CN102230011A - 一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法。该方法主要步骤是：取苗期鲜叶样采用CTAB法提取基因组DNA，以基因组DNA作为扩增模板结合特异引物进行PCR反应，然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统中观察、读取分子标记带谱，再与目标带谱进行对比来判定样品的转化特性。本发明所述的方法不受环境因素影响，也无需人工化学诱导烟碱转化，苗期即可取样操作，将转化株的鉴定与筛选提前到烟苗移栽前，大大节省了时间，而且精准高效、操作简便、易于推广，可用于烟草亲本种子提纯，种子烟碱转化性状鉴定，也可适应于其他烟草类型烟碱转化株的鉴定与剔除。
Description
技术领域
本发明涉及一种烟草烟碱转化株的鉴定方法，特别是涉及一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法。
背景技术
目前研究结果表明，烟草中的生物碱主要有四种：烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱四种。普通烟草属烟碱积累型，以烟碱为主，其含量占总生物碱的90％以上，降烟碱是第二大生物碱，含量一般只占总生物碱的3-5％，另外两种生物碱仅占很少部分。烟碱含量的高低是决定烟叶感官品质的重要因素，一般要求烟碱含量适宜，以达到生理强度适中、吃味醇和、刺激性小的目的。降烟碱亦称去甲基烟碱，主要由烟碱在去甲基酶的作用下脱甲基形成。由于降烟碱易于在烟叶调制和陈化过程中发生一系列亚硝化和酰化等生化反应，形成具有致癌作用的烟草特有亚硝胺(TSNAs)的主要成分N-亚硝基降烟碱(NNN)及麦斯明、甲酰降烟碱、乙酰降烟碱等酰化产物，导致烟叶有害成分增加和香味品质下降，直接影响着吸烟者的身体健康。因此，烟叶减害、降低烟草特有的亚硝胺含量成为目前国际烟草界的共识和主攻方向，一直是研究的重点和热点。
我国对烟碱转化的研究起于世纪90年代末期，研究结果表明，中国白肋烟、马里兰烟和香料烟均不同程度的存在烟碱转化株比例、降烟碱含量和烟碱转化率过高的问题。目前，美国已将降烟碱含量作为考核新品种的主要指标，制定了降烟碱(区域试验和小区试验)不超过被测样品总生物碱13％的最高限额，超限品种不得种植(王晓云，邓云龙，李红莺.国外烤烟育种概况.云南农业科技，1999，4：16-19)。
群体中的转化株必须在烟叶生长的早期甚至苗期阶段被鉴定和清除，以保证品种群体材料非转化株的高度纯合性，由于在外观形态上无法区分非转化株和转化株，因此，需要通过化学或者生物技术手段来加以鉴定区分。中国烟草总公司郑州烟草研究院申请的专利号“ZL2007100540828”，公开号：“CN 101070535A”的发明专利一种诱导烟草烟碱提前转化方法及其应用，是在团棵期取8-12叶位(自下而上)的烟叶1片，喷施诱导烟碱转化性状在绿叶中早期表达的药品3，5-二硝基水杨酸，浓度为0.1％，然后进行调制处理后测定烟碱和降烟碱含量，以此判断烟株的烟碱转化高低属性，再进行田间转化株剔除。本方法虽然有效，但存在以下不足：1、取样时期在移栽后的团棵期，仍然偏迟，剔除转化株后浪费了田地，且难以保证目标群体大小；2、需化学药品诱导方可；3、鉴定结果受环境因素影响：比如药品浓度、调制温度和时间、化学检测的影响因子等。因此，虽有较好的借鉴作用，但仍不够高效与及时，无法满足现实的需求。
发明内容
本发明的为解决现有技术的不足提供一种苗期鉴定和纯化非转化品种群体的方法，具体是一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，将鉴定时期从团棵期提前至苗期，而且鉴定手段简单、准确性高，试验效果只决定于其内在的遗传物质而不受外部环境条件的影响，这为提高烟叶安全性和改善烟叶品质，为低危害烟叶开发奠定了坚实的理论与技术基础。
所述一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，其特征在于具体步骤依次如下：
A、对需鉴定的烟苗逐个挂牌以标识，然后于苗期对每个被标识的烟苗进行鲜叶取样，每个烟苗取样量为1-2个叶片，取好的鲜叶样品用密封袋装好，并做好与原烟苗一致的标识，迅速放入冰盒或超低温冰箱中保存；
B、提取基因组DNA：取出每个密封袋中的鲜叶样品，采用CTAB法提取各样品烟苗基因组DNA，纯化后保存备用；
C、对基因组DNA进行PCR反应：用紫外分光光度计测定B步骤中提取的烟苗基因组DNA的浓度，然后取各样品烟苗基因组DNA溶液少许，将其浓度稀释成50ng/μL作为反应模板进行PCR反应，PCR反应中的特异引物序列：
正向引物：5’-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3’，
反向引物：5’-TCGAGGTCGACGGTATC-3’；
D、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及电泳结果的读取：将步骤C中所获得的PCR产物与溴酚蓝-甘油溶液以4∶1的体积比混合，注入样品槽，同时注入对照ladder进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，清除表面的溴化乙锭溶液，然后将胶板放入凝胶成像仪的观察板上，利用电脑成像系统在波长254nm紫外灯下进行观察，拍照记录下电泳图谱，并保存以进行比较分析；
E、转化株的鉴定与淘汰：将通过PCR特异引物扩增已知高转化株所获得的分子带谱数值作为比较分析的参照数据，其具体数值的大小介于1700-1800bp之间；将步骤D中样品PCR扩增所得的分子带谱与两边对照ladder带谱进行对比，其中能扩增出分子带谱且带谱数值大小介于1700-1800bp之间的样品为高转化株，有分子带谱但大小小于1700bp的样品为中等转化株，淘汰高转化株和中等转化株；无法扩增出分子带谱或者带谱信号微弱的样品为非转化株烟苗，保留备用。
在步骤A摘取的鲜叶样品，需要马上提取DNA就迅速用冰盒保存，若不立即提取DNA则应置于超低温冰箱长期保存待用。
在步骤C中PCR反应在PTC-225型热循环仪上进行，其反应体系为：2.5μL带(NH4)2SO4的10×反应缓冲液，MgCl22.0mmol/L，dNTPs 200μmol/L，1.2U Tag酶，50ng模板DNA，正向和反向引物各0.45μmol/L，不足部分用dd H2O补足，总体积为25μL；反应程序为：第一阶段在94℃环境下反应4min，第二阶段在94℃的环境下反应30sec，第三阶段先在55℃环境下反应35sec，然后在72℃的环境下反应90sec，第二和第三阶段共循环28次；第四阶段在72℃环境下反应4min，并在4℃的环境下保存。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳过程中，在样品进胶前可用6.5V/cm的电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm。
本发明所涉及的一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，具有精准高效、操作简便、易于推广，可用于苗期鉴定和剔除烟草烟碱转化株、保留非烟碱转化株、极大提高目标品种群体尤其是亲本群体的非转化株比例、烟草亲本种子提纯，种子烟碱转化性状鉴定，可降低平均烟碱转化率，提高烟叶质量，为早期鉴定和筛选低有害物质特有亚硝胺(TSNAs)烟株开辟了一条新的高效途径。本发明适用范围于白肋烟、马里兰烟、香料烟、烤烟和其它地方晾晒烟的常规种和雄性不育杂交种的品种选育和原种提纯，还适用于减少烟叶中有害成分TSNAs为目标的非烟碱转化株的早期鉴定和筛选。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1、白肋烟烟碱转化株的苗期分子生物学鉴定，其具体步骤依次如下：
A、烟苗标识与鲜叶样品获取：对需鉴定的白肋烟烟苗逐个挂牌以标识，然后于苗期(只要可以取到1个叶片的生长时期均可)对每个被标识烟苗进行鲜叶取样，每个烟苗取样量为1个叶片，取好的鲜叶样用密封袋装好，并做好与原烟苗一致的标识，迅速放入冰盒中保存；
B、烟苗基因组DNA提取：取出每个封口袋中的鲜叶样品，采用CTAB法提取各样品烟苗基因组DNA，具体提取方法依次如下：
a、将浓度为2％的CTAB抽提缓冲液65℃水浴预热；
b、从其中一个密封袋中取出1片白肋烟鲜叶样置于小研钵中，用液氮磨至粉状，将磨好的样品粉末装入1.5ml的灭菌离心管中，并迅速加入约650μL的2％CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动混合，其混合液的量为管高的2/3；
c、然后将装有混合液的离心管进行65℃水浴，每10min轻轻摇动一次，30-60min后取出；
d、冷却2.5min后，在离心管中加入氯仿-异戊醇(24：1)至满管，轻微上下振荡2.5min，使两者混合均匀，放入离心机中，10000rpm离心10min；与此同时，将650μL的异丙醇装入一支新的离心管中；
e、当混合液在离心机中10000rpm离心1min后，使用移液器轻轻地吸取上清夜，转入装有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动40sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物，再在10000rpm的条件下离心1min后，立即倒掉液体，保留白色DNA沉淀，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
f、2min后，直立离心管，加入650μL的75％乙醇及90μL浓度为5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中，放置40min，使DNA块状物的不纯物溶解；
g、然后再放入离心机中，10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800μL 75％的乙醇，将DNA放置40min以溶解，放入离心机，10000rpm离心40sec后，立即倒掉液体，再将离心管倒立于铺开的纸巾上，数分钟后，直立离心管，干燥DNA；
h、在干燥的DNA中加入50μL浓度为0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约18h，使RNA消解。
C、基因组DNA的PCR反应：用紫外分光光度计测定B步骤中提取的烟苗基因组DNA的浓度，取各样品烟苗基因组DNA少许，将其浓度稀释调成50ng/μL作为反应模板进行PCR反应，PCR反应中的特异引物序列：
正向引物：5’-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3’，
反向引物：5’-TCGAGGTCGACGGTATC-3’；
PCR反应体系为：2.5μL带(NH4)25O4的10×反应缓冲液，2.0mmol/L MgCl2，dNTPs 200μmol/L，Tag酶1.2U(购自MBI公司)，模板DNA 50ng，正向和反向引物各0.45μmol/L，不足部分用dd H2O补足，总体积为25μL。
PCR反应程序为：第一阶段在94℃环境下反应4min，第二阶段在94℃的环境下反应30sec，第三阶段先在55℃环境下反应35sec，然后在72℃的环境下反应90sec，第二和第三阶段共循环28次；第四阶段在72℃环境下反应4min，并在4℃的环境下保存。
D、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及电泳结果的读取，其具体步骤如下：
a、琼脂糖胶液的制备：称取0.7g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100ml pH为8.3的Tris-硼酸EDTA缓冲液，加热配制成为0.7％琼脂，加入溴化乙锭(EB)2μL；
b、凝胶板的制备：将热的处于液体状态的琼脂糖胶液倒入预先制作好的凝胶模板槽中，插上样品梳，四周用胶液封口，冷却待用；
c、上样：用pH为8.3的Tris-硼酸-EDTA缓冲液先填满加样槽，接着再倒入大量缓冲液直至浸没过凝胶面2mm，将C步骤中获得的PCR产物与溴酚蓝-甘油溶液以4∶1的体积比混合，用加样枪将PCR产物注入样品槽中，每个样品加入量一般不超过20μL，最后在第一个和最后一个加样孔加入对照ladder：λDNA/HindIII；
d、电泳：加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极.另一端连接正极，接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用6.5V/cm电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm(电压值V/电泳板两极之间距离比)，当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳；
e.观察记录电泳结果：小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，然后再将胶板小心放置入凝胶成像仪的观察板上，关上门，利用电脑成像系统在波长254nm紫外灯下进行观察DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，初步观察后，应立即拍照记录下电泳图谱，并编号保存在电脑中以作后续分析判断。
E、转化株的鉴定与淘汰：将通过PCR特异引物扩增已知高转化株所获得的分子带谱作为比较分析的参照数据，大小数值介于1700-1800bp之间；将样品PCR扩增所得的分子带谱与两边对照ladder带谱进行对比，将能扩增出分子带谱且大小介于1700-1800bp之间的样品确定为高转化株，有分子带谱但大小小于1700bp的样品确定为中等转化株，淘汰高和中等转化株；将无法扩增出分子带谱或者带谱信号微弱的样品确定为非转化株烟苗，保留备用；由此获得高度纯合的非转化株品种群体。
为验证本发明鉴定的准确性，随机选择通过以上步骤鉴定为高转化株和非转化株的白肋烟烟苗各20株，于团棵期测定其烟碱和降烟碱含量(参照烟草行业标准YC/T 383-2010，烟草及烟草制品烟碱、降烟碱、新烟碱、麦斯明和假木贼碱的测定-气相色谱-质谱联用法)，以此计算其烟碱转化率，一般按烟碱转化率大小对烟株进行分级：(1)非转化株：烟碱转化率低于5％的烟株；(2)低转化株：烟碱转化率低于5％至20％的烟株；(3)中转化株：烟碱转化率低于20％至50％的烟株；(4)高转化率：烟碱转化率大于50％；结果显示，本发明鉴定的20株高转化株经过化学检测确认全部为高转化株，平均转化率为95.5％，而本发明鉴定的20株非转化株经过化学检测确认全部为非烟碱转化株，平均转化率为2.1％，由此可见，本发明所提供的方法具有高度的准确性，与实际情况完全吻合。
实例2、马里兰烟烟碱转化株的苗期分子生物学鉴定，其具体步骤依次如下：
A、烟苗标识与鲜叶样品获取：对需鉴定的马里兰烟苗逐个挂牌以标识，然后于苗期(只要可以取到2个叶片的生长时期均可)对每个被标识烟苗进行鲜叶取样，每个烟苗取样量为2个叶片，取好的鲜叶样用密封袋装好，并做好与原烟苗一致的标识，迅速放入冰盒中保存，回实验后将鲜叶样放入超低温冰箱中保存20天后再取出提取基因组DNA；
B、烟苗基因组DNA提取：取出每个封口袋中的鲜叶样品，采用CTAB法提取烟苗基因组DNA，具体提取方法依次如下：
a、将浓度为2％的CTAB抽提缓冲液65℃水浴预热；
b、从其中一个封口袋中取出2片马里兰烟鲜叶样置于小研钵中，用液氮磨至粉状，用2ml的灭菌离心管收集磨好的样品粉末，并立即加入约700μL的2％CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动混合，混合液的量约为管高的2/3；
c、然后将装有混合液的离心管进行65℃水浴，每10min轻轻摇动一次，30-60min后取出；
d、冷却4min后，在离心管中加入氯仿-异戊醇(24：1)至满管，轻微上下振荡3min，使两者混合均匀，放入离心机中，10000rpm离心10min；与此同时，将750μL的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
e、当混合液在离心机中10000rpm离心1min后，使用移液器轻轻地吸取上清夜，转入装有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动50sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物，再在10000rpm的条件下离心1min后，立即倒掉液体，保留白色DNA沉淀，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
f、3min后，直立离心管，加入700μL的75％乙醇及100μL浓度为5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中，放置50min，使DNA块状物的不纯物溶解；
g、然后再放入离心机中，10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800μL 75％的乙醇，将DNA放置50min，然后放入离心机，10000rpm离心50sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上，数分钟后，直立离心管，干燥DNA；
h、在干燥的DNA中加入50μL 0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约20h，使RNA消解。
C、基因组DNA的PCR反应：用紫外分光光度计测定B步骤中提取的烟苗基因组DNA的浓度，取各种样品烟苗基因组DNA溶液少许，将其浓度稀释成50ng/μL作为反应模板进行PCR反应，PCR反应中的特异引物序列：
正向引物：5’-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3’，
反向引物：5’-TCGAGGTCGACGGTATC-3’；
PCR反应体系为：2.5μL带(NH4)25O4的10×反应缓冲液，2.0mmol/L MgCl2，dNTPs 200μmol/L，Tag酶1.2U(购自MBI公司)，模板DNA 50ng，正向和反向引物各0.45μmol/L，不足部分用dd H2O补足，总体积为25μL。
PCR反应程序为：第一阶段在94℃环境下反应4min，第二阶段在94℃的环境下反应30sec，第三阶段先在55℃环境下反应35sec，然后在72℃的环境下反应90sec，第二和第三阶段共循环28次；第四阶段在72℃环境下反应4min，并在4℃的环境下保存。
D、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及电泳结果的读取，其具体步骤如下：
a、琼脂糖胶液的制备：称取1g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100ml pH为8.3的Tris-硼酸EDTA缓冲液，加热配制成为1％琼脂，加入溴化乙锭(EB)2.5μL；
b、凝胶板的制备：将热的处于液体状态的琼脂糖胶液倒入预先制作好的凝胶模板槽中，插上样品梳，四周用胶液封口，冷却待用；
c、上样：用pH为8.3的Tris-硼酸-EDTA缓冲液先填满加样槽，接着再倒入大量缓冲液直至浸没过凝胶面3mm，将C步骤中获得的PCR产物与溴酚蓝-甘油溶液以4∶1的体积比混合，用加样枪将PCR产物注入样品槽中，每个样品加入量一般不超过20μL，最后在第一个和最后一个加样孔加入对照ladder：λDNA/HindIII；
d、电泳：加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极.另一端连接正极，接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用6.5V/cm电压.防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压5V/cm(电压值V/电泳板两极之间距离比)，当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳；
e.观察记录电泳结果：小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，然后再将胶板小心放置入凝胶成像仪的观察板上，关上门，利用电脑成像系统在波长254nm紫外灯下进行观察DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，初步观察后，应立即拍照记录下电泳图谱，并编号保存在电脑中以作后续分析判断。
E、转化株的鉴定与淘汰：将通过PCR特异引物扩增已知高转化株所获得的分子带谱大小数值作为比较分析的参照数据，数值大小介于1700-1800bp之间。将样品PCR扩增所得的分子带谱与两边对照ladder带谱进行对比，将能扩增出分子带谱且大小介于1700-1800bp之间的样品确定为高转化株，有分子带谱但大小小于1700bp的样品确定为中等转化株，淘汰高和中等转化株；将无法扩增出分子带谱或者带谱信号微弱的样品确定为非转化株烟苗，保留备用。由此获得了高度纯合的非转化株品种群体。
同样，为验证本发明所提供技术的准确性，采用同实例1的方法进行了结果验证，结果显示，本发明鉴定的20株马里兰烟高转化株经过化学检测确认全部为高烟碱转化株，平均转化率为93.6％，而本发明鉴定的20株马里兰烟非转化株经过化学检测确认全部为非烟碱转化株，平均转化率为3.3％，由此可见，本发明所提供的方法具有高度的准确性，与实际情况完全吻合。
Claims (4)
1.一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，其特征在于具体步骤依次如下：
A、对需鉴定的烟苗逐个挂牌以标识，然后于苗期对每个被标识的烟苗进行鲜叶取样，每个烟苗取样量为1-2个叶片，取好的鲜叶样品用密封袋装好，并做好与原烟苗一致的标识，迅速放入冰盒或超低温冰箱中保存；
B、提取基因组DNA：取出每个密封袋中的鲜叶样品，采用CTAB法提取各样品烟苗基因组DNA，纯化后保存备用；
C、对基因组DNA进行PCR反应：用紫外分光光度计测定B步骤中提取的烟苗基因组DNA的浓度，然后取各样品烟苗基因组DNA溶液，将其浓度稀释成50ng/μL作为反应模板进行PCR反应，PCR反应中的特异引物序列：
正向引物：5’-ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC-3’，
反向引物：5’-TCGAGGTCGACGGTATC-3’；
D、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及电泳结果的读取：将步骤C中所获得的PCR产物与溴酚蓝-甘油溶液以4∶1的体积比混合，注入样品槽，同时注入对照ladder进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，清除表面的溴化乙锭溶液，然后将胶板放入凝胶成像仪的观察板上，利用电脑成像系统在波长254nm紫外灯下进行观察，拍照记录下电泳图谱，并保存以进行比较分析；
E、转化株的鉴定与淘汰：将通过PCR特异引物扩增已知高转化株所获得的分子带谱数值作为比较分析的参照数据，其具体数值的大小介于1700-1800bp之间；将步骤D中样品PCR扩增所得的分子带谱与两边对照ladder带谱进行对比，其中能扩增出分子带谱且带谱数值大小介于1700-1800bp之间的样品为高转化株，有分子带谱但大小小于1700bp的样品为中等转化株，淘汰高转化株和中等转化株；无法扩增出分子带谱或者带谱信号微弱的样品为非转化株烟苗，保留备用。
2.根据权利要求1所述的一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，其特征在于：在步骤A摘取的鲜叶样品，需要马上提取DNA就迅速用冰盒保存，若不立即提取DNA则应置于超低温冰箱长期保存待用。
3.根据权利要求1所述的一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，其特征在于：在步骤C中PCR反应在PTC-225型热循环仪上进行，其反应体系为：2.5μL带(NH4)2SO4的10×反应缓冲液，MgCl22.0mmol/L，dNTPs 200μmol/L，1.2U Tag酶，50ng模板DNA，正向和反向引物各0.45μmol/L，不足部分用dd H2O补足，总体积为25μL；反应程序为：第一阶段在94℃环境下反应4min，第二阶段在94℃的环境下反应30sec，第三阶段先在55℃环境下反应35sec，然后在72℃的环境下反应90sec，第二和第三阶段共循环28次；第四阶段在72℃环境下反应4min，并在4℃的环境下保存。
4.根据权利要求1所述的一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，其特征在于：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳过程中，在样品进胶前可用6.5V/cm的电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压不高于5V/cm。
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|---|---|
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104946781A (zh) * | 2015-07-16 | 2015-09-30 | 湖北省烟草科学研究院 | 一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法 |
| CN105717110A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-06-29 | 安徽中烟工业有限责任公司 | 一种白肋烟转化株快速鉴定的方法 |
| CN104946781B (zh) * | 2015-07-16 | 2018-06-01 | 湖北省烟草科学研究院 | 一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法 |
| CN111505157A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-07 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种基于非孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法 |
| CN111505158A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-07 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法 |
-
2011
- 2011-06-16 CN CN2011101618703A patent/CN102230011A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BALAZS SIMINSZKY ET AL.: "Conversion of nicotine to nornicotine in Nicotiana tabacum is mediated by CYP82E4, a cytochrome P450 monooxygenase", 《PNAS》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104946781A (zh) * | 2015-07-16 | 2015-09-30 | 湖北省烟草科学研究院 | 一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法 |
| CN104946781B (zh) * | 2015-07-16 | 2018-06-01 | 湖北省烟草科学研究院 | 一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法 |
| CN105717110A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-06-29 | 安徽中烟工业有限责任公司 | 一种白肋烟转化株快速鉴定的方法 |
| CN105717110B (zh) * | 2016-04-25 | 2018-05-01 | 安徽中烟工业有限责任公司 | 一种白肋烟转化株快速鉴定的方法 |
| CN111505157A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-07 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种基于非孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法 |
| CN111505158A (zh) * | 2020-05-09 | 2020-08-07 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种基于孵化处理的尼古丁转化烟株色质快速筛查方法 |
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