CN112841023A - 工业大麻的单性结实育种方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及育种技术领域，尤其涉及一种工业大麻的单性结实育种方法及其应用。本发明公开的工业大麻的育种方法，包括首先诱导雌株产生雄花，进行一次不同品种间大麻雌株杂交结实，将两个亲本的遗传物质混合；然后筛选杂交后代中综合了两个亲本优良性状的雌性单株，再诱导雄花自交或回交结实，接着重复进行多代筛选和自交或回交，直到获得性状均一、遗传稳定的大麻品种。本发明通过开发诱导雌性大麻植株产生可育雄花并散粉的关键技术，雌株单性自交后产生可萌发正常种子，实现大麻的雌株自交育种和繁种，后代全部为雌株并保持了单株母体雌株的全部遗传物质，从根本上解决上述工业大麻生产面临的品种短缺和育种难的瓶颈问题。

Description

工业大麻的单性结实育种方法及其应用

技术领域

本发明涉及育种技术领域，尤其涉及一种工业大麻的单性结实育种方法及其应用。

技术背景

大麻含有约60种分子结构相似的大麻酚类物质，主要由雌花花叶的毛状油腺体合成(Meng et al.,2018；Spitzer-Rimon et al.,2019)，其中四氢大麻酚THC和大麻二酚CBD的化学结构都类似于人脑中负责信息传输的神经介质，因此可以作用于人的神经系统，对疼痛、忧郁等多种常见疾病有独特疗效。四氢大麻酚THC是大麻的精神活性成分，是人脑两个神经受体的配位体，可影响心情、食欲、记忆、炎症等，但会致幻、成瘾，在多国仍属于管制药物，我国规定药用大麻的THC含量不能高于0.3％，否则为违禁毒品。而大麻二酚具有抗痉挛、镇痛、治疗风湿、痛风、青光眼、抑郁、失眠、哮喘、神经痛等多种功效，在提供多种疗效的同时不会致幻、成瘾，并且已经被国际卫生组织认定为非依赖性药物，可以广泛用于医药、化妆品、食品添加剂等，应用市场刚刚起步，发展远景看好。

大麻品种质量主要决定于其主要有效成分大麻二酚CBD和四氢大麻酚THC的含量水平，可以用高效液相色谱、气相色谱结合质谱等不同方法测定(Meng et al.,2018；Ruppel and Kuffel,2013；Storm et al.,2020)。工业大麻是指四氢大麻酚含量低于0.3％的品种，高于0.3％则被认为是需要严格管控的毒品品种。优良工业大麻品种的大麻二酚含量可高达约占花叶干重的20％，而四氢大麻酚的含量则可低于现代仪器检测水平。由于不同工业大麻品种的CBD含量可从低于1％到接近20％，差异极大，且植株的农艺性状千差万别，优选THC含量低，CBD含量高，生物产量高，农艺性状适宜田间种植的品种对工业大麻产业的发展至关重要。

大麻主要是雌雄异株，虽然也有雌雄同株情况，但分别产生单性雌化和雄花，异花授粉、受精结实。自然授粉结实的后代不仅有一半雄株、一半雌株，雌株也由于随机分离而缺乏一致性，株高、株型、生育期、大麻酚含量等均不整齐，不适宜种植生产。大麻进入生殖生长时一般雄株首先分化，雄花序排列疏松，雄花有5个雄蕊，花粉小，花粉量大，很容易随风飘散；雌花单子房，伸长的两个白色分支柱头明显，花叶上有丰富毛状腺体分泌粘液，雌花序紧凑，花叶密集，是有效药用成分大麻酚的主要合成和储存器官(Mediavilla et al.,1998；Spitzer-Rimon et al.,2019)。雄株基本不含大麻酚，在实际田间生产中所有的雄性植株必需及时发现、及早去除。由于雄株花粉量极大，如果去除不及时、不彻底就会导致大量雌株授粉结实，导致雌花序分化生长终止，积累的营养物质转换为种子发育所用，停止合成大麻酚，严重影响生物产量和有效成分大麻酚的积累，因此自然结实的种子不适宜工业大麻的大规模生产种植。

大麻的性别主要由遗传基因决定，但也受环境影响，有的雌性植株在生殖生长晚期如果环境周围没有雄株提供可受精花粉，也常会在腋芽处分化出可育雄花，完成授粉结实、传宗接代的任务。虽然大麻是否有性染色体尚无定论，到目前为止也没有发现任何决定雌雄性别的专有基因，但通过对比多个大麻品种雌雄株的RAPD(Random AmplifiedPolymorphic DNA)带型差异，发现有多个雄株特异带，克隆其中差异比较稳定的片段并测序，开发出了几个SCAR(Sequenced Characterized Amplified Region)分子标记，据此可通过简单PCR分析在大麻苗期即及时鉴别雌雄株(Mandolinoet al.,1999；Techen et al.,2010；

et al.,2002)。

优良大麻单株可以通过观察农艺性状和测定四氢大麻酚及大麻二酚的含量筛选，由于异花受精导致的后代杂合，优良性状难以靠自然结实的种子稳定遗传，但可以通过扦插、组培苗生产等常用于果树的无性营养繁殖方法保留。组培苗克隆方法繁殖系数高，不改变母本植株的性状，广泛用于快速繁殖经济价值高的花卉、药材、果树等，如果大麻种苗的价格能高于组培苗成本，组培苗也适用于优良大麻品种的无性繁殖。组培苗生产需要无菌操作，技术要求高，风险大，成本控制复杂，较高的技术要求和育苗成本不适合大规模生产应用(Lata et al.,2009；Wang et al.,2019)。

大麻虽然为一年生草本，但茎杆坚硬，纤维物质含量高，能诱导生根，通过扦插方式繁殖。可以在播种季节前几个月于温室中多代扦插扩繁雌性幼苗，达到一定数量和大小后在适宜时机移栽到田间种植。虽然扦插幼苗扩繁和移栽的人工成本高，移栽成活率受多种因素影响，移栽后幼苗恢复生长缓慢，活力差，影响后期发育，但如果能规划控制好流程，仍然是一种可忠实保留母本植株优良性状的有效繁殖途径，适合特殊条件下的大麻生产种植，比如工业化温室种植。

上述的自然种子苗田间去雄和营养繁殖后雌苗移栽都需要额外操作，不仅增加成本，而且有打断生产进程的不确定风险，严重制约了工业大麻的规模化生产。理想的繁殖方法是诱导大麻雌株自交产生种子，能够像玉米、大豆等农作物一样用种子直接播种，同时种子不形成任何雄株，只产生雌性植株，且所有雌性植株具有整齐一致的习性和农艺性状，便于田间管理。各类植物激素在植物的各个生长发育阶段中都起着及其重要的调节作用，虽然不同植物对不同激素的反应有很大差异，但大多数植物从营养生长到生殖生长的转变和性器官发育受赤霉素、细胞分裂素、乙烯等的直接影响，因此通过调节植物体内不同植物激素的作用，有可能改变某些植物雌雄花的分化发育。通过人工调控影响雌雄花发育的植物激素水平，可以改变包括黄瓜、啤酒花、和大麻等多种植物的雌雄花发育状态。例如乙烯可通过诱导雄蕊特异的DNA损伤抑制雄花发育，体外增施乙烯可促进黄瓜多产生雌花(Wanget al.,2010)；增加赤霉素和抑制乙烯能诱导雌性大麻植株发育雄花(Mohan Ram andJaiswal,1972；Mohan Ram and Sett,1982)；抑制乙烯可以诱导啤酒花的雌性植株产生雄花(Momma and Umemoto,2017)。

中国多地有纤维用大麻的传统种植生产，但由于长期禁止药用大麻的种植生产，直到近年来才先后容许云南和黑龙江两省在严格监管的条件下种植工业大麻，因此目前严重缺乏优良工业大麻品种，是工业大麻产业化发展的制约瓶颈，亟需培育适宜当地栽培生长条件的自主产权品种。

发明内容

本发明通过开发诱导雌性大麻植株产生可育雄花并散粉的关键技术，雌株单性自交后产生可萌发正常种子，后代全部为雌株并保持了单株母体雌株的全部遗传物质，不引入任何其它来源遗传物质；提出了工业大麻雌株单性结实育种概念和技术流程，通过不同遗传背景的雌株间杂交后的多代筛选和自交、或回交，挑选培育稳定遗传的优良品种。技术包括了雌雄株苗期鉴定，母株的扦插克隆扩繁，雌株单性结实，和优良单株选育等完整体系，可以从根本上解决上述工业大麻生产面临的品种短缺和育种难的瓶颈问题。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种工业大麻的育种方法，包括：首先进行一次不同品种间大麻雌株杂交结实，将两个亲本的遗传物质混合；然后筛选杂交后代中综合了两个亲本优良性状的雌性单株，再诱导雄花自交或回交结实，接着重复进行多代筛选和自交或回交，直到获得性状均一、遗传稳定的大麻品种。

优选的，采用乙烯生物合成抑制剂或乙烯功能阻遏剂诱导工业大麻雌株开雄花，授粉后实现雌株单性结实；或，

采用体外增施植物激素赤霉素的方法，诱导雌株分化产生雄花，授粉后实现雌株单性结实；

更优选的，采用的乙烯生物合成抑制剂选自氨基氧乙酸、2-氨基异丁酸、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、氯化钴或根瘤菌毒素中的至少一种；

更优选的，采用的乙烯功能阻遏剂选自硝酸银、银粉溶胶、硫代硫酸银或1-甲基环丙烯中的至少一种。

在本发明的一些具体实施例中，乙烯功能阻遏剂为硫代硫酸银，其有效使用浓度为每升0.1-30毫摩尔。

优选的，包括：

S1：基于分子生物学的方法鉴定大麻的雌雄株；

S2：筛选出优良的大麻雌株；

S3：将优良单株扦插繁殖；

S4：雌株单性结实；

S5：雌株自交育种和繁种。

优选的，在S1中，在大麻苗期，根据大麻雄珠特异性的SCAR分子标记，基于PCR分析方法，鉴定出雌雄株。

优选的，所述S2包括：

S21：筛选出长势旺盛、分枝多、株型紧凑、植株粗壮高大的单株；

S22：接着在大麻开花后挑选雌花花序多，花和花叶密集，毛状腺体丰富的单株；

S23：采集花叶阴干，测定其大麻二酚和四氢大麻酚的含量，筛选出优良的大麻雌株。

优选的，所述S3包括：

通过扦插繁殖优良雌性单株克隆，保留部分克隆株自然开雌花，诱导部分克隆株产生雄花，相互授粉自交结实后留种储存，并进入下一步育种选育。

优选的，所述S3包括：

挑选长势旺盛的优良雌性单株成株，修剪后将枝条插入5-500毫克/升的IBA生长素溶液中浸泡后，取出晾干，插入由花土与蛭石均匀混合的生根介质中，浇水至土壤水分饱和，保持25℃，16小时光照。

更优选的，诱导工业大麻KM1和KM4雌株开雄花。所述KM1和KM4购买于美国俄勒冈州Zoe Therapeutics公司。

本发明第二个方面公开了一种工业大麻，采用上述的方法育种得到。

本发明第三个方面公开了上述的方法在农学领域中的应用。

大麻雌雄异株、异花授粉结实产生的后代群体一半为雌株、另一半为雄株，由于遗传重组和分离，具有经济价值的雌株个体间也各不相同，难以保持群体的整齐划一，对品种培育和生产栽培均造成极大的挑战。本发明通过化学处理方法诱导雌株或其扦插繁殖的克隆株产生可育雄花，与同一雌株或其克隆株自然产生的雌花授粉，实现雌株单性结实，进而实现大麻的雌株自交育种和繁种，解决了大麻育种难和自然结实品种杂合的难题，涉及下列相关技术：

1.大麻雌株的苗期鉴定：雌雄异株大麻异花授粉结实，产生的后代雌株和雄株在营养生长期间没有显著形态学差异，难以辨别，直到进入生殖生长期开花时才易于分辨。因为雄株没有经济价值，并且一旦散粉后会严重影响雌株的继续发育和有效成分产量，需要及早发现去除。已经发现大麻雄株特异的SCAR分子标记，可以通过简单快速PCR分析方法，在大麻苗期就能有效鉴别雌雄株。

2.优良单株的筛选：工业大麻的经济价值主要体现在大麻二酚的产量，因为大麻二酚主要在雌株的雌花和花叶的毛状腺体中合成，所以要求优良单株必须生物产量高，大麻二酚含量高并且四氢大麻酚含量低于0.3％。筛选优良雌性单株时，优选长势旺盛、分枝多、株型紧凑、植株粗壮高大的单株；其次在大麻开花后挑选雌花花序多，花和花叶密集，毛状腺体丰富的单株，及时采集少量花叶阴干，用标准液相色谱或气相色谱等方法测定主要大麻酚含量，优选大麻二酚最高、四氢大麻酚含量最低的单株。另外可以开发与上述重要性状关联的各类分子标记，用分子标记辅助技术加快育种筛选进程。

3.优良单株的扦插繁殖：大麻植株长大后茎秆坚硬，类似多年生树木的细枝，富含木质素、纤维素类物质。剪枝处理后插入土壤等适当栽培介质中可诱导发生新根，实现扦插繁殖，扦插苗成活长大后可以再进行扦插，因此优良单株可以通过多代扦插的方式克隆。但扦插繁殖成本较高，繁殖系数低，适宜于育种和实验研究，难以满足大规模生产种植的需求。

4.雌株单性结实：植物激素在植物生长发育的各个阶段中都起着及其重要的调节作用，虽然不同植物对不同激素的反应有很大差异，但大多数植物的生殖生长转变和性器官发育受赤霉素、细胞分裂素、乙烯等的影响，其中的气体激素乙烯促进雌花发育，抑制雄花分化，直接决定多种植物开雌、雄花的比例。通过体外人工调控乙烯的生物合成和作用，也可以促进植物多开雌花或雄花。因为乙烯促进雌花发育，用乙烯生物合成抑制剂或其生物受体阻遏剂处理大麻雌性植株，降低甚至阻断乙烯功能，可以诱导花原基发育为雄花，与雌株本身或其克隆株的雌花自交结实，因为没有引进雄株的任何遗传物质，自交后代种子完全是雌性。植物激素赤霉素与乙烯的许多生物作用相互对抗，体外增施赤霉素可以拮抗乙烯活性，同样诱导雌株分化产生雄花。

5.雌株自交育种和繁种：掌握了雌株单性结实关键技术后，可以彻底排除雄株在大麻育、繁种中的作用，仅用雌株就能设计大麻的自交育种(图1)。首先通过诱导不同大麻品种雌株产生可育雄花，进行一次品种间杂交，将两个亲本的不同遗传物质结合(F1)；F1自交、与一个亲本回交、或再与第三个亲本杂交，后代发生遗传重组分离，筛选其中性状优良的雌性单株，再诱导雄花后自交或回交产生雌性后代，如此重复进行多代筛选和自交，直到获得性状均一、遗传稳定的新品种。新品种可以通过同样的雌株扦插克隆、单性自交结实技术，制种扩繁。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提出了雌雄异株植物大麻的创新育种设计方案，包括一次不同亲本雌株间杂交和多代雌株自交筛选。1)雌株间杂交：通过诱导不同大麻亲本品种雌株产生可育雄花，在不同品种的雌株间进行杂交结实，没有雄株参与，彻底排除了雄株携带的遗传物质的干扰，产生的后代也全部为雌株，简化了后代单株筛选。2)多代雌株自交：筛选杂交后代中性状优良单株，诱导产生雄花后自交产生雌性后代，重复筛选性状优良的雌性单株再自交或回交。经过多代优良雌性单株的筛选和自交，直到获得遗传性状稳定均一的新品种。3)回交和三交：两个亲本的杂交后代也可以与一个亲本进行一次或多次回交，从而更多选用该亲本的遗传物质；或再与第三个亲本杂交，引入不同遗传性状。无论采用何种育种设计，每一代筛选的雌株均需要诱导雄花进行种子繁殖，必要时也可以用扦插的方式克隆扩繁，全程不需要雄株参与。

(2)本发明公布了大麻雌株单性结实关键技术，通过在大麻特定发育时期喷施乙烯生物合成抑制剂，或乙烯生物受体阻遏剂等抑制或阻断植物内源乙烯激素功能，在雌性植株上诱导雄花发育，产生可育花粉，单株自交或与其它雌株的雌花杂交结实，产生的后代均为雌性植株。

(3)大麻雌性单株在生长的多个发育阶段均可以通过扦插方式进行营养繁殖克隆，扦插后代植株的遗传信息与母株保持完全一致，可以提供更多的克隆单株用于育种筛选和单性结实制种。

(4)综合使用包括多种分子标记筛选，农艺性状观察对比，大麻酚含量测定等方法，有效甄别优良性状雌性单株作为育种亲本，经多代筛选和自交形成稳定遗传的品种后，通过雌性单株扦插克隆和自交结实方式扩繁。

附图说明

图1为工业大麻雌株自交结实育种流程示意图；

图2为大麻雌雄植株的分子鉴定示意图(图中样品1-7为已知KM1雄性植株，8-16为雌性植株；样品17-21为未知性别KM2幼苗，长大后观察确认17-20为雌株，21为雄株。样品X和Y分别为已知雌株和雄株对照。标记DNA片段长度分别为1000，750，500，250，和100bp)；

图3为工业大麻KM1的扦插克隆繁殖示意图(图中(a)扦插成活苗；(b)移栽根系发达的扦插苗；(c)移栽成活的扦插克隆植株)；

图4为诱导KM1雌株产生可育雄花的示意图((a)未处理雌株，自然开雌花；(b)处理雌株，全部开雄花；(c)处理雌株，同一花序中既含雄花，也保留部分雌花)；

图5为诱导KM4雌株产生可育雄花示意图((a)未处理雌株，自然全部开雌花；(b)处理雌株，全部开雄花)；

图6为KM1和KM4雌株单性结实((a)KM1雌株自交结实；(b)KM4雌株自交结实；(c)KM1雌株自交结实收获的种子；(d)KM4雌株雄花与KM1雌株雌花杂交结实收获的种子；(e)KM4雌株自交结实收获的种子)。

具体实施方式

下面通过详细的实施例对本申请进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本申请，并不对发明内容进行限定。

实施例中所用仪器、设备、试剂均可通过各种渠道获得，例如购买得到，或可以制备而得。

大麻雌雄株的早期鉴定：利用大麻雄株特异的SCAR分子标记，通过简单PCR分析，在苗期就能快速有效的鉴别大麻雌雄株。

取样幼苗或未开花植株叶片，用一个基于SDS(Sodium dodecyl sulphate)的DNA快速提取方法提取基因组DNA，进行大麻雄株特异的SCAR标记PCR检测鉴定(Mandolinoetal.,1999)。PCR反应体系采用的Quick Taq HS DyeMix(DTM-101)试剂盒(TOYOBO LifeScience)，20微升的PCR反应体系包含：10μl 2X Quick Taq HS DyeMix，1.0μl 10pmol/μl引物MADC2-F(GTGACGTAGGTAGAGTTGAA(SEQ ID NO:1))或MADC5-F(GAGCGGACATCATTGCCT(SEQ ID NO:2))，1.0μl 10pmol/μl引物MADC2-R(GTGACGTAGGCTATGAGAG(SEQ ID NO:3))或MADC5-R(ATCACCCCACCGTTTAGG(SEQ ID NO:4))，6.0μl无菌水,最后加2.0μl 50ng/μl样品的基因组DNA。PCR反应条件为95℃初始变性5分钟，然后95℃变性30秒，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟共35个循环，最后72℃延伸7分钟，并在4℃保持。PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离。PCR样品中包括分别已知的雌性和雄性大麻基因组DNA对照，成功扩增了雄性特异约400bp长片段的样品判定为雄性植株。

雌雄鉴定的验证实验分别选取了已经开花的KM1工业大麻7株雄性1-7，和9株雌性8-16。用引物对MADC2-F和MADC2-R的PCR均从7株雄性扩增了约400bp的雄性特异片段，9株雌性则扩增了较大的弱带，应该为非特异扩增。另外5个样品17-21为未知性别的KM2幼苗，同样的PCR分析判断17-20为雌株，21为雄株，长大开花后实际观察情况确认与PCR的鉴定结论完全一致，如图2所示，具体的，提取大麻叶片基因组DNA，用雄株特异MADC2-F和MADC2-R引物进行PCR扩增分析。因此该雄性特异的SCAR标记能有效可靠的用于大麻雌雄株的早期鉴定，尽早将雄性植株去除，杜绝雌雄株间自然授粉。

优良单株的筛选：工业大麻的经济价值主要体现在大麻二酚的产量，而大麻二酚主要在雌株的雌花和花叶的腺体中合成，因此要求优良单株必须健壮高大，生物产量高，能大量开花，花叶大麻二酚含量高并且四氢大麻酚含量低于0.3％。

筛选优良雌性单株时，首先在营养生长阶段观察对比长势、分枝、株型、株高、抗逆性、等综合农艺栽培性状，优选长势旺盛、分枝发达、株型紧凑、植株粗壮高大的单株，并且植株不能过早开花，必须有充足的营养生长阶段，积累足够的生物量后才转入生殖生长阶段，为大量开花提供物质基础。其次在大麻开花后挑选雌花花序多，花和花叶密集，毛状腺体丰富，花序无限生长的不同单株，及时採取少量花和花叶阴干，用标准液相色谱或气相色谱等方法测定主要大麻酚的含量，优先选取大麻二酚最高、四氢大麻酚含量最低的单株。

由于表现型取决于基因在植株的实际表达情况，大麻的农艺栽培性状和大麻酚含量水平等表现型均由基因型决定。表型比较分析的实验周期长，影响因素多，效率低，不确定性高，而基因型由基因组DNA的组成决定，一般不受环境因素影响，相对稳定。现代植物育种利用分子标记辅助技术，借助基因型的筛选而间接筛选表现型，手段多样成熟，成本逐步降低，可用于快速筛选优良雌性单株，加快育种进程。分子标记辅助育种技术原理基于不同个体间对应DNA序列的多态性，采用包括常用的AFLP(Amplified Fragment LengthPolymorphism),RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism),SSR(SimpleSequence Repeats)，RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)等不同标记方法(Garciaet al.，2004；Powell et al.,1996)，开发与大麻重要农艺和品质性状相关联的分子标记，积累一定数量并验证后，用于快速低成本筛选大麻雌株间杂交后代再多次自交的各代分离个体，挑选优良单株进入后续育种筛选。

优良单株的扦插繁殖：挑选好的优良雌性单株可以通过扦插繁殖少量克隆，保留部分克隆株自然开雌花，诱导部分克隆株产生雄花，相互授粉自交结实后留种储存，并可进入下一步育种选育。

挑选长势旺盛的优良雌性单株成株，剪取含有至少两个腋芽、约15-20厘米长侧枝，剪去下方大部分叶子，将顶部剩余的叶子剪掉部分叶尖，减少蒸腾作用，再将枝条底部以45度用手术刀切割，以增大生根表面积。将枝条插入5-500毫克/升的IBA生长素溶液中浸泡5分钟后，取出晾干，插入由花土与蛭石按1:1体积均匀混合的生根介质中，浇水至土壤水分饱和，保持25℃，16小时光照。扦插初期要保持土壤中充足的水分，在穴盘上盖盖，约一周后白天掀开盖子通风。约1-2周后扦插枝就会生根，形成发达根系后即可以移栽到较大花盆或田间(图3)。

栽培时可保持16小时长光照，使大麻母株一直处于营养生长阶段，有利于一直取材扦插。在幼苗80厘米左右时，可削去顶芽，即可用来做扦插，又可以去除顶端优势，使侧枝生长的更加茂盛，待侧枝长至60厘米时，可再去一次顶芽，经过两次去顶芽之后，大麻可以长的更加枝繁叶茂。扦插植株长大后，可以作为母株再扦插繁殖，如此循环往复，一棵优良单株可以产生大量遗传性状完全相同的克隆株。

雌株单性结实：雌性大麻植株正常发育至生殖生长阶段会自然开雌花，赤霉素、乙烯、细胞分裂素等植物激素调节该过程，乙烯促进雌性发育，而赤霉素促进雄性发育，降低植物体内乙烯的生物活性可以诱导大麻雌株产生雄花。可以通过直接抑制植物体内乙烯生物合成，降低内源含量，也可通过阻遏乙烯生物受体使其不能发挥功能。常用的乙烯生物合成抑制剂包括但不限于氨基氧乙酸aminooxyacetic acid,2-氨基异丁酸2-aminoisobutyric acid，氨基乙氧基乙烯基甘氨酸aminoethoxyvinylglycine,氯化钴cobalt chloride,根瘤菌毒素rhizobitoxine等；常用的乙烯生物受体阻遏剂包括但不限于硝酸银silver nitrate,银粉溶胶colloidal silver,硫代硫酸银silver thiosulfate,1-甲基环丙烯1-methylcyclopropene等。因为硝酸银、银粉溶胶和硫代硫酸银均容易获得，活性稳定，故被经常使用。此外也可以通过体外增施植物激素赤霉素，拮抗内源乙烯的生物功能，同样诱导雌株分化产生雄花。

诱导工业大麻KM1和KM4雌株开雄花：扦插的KM1克隆苗在温室中长大成熟，调节光照时间为小于12小时的短日照，即将进入生殖生长但还未开花之前，对叶片喷施浓度相当于每升0.1-30毫摩尔不同浓度的硝酸银、银粉溶胶，或硫代硫酸银，处理一次或多次，随时观察植物生长和开花情况，防止引起损伤。当未处理对照植株开始开雌花时，说明植物已经完全进入生殖生长期，停止处理。处理成功的雌株会继续开雌花，并在部分应该开雌花的位置开雄花，也有个别处理成功的雌株会全部开雄花，不开雌花(图4)。不同品种材料对诱导处理的敏感程度差异明显，KM4的成熟雌株也能成功诱导并产生大量雄花，相对来说比KM1更容易诱导(图5)。可以根据需要，对不同工业大麻品种用上述不同浓度诱导剂和不同喷施次数的诱导处理，实现全部处理株全部开雄花，没有雌花，或在相同处理株的同一个花序上同时开雌花和雄花。但有的品种可能因遗传背景差异，成功诱导雄花困难；有的虽然能诱导产生雄花，但雄花发育不完整，花药小，花粉很少或发育不健康，没有活力，散粉困难，不能成功授粉结实。

雌株单性结实：KM1和KM4雌株诱导产生的雄花都能散粉，分别与克隆株自交结实，种子正常发育成熟。另外用处理的KM4雌株雄花与未处理的KM1雌株的雌花杂交，也成功获得了结实种子，杂交种子大小介于KM1小种子和KM4大种子之间(图6)。

雌化KM1种子萌发：雌化处理的种子与自然雌雄花授粉结实的种子外观没有明显差异，应该能同样正常萌发成苗。取少量KM1雌化种子，夹在饱和含水的滤纸间，放在25℃培养室催芽萌发，约两天后大部分种子伸出胚根，播种到土壤中后约3天出苗，苗发育正常，带两片子叶，并很快长出新的真叶，说明雌化种子与自然结实种子活力相似。因为在雌化种子的形成过程中没有任何雄性遗传物质介入，雌化种子萌发只产生雌株。

雌株自交育种和繁种：掌握了雌株单性结实关键技术后，仅用大麻的雌株就能设计自交育种，首先进行一次不同品种间雌株杂交结实，将两个亲本的遗传物质混合；然后筛选杂交后代中综合了两个亲本优良性状的雌性单株，再诱导雄花自交或回交结实，重复进行多代筛选和自交或回交，直到获得性状均一、遗传稳定的新品种。

(1)KM4与KM1雌株间杂交：工业大麻材料KM1株型松紧适中，分枝发达，营养生长期长，花期长，条件适宜的情况下可以不断开花，生物产量高，但有效成分大麻二酚的含量较低。工业大麻材料KM4株型过于紧凑，分枝不发达，营养生长期短，易早开花，难以积累足够的生物产量，但有效成分大麻二酚的含量较高，二者间杂交后有望将各自的优良性状整合。KM4雌株容易诱导产生雄花，用成熟花药花粉给未经任何诱导处理的KM1雌株雌花授粉，产生的种子自然发育成熟(图6)。KM4雌株自交结实的种子较大，约为KM1种子的两倍，KM1×KM4的杂交种子则恰好介于二者之间，从一个方面说明杂交后代(F1)成功获得了两个亲本的性状。

(2)杂交后代KM4×KM1的重复筛选和自交：KM4×KM1的F1后代各携带KM1和KM4的50％遗传物质，自交后KM1和KM4的遗传物质发生重组，产生分离的F2群体，根据育种目标，需要综合利用农艺栽培性状、大麻二酚和四氢大麻酚含量、以及分子标记分离等指标，筛选最佳F2单株，扦插克隆扩繁，诱导克隆株产生雄花，自交产生F3分离群体。重复约5-6代类似的筛选和自交，即可以选出结合了KM1和KM4优良性状，并且稳定遗传的新品种。新品种单株可以通过同样的雌株扦插繁殖少量克隆株，诱导产生雄花后，单性自交结实制种。

参考文献：

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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北大荒垦丰种业股份有限公司

<120> 工业大麻的单性结实育种方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgacgtagg tagagttgaa 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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Claims (11)

1.一种工业大麻的育种方法，其特征在于，首先进行一次不同品种间大麻雌株杂交结实，将两个亲本的遗传物质混合；然后筛选杂交后代中综合了两个亲本优良性状的雌性单株，再诱导雄花自交或回交结实，接着重复进行多代筛选和自交或回交，直到获得性状均一、遗传稳定的大麻品种。

2.根据权利要求1所述的工业大麻的育种方法，其特征在于，采用乙烯生物合成抑制剂或乙烯功能阻遏剂诱导工业大麻雌株开雄花，授粉后实现雌株单性结实；或，

采用体外增施植物激素赤霉素的方法，诱导雌株分化产生雄花，授粉后实现雌株单性结实；

优选的，采用的乙烯生物合成抑制剂选自氨基氧乙酸、2-氨基异丁酸、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、氯化钴或根瘤菌毒素中的至少一种；

优选的，采用的乙烯功能阻遏剂选自硝酸银、银粉溶胶、硫代硫酸银或1-甲基环丙烯中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的工业大麻的育种方法，其特征在于，乙烯功能阻遏剂为硫代硫酸银，其有效使用浓度为每升0.1-30毫摩尔。

4.根据权利要求1所述的工业大麻的育种方法，其特征在于，包括：

S1：基于分子生物学的方法鉴定大麻的雌雄株；

S2：筛选出优良的大麻雌株；

S3：将优良单株扦插繁殖；

S4：雌株单性结实；

S5：雌株自交育种和繁种。

5.根据权利要求1所述的工业大麻的育种方法，其特征在于，在S1中，在大麻苗期，根据大麻雄株特异性的SCAR分子标记，基于PCR分析方法，鉴定出雌雄株。

6.根据权利要求1所述的工业大麻的育种方法，其特征在于，所述S2包括：

S21：筛选出长势旺盛、分枝多、株型紧凑、植株粗壮高大的单株；

S22：接着在大麻开花后挑选雌花花序多，花和花叶密集，毛状腺体丰富的单株；

S23：采集花叶阴干，测定其大麻二酚和四氢大麻酚的含量，筛选出优良的大麻雌株。

7.根据权利要求1所述的工业大麻的育种方法，其特征在于，所述S3包括：

通过扦插繁殖优良雌性单株克隆，保留部分克隆株自然开雌花，诱导部分克隆株产生雄花，相互授粉自交结实后留种储存，并进入下一步育种选育。

8.根据权利要求1所述的工业大麻的育种方法，其特征在于，所述S3包括：

挑选长势旺盛的优良雌性单株成株，修剪后将枝条插入5-500毫克/升的IBA生长素溶液中浸泡后，取出晾干，插入由花土与蛭石均匀混合的生根介质中，浇水至土壤水分饱和，保持25℃，16小时光照。

9.根据权利要求7所述的工业大麻的育种方法，其特征在于，诱导工业大麻KM1和KM4雌株开雄花。

10.一种工业大麻，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的方法育种得到。

11.根据权利要求1-9任一项所述的方法在农学领域中的应用。

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