CN111505158A - 一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，包括育苗采样、生物碱提取、样品孵化、仪器分析及数据分析，本发明孵化培养烟叶不需要添加激化剂，无需控制湿度，将烟苗烟叶样品置于密闭容器中孵化10‑12小时即可进行生物碱提取及分析，由于本实验无需额外控制孵化反应的湿度，也无需添加激化剂，简化了反应条件，使得孵化反应在任何温度可控的环境下均可进行，极大缩短了孵化时间，提高了工作效率；本发明通过气质联用仪进行生物碱含量分析，只需5‑6分钟即可测定出尼古丁及降烟碱的含量从而得出PNC值，缩短了样品液的分析时间；本发明引入了PPNC作为PNC的简化方案，PPNC比PNC更容易获得，且不受标准品纯度、标准曲线质量等因素影响。

Description

一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法。
背景技术
在栽培烟草中，能将大部分尼古丁转化为降烟碱的突变植株被称为"转化株"，转化株中尼古丁含量降低，而降烟碱、N-亚硝基降烟碱以及麦司明等致癌物含量则成倍上升，这种变化导致转化株烟叶的评吸质量降低，致癌风险上升。
因此，如何从栽培烟草群体中鉴别并去除转化株对于生产质量合格的烟叶是极其必要的。目前，鉴别转化株的方法通常为化学分析检测法，通过乙烯、乙烯利、碳酸氢钠等为激化剂孵化成熟烟叶，促使转化株烟叶中的尼古丁在短时间内大量转化为降烟碱，进而检测尼古丁和降烟碱的变化来鉴别转化株。Shi等人优化了转化株的孵化条件(包括温度，相对湿度和激化剂)，以实现尼古丁的最大转化，然后根据最大转化率筛选转化株。该方法十分有效但比较费时，孵化反应耗时4-6天，测定尼古丁和降烟碱的含量还需几个小时，因此不适合大规模烟株样本的筛查。
以上方法均耗时长，效率低下，费时费力，不适合大规模烟株样本的筛查，而且需要通过添加激化剂、控制湿度来对烟叶进行孵化，其操作过程需严格控制孵化条件，在苗期和大田环境下操作难度较大，从而导致鉴定效率低下。因此，如何在保证筛查转化株有效性的情况下，提高筛查效率，简化操作步骤、缩短筛查时间是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法。
本发明的目的是这样实现的，一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，包括育苗采样、样品孵化、生物碱提取、仪器分析及数据分析，具体包括以下步骤：
S1、育苗采样：将待筛选品种的烟草种子在温室育苗盘中播种培育，45-55天后，对各株烟草幼苗叶片进行取样，在叶片上收集大小均匀、数量一致的叶块；
S2、样品孵化：将所述叶块于37℃密封于容器中10-12小时得到孵化烟叶；
S3、生物碱提取：将所述孵化烟叶用提取剂进行生物碱提取，得到生物碱提取液样品；
S4、仪器分析：采用气质联用仪对样品中的尼古丁和降烟碱含量进行分析；
S5、数据分析：使用气质联用仪化学工作站对所有样品和标准品进行自动峰识别和积分，计算PNC或PPNC值，其中，PNC为降烟碱浓度除以尼古丁和降烟碱总浓度的商，PPNC为降烟碱峰面积除以尼古丁和降烟碱总峰面积的商；当烟株的PNC或PPNC大于或等于其对应的判断点时，即判断该烟株为转化株，将其去除，当烟株的PNC或PPNC小于其对应的判断点时，即判断该烟株为非转化株，将其保留。
本发明的有益效果为：
1、现有技术转化株筛选方法均采用激化剂(乙烯、乙烯利或碳酸氢钠)对烟苗进行孵化培养，以扩大转化株和非转化株之间的PNC差异，这些方法均需要在合适激化剂存控制温度和湿度培养几天方可实现。而本发明孵化培养不需要添加激化剂，无需控制湿度，将烟苗烟叶样品置于密闭容器中孵化10-12小时即可进行生物碱提取及分析，由于本实验无需额外控制孵化反应的湿度，也无需添加激化剂，简化了反应条件，使得孵化反应在任何温度可控的环境下均可进行，极大缩短了孵化时间，提高了工作效率。
2、与现有技术生物碱提取及分析需耗时几小时相比，本方案通过气质联用仪进行生物碱含量分析，只需5-6分钟即可测定出尼古丁及降烟碱的含量从而得出PNC值，缩短了样品的分析时间；
3、本发明首次引入了PPNC作为PNC的简化方案，PPNC比PNC更容易获得，且不受标准品纯度、标准曲线质量等因素影响。
附图说明
图1为PNC值在孵化过程中的变化图；
图2为PPNC值在孵化过程中的变化图；
图3为PNC值在转化株和非转化株间值的分布图；
图4为PPNC值在转化株和非转化株间值的分布图；
图5为本发明筛选方法的流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，如图1所示，包括育苗采样、样品孵化、生物碱提取、仪器分析及数据分析，具体包括以下步骤：
S1、育苗采样：将待筛选品种的烟草种子在温室育苗盘中播种培育，45-55天后，对各株烟草幼苗叶片进行取样，在叶片上收集大小均匀、数量一致的叶块；
S2、样品孵化：将所述叶块于37℃密封于容器中10-12小时得到孵化烟叶；
S3、生物碱提取：将所述孵化烟叶用提取剂进行生物碱提取，得到生物碱提取液样品；
S4、仪器分析：采用气质联用仪对样品中的尼古丁和降烟碱含量进行分析；
S5、数据分析：使用气质联用仪化学工作站对所有样品和标准品进行自动峰识别和积分，计算PNC或PPNC值，其中，PNC为降烟碱浓度除以尼古丁和降烟碱总浓度的商，PPNC为降烟碱峰面积除以尼古丁和降烟碱总峰面积的商；当烟株的PNC或PPNC大于或等于其对应的判断点时，即判断该烟株为转化株，将其去除，当烟株的PNC或PPNC小于其对应的判断点时，即判断该烟株为非转化株，将其保留。
所述步骤5中，PNC值对应的判断点为9％，PPNC值对应的判断点为1.6％。
所述取样的具体方法为：将该叶片沿主脉对折，然后再对折，用直径为5-7mm打孔器在折后烟叶上进行2-4次打孔，尽量使各孔在折后烟叶上分布均匀，收集8-16个圆形叶块。
步骤1中所述叶片选择烟株的最大叶片，所述最大叶片的长宽乘积大于35cm2。
步骤2中所述提取剂为MTBE，将每个幼苗样品置于1.5mL离心管中，加入含1μg/mL喹啉的0.3mL MTBE和0.5mL 2.5％的氢氧化钠水溶液，旋涡1分钟，萃取液静止分层后取150μL上清液转移至气相色谱自动进样器进样小瓶进行仪器分析。选取MTBE作为提取剂的原因是：MTBE能很好的溶解尼古丁及降烟碱，且其极性与水相差很大，因此萃取时不会出现乳化现象，且能迅速与水分层。
步骤3中，所述气质联用仪的型号为Agilent 7890A-5977B。
步骤3中，所述气质联用仪的气相色谱分析条件为：采用DB-5 MS毛细管色谱柱，分流比为20:1，进样量为2μL，分离温度为270℃恒温，分离时间为1.8min，每个样品仪器总运行时间为3.4-3.6min，载气流量为0.5-1.5mL/min。本发明采用气质联用的方式进行样品分离，色谱分析时不需要完全分离，因此采用恒温分离。恒温分离相对于程序升温，分离时间大大缩短，程序升温由于升温和降温都需要花费一定时间，所以时间周期较长，而恒温分离的时间仅为1.8min，每个样品仪器总运行时间为3.4-3.6min。
所述载气为氦气。
步骤3中，所述气质联用仪的质谱分析条件为：选择离子模式进行数据采集，所述尼古丁和降烟碱的分析离子分别设置为84和70；采用电子轰击模式电离，电离电压70eV，检测器电压为1.0kV，离子源和传输线温度分别保持在200℃和300℃。
所述烟草品种为烤烟或白肋烟。
所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法应用于判别移栽后的大田烟株或采烤前的成熟烟株的转化株的鉴定中，对于非幼苗样品应根据其烟叶中尼古丁和降烟碱含量，应适当减少采样量或者对提取液进行稀释，以确保方法在合理的线性响应范围。
为验证本发明所述方法的可行性和准确性，以下各实施例所有实验烟苗在采用本发明提供的方法进行筛选的同时，还采用基于Shi方法(见技术背景)的程序进行孵化，即样品在37℃和80％相对湿度下，添加激化剂孵育7天，然后取出进行分析，确定其是否为转化株，作为参照物以确定本方法的准确性。
实施例1
S1、育苗和采样
将云烟85烟草种子播种在温室中各自的苗盘(9×18孔，孔径：3cm×3cm)，播种后第45天进行取样。对于每一株幼苗，取其最大叶片(长宽积大于35cm2)，将采集的叶片沿主脉对折，然后再对折，采用直径为6mm的打孔器在折后烟叶上进行3次打孔(打孔时尽量使三个孔在折后烟叶上分布均匀)，收集12个直径为6mm的圆形叶块，放入1.5mL塑料离心管。
S2、样品孵化：将所述叶块于37℃密封于容器中10小时得到孵化烟叶，将叶片样品密封在1.5mL离心管中进行孵育，叶片的水分被封锁在离心管中，因此无需提供额外的环境湿度。
S3、生物碱提取
采用甲基丁基乙醚(MTBE)作提取剂，喹啉作内标。对于每个幼苗样品，同时加入0.3mL MTBE(含1μg/mL喹啉)和0.5mL 2.5％的氢氧化钠水溶液，旋涡1分钟，萃取液静止分层后取150μL上清液转移至气相色谱自动进样器进样小瓶进行仪器分析。
S4、仪器分析
采用Agilent 7890A气相色谱仪与5977B质谱仪进行分析。气相色谱的分析条件为：色谱柱为DB-5 MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，分流比为20:1，进样量为2μL，分离温度270℃恒温，分离时间1.8min，每个样品仪器总运行时间约3.5min，载气(氦气)流量为1.0mL/min。质谱的分析条件为：采用选择离子模式(SIM)进行于数据采集，尼古丁和降烟碱的分析离子分别设置为84和70；采用电子轰击(EI)模式电离，电离电压70eV，检测器电压为1.0kV，离子源和传输线温度分别保持在200℃和300℃。
S5、数据分析
使用安捷伦MSD ChemStation F.01.03.2357化学工作站对所有样品和标准品进行自动峰识别和积分，手动检查积分错误并在必要时重新积分。用于校正曲线的尼古丁和降烟碱的浓度范围分别0.78-50μg/mL和0.15-10μg/mL，内标(喹啉)浓度为1.0μg/mL。使用MSD化学工作站完成定量校准，并将所得数据转移到Microsoft Excel中进行进一步分析：用尼古丁转化百分比(PNC)区分转化株和非转化株，PNC定义为降烟碱浓度(mol/L)除以尼古丁和降烟碱总浓度(mol/L)的商，与Shi方法对比，测得的PNC值大于或等于10％的烟苗即鉴定为转化株，本方法可以在不损失非转化株的情况下完全去除转化株。
实施例2
实施例2的方法与实施例1一致，唯一不同的在于本实施例用PPNC区分转化株和非转化株，与Shi方法对比，测得的PPNC值大于或等于1.8％的烟苗即鉴定为转化株，本方法可以在不损失非转化株的情况下完全去除转化株。
实施例3
S1、育苗和采样
将白肋烟TN90种子播种在温室中各自的苗盘(9×18孔，孔径：3cm×3cm)，播种后第50天进行取样。对于每一株幼苗，取其最大叶片(长宽积大于35cm2)，将采集的叶片沿主脉对折，然后再对折，采用直径为5mm的打孔器在折后烟叶上进行3次打孔(打孔时尽量使三个孔在折后烟叶上分布均匀)，收集12个直径为5mm的圆形叶块，放入1.5mL塑料离心管。
S2、样品孵化：将所述叶块于37℃密封于容器中12小时得到孵化烟叶；
S3、生物碱提取
采用甲基丁基乙醚(MTBE)作提取剂，喹啉作内标。对于每个幼苗样品，同时加入0.3mL MTBE(含1μg/mL喹啉)和0.5mL 2.5％的氢氧化钠水溶液，旋涡1分钟，萃取液静止分层后取150μL上清液转移至气相色谱自动进样器进样小瓶进行仪器分析。
S4、仪器分析
采用Agilent 7890A气相色谱仪与5977B质谱仪进行分析。气相色谱的分析条件为：色谱柱为DB-5 MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，分流比为20:1，进样量为2μL，分离温度270℃恒温，分离时间1.8min，每个样品仪器总运行时间约3.5min，载气(氦气)流量为1.0mL/min。质谱的分析条件为：采用选择离子模式(SIM)进行于数据采集，尼古丁和降烟碱的分析离子分别设置为84和70；采用电子轰击(EI)模式电离，电离电压70eV，检测器电压为1.0kV，离子源和传输线温度分别保持在200℃和300℃。
S5、数据分析
使用安捷伦MSD ChemStation F.01.03.2357化学工作站对所有样品和标准品进行自动峰识别和积分，手动检查积分错误并在必要时重新积分。用于校正曲线的尼古丁和降烟碱的浓度范围分别0.78-50μg/mL和0.15-10μg/mL，内标(喹啉)浓度为1.0μg/mL。使用MSD化学工作站完成定量校准，并将所得数据转移到Microsoft Excel中进行进一步分析：用尼古丁转化百分比(PNC)区分转化株和非转化株，PNC定义为降烟碱浓度(mol/L)除以尼古丁和降烟碱总浓度(mol/L)的商，与Shi方法对比，测得的PNC值大于或等于9％的烟苗即鉴定为转化株，本方法可以在不损失非转化株的情况下完全去除转化株。
实施例4
实施例4的方法与实施例3一致，唯一不同的在于本实施例用PPNC区分转化株和非转化株，与Shi方法对比，测得的PPNC值大于或等于1.6％的烟苗即鉴定为转化株，本方法可以在不损失非转化株的情况下完全去除转化株。
试验例1
以烤烟品种云烟85为例进行了如下验证试验：
1、采样稳定性实验
为了实现转化株的快速筛选，本实验在采样时省略了称样步骤。实验评价了所采样品重量的稳定性(表1)，表明10个不同烟叶样品之间的重量相对标准偏差在4.1-4.6％之间，表明所使用的采样方法可以采集重量较为稳定的样品。其原因可能为苗盘烟苗所处的生长环境几乎完全相同，所采叶片具有相似的厚度和密度，样品重量的稳定性确保了所计算的PNC或PPNC的可比性。大田烟叶由于所处生长环境差异较大，如采用本实验使用的方法采样可能导致不同样本间的重量差异较大。但由于PNC或PPNC的计算与采样重量无关，只要尼古丁和降烟碱的浓度处于仪器的线性响应范围，采样重量的差异不会对PNC和PPNC的计算值产生影响。
表1打孔器取样获得样品的重量分布
叶面积(cm<sup>2</sup>) 样品重量(mg) RSD(％)
转化株(烤烟) 68.1±12.3 46.1±2.1 4.6
非转化株(烤烟) 69.3±13.2 46.0±1.9 4.1
注:叶面积为10个样品的叶片长度与叶片宽度的乘积的平均值，RSD为样品重量的相对标准差。
2、叶片上采样位置对分析结果的影响实验
为了实现转化株的快速筛选，本实验从幼苗叶片中收集12个叶块作为一个样品，而不是把整片叶子或整个植物作为样本采集。本实验比较了从幼苗叶边缘与中间获得的样品的差别(见表2)，发现尼古丁和降烟碱在边缘叶子中的含量高于中间，而PNC和PPNC值在边缘和中间采样间无显著差异，这表明叶片上的采样位置对PNC和PPNC值影响不大，但仍建议对每片叶子进行固定位置采样，例如在本实验中对折后烟叶进行打孔时尽量使3次打孔在烟叶表面均匀分布。
表2叶面采样位置对PNC和PPNC的影响
Figure BDA0002483696380000111
注:每组包括10个样品。
3、叶片大小对分析结果的影响实验
表3对比分析了烤烟烟苗45天时大叶采样和小叶采样对PNC和PPNC的影响，结果表面，尼古丁和降烟碱的含量在大叶和小叶之间没有显着差异，PNC和PPNC的差异也不明显。考虑到对太小的叶子采样时的操作较困难，所以建议选择长宽积超过35cm2的叶片进行采样。
表3叶面尺寸对PNC和PPNC的影响。
Figure BDA0002483696380000112
Figure BDA0002483696380000121
注:叶面积为叶长度与叶宽的乘积
4、激化剂对尼古丁转化的影响
现有技术使用了包括乙烯，乙烯利和碳酸氢钠等激化剂促进尼古丁转化，而碳酸钠被认为与乙烯和乙烯利具有相同的刺激效果。本实验比较了使用和不使用0.8％碳酸氢钠处理的转化株幼苗，发现两种处理之间PNC无明显差异。因此，本实验在进行孵化培养时没有外加激化剂。
5、PNC、PPNC在孵化样品中的分布情况
如图1和图2所示，在37℃下孵化所采集的烟叶样品(密封于1.5mL离心管中)12小时后，对比孵化前，转化株的PNC和PPNC分别增加了3.1倍和3.7倍，而非转化株的PNC和PPNC均没有显著变化，可知本孵化实验促进了转化株中尼古丁想降烟碱的转化，使得转化株群体和非转化株群体的PNC或PPNC不再有重叠(如图3和图4)，从而能够通过判断PNC或PPNC，在不损失非转化株的情况下得以完全去除转化株。
由上述实验可知，经本方法孵化培养的幼苗转化株的平均PNC和PPNC分别为非转化株的3.1和3.7倍，采用PNC和PPNC值在不损失非转化株的情况下能实现转化株的完全剔除，本方法不仅取消样品研磨和称样步骤，且省去了添加激化剂及控制孵化湿度的步骤，较现有技术大大缩短了鉴定时间，提高了工作效率。
本发明简化了尼古丁和降烟碱的测定方法，取消样品研磨和称样步骤，缩短了样品提取时间，优化了气质联用分析方法(采用270℃恒温模式而不是程序升温)，最终使得整个鉴定过程只需5-6分钟(如图4)。

Claims (10)

1.一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，其特征在于，包括育苗采样、生物碱提取、样品孵化、仪器分析及数据分析，具体包括以下步骤：
S1、育苗采样：将待筛选品种的烟草种子在温室育苗盘中播种培育，45-55天后，对各株烟草幼苗叶片进行取样，在叶片上收集大小均匀、数量一致的叶块；
S2、样品孵化：将所述叶块于37 ℃密封于容器中10-12小时得到孵化烟叶；
S3、生物碱提取：将所述孵化烟叶用提取剂进行生物碱提取，得到生物碱提取液样品；
S4、仪器分析：采用气质联用仪对样品中的尼古丁和降烟碱含量进行分析；
S5、数据分析：使用气质联用仪化学工作站对所有样品和标准品进行自动峰识别和积分，计算PNC或PPNC值，其中，PNC为降烟碱浓度除以尼古丁和降烟碱总浓度的商，PPNC为降烟碱峰面积除以尼古丁和降烟碱总峰面积的商；当烟株的PNC或PPNC大于或等于其对应的判断点时，即判断该烟株为转化株，将其去除，当烟株的PNC或PPNC小于其对应的判断点时，即判断该烟株为非转化株，将其保留。
2.根据权利要求1所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，其特征在于，所述步骤5中，PNC值对应的判断点为9％，PPNC值对应的判断点为1.6％。
3.根据权利要求1所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，其特征在于，所述取样的具体方法为：将该叶片沿主脉对折，然后再对折，用直径为5-7mm打孔器在折后烟叶上进行2-4次打孔，尽量使各孔在折后烟叶上分布均匀，收集8-16个圆形叶块。
4.根据权利要求1或3所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，其特征在于，步骤1中所述叶片选择烟株的最大叶片，所述最大叶片的长宽乘积大于35cm2。
5.根据权利要求1所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，其特征在于，步骤2中所述提取剂为MTBE，将每个幼苗样品置于1.5mL离心管中，加入含 1 μg/mL喹啉的0.3 mL MTBE和0.5 mL 2.5%的氢氧化钠水溶液，旋涡1分钟，萃取液静止分层后取150μL上清液转移至气相色谱自动进样器进样小瓶进行仪器分析。
6.根据权利要求1所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，其特征在于，步骤3中，所述气质联用仪的气相色谱分析条件为：采用DB-5 MS毛细管色谱柱，分流比为20:1，进样量为2μL，分离温度为270℃恒温，分离时间为1.8 min，每个样品仪器总运行时间为3.4-3.6min，载气流量为0.5-1.5mL/min。
7.根据权利要求6所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，其特征在于，所述载气为氦气。
8.根据权利要求1所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，其特征在于，步骤3中，所述气质联用仪的质谱分析条件为：选择离子模式进行数据采集，所述尼古丁和降烟碱的分析离子分别设置为84和70；采用电子轰击模式电离，电离电压70 eV，检测器电压为1.0 kV，离子源和传输线温度分别保持在200 ℃和300 ℃。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法，其特征在于，所述烟草品种为烤烟或白肋烟。
10.权利要求9所述的基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法应用于移栽后的大田烟株或采烤前的成熟烟株的转化株的判别鉴定。
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