试验建立增殖中和法检测方法，以检测4E9V10-2B3V2-2(样品B)中和混合人源IL-4、IL-5诱导TF-1细胞增殖的活性。为方便，后续描述均将4E9V10-2B3V2-2以样品B代称。
表7阳性对照样品信息
表8阴性对照样品信息
样品名称 Human IgG1,kappa Isotype Control
生产/供货商 Sino Biological Inc.
货号 HG1K
聚合 <5％聚合
浓度 >1mg/ml
纯度 >95％
内毒素 <3EU/mg
保存条件 -20℃
表9受试样品信息
样品名称 样品B(4E9V10-2B3V2-2)
批号 20210317
浓度 1.99mg/ml
保存条件 -80℃
2.样品配制方法
试验缓冲液：试验培养基，RPMI-1640+10％FBS，2～8°储存备用。
Human IL-4准备：将Human IL-4用无菌超纯水溶解至100μg/ml，配制好的蛋白置于-80℃，储存备用。
Human IL-5准备：将Human IL-5用无菌超纯水溶解至100μg/ml，配制好的蛋白置于-80℃，储存备用。
3.样品配制方法
3.1细胞培养(TF-1)
细胞培养基：RPMI-1640+10％FBS+2ng/ml GM-CSF，传代密度为3E4-7E5。
3.2制备细胞悬液：取生长状态良好且密度达到1×105～4×105cells/ml的TF-1细胞，取适量细胞至15ml离心管，1200r，5min离心，弃上清，加1～2ml Assay Buffer重悬。
3.3细胞计数及接种：对重悬后的细胞悬液进行细胞计数，将细胞密度调整为2×105cells/ml，每孔50μl即1×104cells/well接种于白边底透的96孔细胞培养板中。
3.4将IL-4和IL-5按比例(4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4)混合，总蛋白浓度为100μg/ml；用试验缓冲液稀释100μg/ml的混合蛋白分别至3.11ng/ml、2.6928ng/ml、3.1532ng/ml、5.184ng/ml、15.568ng/ml、6.84ng/ml、3.9116ng/ml备用；用试验缓冲液将对照品或样品稀释至4×10μg/ml，将此浓度的样品按5倍比例进行9个浓度梯度稀释，第10个孔为0μg/ml，每个浓度2个复孔；将各比例IL-4和IL-5混合物与稀释后的样品1：1混合。
3.5将上述混合后样品按50μl/孔加入铺入细胞的96孔板。
3.6将96孔板放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育72h。
3.7从孵箱中取出细胞板，每孔加入100μl CellTiter-Glo，避光常温孵育15min，用多功能酶标仪测定各孔细胞活性。
本次试验阳性对照为Dupilumab、Mepolizumab和Dupilumab+Mepolizumab(1：1混合)，阴性对照为Human IgG，待测样品为样品B(4E9-V10-2B3V2-2)。每种样品设置两个复孔，起始浓度4*10μg/mL，5倍梯度稀释成9个浓度，每组最后一组复孔为0μg/ml浓度(96孔细胞板中第2列浓度为10μg/ml，第3列浓度为2μg/ml，第4列浓度为0.4μg/ml，第5列浓度为0.08μg/ml，第6列浓度为0.016μg/ml，第7列浓度为0.0032μg/ml，第8列浓度为0.00064μg/ml，第9列浓度为0.000128μg/ml，第10列浓度为0.0000256μg/ml，第11列浓度为0μg/ml)；按比例(4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4)混合的IL-4和IL-5配成3.11ng/ml、2.6928ng/ml、3.1532ng/ml、5.184ng/ml、15.568ng/ml、6.84ng/ml、3.9116ng/ml备用，与上述样品1：1混合；再将混合物与细胞按体积1：1混合，置于CO2培养箱中孵育72h(37℃，5％CO2)。最终使用多功能酶标仪读数，处理数据后得出结论。
试验数据见附表以摩尔浓度为横坐标，相对光单位(RLU)为纵坐标，用GraphPadPrism作非线性回归四参数曲线拟合，得到EC50和量效曲线，量效曲线如图6至图19所示。
表10主要仪器表
仪器 型号 生产公司
多功能酶标仪 VICTOR Nivo PerkinElmer
生物安全柜 Bsc-1304IIA2 苏州安泰空气技术有限公司
低速细胞离心机 DM0412 SCILOGEX
二氧化碳培养箱 CCL-170B-8 ESCO
表11主要试剂表
耗材及试剂名称 厂家 货号
RPMI-1640 Gibco 61870-127
96-孔细胞板 CORNING 3917
FBS Gibco 10091-148
GM-CSF sigma G5035
Human IL-5 Novoprotein CI59
Human IL-4 Novoprotein CX03
CellTiter-Glo Promega G7573
4.结果汇总
表12试验结果汇总
结果表明，IL4:IL5＝4:1时，板1中，阳性对照Dupilumab的试验窗口为1.77倍，EC50为0.8127nM；Mepolizumab的试验窗口为1.02倍，EC50为0.001298nM；样品B双价抗体的试验窗口为1.59倍，EC50为0.4245nM；板2中，样品B的试验窗口为1.78倍，EC50为0.3212nM；对照Dupilumab+Mepolizumab的窗口为1.68倍，EC50约为0.8250nM；阴性对照human IgG的窗口为1.01倍，EC50约为0.1051nM。根据以上数据做出的拟合曲线如图6和图7所示。
IL4:IL5＝3:1时，板3中，阳性对照Dupilumab的试验窗口为1.83倍，EC50为0.4481nM；Mepolizumab的试验窗口为1.05倍，EC50为0.001322nM；样品B双价抗体的试验窗口为1.53倍，EC50为0.2429nM；板4中，样品B双价抗体的窗口为1.60倍，EC50为0.2186nM；阳性对照Dupilumab+Mepolizumab的窗口为1.67倍，EC50约为0.9652nM；阴性对照human IgG的窗口为1.02倍，EC50约为0.0009147nM。根据以上数据做出的拟合曲线如图8和图9所示。
IL4:IL5＝2:1时，板5中，阳性对照Dupilumab的试验窗口为1.60倍，EC50为0.4519nM；Mepolizumab的试验窗口为0.99倍，EC50为2.936nM；样品B双价抗体的试验窗口为1.55倍，EC50为0.2402nM；板6中，样品B双价抗体的窗口为1.63倍，EC50为0.2127nM；阳性对照Dupilumab+Mepolizumab的窗口为1.76倍，EC50约为1.279nM；阴性对照human IgG的窗口为0.99倍，EC50无法计算。根据以上数据做出的拟合曲线如图10和图11所示。
IL4:IL5＝1:1时，板7中，阳性对照Dupilumab的试验窗口为1.77倍，EC50为0.5701nM；Mepolizumab的试验窗口为1.11倍，EC50为14.89nM；样品B双价抗体的试验窗口为1.71倍，EC50为0.3692nM；板8中，样品B双价抗体的窗口为1.70倍，EC50为0.3709nM；阳性对照Dupilumab+Mepolizumab的窗口为1.92倍，EC50约为1.733nM；阴性对照human IgG的窗口为1.07倍，EC50约为14.70nM。根据以上数据做出的拟合曲线如图12和图13所示。
IL4:IL5＝1:2时，板9中，阳性对照Dupilumab的试验窗口为1.68倍，EC50为0.8986nM；Mepolizumab的试验窗口为1.06倍，EC50为0.001038nM；样品B双价抗体的试验窗口为1.58倍，EC50为0.5947nM；板10中，样品B双价抗体的窗口为1.64倍，EC50为0.7358nM；阳性对照Dupilumab+Mepolizumab的窗口为1.62倍，EC50约为1.960nM；阴性对照human IgG的窗口为0.99倍，EC50约为0.002641nM。根据以上数据做出的拟合曲线如图14和图15所示。
IL4:IL5＝1:3时，板11中，阳性对照Dupilumab的试验窗口为1.53倍，EC50为0.3429nM；Mepolizumab的试验窗口为1.01倍，EC50为0.001468nM；样品B双价抗体的试验窗口为1.50倍，EC50为0.1523nM；板12中，样品B双价抗体的窗口为1.74倍，EC50为0.1077nM；阳性对照Dupilumab+Mepolizumab的窗口为1.76倍，EC50约为0.8805nM；阴性对照humanIgG的窗口为0.95倍，EC50约为0.001926nM。根据以上数据做出的拟合曲线如图16和图17所示。
IL4:IL5＝1:4时，板13中，阳性对照Dupilumab的试验窗口为1.58倍，EC50为0.1562nM；Mepolizumab的试验窗口为1.14倍，EC50为1.105nM；样品B双价抗体的试验窗口为1.50倍，EC50为0.07883nM；板14中，样品B双价抗体的窗口为1.67倍，EC50为0.04987nM；阳性对照Dupilumab+Mepolizumab的窗口为1.79倍，EC50约为0.3949nM；阴性对照humanIgG的窗口为1.03倍，EC50约为0。根据以上数据做出的拟合曲线如图18和图19所示。
结论：在上述检测条件下，不同比例混合的IL-4和IL-5的检测中，双价抗体样品B窗口均与Dupilumab以及混合Dupilumab+Mepolizumab的相当，且EC50明显低于Dupilumab以及混合Dupilumab+Mepolizumab；因此双价抗体样品B的中和活性相近于Dupilumab，优于混合Dupilumab+Mepolizumab。
实施例11
1.处方制剂的制备过程如下：
(1)配置制剂缓冲液：称取一定量的醋酸-醋酸钠，蔗糖，盐酸精氨酸，聚山梨酯80，溶剂为超纯水，醋酸-醋酸钠用于调整pH值；
(2)将抗体蛋白(样品B)加入至制剂缓冲液中，从而获得表13的各处方制剂制品。
处方设计：
表13各处方的成分组成
注：各个缓冲液均可以根据需求放大和缩小配置体积。
表13中的pH为制剂缓冲液(不含抗体)的pH；由抗体蛋白和制剂缓冲液组成的C01、C02、C05制剂的pH分别为5.1、5.1、5.0(如表16T0一列所示)。
醋酸-醋酸钠浓度是指醋酸和醋酸钠在处方制剂中的总浓度(以处方C01为例，醋酸在C01制剂中的浓度与醋酸钠在C01制剂中的浓度之和为20mmol/L)；聚山梨酯80的浓度w/v单位为g/ml。以处方C01为例，在每毫升处方制剂中含有0.0005g聚山梨酯80。在配制处方制剂时，所用的醋酸钠为三水合醋酸钠。
表14辅料厂家信息
2.各检测方法如下：
2.1 pH检测
按照《中华人民共和国药典》(2015年版，四部)通则0631“pH值测定法”测定。
2.2蛋白浓度检测
采用紫外分光光度法检测。称取超纯水稀释供试品，测定稀释后样品溶液在280nm处吸光度。每个供试品平行制备两份溶液。蛋白含量计算公式：C(mg/ml)＝A×D/ε，其中，A为溶液吸光度值，D为稀释倍数，ε为消光系数：1.666(mg/ml)-1+cm-1。蛋白含量为两次平行计算结果的平均值。
2.3渗透压(摩尔浓度测定法)
按照《中华人民共和国药典》(2015年版，四部)通则0632“渗透压摩尔浓度测定法”测定。
2.4粘度
RheoSensemicroVISC型粘度计对蛋白的粘度进行测定。
2.5纯度(SEC-HPLC)
采用高效液相色谱法检测。使用体积排阻色谱柱分离，流动相为50mmol/L磷酸缓冲液+300mmol/L NaCl+10％乙腈，pH6.8(称取NaH2PO4·2H2O 7.8g、NaCl 17.53g溶解于800ml超纯水中，混匀，加入100ml乙腈，用NaOH调节pH至6.8，定容到1000ml，使用0.22μm滤膜过滤，在室温下保存)流速0.5ml/min，检测波长280nm，柱温25℃。用超纯水将供试品稀释至2mg/ml，作为供试品溶液；将工作参比品用超纯水稀释至2mg/ml，作为系统适用性溶液。取样品缓冲液用超纯水稀释相同倍数做为空白溶液。取空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液各50μl注入液相色谱仪。
表15不同配方的渗透压、粘度及电导率
配方 渗透压(mOsm/kg) 粘度(mPa.s) 电导率(mS/cm)
C01 335 2.686 8.191
C02 327 2.814 8.084
C05 333 3.040 6.853
由上述结果可知，本发明制备的抗体制剂的渗透压在327～335mOsm/kg，粘度在2.686～3.040mPa.s，电导率在6.853～8.191mS/cm。
表16不同处方的pH稳定性测试
T0指零点(即刚制备得到抗体制剂时)，Agt48h代表将制剂溶液震荡48h，FT-5cyc是代表将制剂溶液冻融5个循环。
表17不同处方的蛋白浓度稳定性测试(mg/ml)
T0 5℃7d 5℃30d 25℃7d 25℃14d -20℃30d Agt48h FT-5cyc
C01 66.1 N/A 65.7 65.8 65.8 64.4 66.0 61.8
C02 68.5 N/A 68.5 68.6 68.0 62.4 68.5 64.4
C05 71.8 N/A 72.0 71.7 71.2 69.7 71.6 64.2
该项测试采用2.2蛋白浓度检测所示的方法检测。
表18不同处方的外观测试
表19-21中的数据为采用2.5纯度(SEC-HPLC)测试的方法测定的结果。
表19 SEC检测中高分子物质检测
根据以上结果可知，本发明制备的制剂在25℃储存14天后少于5％的所述抗体形成聚集体，在-20℃储存30天后少于4％的所述抗体形成聚集体。
表20 SEC检测中蛋白质单体检测
根据以上结果可知，本发明制备的制剂在25℃储存14天后纯度还能保持96％。
表21 SEC检测中LMV检测
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
序列表
<110> 南京融捷康生物科技有限公司
<120> 一种稳定的双特异性纳米抗体制剂
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Gly Asp Phe Tyr Cys
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Arg Ser Gly Gly Arg Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Val Gly Val Asp Gly Asn Cys Arg Asn Tyr Trp
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Asn Thr Phe Ser Phe Ser Thr Tyr Cys
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr
1 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp
1 5 10 15
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Cys Met Ala
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile
35 40 45
Arg Ser Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Gly
85 90 95
Val Asp Gly Asn Cys Arg Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ser Phe Ser
20 25 30
Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Gly Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ile Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Cys Met Ala
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile
35 40 45
Arg Ser Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Gly
85 90 95
Val Asp Gly Asn Cys Arg Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala
115 120 125
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
130 135 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145 150 155 160
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
165 170 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
180 185 190
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
195 200 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
210 215 220
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
245 250 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
260 265 270
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
275 280 285
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
290 295 300
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
305 310 315 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
340 345 350
Pro Ser Cys Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
355 360 365
Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr
370 375 380
Phe Ser Phe Ser Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly
385 390 395 400
Lys Glu Arg Glu Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ala
405 410 415
Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
420 425 430
Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr
435 440 445
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His
450 455 460
Pro Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
465 470 475
<210> 10
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Cys Met Ala
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala Ala Ile
35 40 45
Arg Ser Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Gly
85 90 95
Val Asp Gly Asn Cys Arg Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
115 120 125
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
130 135 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145 150 155 160
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
165 170 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
180 185 190
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
195 200 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
210 215 220
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
245 250 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
260 265 270
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
275 280 285
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
290 295 300
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
305 310 315 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
340 345 350
Pro Pro Cys Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val
355 360 365
Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr
370 375 380
Phe Ser Phe Ser Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly
385 390 395 400
Lys Glu Arg Glu Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ala
405 410 415
Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
420 425 430
Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr
435 440 445
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His
450 455 460
Pro Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
465 470 475
<210> 11
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caagtgcaac ttgtggaatc aggaggagga tcagtgcaag caggaggatc acttagactt 60
tcatgcgcag catcaggaga tttctattgt atggcatggt ttagacaagc acctggaaag 120
gagagggaag gagtggcaac aatcagatca ggaggaagat caacatacta cgcagattca 180
gtgaaaggaa gatttacaat ctcaaaggac aatgcaaagg acacccttta ccttcaaatg 240
aactcactta aacctgaaga tacagcaatg tactactgcg cagtgggagt ggatggaaac 300
tgcagaaact actggggcca ggggacacaa gtgacagtgt catcagagag caagtacggc 360
cctccttgcc ccagctgccc cgcccccgag tttctgggag gccccagcgt gtttctgttt 420
cctcccaagc ccaaagacac actgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac atgcgtggtg 480
gtcgacgtga gccaagaaga tcccgaggtg cagttcaact ggtatgtgga cggcgtggag 540
gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagggag gagcaattca acagcaccta cagagtggtg 600
agcgtgctga ccgtgctgca ccaagactgg ctgaacggca aggagtataa gtgtaaggtg 660
agcaacaagg gcctccccag cagcatcgag aagaccatct ccaaggccaa gggccagcct 720
agggagcctc aagtgtacac actgcccccc agccaagagg agatgaccaa aaaccaagtg 780
tctctgacat gcctcgtgaa gggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 840
aatggccagc ccgagaataa ctacaagacc accccccccg tgctcgactc cgatggcagc 900
ttctttctgt actctaggct gaccgtggac aagtctaggt ggcaagaggg aaacgtgttc 960
agctgttccg tgatgcacga ggctctgcac aaccactaca cccagaagag cctctctctg 1020
tctctgggaa aggagagcaa gtacggccct ccttgcccca gctgccccca agtgcagctg 1080
gtggagagtg ggggcggtag cgtacaagcg ggcggcagcc tgagactgag ctgcgccgcc 1140
agcggcaaca ccttcagctt cagcacctac tgcatgggct ggttcagaca gagccccggc 1200
aaggagagag agggcagcct ggccaccatc tacgacgcca gcaccgccta cgccggcagc 1260
gtgaagggca gattcaccat cagcagagac aacagcaaga acatcctgta cctgcagatg 1320
aacaacctga gagccgagga caccgccgtg tactactgcg ccgccgccag atactgcatg 1380
ttctggagcc accccagcta ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc 1434
<210> 12
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caagtgcagc tggtggagag tgggggcggt ctggtacaac cgggcggcag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggcga cttctactgc atggcctggt tcagacaggc ccccggcaag 120
gagagagagg ccgtggccgc catcagaagc ggcggcagaa gcacctacta cgccgacagc 180
gtgaagggca gattcaccat cagcagagac aacagcaaga acaccctgta cctgcagatg 240
aacagcctga aggccgagga caccgccgtg tactactgcg ccgtgggcgt ggacggcaac 300
tgcagaaact actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcagcgagag caagtacggc 360
cctccttgcc ccccttgccc cgcccccgag tttctgggag gccccagcgt gtttctgttt 420
cctcccaagc ccaaagacac actgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac atgcgtggtg 480
gtcgacgtga gccaagaaga tcccgaggtg cagttcaact ggtatgtgga cggcgtggag 540
gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagggag gagcaattca acagcaccta cagagtggtg 600
agcgtgctga ccgtgctgca ccaagactgg ctgaacggca aggagtataa gtgtaaggtg 660
agcaacaagg gcctccccag cagcatcgag aagaccatct ccaaggccaa gggccagcct 720
agggagcctc aagtgtacac actgcccccc agccaagagg agatgaccaa aaaccaagtg 780
tctctgacat gcctcgtgaa gggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 840
aatggccagc ccgagaataa ctacaagacc accccccccg tgctcgactc cgatggcagc 900
ttctttctgt actctaggct gaccgtggac aagtctaggt ggcaagaggg aaacgtgttc 960
agctgttccg tgatgcacga ggctctgcac aaccactaca cccagaagag cctctctctg 1020
tctctgggaa aggagagcaa gtacggccct ccttgccccc cttgccccca agtgcagctg 1080
gtggagagtg ggggcggtag cgtacaagcg ggcggcagcc tgagactgag ctgcgccgcc 1140
agcggcaaca ccttcagctt cagcacctac tgcatgggct ggttcagaca gagccccggc 1200
aaggagagag agggcagcct ggccaccatc tacgacgcca gcaccgccta cgccggcagc 1260
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ttctggagcc accccagcta ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc 1434
<210> 13
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
225 230 235 240
Pro
<210> 14
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
20
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ala Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 16
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ser Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 20
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ala Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10

Claims (10)

1.一种稳定的双特异性纳米抗体制剂，其特征在于：其包含有效量的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性纳米抗体，以及醋酸盐缓冲系统；所述制剂具有5.0至5.3的pH，所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性纳米抗体具有用于特异性结合IL-4Rα的第一抗原结合部分和用于特异性结合IL-5的第二抗原结合部分，第一抗原结合部分包括SEQ ID NO.1所示的CDR1、SEQ ID NO.2所示的CDR2和SEQ ID NO.3所示的CDR3；第二抗原结合部分包括SEQ ID NO.4所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2和SEQ ID NO.6所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的稳定的双特异性纳米抗体制剂，其特征在于：还包含
b）盐酸精氨酸；
c）蔗糖；
d）聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆188或其组合。
3.根据权利要求1所述的稳定的双特异纳米抗体制剂，其特征在于：所述的双特异性纳米抗体含有如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的稳定的双特异性纳米抗体制剂，其特征在于：所述醋酸盐缓冲系统为醋酸-醋酸钠缓冲系统，所述醋酸-醋酸钠浓度为20-40mmol/L，和/或盐酸精氨酸浓度为70-100mmol/L，和/或蔗糖浓度为80-120mmol/L，和/或所述制剂中含有聚山梨酯80，聚山梨酯80浓度为0.02~0.05%（w/v）。
5.根据权利要求4所述的稳定的双特异性纳米抗体制剂，其特征在于：所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体以小于100mg/mL的量存在。
6.根据权利要求1所述的稳定的双特异性纳米抗体制剂，其特征在于：所述的制剂含有60-70mg/mL的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体、20mmol/L醋酸-醋酸钠、100mmol/L盐酸精氨酸、80mmol/L蔗糖及0.05%（w/v）的聚山梨酯80，pH5.0~5.2；
或者，所述的制剂含有60-70mg/mL的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体、20mmol/L醋酸-醋酸钠、100mmol/L盐酸精氨酸、80mmol/L蔗糖及0.02%（w/v）的聚山梨酯80，pH5.0~5.2；
或者，所述的制剂含有60-70mg/mL的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性抗体、40mmol/L醋酸-醋酸钠、70mmol/L盐酸精氨酸、100mmol/L蔗糖及0.03%（w/v）的聚山梨酯80，pH5.0~5.2。
7.根据权利要求1所述的稳定的双特异性纳米抗体制剂，其特征在于：所述制剂在约25℃储存 14天后少于5% 的所述抗体形成聚集体。
8.一种液体组合物，其特征在于：其包含有效量的抗IL-4Rα/IL-5的双特异性纳米抗体，还包含
a）醋酸盐缓冲系统；
b）盐酸精氨酸；
c）蔗糖；
d）聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆188或其组合；
所述制剂具有5.0至5.3的pH；
所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性纳米抗体具有用于特异性结合IL-4Rα的第一抗原结合部分和用于特异性结合IL-5的第二抗原结合部分，第一抗原结合部分包括SEQ ID NO.1所示的CDR1、SEQ ID NO.2所示的CDR2和SEQ ID NO.3所示的CDR3；第二抗原结合部分包括SEQID NO.4所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2和SEQ ID NO.6所示的CDR3；
或者，所述抗IL-4Rα/IL-5的双特异性纳米抗体含有SEQ ID NO.9或10的氨基酸序列。
9.一种容器，其包括权利要求1-7中任一项所述的稳定的双特异性纳米抗体制剂或权利要求8所述的液体组合物。
10.权利要求1-7任一项所述的稳定的双特异性纳米抗体制剂在制备治疗疾病的药物中应用，所述疾病包括哮喘、过敏性皮炎、湿疹、关节炎、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、慢性阻塞性肺疾病、特应性皮炎、特发性肺纤维化、川崎病、镰状细胞病、格雷夫斯氏病、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核病和肾病、自身免疫疾病、含嗜酸性肉芽肿性多血管炎成人患者治疗、重度嗜酸性粒细胞性哮喘、高嗜酸性粒细胞综合征、慢性鼻窦炎伴鼻息肉、慢性阻塞性肺疾病、未控制的慢性鼻窦炎不伴鼻息肉、变应性真菌性鼻窦炎、结节性痒疹、家族性冷荨麻疹、大疱性类天疱疮、变应性真菌性鼻-鼻窦炎、慢性诱导性寒冷性荨麻疹、花生过敏、花粉过敏、嗜酸性粒细胞性食管炎、瘢痕瘤、瘙痒症、变应性支气管肺曲霉病、季节性过敏性鼻炎。
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