CN110890128A - 一种用于检测皮肤肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用 - Google Patents

一种用于检测皮肤肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测皮肤肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用，所述模型通过计算印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达量对印记基因在肿瘤中的变化进行分级。本发明所述检测模型和装置，以直观的方法表现了印记缺失在皮肤肿瘤病人的组织和细胞样本上的表现，通过对印记基因原位标记的方法，客观、直观、早期、精确地检测出印记(迹)基因的变化，并可以提供量化的模型，为皮肤肿瘤的诊断做出巨大贡献。

Description

一种用于检测皮肤肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及基因诊断领域，涉及一种用于检测皮肤肿瘤良恶性程度 的分级模型及其应用，具体涉及一组印记基因在检测皮肤肿瘤良恶性程度中的分级模型及其 组成的装置。
背景技术
皮肤癌包括恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、湿疹样癌、纤维肉瘤等多种类型， 恶性黑色素瘤以外的其他皮肤癌较为普遍，但恶性程度较低，在很多国家并不纳入癌症统计 数据，根据世界卫生组织估计，每年约有超过300万的新增病例。而恶性黑色素瘤的恶性程 度很高，容易发生全身转移。根据世界卫生组织统计，2012年恶性黑色素瘤全球新增病例23.2 万例，死亡5.5万例。黑色素瘤好发于皮肤黑色素较少的白色人种，随着大气层臭氧水平的 降低，对紫外线的过滤作用逐渐减弱，黑色素瘤的发病率还在继续升高。早期的原位黑色素 瘤很容易通过手术切除，但是原位黑色素瘤与黑痣在形态上很难分辨，一直是黑色素瘤病理 诊断的难点，一些黑色素瘤患者在得到明确诊断时已经发生转移，增加了治疗的复杂程度， 也增加了患者的痛苦。因此，一种准确率更高的黑色素瘤早期检测技术将挽救大量患者的生 命，也能极大地降低社会医疗支出。
传统病理学对细胞的良恶性诊断是基于细胞的大小，形态，侵润性和周边细胞组织的关 系来作出判断的。它对细胞(癌症)的早期变化的发现有很大的局限性，因此细胞分子水平 的癌症诊断方法，一度成为研究热点。随着人们在分子生物学领域的不断深入研究，越来越 多的分子检测技术被运用到癌症诊断中。
癌症的产生是随时间推移而累积的表观遗传改变和基因上的变异所导致的不受控制的细 胞生长/分裂。传统病理学诊断根据细胞和组织的大小，形态和结构上的变异，从而做出皮 肤肿瘤良恶性判断。随着分子生物学的发展与深入，越来越多的分子检测技术被应用于皮肤 癌症的检测。从癌症的发展过程分析，分子层面的改变(表观遗传学和基因学)远早于细胞 形态和组织结构的变异。所以分子生物学检测对癌症早期的检测更敏感。
基因组印记是表观遗传学中基因调控的一种方式。其特点是，通过甲基化来自特定亲代 的等位基因，使某个基因只有一个等位基因表达，而另一个则陷入基因沉默状态。该种类的 基因，被称为印迹(记)基因。印迹缺失是印迹基因去甲基化导致沉默状态的等位基因被激 活并且开始基因表达的一种表观遗传改变。大量研究表明，该现象(印迹缺失)普遍存在于 各类癌症并且发生时间早于细胞和组织形态改变。与此同时，在健康细胞中，印迹缺失比例 极低，与癌细胞成鲜明对比。所以，印迹基因的甲基化状态可以作为病理标记，通过特定分 子检测技术，对细胞异常状态进行分析。
基于上述原因，目前的皮肤癌诊断需要新的检测系统和检测模型，基于患者活检样本， 解析皮肤癌在细胞层面上存在的分子标记物变化，以此提供更精确的预诊和诊断信息。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供了一种用于检测皮肤肿瘤良恶性程度的 分级模型及其应用，该检测系统和模型是用于细胞和组织水平下早期直观地观察皮肤癌的印 记(迹)基因的变化从而判断皮肤肿瘤的良恶性及恶性程度。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于皮肤肿瘤的印记基因分级模型，所述模型通过计算印 记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因的总表达量在皮肤肿瘤中的变化 对印记基因的表达状态进行分级；
其中，所述印记基因为Z1、Z8、Z11或Z16中的任意一个或至少两个的组合，所述印记 基因Z1为Gnas，所述印记基因Z8为Dcn，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z16 为Snrpn/Snurf。
本发明中，发明人发现通过计算Z1、Z8、Z11和Z16中任意一个印记基因在皮肤肿瘤中 的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量，对皮肤癌的诊断敏感度可以达到 77.8％以上。
根据本发明，若初步检测只检测一个印记基因，可以检测Z1、Z8、Z11和Z16中的任意 一个，优选为Z8、Z1或Z11中的任意一个，最优选为Z1或Z8。
本发明中，发明人发现，单独检测一个Z1印记基因，对皮肤癌的诊断敏感度可以达到 81.8％，单独检测一个Z8印记基因，其对皮肤肿瘤中的黑色素瘤的诊断敏感，诊断敏感度可 以达到95.5％，单独检测一个Z11印记基因，对皮肤癌的诊断敏感度可以达到79.5％，单独 检测一个Z16印记基因，对皮肤癌的诊断敏感度可以达到77.8％。
根据本发明，若检测印记基因的两个印记基因的组合，所述组合可以是Z1、Z8、Z11和 Z16中的任意两个，优选为Z1和Z8的组合，Z8和Z11的组合。
本发明中，发明人发现通过计算两个或两个以上的印记基因的印记基因缺失表达量和印 记基因拷贝数异常表达量可以进一步提高敏感度，检测印记基因的两个印记基因的组合，对 皮肤癌的诊断敏感度可以达到90.9％以上，检测Z1和Z8的组合时，对皮肤癌的诊断敏感度 可以达到99.0％，检测Z8和Z11的组合时，对皮肤癌的诊断敏感度可以达到97.7％。
根据本发明，所述印记基因还包括Z6、Z10或Z13中的任意一个或至少两个的组合；其 中，所述印记基因Z6为Plagl1，所述印记基因Z10为Gatm，所述印记基因Z13为Sgce。
本发明中，发明人发现在使用Z1、Z8、Z11和Z16基因检测的基础上再增加Z6、Z10、Z13基因进行联合诊断，不仅有助于增加检测的准确度，而且增加其他探针辅助诊断可以进一步避免假阳性的出现，能够将检测准确度进一步提高，从而能够实现所有肺肿瘤样本的精 确分级和判断。
根据本发明，所述模型计算印记基因的方法为：计算印记基因的组合，所述印记基因为 Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16基因的组合。
本发明中，所述印记基因缺失为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色 标记，所述印记基因拷贝数异常为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕 色标记，所述拷贝数异常是由于癌细胞异常地进行基因复制，导致这个基因表达时呈现为三 倍体甚至更高的多倍体的情况。
本发明中，所述苏木素染色后的标记选自但不限于红色或棕色，用其他颜色进行染色标 记也可用于印迹基因总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的计算。
本发明中，所述印记基因与印迹基因同时一个概念，表示同一个意思，可以进行替换。
优选地，所述计算印记基因总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达 量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因总表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失基因表达量(LOI)＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常的基因表达量(CNV)＝d/(b+c+d)×100％；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的 细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存 在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基 因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记， 印记基因拷贝数异常的细胞核。
本发明中，所述苏木素染色后的标记选自但不限于红色或棕色，用其他颜色进行染色标 记也可用于印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达量的计算。
本发明中，将探针通过原位杂交，和Hemotoxy(苏木精)细胞核染色扩增信号，在40× 或60×显微镜下，判断每一个细胞核内印记基因存在、印记基因缺失或拷贝数异常，通过计 算印记基因缺失基因表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达量来判定该样本 的肿瘤良恶性程度；由于切片仅为10μm，所以在显微镜下所见细胞核大约有20％为不完整细 胞核，也就是说有部分假阴性的可能性存在。
根据本发明，所述印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达 量分成五个不同的等级。
根据本发明，通过每个探针在样本表达最阳性的区域对至少1200个细胞进行计数，针对 Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的七个印记基因的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝 数异常表达量和印记基因总表达量分别进行划分的五个不同的等级。
优选地，所述针对Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总 表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z1和Z16 的印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量小于25％中的 任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为25-35％ 中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为20-23％、所述印记基因Z1和 Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为35-45％ 中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为23-27％、所述印记基因Z1和 Z16的印记基因拷贝数异常表达量为3.5-5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为45-55％ 中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量大于27％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量大于55％中的任意一种或至少两种的组合；
本发明中，所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达 量和总表达量是相互独立的。
优选地，所述针对Z6的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划 分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量小于10％、所述印记基因Z6的印记基因 拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z6的总表达量小于20％中的任意一种或至少两 种的组合；
I级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量为10-15％、所述印记基因Z6的印记基因 拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或所述印记基因Z6的总表达量为20-30％中的任意一种或至少 两种的组合；
II级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量为15-23％、所述印记基因Z6的印记基因 拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或所述印记基因Z6的总表达量为30-40％中的任意一种或至少 两种的组合；
III级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量为23-27％、所述印记基因Z6的印记基 因拷贝数异常表达量为3.5-5％或所述印记基因Z6的总表达量为40-50％中的任意一种或至少 两种的组合；
IV级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量大于27％、所述印记基因Z6的印记基因 拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z6的总表达量大于50％中的任意一种或至少两种 的组合。
优选地，所述针对Z8的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划 分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量小于16％、所述印记基因Z8的印记基因 拷贝数异常表达量小于5％或所述印记基因Z8的总表达量小于10％中的任意一种或至少两种 的组合；
I级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量为16-20％、所述印记基因Z8的印记基因 拷贝数异常表达量为5-10％或所述印记基因Z8的总表达量为10-20％中的任意一种或至少两 种的组合；
II级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量为20-30％、所述印记基因Z8的印记基因 拷贝数异常表达量为10-20％或所述印记基因Z8的总表达量为20-30％中的任意一种或至少两 种的组合；
III级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量为30-40％、所述印记基因Z8的印记基 因拷贝数异常表达量为20-30％或所述印记基因Z8的总表达量为30-40％中的任意一种或至少 两种的组合；
IV级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量大于40％、所述印记基因Z8的印记基因 拷贝数异常表达量大于30％或所述印记基因Z8的总表达量大于40％中的任意一种或至少两 种的组合。
优选地，所述针对Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达 量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13 的总表达量小于20％中的任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因 Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13 的总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为20-23％、所述印记基因 Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13 的总表达量为30-40％中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为23-27％、所述印记基因 Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为3.5-5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13的 总表达量为40-50％中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量大于27％、所述印记基因 Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13的总表达量大于50％中的任意一种或至少两种的组合；
本发明中，所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异 常表达量和总表达量是相互独立的。
第二方面，本发明提供了一种用于检测皮肤肿瘤良恶性程度的装置，包括如下单元：
(1)取样单元：获取待测样本；
(2)探针设计单元：根据印记基因序列设计特异性引物；
(3)检测单元：将步骤(2)的探针与待测样本进行原位杂交；
(4)分析单元：显微镜成像分析印记基因的表达情况；
其中，所述分析单元通过计算印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记 基因总表达量，通过第一方面所述的模型，从而通过印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数 异常表达量和印记基因总表达量的等级来判断皮肤肿瘤的良恶性程度。
本发明中，所述印记基因缺失为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色 标记的细胞核，所述印记基因拷贝数异常为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以 上红色/棕色标记的细胞核，所述拷贝数异常是由于癌细胞异常地进行基因复制，导致这个基 因表达时呈现为三倍体甚至更高的多倍体的情况。
本发明中，所述苏木素染色后的标记选自但不限于红色或棕色，用其他颜色进行染色标 记也可用于印记基因总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的计算。
本发明所述检测系统是用于细胞和组织水平下早期直观地观察皮肤肿瘤的印记(迹)基 因的变化从而判断肿瘤的良恶性及恶性程度，为早期皮肤肿瘤患者提供最有利的治疗机会。
根据本发明，步骤(1)所述的待测样本来自于人的组织和/或细胞。
本发明中，所述待测样本只要RNA经过及时固定的处理都是可行的，本领域技术人员可 以根据需要进行选择，在此不做特殊限定，本发明所述待测样本包括组织的石蜡切片、皮肤 穿刺活检样本中的任意一种或至少两种的组合。
所述组织的石蜡切片具体操作步骤为获取人体肿瘤组织样本，及时用10％中性福尔马林 固定，石蜡包埋，切成10μm厚，用带正电荷的玻片制成组织片子；因为只有10μm厚，因 此显微镜下看见的有一部分为不完整的细胞核，所以会出现部分假阴性的基因缺失。
所述皮肤穿刺活检样本具体操作步骤为通过穿刺获取人体细胞，及时用10％中性福尔马 林固定即可。
本发明中，由于穿刺活检对病人伤害小，取样过程简单，相较于血液的循环特性，穿刺 活检还能定位，穿刺活检作为实验样本有其特殊的优势。
优选地，所述待测样本为皮肤穿刺活检样本。
优选地，所述印记基因为Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z6为Plagl1，所述印记基因Z8为Dcn，所述印记基因Z10为Gatm，所述印记 基因Z11为Grb10，所述印记基因Z13为Sgce，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf。
本发明中，所述印记基因Z1(Gnas)，Z6(Plagl1)，Z8(Dcn)，Z10(Gatm)，Z11(Grb10)， Z13(Sgce)，Z16(Snrpn/Snurf)在正常肿瘤细胞组织内有不同程度的表达，在发生恶性病变时， 表达量和印记状态都会发生明显变化。
本发明中，所述设计探针是根据印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16，即Gnas，Plagl1，Dcn，Gatm，Grb10，Sgce和Snrpn/Snurf进行设计的，具体在每个基因的内旋子内选择一段序列作为探针，具体的探针由Advanced Cell Diagnostics公司设计。
优选地，所述原位杂交采用RNAscope原位杂交方法。
优选地，所述RNAscope原位杂交方法使用单通道或多通道的呈色试剂盒或者单通道或 多通道的荧光试剂盒，优选为单通道红色/棕色呈色试剂盒或多通道的荧光试剂盒。
本发明中，所述多通道呈色试剂盒或多通道荧光试剂盒包括两通道或两通道以上的呈色 试剂盒或荧光试剂盒，所述两通道的呈色试剂盒或多通道的荧光试剂盒可以使用两个印记基 因探针或印记基因和其他基因的联合表达甚至多个印记基因和非印记基因的综合表达。
根据本发明，所述模型中的计算印记基因总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷 贝数异常表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因总表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失基因表达量(LOI)＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常的基因表达量(CNV)＝d/(b+c+d)×100％；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的 细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存 在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基 因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记， 印记基因拷贝数异常的细胞核。
本发明中，所述苏木素染色后的标记选自但不限于红色或棕色，用其他颜色进行染色标 记也可用于印迹基因总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的计算。
本发明中，将探针通过原位杂交，和Hemotoxy(苏木精)细胞核染色扩增信号，在40× 或60×显微镜下，判断每一个细胞核内印记基因存在、印记基因缺失或拷贝数异常，通过计 算印记基因总表达量、印记基因缺失基因表达量和印记基因拷贝数异常的基因表达量来判定 该样本的肿瘤良恶性程度。由于切片仅为10微米，所以在显微镜下所见细胞核大约有20％ 为不完整细胞核，也就是说有部分假阴性的可能性存在。
根据本发明，所述印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量分成五 个不同的等级。
所述五个不同的等级为在样本每个探针表达最阳性的区域对至少1200个细胞进行计 数，针对Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的七个印记基因的印记基因缺失表达量、印 记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达量分别进行划分。
优选地，所述针对Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总 表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z1和Z16 的印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量小于25％中的 任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为25-35％ 中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为20-23％、所述印记基因Z1和 Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为35-45％ 中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为23-27％、所述印记基因Z1和 Z16的印记基因拷贝数异常表达量为3.5-5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为45-55％ 中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量大于27％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量大于55％中的任意一种或至少两种的组合；
本发明中，所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达 量和总表达量是相互独立的。
优选地，所述针对Z6的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划 分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量小于10％、所述印记基因Z6的印记基因 拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z6的总表达量小于20％中的任意一种或至少两 种的组合；
I级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量为10-15％、所述印记基因Z6的印记基因 拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或所述印记基因Z6的总表达量为20-30％中的任意一种或至少 两种的组合；
II级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量为15-23％、所述印记基因Z6的印记基因 拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或所述印记基因Z6的总表达量为30-40％中的任意一种或至少 两种的组合；
III级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量为23-27％、所述印记基因Z6的印记基 因拷贝数异常表达量为3.5-5％或所述印记基因Z6的总表达量为40-50％中的任意一种或至少 两种的组合；
IV级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量大于27％、所述印记基因Z6的印记基因 拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z6的总表达量大于50％中的任意一种或至少两种 的组合。
优选地，所述针对Z8的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划 分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量小于16％、所述印记基因Z8的印记基因 拷贝数异常表达量小于5％或所述印记基因Z8的总表达量小于10％中的任意一种或至少两种 的组合；
I级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量为16-20％、所述印记基因Z8的印记基因 拷贝数异常表达量为5-10％或所述印记基因Z8的总表达量为10-20％中的任意一种或至少两 种的组合；
II级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量为20-30％、所述印记基因Z8的印记基因 拷贝数异常表达量为10-20％或所述印记基因Z8的总表达量为20-30％中的任意一种或至少两 种的组合；
III级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量为30-40％、所述印记基因Z8的印记基 因拷贝数异常表达量为20-30％或所述印记基因Z8的总表达量为30-40％中的任意一种或至少 两种的组合；
IV级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量大于40％、所述印记基因Z8的印记基因 拷贝数异常表达量大于30％或所述印记基因Z8的总表达量大于40％中的任意一种或至少两 种的组合。
优选地，所述针对Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达 量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13 的总表达量小于20％中的任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因 Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13 的总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为20-23％、所述印记基因 Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13 的总表达量为30-40％中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为23-27％、所述印记基因 Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为3.5-5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13的 总表达量为40-50％中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量大于27％、所述印记基因 Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13的总表达量大于50％中的任意一种或至少两种的组合；
本发明中，所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异 常表达量和总表达量是相互独立的。
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度分为良性肿瘤、皮肤癌潜能、早期皮肤癌、中 期皮肤癌和晚期皮肤癌。
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级，或同时满足印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达 量为I级、印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基 因拷贝数异常表达量为I级和印记基因Z8的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达 量不同时为I级，则为良性肿瘤；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级，印记基因Z8的 印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均为I级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z6、 Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中 的任意一种情况，则判断为皮肤癌潜能；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z6、Z8、 Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，或印记基 因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III 级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷 贝数异常表达量为III级中的任意一种情况，则为早期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z6、Z8、 Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级，或印记 基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为 IV级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因 拷贝数异常表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级，或印记基因Z1、Z6、Z8、 Z10、Z11、Z13和Z16中至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚 期皮肤癌。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的模型或如第二方面所述的装置用于制备皮 肤癌检测和/或治疗的药物或试剂盒。
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度分为良性肿瘤、皮肤癌潜能、早期皮肤癌、中 期皮肤癌和晚期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级，或同时满足印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达 量为I级、印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基 因拷贝数异常表达量为I级和印记基因Z8的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达 量不同时为I级，则为良性肿瘤；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级，印记基因Z8的 印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均为I级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z6、 Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中 的任意一种情况，则判断为皮肤癌潜能；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z6、Z8、 Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，或印记基 因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III 级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷 贝数异常表达量为III级中的任意一种情况，则为早期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z6、Z8、 Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级，或印记 基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为 IV级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因 拷贝数异常表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级，或印记基因Z1、Z6、Z8、 Z10、Z11、Z13和Z16中至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚 期皮肤癌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述检测模型和系统，以直观的方法表现了印记缺失在皮肤肿瘤病人的样本 上的表现，通过对印记基因原位标记的方法，客观，直观，早期，精确地检测出印记(迹) 基因的变化，并可以提供量化的模型，为皮肤肿瘤的诊断做出巨大贡献；
(2)本发明检测装置，可以在皮肤肿瘤病人手术前通过穿刺活检得出皮肤肿瘤良恶性程 度的判断，从而为手术及精准治疗提供依据，这是细胞分子领域诊断皮肤肿瘤的革命性突破；
(3)本发明可以精确的判断皮肤肿瘤的类型，通过印记基因的组合检测对皮肤肿瘤的恶 性程度进行明确地分级，极大地提高了对皮肤癌的早期、明确诊断，特别是用在早期普查和 癌症术后随访，尤其是对于疑似复发病人的跟踪随访，可以争取时间，为挽救病人生命做出 重大贡献；
(4)本发明可以从分子层面精确地区分黑痣和原位黑色素瘤，为目前组织细胞形态学难 以区分黑痣和原位黑色素瘤的问题提供了解决方案，可以实现恶性黑色素瘤的早期、准确诊 断。
(5)本发明检测方法区别于免疫组化方法，减少了假阳性和其他负面作用，不仅如此， 通过发现的皮肤肿瘤相关印记基因缺失位点的致该基因沉默、剔除、重排的靶向药物或技术 方法，可用于指导后期的治疗和用药。
附图说明
图1是本发明苏木素染色细胞核的皮肤癌的病理切片，其中，所述a为将细胞进行苏木 素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达；所述b为将细胞进行苏木素染色后， 细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞 核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内 存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常；
图2(a)为0级皮肤肿瘤的病理切片中7个基因的表达状态，图2(b)为I级皮肤癌的病理切片中7个基因的表达状态，图2(c)为II级皮肤癌的病理切片中7个基因的表达状态，图2(d)为III级皮肤癌的病理切片中7个基因的表达状态，图2(e)为IV级皮肤癌的病理 切片中7个基因的表达状态；
图3(a)为印记基因Z1、Z8、Z11和Z16对皮肤癌的印记缺失的强度，图3(b)为印 记基因Z1、Z8、Z11和Z16对皮肤癌的拷贝数异常的强度，图3(c)为印记基因Z1、Z8、 Z11和Z16对皮肤癌的总表达量的强度，图3(d)为印记基因Z6、Z10和Z13对皮肤癌的印 记缺失的强度，图3(e)为印记基因Z6、Z10和Z13对皮肤癌的拷贝数异常的强度，图3(f) 为印记基因Z6、Z10和Z13对皮肤癌的总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表 达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为印记基因总表达量；
图4(a)为印记基因Z1印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图4(b)为印记基因Z8印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图4(c)为印记基因Z11印记缺失、拷贝 数异常和总表达量的强度，图4(d)为印记基因Z16印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强 度，图4(e)为印记基因Z6印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图4(f)为印记基 因Z10印记缺失、拷贝数异常和总表达量的强度，图4(g)为印记基因Z13印记缺失、拷贝 数异常和总表达量的强度，其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数 异常的基因表达量，TE为印记基因总表达量；
图5(a)为印记基因Z1应用于47例皮肤癌病理切片中，印记缺失、拷贝数异常和总表 达量的分布范围和分级标准，图5(b)为印记基因Z8应用于47例皮肤癌病理切片中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，图5(c)为印记基因Z11应用于47 例皮肤癌病理切片中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，图5(d) 为印记基因Z16应用于47例皮肤癌病理切片中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，图5(e)为印记基因Z6应用于47例皮肤癌病理切片中，印记缺失、拷贝数 异常和总表达量的分布范围和分级标准，图5(f)为印记基因Z10应用于47例皮肤癌病理 切片中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准，图5(g)为印记基因Z13 应用于47例皮肤癌病理切片中，印记缺失、拷贝数异常和总表达量的分布范围和分级标准， 其中，LOI为印记基因缺失基因表达量，CNV为印记基因拷贝数异常的基因表达量，TE为 印记基因总表达量。
图6(a)为印记基因Z1和Z8在良性黑痣、原位黑色素瘤和恶性黑色素瘤中的印记缺失 表达量，图6(b)为印记基因Z1和Z8在良性黑痣、原位黑色素瘤和恶性黑色素瘤中的拷贝数异常表达量。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式 来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1皮肤癌的印记基因分析
所述的印记基因的检测方法，包括如下步骤：
(1)获取皮肤癌的组织细胞切片(10微米)，放入10％中性福尔马林溶液中进行固定， 以防RNA降解，固定时间为24小时，石蜡包埋(FFPE)，所述玻片需要用正电荷脱载玻片，所述切片在40℃烤箱烘烤3h以上；
(2)按照RNASCope的样品处理方法进行脱蜡处理，封闭样本中内源性过氧化物酶活 性，增强通透性并暴露出RNA分子；
(3)设计探针：根据印记基因序列设计特异性引物；
所述设计探针是根据印记基因Z1(Gnas)、Z6(Plagl1)、Z8(Dcn)、Z10(Gatm)、Z11(Grb10)、 Z13(Sgce)和Z16(Snrpn/Snurf)进行设计的，具体在每个基因的内旋子内选择一段序列作为 探针，具体的探针由Advanced Cell Diagnostics公司设计；
(4)将步骤(3)的探针与待测样本通过试剂盒进行RNASCope原位杂交；
(5)信号扩增和苏木精染色，用显微镜成像分析印记基因的表达情况；
所述模型中的计算印记基因总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达 量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因总表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失基因表达量(LOI)＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常的基因表达量(CNV)＝d/(b+c+d)×100％；
其中，a、b、c、d如图1所示，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核。
从图2(a)-图2(e)可以看出，从0级到IV级的样本中，印记缺失(细胞核内有两个信号点)和拷贝数异常(细胞核内有三个或以上信号点)的细胞比例随恶性程度的增加而逐渐增加。
实施例2皮肤穿刺活检样本的印记基因分析
所述皮肤穿刺活检样本是，通过穿刺取出可疑病变组织，10％中性福尔马林溶液固定24h 以上，其他检测方法同实施例1。
从图3(a)-图3(f)可以看出，Z1，Z6，Z8，Z10，Z11，Z13，Z16每个基因对皮肤癌 的反应敏感性或者说对应于皮肤癌表达的印记缺失的强度和状态是不同的。
具体每个印记基因对皮肤癌的敏感度如图4(a)-图4(g)，从图4(a)-图4(d)看出，印记基因Z1的印记缺失在恶性潜能阶段开始出现，随皮肤癌的发展而逐渐上升到较高水平， 印记基因的拷贝数异常在在恶性潜能阶段开始出现，随皮肤癌的发展在中期皮肤癌中上升到 很高的水平，并在晚期皮肤癌中继续维持，印记基因Z1的表达量增加在早期和中期皮肤癌中 逐渐上升到较高的水平，并在晚期皮肤癌中维持稳定；印记基因Z8的印记缺失在恶性潜能阶 段快速上升，但是在早期皮肤癌到晚期皮肤癌的发展过程中不再继续增加，印记基因Z8的拷 贝数异常在恶性潜能阶段开始出现，在早期皮肤癌中快速上升到很高水平，在中期到晚期皮 肤癌中继续缓慢上升，印记基因Z8的表达量增加在早期皮肤癌和中期皮肤癌中快速上升，在 晚期皮肤癌阶段维持稳定；印记基因Z11的印记缺失在恶性潜能阶段开始出现，在早期皮肤 癌阶段上升不明显，在中期和晚期皮肤癌阶段上升到较高水平，印记基因Z11的拷贝数异常 在恶性潜能阶段开始出现，随皮肤癌的发展而逐渐上升到很高水平，印记基因Z11的表达量 增加在恶性潜能阶段开始出现，但是在皮肤癌发展过程中没有明显上升；印记基因Z16的印 记缺失和拷贝数异常在恶性潜能阶段到早期皮肤癌阶段迅速上升到很高水平，并在中晚期皮 肤癌中继续维持，印记基因Z16的表达量增加在恶性潜能阶段就迅速上升到很高水平，在皮 肤癌继续发展的过程中继续维持；
从图4(e)-图4(g)看出，印记基因Z6的印记缺失在早期和中期皮肤癌中迅速上升到 较高水平，并在晚期皮肤癌中维持不变，印记基因Z6的拷贝数异常在皮肤癌潜能阶段开始出 现，在早期皮肤癌阶段迅速上升到较高水平，并在中期和晚期皮肤癌阶段维持稳定，印记基 因Z6的表达量增加在早期皮肤癌阶段出现上升，但是在中晚期皮肤癌中上升不明显；印记基 因Z10的印记缺失在恶性潜能阶段出现上升，但是在早期到晚期皮肤癌的发展过程中没有明 显上升，印记基因Z10的拷贝数异常在恶性潜能和早期皮肤癌阶段迅速上升到较高水平，并 在中晚期皮肤癌中继续维持，印记基因Z10的表达量增加在早期皮肤癌阶段出现，但是在中 晚期皮肤癌中上升不明显；印记基因Z13的印记缺失和表达量增加在恶性潜能和早期皮肤癌 阶段没有明显上升，在中期皮肤癌阶段出现一定的上升，到晚期皮肤癌中维持稳定，印记基 因Z13的拷贝数异常在恶性潜能和早期皮肤癌阶段没有明显上升，在中期和晚期皮肤癌阶段 逐渐上升到较高水平。
实施例3 47例皮肤肿瘤样本的印记基因分析
获取47例皮肤癌病人的组织包括皮肤穿刺活检样本(10微米)，检测方法同实施例1。
从图5(a)-图5(g)可以看出，47例皮肤肿瘤组织样本中Z1，Z6，Z8，Z10，Z11， Z13和Z16七个探针的印记缺失、拷贝数异常和总表达量的比例呈现从低到高的分布，根据 不同探针的分布趋势，我们计算得到了图中虚线所示的分级标准，可以将每个探针的印记缺失、拷贝数异常和总表达量分别从低到高分成5个等级。
具体的分级如下：
从图5(a)可以看出，对于所述印记基因Z1，印记基因缺失表达量小于15％印记基因拷 贝数异常表达量小于1.5％或印记基因总表达量小于25％中的任意一种或至少两种的组合为0 级，印记基因缺失表达量为15-20％、印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或印记基因总表 达量为25-35％中的任意一种或至少两种的组合为I级，印记基因缺失表达量为20-23％、印 记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或印记基因总表达量为35-45％中的任意一种或至少两种 的组合为II级，印记基因缺失表达量为23-27％、印记基因拷贝数异常表达量为3.5-5％或印 记基因总表达量为45-55％中的任意一种或至少两种的组合为III级，印记基因缺失表达量大 于27％、印记基因拷贝数异常表达量大于5％或印记基因总表达量大于55％中的任意一种或 至少两种的组合为IV级；
从图5(b)可以看出，对于所述印记基因Z8，印记基因缺失表达量小于16％、印记基因拷贝数异常表达量小于5％或印记基因总表达量小于10％中的任意一种或至少两种的组合 为0级，印记基因缺失表达量为16-20％、印记基因拷贝数异常表达量为5-10％或印记基因总 表达量为10-20％中的任意一种或至少两种的组合为I级，印记基因缺失表达量为20-30％、 印记基因拷贝数异常表达量为10-20％或印记基因总表达量为20-30％中的任意一种或至少两 种的组合为II级，印记基因缺失表达量为30-40％、印记基因拷贝数异常表达量为20-30％或 印记基因总表达量为30-40％中的任意一种或至少两种的组合为III级，印记基因缺失表达量 大于40％、印记基因拷贝数异常表达量大于30％或印记基因总表达量大于40％中的任意一种 或至少两种的组合为IV级；
从图5(c)可以看出，对于所述印记基因Z11，印记基因缺失表达量小于10％、印记基 因拷贝数异常表达量小于1.5％或印记基因总表达量小于20％中的任意一种或至少两种的组 合为0级，印记基因缺失表达量为10-15％、印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或印记基 因总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合为I级，印记基因缺失表达量为 15-23％、印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或印记基因总表达量为30-40％中的任意一种 或至少两种的组合为II级，印记基因缺失表达量为23-27％、印记基因拷贝数异常表达量为 3.5-5％或印记基因总表达量为40-50％中的任意一种或至少两种的组合为III级，印记基因缺 失表达量大于27％、印记基因拷贝数异常表达量大于5％或印记基因总表达量大于50％中的 任意一种或至少两种的组合为IV级；
从图5(d)可以看出，对于所述印记基因Z16，印记基因缺失表达量小于15％、印记基 因拷贝数异常表达量小于1.5％或印记基因总表达量小于25％中的任意一种或至少两种的组 合为0级，印记基因缺失表达量为15-20％、印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或印记基 因总表达量为25-35％中的任意一种或至少两种的组合为I级，印记基因缺失表达量为 20-23％、印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或印记基因总表达量为35-45％中的任意一种 或至少两种的组合为II级，印记基因缺失表达量为23-27％、印记基因拷贝数异常表达量为 3.5-5％或印记基因总表达量为45-55％中的任意一种或至少两种的组合为III级，印记基因缺 失表达量大于27％、印记基因拷贝数异常表达量大于5％或印记基因总表达量大于55％中的 任意一种或至少两种的组合为IV级；
从图5(e)可以看出，对于所述印记基因Z6，印记基因缺失表达量小于10％、印记基因 拷贝数异常表达量小于1.5％或印记基因总表达量小于20％中的任意一种或至少两种的组合 为0级，印记基因缺失表达量为10-15％、印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或印记基因 总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合为I级，印记基因缺失表达量为15-23％、 印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或印记基因总表达量为30-40％中的任意一种或至少两 种的组合为II级，印记基因缺失表达量为23-27％、印记基因拷贝数异常表达量为3.5-5％或 印记基因总表达量为40-50％中的任意一种或至少两种的组合为III级，印记基因缺失表达量 大于27％、印记基因拷贝数异常表达量大于5％或印记基因总表达量大于50％中的任意一种 或至少两种的组合为IV级；
从图5(f)可以看出，对于所述印记基因Z10，印记基因缺失表达量小于10％、印记基 因拷贝数异常表达量小于1.5％或印记基因总表达量小于20％中的任意一种或至少两种的组 合为0级，印记基因缺失表达量为10-15％、印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或印记基 因总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合为I级，印记基因缺失表达量为 15-23％、印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或印记基因总表达量为30-40％中的任意一种 或至少两种的组合为II级，印记基因缺失表达量为23-27％、印记基因拷贝数异常表达量为 3.5-5％或印记基因总表达量为40-50％中的任意一种或至少两种的组合为III级，印记基因缺 失表达量大于27％、印记基因拷贝数异常表达量大于5％或印记基因总表达量大于50％中的 任意一种或至少两种的组合为IV级；
从图5(g)可以看出，对于所述印记基因Z13，印记基因缺失表达量小于10％、印记基 因拷贝数异常表达量小于1.5％或印记基因总表达量小于20％中的任意一种或至少两种的组 合为0级，印记基因缺失表达量为10-15％、印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或印记基 因总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合为I级，印记基因缺失表达量为 15-23％、印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或印记基因总表达量为30-40％中的任意一种 或至少两种的组合为II级，印记基因缺失表达量为23-27％、印记基因拷贝数异常表达量为 3.5-5％或印记基因总表达量为40-50％中的任意一种或至少两种的组合为III级，印记基因缺 失表达量大于27％、印记基因拷贝数异常表达量大于5％或印记基因总表达量大于50％中的 任意一种或至少两种的组合为IV级；
从这47例皮肤癌肿瘤的样本综合分析可以得出：
所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度分为良性肿瘤、皮肤癌潜能、早期皮肤癌、中期皮肤癌 和晚期皮肤癌；
所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级，或同时满足印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级、印 记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异 常表达量为I级和印记基因Z8的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量不同时为 I级，则为良性肿瘤；
所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、 Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级，印记基因Z8的印记基 因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均为I级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、 Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z6、Z8、 Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中的任 意一种情况，则判断为皮肤癌潜能；
所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、 Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，或印记基因Z1、Z6、 Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III级且印记基 因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表 达量为III级中的任意一种情况，则为早期皮肤癌；
所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、 Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级，或印记基因Z1、Z6、 Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级且印记基 因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表 达量为IV级中的任意一种情况，则为中期皮肤癌；
所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、 Z13和Z16中至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期皮肤癌。
实施例4 18例黑痣和黑色素瘤样本的印记基因分析
获取18例黑痣和黑色素瘤病人的组织包括皮肤穿刺活检样本(10微米)，检测方法同实 施例1。
从图6(a)-图6(b)可以看出，良性黑痣中印记基因Z1和Z8的印记缺失和拷贝数异常都处于很低的水平，原位黑色素瘤中印记基因Z1的印记缺失和拷贝数异常增加不明显，但 是印记基因Z8的印记缺失和拷贝数异常有显著增加，恶性黑色素瘤中印记基因Z1和Z8的 印记缺失和拷贝数异常都达到很高的水平。因此印记基因Z8可以更敏感地对原位黑色素瘤进 行早期检测。
综上所述，本发明所述检测模型和系统，以直观的方法表现了印记缺失在皮肤肿瘤病人 的样本上的表现，通过对印记基因原位标记的方法，客观，直观，早期，精确地检测出印记 (迹)基因的变化，并可以提供量化的模型，为皮肤肿瘤的诊断做出巨大贡献。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上 述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员 应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体 方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于皮肤肿瘤的印记基因分级模型，其特征在于，所述模型通过计算印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因的总表达量在皮肤肿瘤中的变化对印记基因的表达状态进行分级；
其中，所述印记基因为Z1、Z8、Z11或Z16中的任意一个或至少两个的组合，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z8为Dcn，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf。
2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于，所述模型计算印记基因的方法如下：
计算Z1、Z8、Z11或Z16中的任意一个，优选为Z1、Z8或Z11中的任意一个，进一步优选为Z1或Z8；
优选地，所述模型计算印记基因的方法为：计算Z1、Z8、Z11或Z16中的任意两个，优选为Z1和Z8的组合，Z8和Z11的组合。
3.根据权利要求1或2所述的模型，其特征在于，所述印记基因还包括Z6、Z10或Z13中的任意一个或至少两个的组合；其中，所述印记基因Z6为Plagl1，所述印记基因Z10为Gatm，所述印记基因Z13为Sgce；
优选地，所述模型计算印记基因的方法为：计算印记基因的组合，计算Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的七个印记基因的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的模型，其特征在于，所述计算印记基因的总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因总表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失基因表达量＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常的基因表达量＝d/(b+c+d)×100％；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的模型，其特征在于，所述印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达量分成五个不同的等级；
优选地，所述五个不同的等级为针对Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的七个印记基因的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达量分别进行划分的五个不同的等级；
优选地，所述针对Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量小于25％中的任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为25-35％中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为20-23％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为35-45％中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为23-27％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为3.5-5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为45-55％中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量大于27％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量大于55％中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述针对Z6的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量小于10％、所述印记基因Z6的印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z6的总表达量小于20％中的任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量为10-15％、所述印记基因Z6的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或所述印记基因Z6的总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量为15-23％、所述印记基因Z6的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或所述印记基因Z6的总表达量为30-40％中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量为23-27％、所述印记基因Z6的印记基因拷贝数异常表达量为3.5-5％或所述印记基因Z6的总表达量为40-50％中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z6的印记基因缺失表达量大于27％、所述印记基因Z6的印记基因拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z6的总表达量大于50％中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述针对Z8的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量小于16％、所述印记基因Z8的印记基因拷贝数异常表达量小于5％或所述印记基因Z8的总表达量小于10％中的任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量为16-20％、所述印记基因Z8的印记基因拷贝数异常表达量为5-10％或所述印记基因Z8的总表达量为10-20％中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量为20-30％、所述印记基因Z8的印记基因拷贝数异常表达量为10-20％或所述印记基因Z8的总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量为30-40％、所述印记基因Z8的印记基因拷贝数异常表达量为20-30％或所述印记基因Z8的总表达量为30-40％中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z8的印记基因缺失表达量大于40％、所述印记基因Z8的印记基因拷贝数异常表达量大于30％或所述印记基因Z8的总表达量大于40％中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述针对Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量小于15％、所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量小于1.5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13的总表达量小于20％中的任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为1.5-2.5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13的总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为20-23％、所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为2.5-3.5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13的总表达量为30-40％中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为23-27％、所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为3.5-5％和或所述印记基因Z10、Z11和Z13的总表达量为40-50％中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量大于27％、所述印记基因Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z10、Z11和Z13的总表达量大于50％中的任意一种或至少两种的组合。
6.一种用于检测皮肤肿瘤良恶性程度的装置，其特征在于，包括如下单元：
(1)取样单元：获取待测样本；
(2)探针设计单元：根据印记基因序列设计特异性引物；
(3)检测单元：将步骤(2)的探针与待测样本进行原位杂交；
(4)分析单元：显微镜成像分析印记基因的表达情况；
其中，所述分析单元通过计算印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量，通过权利要求1-5中任一项所述的模型，从而通过印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的等级来判断皮肤肿瘤的良恶性程度。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，步骤(1)所述的待测样本来自于人的组织和/或细胞；
优选地，所述待测样本为皮肤穿刺活检样本；
优选地，所述原位杂交采用RNAscope原位杂交方法；
优选地，所述RNAscope原位杂交方法使用单通道或多通道的呈色试剂盒或者单通道或多通道的荧光试剂盒，优选为单通道红色/棕色呈色试剂盒或多通道的荧光试剂盒。
8.根据权利要求6或7所述的装置，其特征在于，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度分为良性肿瘤、皮肤癌潜能、早期皮肤癌、中期皮肤癌和晚期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级，或同时满足印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级、印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级和印记基因Z8的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量不同时为I级，则为良性肿瘤；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级，印记基因Z8的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均为I级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中的任意一种情况，则判断为皮肤癌潜能；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级中的任意一种情况，则为早期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级，则为晚期皮肤癌。
9.一种如权利要求1-5中任一项所述的模型和/或如权利要求6-8中任一项所述的装置用于制备皮肤肿瘤检测和/或治疗的药物或试剂盒。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度分为良性肿瘤、皮肤癌潜能、早期皮肤癌、中期皮肤癌和晚期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均小于I级，或同时满足印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为I级、印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级和印记基因Z8的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量不同时为I级，则为良性肿瘤；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为I级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为I级，印记基因Z8的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量均为I级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为II级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级中的任意一种情况，则判断为皮肤癌潜能；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为II级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为II级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为III级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级中的任意一种情况，则为早期皮肤癌；
优选地，所述判断皮肤肿瘤的良恶性程度的结果为印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的至少2个印记基因的印记基因缺失表达量为III级，印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的至少2个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为III级，或印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中不超过1个印记基因的印记基因缺失表达量为IV级且印记基因Z1、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16中的不超过1个印记基因的印记基因拷贝数异常表达量为IV级中的任意一种情况，则为中期皮肤癌；
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