CN111481672A

CN111481672A - 抑制sgce基因的试剂的应用

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Publication number: CN111481672A
Application number: CN202010309986.6A
Authority: CN
Inventors: 焦保卫; 赵丽娜; 陈策实; 邱婷
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2040-04-20
Also published as: CN111481672B

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及抑制SGCE基因的试剂与肿瘤化疗药物联合用药在制备治疗肿瘤化疗药物中的应用以及抑制SGCE基因的试剂在制备治疗EGFR高表达肿瘤药物中的应用。本发明发现抑制SGCE基因后能够减弱化疗药物引起的肿瘤干细胞的富集；而且抑制SGCE后增强了Cbl与EGFR的结合，进而导致EGFR降解，并最终使得耐EGFR抑制剂的细胞株对EGFR抑制剂的敏感性显著增强，提示合成SGCE的抑制剂与EGFR抑制剂联合应用在治疗EGFR高表达的肿瘤药物中能够克服肿瘤细胞对EGFR抑制剂的耐药性。因此，SGCE抑制的同时联合抑制EGFR可有效抑制多种EGFR高表达肿瘤如三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌等细胞的增殖和转移生长，有效阻止癌症的复发。在临床应用具有重要指导意义并有广阔前景。

Description

抑制SGCE基因的试剂的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抑制SGCE基因的试剂的应用，具体地说，涉及抑制SGCE基因的试剂与肿瘤化疗药物联合用药在制备治疗肿瘤化疗药物中的应用以及抑制SGCE基因的试剂在制备治疗EGFR高表达肿瘤的药物中的应用。

背景技术

在肿瘤中存在一类特殊的细胞——肿瘤干细胞。肿瘤干细胞在肿瘤复发转移中发挥重要作用。化疗药物是治疗肿瘤的一种常见手段，但随着用药时间的增加病人会产生耐药性。化疗药物能够杀死正在分裂的肿瘤细胞，但对于静止期的肿瘤干细胞没有明显效果，并导致导致肿瘤干细胞富集，这是导致病人产生耐药性的主要原因之一。筛选能够在化疗过程中抑制肿瘤干细胞富集的分子对解决化疗耐药性有重要作用。

筛选在肿瘤干细胞中发挥作用的细胞标记对了解肿瘤干细胞并开发靶向药物具有指导意义。EGFR(epidermal growth factor,EGFR)分子由胞外结构域(氨基酸1-612)和胞内结构域(氨基酸645-1186)组成，胞外结构域包括配体结合结构域1(结构域I)、半胱氨酸富集结构域1(结构域II)、配体结合结构域2(结构域III)和半胱氨酸富集结构域2(结构域IV)；胞内结构域包括近膜结构域、酪氨酸蛋白激酶结构域和羧基端，羧基端含有20个酪氨酸残基，其中里面有7个酪氨酸残基可以被磷酸化并作为下游信号的锚定位点，EGFR在包括非小细胞肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌在内的多种肿瘤中高表达。目前已经开发出EGFR抑制剂如吉非替尼、拉帕替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼、卡纳替尼、西妥昔单抗和帕尼单抗等进入临床应用但EGFR抑制剂在胃癌、乳腺癌中有耐药性治疗效果不显著，在非小细胞肺癌和结直肠癌临床应用较好但随着用药时间延长也表现出耐药性，其中EGFR与c-Cbl的相互结合在耐药性中扮演重要角色。有研究发现在耐EGFR抑制剂的肺癌细胞株EGFR与c-Cbl无关而在敏感的细胞株EGFR与c-Cbl相互作用促进EGFR的泛素化和降解，而在本发明的研究中发现敲低SGCE后增强了EGFR与c-Cbl的相互结合而促进溶酶体降解并最终导致耐药细胞对EGFR抑制剂敏感性增强。

本发明发现使用SGCE抑制剂shSGCE不仅能够增强肿瘤细胞系对化疗药物的敏感性，而且能够减弱肿瘤干细胞的富集，揭示SGCE抑制剂与化疗药物联合应用能够抑制肿瘤干细胞的富集从而抑制肿瘤生长，提示合成SGCE基因的抑制物在抑制化疗药物引起的肿瘤干细富集中发挥重要作用。因此SGCE基因抑制物与化疗药物的联合应用在治疗多种肿瘤中有广阔前景。本发明发现抑制SGCE后增强了Cbl与EGFR的结合，进而导致EGFR降解，并最终使得耐EGFR抑制剂的细胞株对EGFR抑制剂的敏感性显著增强，提示合成SGCE的抑制剂与EGFR抑制剂联合应用在治疗EGFR高表达的病人中能够克服病人对EGFR抑制剂的耐药性，在临床应用具有重要指导意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于解决现有技术中病人产生化疗耐药性的问题，提供抑制SGCE基因的试剂与肿瘤化疗药物联合用药在制备治疗肿瘤化疗药物中的应用。

为实现第一个目的，本发明公开以下技术方案：

抑制SGCE基因的试剂与肿瘤化疗药物联合用药在制备治疗肿瘤化疗药物中的应用。作为一个优选方案，所述的肿瘤化疗药物包括紫杉醇(paclitaxel)、阿霉素(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)。

优选地，所述的抑制SGCE基因的试剂包括：SGCE基因的shRNA、SGCE基因的siRNA、抑制SGCE基因表达的小分子化合物以及SGCE的单抗。

本发明的第二个目的在于提供抑制SGCE基因的试剂在制备治疗EGFR高表达肿瘤的药物中的应用。

优选地，所述的抑制SGCE基因的试剂与靶向EGFR的抑制剂联合用药在制备治疗EGFR高表达肿瘤药物中的应用。

优选地，所述EGFR高表达肿瘤主要包括非小细胞肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌。

优选地，所述靶向EGFR抑制剂包括：吉非替尼、拉帕替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼、卡纳替尼、西妥昔单抗和帕尼单抗。

本发明的发明原理：抑制SGCE后，促进EGFR与Cbl结合，进而导致EGFR降解，并最终增强耐EGFR抑制剂细胞株的敏感性，揭示抑制SGCE基因的表达能够使得耐EGFR抑制剂的细胞克服耐药性。

本发明的有益效果：

本发明揭示：在SGCE基因表达被抑制时，化疗药物处理过程中所引起的肿瘤干细胞富集现象能够被有效抑制。因此本发明提供的针对SGCE基因的shRNA序列可用于制备治疗肿瘤的药物，用于有效抑制肿瘤干细胞。如本发明中采用基因治疗的方法，以质粒或病毒为表达载体，与化疗药物共同作用治疗相关肿瘤。本发明还揭示了在EGFR高表达的细胞中抑制SGCE基因表达，增强Cbl与EGFR的结合并导致EGFR进入降解途径，降低EGFR的表达最终增强耐EGFR抑制剂细胞株对EGFR抑制剂的敏感性。本发明体内和体外实验还表明抑制SGCE的表达能够显著抑制乳腺癌等的成瘤能力和转移能力，提示SGCE为研制抗肿瘤新药开辟新的途径因此，本发明合成SGCE的抑制剂与EGFR抑制剂联合应用在治疗EGFR高表达的肿瘤病人中能够克服对EGFR抑制剂的耐药性，为二者联合应用提供重要临床线索。对于EGFR高表达肿瘤病人来说，在临床应用具有重要指导意义。

附图及附图说明

图1为SGCE低表达对化疗药物敏感性影响，其中，图1(A)放化疗及内分泌治疗后SGCE表达与乳腺癌患者RFS的Kaplan-Meier生存分析，图1(B)HCC1806和MDA-MB-231敲低SGCE并用阿霉素处理后细胞活性检测；图1(C-D)HCC1806和MDA-MB-231敲低SGCE后并用顺铂处理后细胞活性检测；图1(E-F)HCC1806和MDA-MB-231细胞中敲低SGCE后进行ALDH实验；图1(G-H)HCC1806和HCC1937细胞中敲低SGCE后检测CD24^lowCD44^high BCSC群；图1(I-J)HCC1806和MDA-MB-231细胞中敲低SGCE后的乳腺癌微球实验；图1(K-L)HCC1806和MDA-MB-231细胞中敲低SGCE后克隆形成实验。其中*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。

图2为SGCE敲低对化疗药物富集乳腺癌干细胞的影响，其中，图2(A-B)MDA-MB-231和HCC1806敲低SGCE后用化疗药物Dox、Ptx和Cis处理后进行BCSC的微球实验，图2(C-D)MDA-MB-231和HCC1806敲低SGCE后用化疗药物Dox、Ptx和Cis处理后进行克隆形成实验；图2(E-F)MDA-MB-231和HCC1806敲低SGCE后用化疗药物Dox、Ptx和Cis处理后进行ALDH分析，图2(G)HCC1806敲低SGCE后用化疗药物Dox、Ptx和Cis处理后CD24^lowCD44^high细胞群流式分析，图2(H-N)A-G图结果的百分比统计结果。其中*代表P<0.05，**代表P<0.01。Dox：阿霉素；Ptx：紫杉醇；Cis：顺铂。

图3为SGCE敲低促进EGFR降解，图3(A)EGF诱导不同时间检测EGFR的蛋白水平变化，图3(B)EGFR诱导不同时间检测EGFR的蛋白水平变化统计图

图4为SGCE敲低促进EGFR的溶酶体降解，图4(A-B)细胞表面的EGFR流式检测SGCE敲低促进EGFR的溶酶体降解，图4(C-D)Western检测SGCE敲低促进EGFR的溶酶体降解，图4(E-F)LAMP1和EGFR免疫荧光的共定位。

图5为SGCE敲低促进EGFR与c-Cbl相互作用,其中图5(A)HCC1806和MDA-MB-231敲低SGCE后进行EGFR的IP实验检测EGFR与c-Cbl、Cbl-b和Cbl-c相互作用，图5(B)敲低SGCE后进行EGFR的IP检测EGFR与GRB2的相互作用，图5(C)HCC1806和MDA-MB-231敲低SGCE同时敲低c-Cbl检测EGFR的蛋白变化。

图6为SGCE与c-Cbl相互作用；图6(A)HCC1806中SGCE与EGFR的内源IP实验，图6(B-C)HCC1806中SGCE和c-Cbl內源IP实验，图6(C)MDA-MB-231中SGCE和c-Cbl內源IP实验，图6(D)HCC1806中SGCE和c-Cbl外源IP实验，图6(E)MDA-MB-231中SGCE和c-Cbl外源IP实验。

图7为敲低SGCE促进TNBC细胞对吉非替尼敏感性，图7(A)HCC1806和HCC1806吉非替尼耐药细胞对吉非替尼的药物敏感性实验，图7(B)MDA-MB-231和MDA-MB-231吉非替尼耐药细胞对吉非替尼的药物敏感性实验，图7(C)HCC1806和MDA-MB-231吉非替尼耐药株和非耐药株SGCE的表达，图7(D-E)HCC1806和MDA-MB-231吉非替尼耐药细胞敲低SGCE的药物敏感性实验。

图8为敲低SGCE促进细胞对拉帕提尼敏感性，图8(A)HCC1806和HCC1806拉帕提尼耐药细胞对拉帕提尼的药物敏感性实验，图8(B)MDA-MB-231和MDA-MB-231拉帕提尼耐药细胞对拉帕提尼的药物敏感性实验，图8(C)HCC1806拉帕提尼耐药细胞敲低SGCE的药物敏感性实验，图8(D)MDA-MB-231拉帕提尼耐药细胞敲低SGCE的细胞药物敏感性实验。

图9为SGCE敲低抑制肿瘤细胞转移，图9(A)敲低SGCE在HCC1806和MDA-MB-231细胞中进行细胞迁移和侵袭实验，图9(B)敲低SGCE在HCC1806和MDA-MB-231细胞中进行细胞迁移和侵袭实验的统计结果，图9(C)敲低SGCE进行裸鼠肺转移实验。

图10为SGCE敲低进行梯度稀释成瘤实验，图10(A)为HCC1806敲低SGCE后进行梯度稀释的成瘤实验；图10(B)为HCC1806敲低SGCE后进行梯度稀释的成瘤实验的统计结果；图10(C)为HCC1806分选出CD24^lowCD44^highBCSC后敲低SGCE进行梯度稀释的成瘤实验；图10(D)为HCC1806分选出CD24^lowCD44^highBCSC后敲低SGCE进行梯度稀释的成瘤实验的统计结果。

具体实施方式

实施例1 SGCE低表达使TNBC细胞系对化疗药物更敏感

(1)分析经过治疗后乳腺癌病人SGCE表达与患者生存曲线关系

使用在线软件(http://kmplot.com/analysis/)分析发现，经过放化疗和内分泌治疗的乳腺癌病人中SGCE高表达患者的生存曲线对应于预后差。

(2)构建shSGCE载体

1)设计靶向SGCE的shRNA序列，序列如下：

2)通过公司合成正反链寡核苷酸序列(oligos)

3)合成的正反向oligos稀释成20μM的工作液进行退火

4)退火体系如下：

100℃煮4min，然后自然冷却至室温。

5)PLKO.1载体的酶切回收

酶切体系如下：

双蒸水补足至50μl。

6)连接体系如下

连接程序：16℃，2h；25℃，1h；37℃，30min。

7)连接产物进行转化、挑克隆、摇菌、抽质粒。

8)获得的质粒用EcoRI-HF和NcoI-HF进行双酶切鉴定并测序。

9)选择测序正确的质粒扩增后进行后续实验。

(3)慢病毒包装

1)复苏293T细胞，传代培养至汇合度为80％。

2)将293T细胞的培养基更换为不加FBS的基础培养基饥饿2h。

3)配制A液：

1ml Opti-MEM培养基(Gibico)+56μl PEI。

配制B液：

1ml Opti-MEM培养基+PMD 3.46μg+PSPAX26.36μg+PLKO.14.18μg。

A液、B液分别静置5min，然后将B液加到A液中，混匀，室温静置20min后A+B的混合液轻轻的加到293T细胞中。

4)转染细胞4-6h后更换含5％FBS的DMEM培养基，48h后第一次收病毒液，72h后第二次收集病毒液，两次收集的病毒混合到同一离心管中，4℃，500g，离心5min去除可能残余的细胞，用0.45μm细胞滤膜过滤病毒液，病毒可于-80℃暂时保存。

(4)慢病毒感染

HCC1806或MDA-MB-231进行慢病毒感染，细胞消化后向6孔板中铺适量的细胞加入病毒液和polybrene，病毒过夜感染12h后更换为正常培养基，三天后进行后续实验。

(5)细胞系对药物的敏感性实验

该部分实验选用的化疗药物是阿霉素(doxorubicin)和顺铂(cisplatin)。

1)准备细胞

细胞消化后计数并铺入96孔细胞培养板，每个孔8000个细胞，每组6个重复孔，细胞培养板放于37℃细胞培养箱过夜培养。

2)药物处理细胞

准备含有不同浓度阿霉素的培养基：0μM，0.04μM，0.08μM，0.32μM，1.28μM，2.56μM。细胞铺板12-24h后，吸出原来的培养基更换为上述培养基，处理48h。

3)细胞活力检测

细胞活力的检测是通过MTS实验进行的，MTS试剂CellTiter

AQueous OneSolution Reagent(Promega,G3581)一种四唑盐溶液，可被活细胞中产生的NADPH或NADH还原成一种有色的甲臜产物。药物处理结束后，吸出原培养基，更换为MTS混合液，37℃避光孵育1-2h后，检测并统计490nm吸光值。

MTS混合液：按照1:5的比例避光混合MTS试剂和培养基。

(6)细胞CD24^lowCD44^high流式实验

1)HCC1806细胞接种到6cm的培养皿，待汇合度生长到90％，用胰酶消化细胞。

2)终止细胞消化后进行细胞计数，按照每1×10⁶细胞加入20μl CD24-PE,CD44-FITC的比例向细胞中加入适量的抗体。避光条件下加入抗体后，在冰上避光孵育30-40min。

3)用PBS清洗多余的抗体，4℃，500g，离心5min。

4)重复步骤4)三次。

用400μl PBS重新悬浮细胞，将重悬的细胞加入高速分析流式专用管分析CD24^lowCD44^high的变化。

(7)ALDH实验

该实验通过ALDH试剂盒(Promega,18J95349)，进行检测。

1)HCC1806或MDA-MB-231感染病毒三天后，消化细胞，计数1×10⁶细胞进行下面的操作。

2)4℃，500g，离心5min，弃掉上清，用1mlALDEFLUOR^TMAssay Buffer悬浮细胞。

3)准备一个新的1.5ml EP管标记为control，在control的EP管中加5μlALDEFLUOR^TM DEAB Reagent，迅速盖好盖子。

4)向1ml ALDEFLUOR^TM Assay Buffer的细胞悬液中加入5μl activatedALDEFLUOR^TM Reagent快速混匀，吸出500μl加至对应的标记为control的已经加有5μlALDEFLUOR^TMDEAB Reagent的EP管中混匀。

5)样品组和control组37℃避光孵育30min-60min。

6)4℃，500g，离心5min，弃上清，用300μlALDEFLUOR^TMAssay Buffer重浮细胞进行流式分析。

(8)乳腺癌微球实验(tummorsphere)

该实验需要将细胞铺在超低吸附96孔板中，1000-3000个细胞/孔(不同的细胞系所铺的细胞不同)，每组实验设置6-8组平行重复，tummorsphere培养基中培养10-14天，统计直径>200nm的微球体的数量并进行t-检验。Tummorsphere培养基配方：9ml humanmammcultbasal培养基+1ml supplement+20μl heparin+4.8μl氢化可的松(1mg/ml)。

(9)克隆形成实验

胰酶将细胞消化成单个细胞后计数，用胰酶将细胞消化成单个细胞后，按照500细胞/孔的数量重新铺回6孔板，培养10-14天后，用4％多聚甲醛固定30min，倒掉固定液，用0.1％结晶紫染色15-30min，用清水轻轻浸泡冲洗，晾干后拍照。

实验结果：使用在线软件(http://kmplot.com/analysis/)分析发现，经过放化疗和内分泌治疗的乳腺癌病人中SGCE高表达患者的生存曲线对应于预后差(图1(A))，为了进一步验证SGCE低表达是否会增加细胞对化疗药物的敏感性，本发明在TNBC细胞HCC1806和MDA-MB-231中敲低SGCE后并用化疗药物阿霉素和顺铂处理细胞，检测结果显示SGCE低表达组的IC₅₀值低于对照组，说明SGCE敲低后增强了细胞对化疗药物的敏感性(图1(B-D))，鉴于病人经过化疗治疗后会导致肿瘤干细胞富集进而出现耐药性，同时实验数据中显示敲低SGCE能够抑制乳腺癌干细胞的自我更新(图1(E-L))，这暗示敲低SGCE可能能够减弱化疗药物引起的干细胞富集所导致的耐药性。

实施例2 SGCE低表达减少化疗药物引起的肿瘤干细胞富集

(1)化疗药物对细胞预处理

1)准备细胞

细胞消化后计数并铺到6孔板，每个孔3×10⁵个细胞，37℃过夜培养。

2)加药处理

第二天更换加有阿霉素、紫杉醇(paclitaxel)和顺铂不同化疗药物的培养基，使用的药物浓度如下：

阿霉素处理HCC1806和MDA-MB-231的药物浓度分别为5nM和1nM；

紫杉醇处理HCC1806和MDA-MB-231的药物浓度分别为1nM和1nM；

顺铂处理HCC1806和MDA-MB-231的药物浓度分别为100nM和100nM；

另外还需要有一组不加任何药物的细胞作为对照。

加药培养基培养48h后进行下列实验。

(2)细胞CD24^lowCD44^high流式实验

同实施例1。

(3)ALDH实验

同实施例1。

(4)乳腺癌微球实验(tummorsphere)

同实施例1。

(5)克隆形成实验

同实施例1。

结果：本发明用化疗药物阿霉素、紫杉醇和顺铂处理TNBC细胞进行微球实验。结果显示与不加药组相比，用不同的药物处理后微球数量显著增多；当SGCE敲低后化疗药物所导致的微球数量的升高现象被明显抑制(图2(A-B))。在克隆形成实验发现，与不加药组相比，用这三种药物分别处理后也都能导致形成的克隆数量增多；当SGCE敲低后，药物所诱导的形成克隆数量增多的现象被显著抑制(图2(C-D))。另外，在ALDH和CD24^lowCD44^high流式分析实验中得到类似的结果，与不加药组相比，药物处理后ALDH⁺和CD24^lowCD44^high细胞群出现富集现象；而敲低SGCE后该现象被抑制(图2(E-G))。为了进一步探讨敲低SGCE并用化疗药物处理后BCSC数量减少或自我更新能力减弱的现象是由于敲低SGCE后抑制BCSC所造成的还是由于敲低SGCE本身会增强BCSC对化疗药物敏感性所造成的，本发明对图2A-G的统计结果进行抑制率的比较分析发现：加入化疗药物后敲低SGCE微球数量下降比例要显著高于不加化疗药物后敲低SGCE微球数量下降的比例(图2(H-I))，在其它的实验也得到类似趋势的结果(图2(J-N))，说明敲低SGCE且用化疗药物处理后BCSC被抑制的现象是由于敲低SGCE抑制BCSC自我更新能力和增强BCSC药物敏感性二者协同作用造成的。

实施例3 SGCE敲低促进了EGFR的溶酶体降解

(1)Western检测

1)蛋白样品的收集

细胞生长至70％左右，移除原培养基，加入基础培养基过夜饥饿，并用含50ng/mlEGF分别刺激15min、15min、30min并在每个时间点刮取细胞，加入含有蛋白抑制剂的蛋白裂解液(碧云天,P10013)，冰上裂解30min，4℃，12000g，离心15min，将上层的蛋白样品转移到新的1.5ml EP管中。

2)蛋白浓度的测定

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce,23225)进行蛋白浓度的测定。根据说明书将BSA母液稀释至不同浓度梯度的蛋白标准品，并按照比例配置A+B混合液，混合液现用现配。蛋白标准品和需要测定蛋白浓度的样品均吸取10μl于96孔酶标板的比色皿中，加入100μl A+B混合液，37℃反应30min，在酶标仪(Epoch BioTak)上测定561nm的吸光值，按照标准蛋白样品的浓度和吸光值计算出不同蛋白样品的浓度，根据测定的样品的浓度用蛋白裂解液对不同的样品进行浓度的归一化，使得所有样品蛋白浓度一致，加入5×SDS LoadingBuffer，100度10min金属浴使蛋白变性。

3)SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)电泳

根据待检测的目标蛋白的分子量选择配制合适浓度的分离胶，灌胶后用异丙醇缓慢加入进行封胶，水平静置至分离胶完全凝固后，将异丙醇慢慢倒出并用双蒸水冲洗两次，吸干多余的水分，配制浓缩胶迅速插入需要的梳子，待上层胶凝固后拔出梳子，组装好电泳槽，加入1×电泳缓冲液，加入等量的蛋白样品，先用恒压80V电泳30min，再用100V电泳1-2h。

4)转膜

预先裁剪PVDF膜浸泡在甲醇中，电泳后用起胶板将凝胶取出，在装有1×转膜缓冲液的容器中按照夹板黑面、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵、夹板透明面的顺序组装夹板，按照夹板黑面朝向转膜槽负极，夹板透明面朝向转膜槽正极的位置放入转膜槽，转膜槽中注满1×转膜缓冲液，在低温条件下恒压100V转膜1-2h。

5)封闭

用PBST配制5％脱脂奶粉作为封闭液。转膜结束后，根据蛋白分子量的对PVDF膜进行适当裁剪后放入抗体孵育盒，加入封闭液在室温封闭1h。

6)一抗孵育

根据抗体说明书，用含0.01％NaN₃的3％的BSA按照合适比例稀释一抗。封闭结束后用PBST洗膜，每次5min，洗三次，加入一抗稀释液4℃过夜孵育。

7)二抗孵育

将一抗进行回收，PBST洗膜10min，洗三次，加入相应的二抗室温孵育1h。二抗用含有3％脱脂奶粉的PBST按照说明书进行稀释。

8)显影

吸出二抗用PBST洗膜10min，洗三次，将膜浸入新鲜配制的Pierce ECL显影液孵育1min，进行显影。

结果：细胞过夜饥饿后用50ng/ml的EGFR刺激不同时间并收集细胞进行EGFR的Western检测，发现对照组在EGF刺激15min后EGFR的蛋白水平持续上升，而敲低SGCE后EGF刺激15min后EGFR的蛋白水平开始出现下降，而且在刺激60min后敲低SGCE组的EGFR蛋白水平显著低于对照组，说明敲低SGCE显著促进EGFR的降解(图3)。

实施例4 SGCE敲低促进了EGFR的溶酶体降解

(1)细胞膜EGFR检测

1)细胞消化后计数1×10⁶细胞，PBS洗三次，用100μl PBS重悬细胞。

2)含有DNase的5％山羊血清封闭，冰上孵育10min。

3)PBS洗三次，用100μl PBS重悬细胞。

4)按照1μg EGFR抗体/1×10⁶加入EGFR抗体，冰上孵育1h。

5)4℃，500g，离心5min，PBS洗三次。

6)使用荧光二抗AlexaFluor 555goat anti-mouse(1:1000稀释)，加入100μl稀释的二抗，避光冰上孵育30min。

7)4℃，500g，离心5min，PBS洗三次。

8)流式检测。

(2)免疫荧光

1)铺细胞：

消化细胞并计数，2×10⁴个细胞铺到已放入圆形盖玻片的24孔板中，过夜培养。

2)用PBS清洗三次，注意不要将细胞吹起。

3)4％多聚甲醛固定10min，PBS洗三次。

4)含0.1％Triton X-100浓度的5％山羊血清室温封闭1h。

5)一抗孵育：

按照抗体说明书用含0.1％Triton X-100浓度的5％山羊血清稀释一抗，EGFR(1:100)，LAMP1(1:100)，4℃过夜孵育。

6)PBS洗三次，每次5min。

7)二抗孵育：

用PBS稀释荧光二抗，Fluorescein-labeled anti-rabbit(1:200)，Alexa Fluor555goat anti-mouse(1:000)，室温避光孵育1h。

8)PBS洗三次，每次5min。

9)DAPI封片(Vector Laboratories,H-1200)，-20℃放置1h后荧光显微镜观察。

结果：为了能够确认SGCE是否参与EGFR溶酶体的降解，选择用NH₄Cl进行相关实验，NH₄Cl可以改变溶酶体pH值抑制溶酶体降解能力，是一种溶酶体抑制剂，用8mM NH₄Cl处理细胞4h后收集细胞进行EGFR流式检测发现EGFR能够部分被恢复(图4A-B)；Western实验也发现NH₄Cl处理可以部分恢复EGFR的蛋白水平(图4(C-D))；LAMP1是晚期溶酶体的标记物，在敲低SGCE后进行EGFR和LAMP1的免疫荧光共定位实验，在敲低组能够观察到EGFR和LAMP1的共定位显著增多(图4(E-F))，这些数据进一步说明了敲低SGCE后增强了EGFR进入了溶酶体降解从而导致EGFR的蛋白水平的降低。

实施例5敲低SGCE促进EGFR与c-Cbl的相互作用

(1)内源免疫共沉淀实验(co-IP)

1)收集细胞：

用15cm细胞培养皿培养细胞汇合度至90％，用PBS洗两遍，再加入适量PBS后用细胞刮将细胞刮下，4℃，500g，离心5min，弃上清，再用PBS洗两遍。

2)蛋白裂解：

向细胞沉淀中加入2ml蛋白裂解液，于垂直旋转仪上4℃裂解30min，4℃，12000g，离心15min，转移上清至新离心管，取出少量用作input，剩余用作后续实验。

3)内源IP实验，将准备好的蛋白裂解液与EGFR抗体混合，置于4℃垂

直旋转仪上过夜结合。

4)准备IP相关的珠子(beads)：

内源IP实验中用到的是protein A/G琼脂糖珠子(Santa Cruze,sc-2003)，从4℃取出琼脂糖珠混匀后吸出所需珠子，用裂解液洗三遍珠子，离心弃上清。

5)将准备好的proteinA/G琼脂糖珠子与蛋白裂解液和EGFR混合，置于4℃垂直旋转仪上孵育3h。

6)用裂解液洗proteinA/G琼脂糖珠子，4℃，500g，离心5min，洗三次。

7)弃上清，加入2×SDS loading buffer 100℃煮10min，进行后续Western。

(2)外源免疫共沉淀实验

1)细胞收集同(1)。

2)蛋白裂解同(1)。

3)准备IP相关的珠子(beads)

外源IP实验中用到的是Flag-M2珠子，将Flag-M2珠子取出冰上融解后吸出适量的珠子，用裂解液洗三遍珠子，离心弃上清。

4)外源IP实验，准备好的蛋白裂解液与Flag-M2珠子混合，置于4℃垂直旋转仪上过夜孵育。

5)孵育结束后用裂解液洗Flag-M2珠子，4℃，500g，离心5min，洗三次。

6)弃上清，加入2×SDS loading buffer 100℃煮10min，进行后续Western。

结果：泛素连接酶是底物泛素化所必需的，Cbl是一种E3泛素连接酶，参与EGFR的泛素化，Cbl蛋白家族包括c-Cbl、Cbl-b和Cbl-c，其中Cbl-b和c-Cbl都能介导EGFR的泛素化降解，而且二者能单独介导EGFR的降解。首先通过内源IP实验发现在HCC1806和MDA-MB231中敲低SGCE后增强了EGFR与c-Cbl的相互作用，而不是EGFR与Cbl-b和Cbl-c的相互作用(图5(A))。考虑到Cbl可以通过两种方式招募到EGFR受体上：EGFR的磷酸化位点pY1068和pY1086发生磷酸化后与接头蛋白GRB2结合，Cbl再与GRB2结合；另外EGFR的磷酸化位点pY1045发生磷酸化，Cbl直接与pY1045磷酸化位点结合，在结果中发现敲低SGCE后没有影响EGFR与GRB2的相互作用(图5(B))，推测敲低SGCE后促进了c-Cbl与EGFR pY1045磷酸化位点结合。为了进一步确认c-Cbl在EGFR降解中的重要作用，在敲低SGCE的同时敲低c-Cbl发现降低的EGFR的蛋白水平可以部分恢复(图5(C))，综合前面的结果说明敲低SGCE后促进了EGFR与c-Cbl的相互结合引起EGFR的溶酶体降解。

为了进一步确认SGCE、c-Cbl、EGFR三者之间的关系，首先检测了EGFR与SGCE间是否存在相互结合，实验结果说明这二者之间不存在相互作用(图6(A))。接下来通过内源和外源IP实验都发现SGCE和c-Cbl之间存在相互作用(图6(B-E))。

实施例6敲低SGCE促进靶向EGFR的药物的敏感性

(1)吉非替尼(gefitinib)和拉帕提尼(lapatinib)耐药株的筛选

1)购买的吉非替尼(APExBIO,A8219)用DMSO溶解，母液浓度为100mM。以HCC1806细胞为例讲述耐药细胞的筛选。

2)采用逐步增加剂量的方法筛选耐药株约3-4个月，每10天左右增加吉非

替尼的用量，筛选浓度梯度为：0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM。

3)分别使用HCC1806的耐药细胞株和原细胞株进行药物敏感性实验，检测两种细胞的IC₅₀。

MDA-MB-231吉非替尼耐药细胞系以及HCC1806和MDA-MB-231拉帕替尼细胞(Selleck,S2111)耐药细胞用同样的方法筛选获得。

(2)细胞活性检测方法同实施例2

结果：为了更好的研究SGCE是否在靶向EGFR的药物耐药过程中发挥作用，需要在靶向EGFR的TKI耐药株中进行相关实验。本发明筛选了HCC1806和MDA-MB-231耐吉非替尼细胞。获得耐药细胞后，首先将耐药细胞和原细胞株进行吉非替尼药物敏感性实验发现耐药株的IC₅₀远高于原细胞(图7(A-B))，证明耐药株筛选成功。接下来通过Western实验检测到SGCE在耐药细胞的表达水平较高(图7C)，在耐药株中敲低SGCE后增强了细胞对吉非替尼的敏感性(图7(D-E))。

为了验证SGCE在靶向EGFR的药物耐药性中是否具有普遍的作用，筛选了另一个TKI的耐药细胞。获得拉帕提尼耐药株后，将耐药株和原细胞株进行拉帕提尼药物敏感实验发现耐药株的IC₅₀远高于原细胞(图8(A-B))，说明耐药株筛选成功，而且在耐药株中敲低SGCE后增强了细胞对拉帕提尼的敏感性(图8(C-D))，该结果与吉非替尼耐药株的结果一致(图7)，推测SGCE可能在靶向EGFR的TKI耐药株中发挥重要作用。

实施例9 SGCE敲低抑制肿瘤细胞转移

(1)细胞迁移实验

实验过程中采用corning生物公司的Transwell板完成以下实验。

1)细胞胰酶消化并收集细胞，PBS洗2遍，用无血清含有0.1％BSA的培养基重悬细胞。

2)取100μl细胞悬液小心加入Transwell板的上室。

3)在Transwell板下室中加入600μl完全培养基。之后细胞在Transwell板中培养8-16h。

4)取出Transwell上室，弃去孔中培养液，小心用棉签将上室中上层膜上的细胞拭去。

5)将上室放入含有0.1％结晶紫染色后显微镜下观察。

(2)细胞侵袭实验

实验过程中采用corning生物公司的Transwell板完成以下实验。

1)接种细胞前，在Transwell板上室中加入matrigel。

2)消化收集细胞，后用无血清含有0.1％BSA的培养基重悬细胞。小心的取100μl细胞悬液加入含有matrigel的上室中。

3)在Transwell板下室中加入完全培养基，培养12-24h。

5)将上室放入含有0.1％结晶紫染色15-20min，自然风干后显微镜下观察。

(3)裸鼠肺转移实验

1)构建稳定表达Luciferase的MDA-MB231细胞。

2)将MDA-MB231-Luciferase细胞进行不同组处理。

3)收集细胞并计数，采用1X PBS重悬细胞。

4)采用专门的小鼠固定器固定好小鼠，将尾巴拉直，绷紧。选择两侧的静脉进行注射，每只缓慢注射100ul细胞悬液。其中MDA-MB231注射到裸鼠中。

5)尾静脉注射后，在不同时间点腹部注射100mg/g的D-luciferin，10min后，将小鼠麻醉，用小动物荧光成像细胞记录不同时间的成瘤情况，MDA-MB231在裸鼠中肺转移整个实验周期需要8周左右。

结果如图9所示：实验证明：SGCE敲低后抑制乳腺癌形成，在该实施例中发明人讨论了SGCE抑制后对肿瘤细胞的迁移侵袭的影响。首先在HCC1806和MDA-MB-231细胞中敲低SGCE后进行体外迁移侵袭实验，发现抑制SGCE后乳腺癌细胞的迁移侵袭(图9(A-B))；接下来进行了体内的肺转移实验，敲低SGCE后肺部荧光明显减弱说明转移到肺部的肿瘤细胞减少，说明抑制SGCE后能够抑制乳腺癌转移(图9(C))，从而延长病人的生存期，也能够说明SGCE低表达预测病人预后良好。提示，SGCE三阴性乳腺癌抗肿瘤新药开辟新的途径。

实施例10 SGCE敲低抑制乳腺癌的形成(体内实验)

(1)裸鼠原位成瘤实验

1)准备细胞

HCC1806细胞生长到足够数量后，胰酶消化细胞，PBS洗三遍，计数，将实验组和对照组的细胞调整到一致，并加入Matrigel(BD,356235)形成30％Matrigel的悬液，且将细胞密度调整为4×10⁶个细胞/100μl、4×10⁵个细胞/100μl、4×10⁴个细胞/100μl。

2)注射细胞

裸鼠腹腔注射麻醉剂后标记耳环号，对腹部用酒精进行消毒并剪开，使用医用棉签做辅助小心暴露出第四对乳腺，每侧乳腺注入100μl细胞悬液后用缝合器将皮肤缝合。

3)一周后，用起钉器将缝合部位拆除，6周统计成瘤率。

(2)HCC1806 CD24^lowCD44^high乳腺癌干细胞分选

具体方法同实施例1。

结果如图10显示：在HCC1806细胞中敲低SGCE后，按照10⁶、10⁵、10⁴的梯度稀释进行成瘤率的统计，统计结果显示对照组成瘤率是1/28854，而敲低SGCE组的成瘤率分别为1/108421和1/1463997，显著低于对照组成瘤率(图10(A-B))。另外本发明在HCC1806中还用细胞流式分选的方法分选出CD24^lowCD44^high BCSC群，感染病毒后同样进行梯度稀释的成瘤实验，实验的统计结果显示对照组在注入200个BCSCs时有50％的概率可以有效形成肿瘤，而实验组在该梯度时形成肿瘤的概率极少；在用BCSCs进行成瘤实验中对照组成瘤率为1/1656，而敲低SGCE组的成瘤率分别为1/4192和1/8062，显著低于对照组(图10(C-D))。

因此，本发明发现抑制SGCE基因后能够减弱化疗药物引起的肿瘤干细胞的富集；而且抑制SGCE后增强了Cbl与EGFR的结合，进而导致EGFR降解，并最终使得耐EGFR抑制剂的细胞株对EGFR抑制剂的敏感性显著增强，提示合成SGCE的抑制剂与EGFR抑制剂联合应用在治疗EGFR高表达的肿瘤药物中能够克服化疗药物对EGFR抑制剂的耐药性。因此，化疗的同时靶向抑制EGFR可有效抑制多种EGFR高表达肿瘤如三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌等细胞的增殖和转移生长，有效阻止癌症的复发。在临床应用具有重要指导意义并有广阔前景。

Claims

1.抑制SGCE基因的试剂与肿瘤化疗药物联合用药在制备治疗肿瘤化疗药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤化疗药物包括紫杉醇(paclitaxel)、阿霉素(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)。

3.抑制SGCE基因的试剂在制备治疗EGFR高表达肿瘤的化疗药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抑制SGCE基因的试剂与靶向EGFR的抑制剂联合用药在制备治疗EGFR高表达肿瘤的药物中的应用。

5.根据权利要求1或权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抑制SGCE基因的试剂包括：SGCE基因的shRNA、SGCE基因的siRNA、抑制SGCE基因表达的小分子化合物以及SGCE的单抗。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述EGFR高表达肿瘤主要包括非小细胞肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述靶向EGFR抑制剂包括：吉非替尼、拉帕替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼、卡纳替尼、西妥昔单抗和帕尼单抗。