CN101201336A

CN101201336A - 烟草烟碱转化株早期诱导鉴定方法

Info

Publication number: CN101201336A
Application number: CNA2006101283643A
Authority: CN
Inventors: 史宏志
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2006-12-12
Filing date: 2006-12-12
Publication date: 2008-06-18

Abstract

本发明公开了一种烟草烟碱转化株早期诱导鉴定方法，通过在田间定株、采叶，用碳酸氢钾、碳酸氢钠、氯化钠或将其中任意两种或三种等体积混合溶液喷施，晾制、烘干，采用气相色谱仪进行烟碱和降烟碱测定，计算降烟碱含量占烟碱和降烟碱总和的百分比，如果比例低于5％，为非转化株；烟碱转化率大于5％的，即是转化株，其中大于20％的为高转化株。采用本发明所述的技术方案具有以下优点：1.本发明所采用的方法可保证在4天以内完成转化，时间短，效率高。2.本发明所采用的化学物质相对比较温和，效果较好。3.本发明所采用的化学物质为环境友好型。4.本发明所采用的化学物质的成本远低于采用乙烯利处理方法的成本。

Description

烟草烟碱转化株早期诱导鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种烟草烟碱转化株早期诱导鉴定方法。

背景技术

生物碱是烟草植物含有的一类重要化学成分，主要包括烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱四种。有栽培利用价值的普通烟草(N.tabacum L)和黄花烟草(N.rustica L)都是烟碱积累型，其烟碱含量占总生物碱含量的94％以上。但在栽培品种的烟株群体中，个别植株会因为基因突变而形成烟碱去甲基能力，导致烟碱含量显著降低，降烟碱含量相应增加，这种具有烟碱向降烟碱转化能力的烟株称为转化株。由于烟碱转化与烟叶香味改变和烟草亚硝胺含量增加密切相关，近年来成为国际学术界研究的热点。

(一)烟碱向降烟碱转化对烟叶品质和TSNA的影响

烟碱转化导致烟叶降烟碱含量异常升高。降烟碱易于在烟叶调制过程和调制后的陈化过程中发生生化转化形成许多不利成分，如麦斯明、酰化降烟碱和N-亚硝基降烟碱(NNN)，因而影响烟叶香味品质和可用性。

1对烟叶香味品质的影响

烟草群体中烟碱转化株的出现和积累导致烟叶化学成分组成发生显著变化。降烟碱的氧化可产生麦斯明。随着烟叶中降烟碱含量的增加，调制后烟叶的叶片和主脉中的麦斯明含量直线增加。降烟碱的酰基化形成一系列含有1-8个碳原子酰基部分的降烟碱衍生物。烟叶降烟碱含量的增加导致香味品质的下降。Roberts(1988)研究发现在热解过程中降烟碱产生麦斯明及吡啶化合物，使烟气具有诸如碱味、鼠臭味等异味。在烤烟烟叶中，具有较高降烟碱含量的转化型烟叶在外观上表现出“樱红”(cherry red)特征。这类烟叶由于香味较差，所以收购时单独列级，售价极低。具有不同烟碱转化能力的白肋烟TN90品系，农艺性状无显著差异，但烟叶香味品质随降烟碱含量增加显著下降，转化型烟叶一般白肋烟风格下降，香味不正，口腔残留严重。

2对烟叶TSNA形成的影响

NNN是烟叶和烟气中主要的烟草特有亚硝胺(TSNA)。动物试验表明，NNN具有显著的致癌活性。在烟碱转化株的调制过程中降烟碱极易发生亚硝化反应形成NNN。Shi等选择了30株具有不同降烟碱含量的烟株(降烟碱含量从0.05％到3.0％)，分别测定烟叶中TSNA含量，发现降烟碱与NNN含量呈显著正相关关系，相关系数为0.9；用我国不同类型烟叶测定也表明二者具有类似的相关关系。在另一项试验中，通过比较转化株和非转化株烟叶叶片和主脉中生物碱和TSNA含量的差异，发现NNK、NAT和NAB在转化株和非转化株间无显著差异，但NNN含量随降烟碱含量增高而大幅度增加，NNN占总TSNA含量比例也随之增加。这些结果充分表明由烟碱转化导致降烟碱含量增高是烟叶NNN形成和积累的重要因素，从群体中去除转化株是降低烟叶和产品中TSNA含量及提高和改善烟叶香味品质的有效途径。

(二)栽培烟草中烟碱转化的机率和时期

尽管早在20世纪50年代在白肋烟中也发现有烟碱转化的问题，但直到今天这一问题才引起重视，白肋烟调制后为深棕色，因此转化株的烟叶在外观上没有显著特征，这给研究带来很大不便。

商用白肋烟品种一般在群体中含有15-20％的转化株，其中约一半转化株的烟碱转化率在20％以上。史宏志等(2001)也发现在中国的白肋烟TN90品种中，含有约20％的转化株，但不同转化株的烟碱转化程度不同，高转化株的烟碱转化率可达80％。进一步研究发现，我国白肋烟主栽杂交种鄂烟一号的烟碱转化株比例高达40％以上，这主要是由于作为母本的B21不育系含有大量转化株所致。

在大田生长过程中，具有烟碱转化能力的转化株的烟碱转化很少发生，烟碱转化主要发生在收获后烟叶调制过程的前3个星期，变黄末期后变化较小。这与烟叶细胞的死亡导致去甲基酶活性终止有关。

(三)转化株早期诱导鉴定的必要性

在白肋烟中，由于非转化株向转化株突变率较高，转化基因为显性基因，缺乏外观可视的鉴别方法，烟草群体可积累一定比例的具有较高降烟碱含量的转化株。

群体中的转化株必须在烟叶生长的早期阶段(指烟叶开花授粉之前)被鉴别和清除，以保证新品种选育和良种繁育中留取纯的非转化株进行繁殖，或在杂交制种中严格选择父、母本的非转化株进行杂交生产杂交种。由于在外观形态上非转化株与转化株没有差异，且转化株的烟碱转化主要是在烟叶调制过程中发生的，所以转化株的早期鉴别首先需要对转化株的烟碱转化进行刺激，以便早期表达转化性状。

(四)研究现状

史宏志在美国做博士后期间，在国际上首次开展转化株早期鉴定方面的研究，最初是采用了乙烯利处理方法。即在烟叶开花前，摘取单叶，平铺喷施乙烯利水溶液，然后保湿自然晾制，待烟叶变黄后，测定烟叶的烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化率。此法虽然有效，但存在以下缺点：一是时间长。由于没有对适宜的温度和浓度条件进行全面研究，在自然条件下晾制，一般需要8天以上的时间才能使烟碱充分转化。但是在实际应用中需要在有限的时间内测定大量样品，时间非常重要。二是乙烯利处理的诱导效果相对较低，主要是因为乙烯利为激素释放剂，对浓度要求严格，不容易准确掌握，往往会出现由于喷施不均匀，导致处理效果不一致，过多时造成叶片部分坏死，过低，又起不到作用，因此，常常不能鉴别出转化能力低的低转化株。三是乙烯利对环境有影响，有污染。四是成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种可诱导烟叶转化株在生长早期最大限度进行烟碱转化的方法，从而为品质育种、良种繁育、杂交制种提供条件。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种烟草烟碱转化株早期诱导鉴定方法，包括以下步骤：

a、采叶，在烟叶移栽后2～4周内，采摘从烟株下部数的第3或第4片叶；

b、在田间定株，每株取1片叶后在叶柄上标记株号；

c、喷施，分别采用碳酸氢钾、碳酸氢钠、氯化钠或将其中任意两种或三种等体积混合溶液，对叶片正反面均匀喷洒；

d、喷施后将叶片串挂，覆盖塑料布保湿，或在恒温恒湿箱中晾制，3～4天后叶片变黄转褐时烘干；

e、采用气相色谱仪进行烟碱和降烟碱测定，计算降烟碱含量占烟碱和降烟碱总和的百分比，如果比例低于5％，为非转化株；烟碱转化率大于5％的，即是转化株，其中大于20％的为高转化株。

所述步骤c中喷施使用的溶液浓度为：碳酸氢钾和氯化钠均为1.1～1.3％，碳酸氢钠为0.9～1.1％；所述步骤d中使用的恒温恒湿箱温度控制在26～35℃，相对湿度不小于65％。

更优选的方案是所述步骤c中喷施使用的溶液浓度为：碳酸氢钾和氯化钠均为1.2％，碳酸氢钠为1.0％。

本发明中对烟叶的处理时间在移栽后2～4周为好，过早，烟株较小，样品量不足，且影响烟株正常生长。采叶部位以从下部数第3-4叶为宜，中上部叶未充分扩展的叶片不宜采摘，试验表明未充分发育的转化株烟叶在处理后不能充分转化。采用的化学物质浓度减小，会延长转化时间，并会造成转化不完全，降低鉴别效果。

采用本发明所述的技术方案具有以下优点：1、本发明所采用的方法可保证在4天以内完成转化，时间短，效率高。2、本发明所采用的化学物质相对比较温和，效果较好。3、本发明所采用的化学物质为环境友好型。4、本发明所采用的化学物质的成本远低于采用乙烯利处理方法的成本。

具体实施方式

在大田条件下，种植120株TN90高烟碱转化株材料，移栽后3周，分别对120个烟株定株取样，每株取下部第3叶，共120片叶，将其均分为6组，每组取10片分别用1.2％碳酸氢钾，1.0％碳酸氢钠，1.2％氯化钠，此三种溶液的等量(体积)混合液，1.2％碳酸氢钾和1.0％碳酸氢钠的等量(体积)混合液，1.0％碳酸氢钠和1.2％氯化钠的等量(体积)混合液进行叶面双面喷施，之后在恒温恒湿箱中28摄氏度，75％相对湿度条件下，晾制4天，然后烘干，用气相色谱测定烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化率，6组处理的平均烟碱转化率分别为：92.5％，93.2％，90.3％，91.6％，93.8％，90.4％，而未处理的对照叶片的烟碱转化率仅为28％。

为了验证早期转化株的鉴定和清除对后代大田群体烟株的净化作用，我们采用1.2％碳酸氢钾和1.0％碳酸氢钠等量(体积)混合液对白肋烟TN90进行了转化株的早期鉴定，并进一步研究了早期鉴定后不同类型烟株在自交后代的表现。根据鉴定结果按烟碱转化率的高低将烟株分为非转化株、低转化株和高转化株，分别选取有代表性的烟株进行自交，次年对各类型烟株的自交后代进行种植，对各自交群体的烟株进行转化株的鉴定。结果表明，高转化株的自交后代群体100％均为高转化株，进一步说明烟碱转化性状为显形基因控制，且遗传比较稳定；低转化株后代群体出现分离现象，约有28.5％的高转化株，31.3％的低转化株和40.2％的非转化株，说明控制烟碱转化的基因处于杂合状态；非转化株的后代群体有91.4％的烟株仍为非转化株，虽然出现了少数转化株，但转化程度较低，说明通过转化株的早期鉴定，严格选用非转化株进行种子生产，对降低后代群体烟碱转化株比例，降低烟叶烟碱转化率是十分有效的。

在移栽后3周，选取60棵烟株进行定株，每株取下部第3叶，采用1.2％碳酸氢钾处理方法进行转化株的诱导鉴定，结果发现23株烟叶的烟碱转化率达到5％，为烟碱转化株，占总测定株数的38.3％，其中10株的烟碱转化率超过20％，为高转化株，占总测定株数的16.7％。在烟叶成熟后，按正常方式进行半整株晾制，干叶期对田间定株的烟株进行第二次取样，测定烟碱和降烟碱含量，计算烟碱转化率。结果表明，在所测烟株群体中有18株烟叶的烟碱转化率达到5％以上。通过两次测定结果的比较可以看出，早期鉴定出的转化株包括了所有在调制后自然形成的18个转化株，而且两次测定所得的烟碱转化率的株间分布趋势具有较高的一致性，说明通过诱导方法早期鉴定转化株是十分有效的。

结果还表明，早期转化株的诱导后所得到的烟碱转化率一般高于烟叶自然晾制后的烟碱转化率，进一步说明碳酸氢钾等处理可以刺激和促进具有烟碱去甲基能力烟株的烟碱向降烟碱转化，这对提高转化株鉴定的准确性和有效性十分有利。更有意义的是，经处理后可以鉴别出一些在正常晾制条件下无法有效鉴别的低转化株。本试验中，有5个低转化株只在早期诱导条件下才被鉴别出来，因此，此方法可以有效地鉴别低转化株，从而提高鉴定的效果。

Claims

1.一种烟草烟碱转化株早期诱导鉴定方法，其特征是包括以下步骤：

b、在田间定株，每株取1片叶后在叶柄上标记株号；

2.如权利要求1所述的烟草烟碱转化株早期诱导鉴定方法，其特征是所述步骤c中喷施使用的溶液浓度为：碳酸氢钾和氯化钠均为1.1～1.3％，碳酸氢钠为0.9～1.1％；所述步骤d中使用的恒温恒湿箱温度控制在26～35℃，相对湿度不小于65％。

3.如权利要求1或2所述的烟草烟碱转化株早期诱导鉴定方法，其特征是所述步骤c中喷施使用的溶液浓度为：碳酸氢钾和氯化钠均为1.2％，碳酸氢钠为1.0％。