CN110839367A - 基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，包括从朱砂烟种子库中选种育苗；出苗到生长30～40d且长至30～40cm高后选底部第2至第4片状态良好烟叶取样；将取样置于乙烯利+脱落酸混合溶液中浸润后打孔，将打孔后剩余烟叶干燥至表面无水分；将无水分烟叶烘干至恒重；用化学分析烟叶的烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化率；检测打孔烟叶CYP82E4基因表达；根据烟碱转化率和CYP82E4基因表达，筛选出符合烟碱定量转化率的烟株培植，同时去掉转化率不符烟株；将筛选出的烟株套袋至成熟留种，即得到烟碱定量转化率的朱砂烟种子。本发明具有稳定可靠、筛选速度快、准确率高、种子烟碱转化率可控等特点。

Description

基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法
技术领域
本发明属于烟草种子预筛技术领域，具体涉及一种稳定可靠、易操作、筛选速度快、准确率高、种子烟碱转化率可控的基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法。
背景技术
朱砂烟是指烤后烟叶外观呈现中药的朱砂色，俗称“朱砂”烟叶。朱砂烟虽然稀少，但其在烟叶生产历史中是客观存在，如国外上世纪研究资料因其颜色与车厘子相似，故称“樱桃红（Cherry-Red）”烟叶。
常规烟叶烟碱主要由烟碱（化学名称叫尼古丁）、降烟碱（去甲基烟碱）、麦斯明、假木贼碱、可替宁、新烟草碱、尼可他因、联吡啶等八种碱性物质总合组成，统称生物碱，也称总烟碱。一般的栽培烤烟品种，烟碱含量占其总生物碱含量的93%以上，降烟碱含量一般不超过总生物碱含量的3.5%，但在栽培烤烟品种的烟株群体中，一些烟株在田间由于某些生态因子作用下而发生基因突变而出现烟碱去甲基化，烟碱转化成去甲基烟碱，即降烟碱，导致烟碱含量显著降低，降烟碱含量相应增加，这种具有烟碱向降烟碱转化能力的烟株被称为转化株（Converter），朱砂烟就是典型转化株。在天然条件下，这种突变株出现的概率很低，约为0.5%。
朱砂烟烟碱主要是降烟碱，占其总生物碱含量的50%以上，甚至达到90%或更高，尼古丁大量转化为降烟碱，尼古丁生物碱含量只有40%左右，有的不到10%。总烟碱不变、低尼古丁、高降烟碱，造就了朱砂烟口感舒适愉悦独特、劲头适中、烟香浓厚、刺激小，杂气轻、道地云南烟叶的品质优势，深受烟民青睐，是最具“三感”特色的烟叶（满足感、舒适感、轻松感），但在广大烟区朱砂烟只有零星出现，属于可遇不可求的天然现象。
朱砂烟遗传属于表观遗传，烤烟中发生朱砂烟的主要原因是CYP82E4基因受到诱导而发生强烈表达，从而使烤烟中烟碱向去甲基烟碱发生转化。基因主效、环境互作、中上部典型，决定表观性状的基因功能表达，并且是可稳定遗传。根据相关信息综合判断，随着代数增加，朱砂烟烟碱转化率逐步增加，即大部分烟碱转化成去甲基烟碱造成烟碱含量下降。
目前，我国尚无烟碱定量转化率的烤烟朱砂烟种子筛选方法。在已有云烟97-朱砂烟与云烟87-朱砂烟的种子库资源下，为满足各大烟区的推广生产以及烟民需求，便于科学制定朱砂烟的鉴定标准和指导评级收购，保障筛选提纯留种种子纯度与便于管理，急需通过对不同烟碱转化率的朱砂烟种子进行筛选，从而全面提升烤烟原料保障能力与核心竞争力。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种稳定可靠、易操作、筛选速度快、准确率高的基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法。
本发明是这样实现的：包括选种育苗、培植取样、前处理、55℃烘干至恒重、烟碱分析、基因检测、烟株筛选、培植取种步骤，具体步骤如下：
A、选种育苗：从不同烟碱转化率的朱砂烟种子库里选择种子进行育苗；
B、培植取样：从出苗开始待烟株生长30～40d且生长至30～40cm高度后，选取烟株底部第2至第4片叶中状态良好的烟叶作为取样叶片；
C、前处理：将取样的烟叶置于乙烯利与脱落酸的混合溶液中浸润后，采用打孔法采集鲜烟叶样品用于基因表达检测，将剩余烟叶干燥至表面没有游离的水分；
D、烘干：将经前处理的表面无水分烟叶在50～60℃条件下烘干至恒重后磨粉保存；
E、烟碱分析：用气相色谱仪分析烘干至恒重后烟叶的烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化为降烟碱的烟碱转化率T；
F、基因检测：检测经前处理后的打孔烟叶样品中CYP82E4基因表达水平；
G、烟株筛选：根据烟碱转化率T和CYP82E4基因的表达情况，筛选出所需烟碱定量转化率的烟株继续培植，同时去掉培植地块中转化率不符合要求的烟株；
H、培植取种：将筛选出的烟株严格单株套袋防止异花授粉，待成熟留种后即可得到所需定量烟碱转化率的烤烟朱砂烟种子。
本发明的有益效果为：
1、本发明创造性的将测定朱砂烟的主效基因CYP82E4表达和烟碱转化率结合形成复合检测，较单一检测转化率更精准，可以极大减小因早期烟叶烟碱转化微弱带来的筛选误差，填补了在基因层面对转化株烤烟种子进行筛选和鉴定的空白，本发明特别适合用于筛选烟碱高转化率且定量转化率的烤烟朱砂烟种子，从而可以为朱砂烟生产提供任意烟碱转化率的良种，有利于朱砂烟的生产推广和制定评级收购标准。
2、本发明采收早期烟叶作为取样，避免了晚期采样时较大的烟叶难以处理的难题，而且早期采样还能将不符合烟碱转化率的烟株尽早去劣，以防止异化授粉影响种子的纯度。
3、本发明将取样的烟叶经乙烯利和脱落酸的混合溶液浸润处理后打孔采样，将采样后剩余的烟叶干燥至表面无游离水分的前处理，通过取样后尽快用乙烯利和脱落酸的混合溶液浸润处理，能促进幼叶变黄和最大程度提高烟碱转化率，而干燥表面水分能防止烟叶霉烂，从而为后续筛选的准确性提供良好基础。
4、本发明根据朱砂烟下一代的烟碱转化率会比上一代略高的实践，当需要筛选转化率为T～T+15%的种子时，用烟碱转化率为T-15%～T的种子进行育苗，然后培植足够的烟株来进行取样以便得到够量的种子，还能避免样本太小而导致遗传漂移和表型改变的问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。
本发明包括选种育苗、培植取样、前处理、55℃烘干至恒重、烟碱分析、基因检测、烟株筛选、培植取种步骤，具体步骤如下：
A、选种育苗：从不同烟碱转化率的朱砂烟种子库里选择种子进行育苗；
B、培植取样：从出苗开始待烟株生长30～40d且生长至30～40cm高度后，选取烟株底部第2至第4片叶中状态良好的烟叶作为取样叶片；
C、前处理：将取样的烟叶置于乙烯利与脱落酸的混合溶液中浸润后，采用打孔法采集鲜烟叶样品用于基因表达检测，将剩余烟叶干燥至表面没有游离的水分；
D、烘干：将经前处理的表面无水分烟叶在50～60℃条件下烘干至恒重后磨粉保存；
E、烟碱分析：用气相色谱仪分析烘干至恒重后烟叶的烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化为降烟碱的烟碱转化率T；
F、基因检测：检测经前处理后的打孔烟叶样品中CYP82E4基因表达水平；
G、烟株筛选：根据烟碱转化率T和CYP82E4基因的表达情况，筛选出所需烟碱定量转化率的烟株继续培植，同时去掉培植地块中转化率不符合要求的烟株；
H、培植取种：将筛选出的烟株严格单株套袋防止异花授粉，待成熟留种后即可得到所需定量烟碱转化率的烤烟朱砂烟种子。
所述A步骤中预筛选的种子烟碱目标转化率为T～T+15%时，从种子库里选择的种子烟碱转化率为T-15%～T。
所述A步骤中的朱砂烟种子库包括云烟97-朱砂烟种子库、云烟87-朱砂烟种子库。
所述B步骤中选取烟株底部第2至第4片叶中状态良好且长度22～28cm的烟叶作为取样叶片。
所述B步骤中在取样前5～10d停止施肥，在取样前10～20d停止施氮肥。
所述C步骤中取样后的烟叶置于1.0～1.5g/L的乙烯利和3～7mg/L的脱落酸等体积混合溶液中浸润5～15s。
所述C步骤中经采集用于基因表达检测的烟叶样品的剩余烟叶置于30～40℃的烘箱中烘干至表面没有游离的水分。
所述E步骤中烟碱转化率T为：
T=降烟碱/(烟碱+降烟碱+其他微量碱)×100%。
所述F步骤中采用荧光定量PCR技术检测经前处理后的烟叶CYP82E4基因表达水平。
所述I步骤中的烟叶CYP82E4基因包括野生型的CYP82E4基因、由野生型的CYP82E4基因核苷酸序列第116位的核苷酸由G突变为A的CYP82E4-1基因。
所述I步骤中的烟叶CYP82E4-1基因由野生型的CYP82E4基因所编码的蛋白质第39位Gly突变为Glu。
实施例1
筛选烟碱转化率为60～75%的烤烟朱砂烟种子：
S100：用烟碱转化率为45～60%的云烟87朱砂烟种子进行育苗。
S200：从出苗开始待烟株在大苗盘中生长30～40d且生长至30～40cm高度后，选取烟株底部第2至第4片叶中状态良好且长度24～26cm的烟叶作为取样叶片，其中在取样前10d停止施肥。
S300：将取样的烟叶置于1.2g/L乙烯利和5mg/L脱落酸的等体积混合溶液中浸润10s，采用打孔法采集鲜烟叶样品用于基因表达检测并将剩余烟叶置于35℃的烘箱中烘干至表面没有游离的水分。
S400：将经前处理的表面无水分烟叶在55℃下烘干至恒重后磨粉装袋保存。
S500：用气相色谱仪分析烘干至恒重后烟粉的烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化为降烟碱的烟碱转化率T：
T=降烟碱/(烟碱+降烟碱+其他微量碱)×100%。
S600：采用荧光定量PCR技术检测经前处理后的打孔烟叶样品CYP82E4基因表达水平。
S700：根据计算的烟碱转化率T和检测的CYP82E4基因表达情况，筛选出烟碱转化率为60～75%的烟株继续培植，同时尽早去掉转化率为60～75%范围以外的烟株；
S800：将筛选出的烟株严格单株套袋防止异花授粉，待其成熟留种后即可得到烟碱转化率为60～75%的烤烟朱砂烟种子，如表1。
表1 筛选后云烟87烤烟朱砂烟烟叶的烟碱转化率
Figure 56266DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，烟碱转化率为45～60%的云烟87烤烟朱砂烟原种，15株筛选种中有12株的烟碱转化率落在60～75%区间，占比80%；2株落在45～60%区间，占比13.33%；1株烟碱转化率>75%。因此，可以用转化率为45～60%的种子来筛选目标转化率为60～75%的烤烟朱砂烟种子。
实施例2
筛选烟碱转化率为70～85%的烤烟朱砂烟种子：
S100：用烟碱转化率为55～70%的云烟97朱砂烟种子进行育苗。
S200：从出苗开始待烟株在大苗盘中生长30～40d且生长至30～40cm高度后，选取烟株底部第2至第4片叶中状态良好且长度22～24cm的烟叶作为取样叶片，其中在取样前5d停止施肥，在取样前15d停止施氮肥。
S300：将取样的烟叶置于1.0g/L乙烯利和7mg/L脱落酸的等体积混合溶液中浸润15s，采用打孔法采集鲜烟叶样品用于基因表达检测并将剩余烟叶置于35℃的烘箱中烘干至表面没有游离的水分。
S400：将经前处理的表面无水分烟叶50℃下烘干至恒重后磨粉装袋保存；
S500：用气相色谱仪分析烘干至恒重后烟粉的烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化为降烟碱的烟碱转化率T：
T=降烟碱/(烟碱+降烟碱+其他微量碱)×100%。
S600：采用荧光定量PCR技术检测经前处理后的打孔烟叶样品CYP82E4基因表达水平。
S700：根据计算的烟碱转化率T和检测的CYP82E4基因表达水平，筛选出烟碱转化率为70～85%的烟株继续培植，同时尽早去掉转化率为70～85%范围以外的烟株；
S800：将筛选出的烟株严格单株套袋防止异花授粉，待其成熟留种后即可得到烟碱转化率为70～85%的烤烟朱砂烟种子，如表2。
表2 筛选后云烟97烤烟朱砂烟烟叶的烟碱转化率
Figure 550833DEST_PATH_IMAGE002
由表2可知，烟碱转化率为55～70%的云烟97烤烟朱砂烟原种，15株筛选种中有13株的烟碱转化率落在70～85%区间，占比86.67%；1株落在55～70%区间，占比6.67%；1株烟碱转化率<55%。
实验例1
将实施例1中的烟叶从出苗后25天开始，每隔5天分别用1.2g/L乙烯利、5mg/L脱落酸、1.2g/L乙烯利和5mg/L脱落酸的等体积混合溶液处理，按本发明所述方法检测烟碱转化率，直至出苗后40天停止。待出苗100天后不经前述溶液处理直接检测得到烟碱标准转化率。统计比较烟碱转化的阳性率如表3、4、5。
表3 不同时间乙烯利溶液处理下烟叶烟碱转化率
Figure 83445DEST_PATH_IMAGE003
注：表中“+”表示烟叶烟碱转化率大于或等于3.5% ；“-”表示烟叶烟碱转化率小于3.5%。
表4 不同时间脱落酸溶液处理下烟叶烟碱转化率
Figure 938138DEST_PATH_IMAGE004
注：表中“+”表示烟叶烟碱转化率大于或等于3.5% ；“-”表示烟叶烟碱转化率小于3.5%。
表5 不同时间乙烯利+脱落酸混合溶液处理下烟叶烟碱转化率
Figure 138175DEST_PATH_IMAGE005
注：表中“+”表示烟叶烟碱转化率大于或等于3.5% ；“-”表示烟叶烟碱转化率小于3.5%。
由表3、4、5可看出，1.2g/L乙烯利处理下，35d后烟叶烟碱转化率与标准转化率一致，而5mg/L脱落酸处理、1.2g/L乙烯利+5mg/L脱落酸等体积混合溶液处理则为40d、30d。综上可得出1.2g/L乙烯利+5mg/L脱落酸等体积混合溶液处理能够帮助提前检测到转化株，从而提高效率。
实验例2
将实施例1中同株采收的烟叶采用不同的干燥方式干燥1h，比较干燥效果如表6。
表6 不同干燥方式1h的干燥效果比较
Figure 538063DEST_PATH_IMAGE006
注：表中“+”表示烟叶表面有游离水分 ；“-”表示烟叶表明没有游离水分。
由表6可看出，1h低温烘干后，10片烟叶表面都没有游离水分，而经风干1h后，9片烟叶表面仍有游离水分，只有1片烟叶表面没有游离水分，说明低温烘干方式比风机风干方式更快速。
实验例3
采集实施例1中苗期烟叶，然后采用实施例1所述方法分别检测烟碱转化率、CYP82E4基因表达水平、烟碱转化率+CYP82E4基因表达水平。统计比较结果如表7。
表7 苗期烟叶采用不同检测方法的比较
Figure 823551DEST_PATH_IMAGE007
注：表中“+”表示阳性 ； “-”表示阴性。
由表7可看出，15株烟株中，化学检测烟碱转化率+ CYP82E4基因表达情况得出的阳性率与烟碱标准转化率一样，而单独化学检测或者CYP82E4基因检测都与烟碱标准转化率有偏差，单独化学检测容易出现假阴性，单独CYP82E4基因检测容易出现假阳性。说明本发明与单独检测转化率或者CYP82E4基因表达检测来筛选种子相比，两种检测方式相结合的检测率可以明显降低假阳性与假阴性率，更加稳定可靠。

Claims (9)

1.一种基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，其特征在于包括选种育苗、培植取样、前处理、烘干、烟碱分析、基因检测、烟株筛选、培植取种步骤，具体步骤如下：
A、选种育苗：从不同烟碱转化率的朱砂烟种子库里选择种子进行育苗；
B、培植取样：从出苗开始待烟株生长30～40d且生长至30～40cm高度后，选取烟株底部第2至第4片叶中状态良好的烟叶作为取样叶片；
C、前处理：将取样的烟叶置于乙烯利与脱落酸的混合溶液中浸润后，采用打孔法采集鲜烟叶样品用于基因表达检测，将剩余烟叶干燥至表面没有游离的水分；
D、烘干：将经前处理的表面无水分烟叶在50～60℃条件下烘干至恒重后保存；
E、烟碱分析：用气相色谱仪分析烘干至恒重后烟叶的烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化为降烟碱的烟碱转化率T；
基因检测：检测经前处理后的打孔烟叶样品中CYP82E4基因表达水平；
烟株筛选：根据烟碱转化率T和CYP82E4基因的表达情况，筛选出所需烟碱定量转化率的烟株继续培植，同时去掉培植地块中转化率不符合要求的烟株；
培植取种：将筛选出的烟株严格单株套袋防止异花授粉，待成熟留种后即可得到所需定量烟碱转化率的烤烟朱砂烟种子。
2.根据权利要求1所述基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，其特征在于所述A步骤中预筛选的种子烟碱目标转化率为T～T+15%时，从种子库里选择的种子烟碱转化率为T-15%～T。
3.根据权利要求2所述基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，其特征在于所述A步骤中的朱砂烟种子库包括云烟97-朱砂烟种子库、云烟87-朱砂烟种子库。
4.根据权利要求2所述基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，其特征在于所述B步骤中选取烟株底部第2至第4片叶中状态良好且长度22～28cm的烟叶作为取样叶片。
5.根据权利要求2所述基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，其特征在于所述B步骤中在取样前5～10d停止施肥，在取样前10～20d停止施氮肥。
6.根据权利要求5所述基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，其特征在于所述C步骤中取样后的烟叶置于1.0～1.5g/L的乙烯利和3～7mg/L的脱落酸等体积混合溶液中浸润5～15s。
7.根据权利要求6所述基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，其特征在于所述C步骤中经采集用于基因表达检测的烟叶样品的剩余烟叶置于30～40℃的烘箱中烘干至表面没有游离的水分。
8.根据权利要求1至7任意一项所述基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，其特征在于所述E步骤中烟碱转化率T为：
T=降烟碱/(烟碱+降烟碱+其他微量碱)×100%。
9.根据权利要求7所述基于烟碱定量转化率和基因表达筛选朱砂烟种子的方法，其特征在于所述F步骤中采用荧光定量PCR技术检测经前处理后的烟叶CYP82E4基因表达水平。
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