CN111471725A - 一种脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种脂肪酶在含水有机相中催化4‑羟基香豆素，丙二腈/氰基乙酸乙酯，芳香醛/杂环醛/脂肪醛进行级联反应合成色烯类化合物的方法。本发明提供一种以脂肪酶TLIM为催化剂，以芳香醛/杂环醛/脂肪醛，丙二腈/氰基乙酸乙酯，4‑羟基香豆素为底物经过级联反应制备色烯类化合物的方法，该方法可在含水有机相中进行，反应条件温和，催化剂用量少且可回收，产物收率高。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种脂肪酶在含水有机溶剂中催化芳香醛/杂环醛/脂肪醛，丙二腈/氰基乙酸乙酯与4-羟基香豆素发生三组分级联反应，合成色烯类化合物的方法。
背景技术
色烯类化合物因其具有广泛的生理和药理活性，受到了广大研究者的关注。它可抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶的活性，用于治疗神经退行性疾病如帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，亨廷顿氏病等；它可用作黄嘌呤氧化酶的抑制剂，有利于降低痛风，高尿酸血症，慢性肾脏病，高血压，动脉粥样硬化等疾病的风险；它有显著的细胞毒性和抗酪氨酸酶活性，用于治疗白化病。色烯类化合物通常以醛，活性亚甲基化合物和各种可烯醇化的C-H活化酸性化合物为底物通过级联反应获得。近年来发展的新的催化剂有超声辐射下的IL@CNTs(来自ACS Sustainable Chemistry&Engineering，2018,6(3):3714-3722)，[DMAP-PEG1000-DIL][BF4](来自Journal of Molecular Liquids.，2015,212:418-422)，Fe3O4@SiO2-guanidine-PAA(来自Materials Chemistry and Physics.，2019,228:140-146)，Fe3O4@SiO2-imid-PMAn(来自RSC Advances，2015,5(34):26625-26633)，{[HMIM]C(CN)3}NMS(来自Journal of Molecular Liquids，2016,221:851-859)，H5BW12O40(来自AppliedOrganometallic Chemistry.，2018,32(9):e4479)，CTMAB-bentonite(来自Applied ClayScience.，2014,95:55-59)，Ru@imine-Z(来自Canadian Journal of Chemistry.，2014,92(11):1086-1091)等。尽管已报道的催化剂有它们各自的优势，还是存在一些问题，比如：使用昂贵或难以制备的催化剂，需要较高的反应温度，底物范围较窄，有时只能获得中等收率的目标产物等。
酶作为一种特殊的生物催化剂，具有专一性、高效性、反应条件温和、环境友好、催化活性可调控等特点，已在化工、医药、食品、和环境治理等众多领域得到广泛应用。近年来，酶在有机合成中发挥了越来越重要的作用，在Aldol缩合，Mannich反应，Henry反应，Knoevenagel缩合，Michael加成，Baylis-Hillman反应等重要的C-C键形成的反应中的应用被相继报道。脂肪酶TLIM被用于在35℃无水正己烷中催化芳香醛和1，3-环己二酮或达米酮的Knoevenagel缩合-Michael加成级联反应，生成氧杂蒽酮类化合物；脂肪酶RMIM被用于45℃的纯水相中催化芳香醛和4-羟基香豆素的Knoevenagel缩合-Michael加成级联反应，生成双香豆素类化合物。脂肪酶TLIM被用于纯水相中催化不同取代基的吲哚和醛的反应。脂肪酶PPL被用于含水乙醇中催化1，3-环己二酮/达米酮、丙二腈/氰基乙酸乙酯和醛的三组分级联反应，当底物为氰乙酸乙酯时，只可获得中等收率的目标产物。目前，没有文献报道过脂肪酶催化4-羟基香豆素、丙二腈/氰基乙酸乙酯和醛的三组分级联反应。
现有技术中4-羟基香豆素，芳香醛/杂环醛/脂肪醛，与丙二腈/氰基乙酸乙酯的级联反应基本都以化学催化的方法进行，尚无文献报道酶法催化合成色烯类化合物。
发明内容
本发明解决的技术问题是：本发明提供一种以脂肪酶TLIM为催化剂，以4-羟基香豆素，芳香醛/杂环醛/脂肪醛，丙二腈(产物收率75-99％)/氰基乙酸乙酯(产物收率85-93％)为底物经过级联反应制备色烯类化合物的方法，该方法可在含水有机溶剂中进行，反应条件温和，催化剂用量少(45mg/mmol醛)且可回收，产物收率高。
为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：
本发明的有益效果
(1)提供了产物的新的合成方法。以脂肪酶TLIM为催化剂，可在含水有机溶剂中催化，提供了反应条件温和，操作简单，生产成本低，产率高，副产物少，底物适用范围广，对环境污染小，催化剂用量少且可回收的色烯类化合物合成方法。
(2)发掘了脂肪酶TLIM的新用途，特别是以4-羟基香豆素，丙二腈/氰基乙酸乙酯和芳香醛/杂环醛/脂肪醛为底物的级联反应。
(3)本发明所述的方法，产物收率为75～99％，相对于其他合成方法，具备较强的竞争优势。
(4)脂肪酶可重复使用，重复使用5次后仍具有较高的催化活性(脂肪酶TLIM重复使用5次后，产物收率仍可达84％)。
(5)脂肪酶PPL被用于含水乙醇中催化4-羟基香豆素、丙二腈/氰基乙酸乙酯和醛的三组分级联反应时，只可获得11％收率的目标产物，即使反应类型类似，底物不一样时，脂肪酶的催化效果也不一样；脂肪酶RMIM被用于纯水中催化4-羟基香豆素、丙二腈/氰基乙酸乙酯和醛的三组分级联反应时，只可获得35％收率的目标产物；即使反应体系中部分底物相同，脂肪酶的催化效果也不一样。
附图说明
下面结合附图对本发明的作进一步说明。
图1是实施例1制得的
2-amino-4-(4-chlorophenyl)-5-oxo-4H,5H-pyrano[3,2-c]chromene-3-carbonitrile核磁共振氢谱图。
图2是实施例2制得的
2-amino-5-oxo-4-(p-tolyl)-4H,5H-pyrano[3,2-c]chromene-3-carbonitrile核磁共振氢谱图。
图3是实施例3制得的
2-amino-5-oxo-4-(thiophen-2-yl)-4H,5H-pyrano[3,2-c]chromene-3-carbonitrile核磁共振氢谱图。
图4是实施例6制得的
2-amino-4-propyl-4H,5H-pyrano[3,2-c]chromene-3-carbonitrile核磁共振氢谱图。
图5是实施例4制得的Ethyl
2-amino-5-oxo-4-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-4H,5H-pyrano[3,2-c]chromene-3-carboxylate核磁共振氢谱图。
图6是实施例5制得的Ethyl
2-amino-5-oxo-4-(p-tolyl)-4H,5H-pyrano[3,2-c]chromene-3-carboxylate核磁共振氢谱图。
图7是实施例10制得的Ethyl 2-amino-5-oxo-4-(thiophen-2-yl)-4H,
5H-pyrano[3,2-c]chromene-3-carboxylate核磁共振氢谱图。
图8是脂肪酶TLIM的重复使用情况
具体实施方式
本发明所涉及的生物酶及其他试剂均为市场购买，其中试剂均未进一步纯化；核磁共振氢谱(1HNMR)用Bruker Advance 2B 300核磁共振波谱仪进行测定，频率为300MHz，溶剂为氘代二甲基亚砜，内标为四甲基硅(TMS)。
实施例1：
将1mmol4-氯苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和2mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。24h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为99％，m p 260℃-261℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.95–7.86(m,1H),7.76–7.68(m,1H),7.59–7.44(m,2H),7.44(d,J＝6.2Hz,2H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H),7.30(d,J＝8.5Hz,2H),4.49(s,1H).HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C19H11ClN2O3[M+Na]+:350.0401,found350.0404.
实施例2：
将1mmol4-甲基苯甲醛和1mmol 4-羟基香豆素和3mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入100mg脂肪酶TLIM，5mL含水50％的二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。35h后，粗品加二甲基亚砜溶解，离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为90％，mp251℃-253℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.89(d,J＝7.7Hz,2H),7.58(t,J＝7.3Hz,2H),7.39–7.27(m,4H),7.02(s,2H),6.30(s,1H),2.24(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ165.4,164.7,155.2,152.2,137.0,134.2,131.6,128.5,126.54,123.8,123.5,118.2,115.8,104.1,102.5,62.6.HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C20H14N2O3[M+Na]+:330.1005,found 330.1002.
实施例3：
将2mmol2-噻吩苯甲醛，2mmol 4-羟基香豆素和1mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入10mg脂肪酶TLIM，5mL含水5％的二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。72h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为93％，m p 214℃-215℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.88(d,J＝7.8Hz,1H),7.72(t,J＝7.8Hz,1H),7.48(d,J＝8.6Hz,4H),7.39(d,J＝4.9Hz,1H),7.02(s,1H),6.98–6.93(m,1H),4.82(s,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ159.4,158.4,153.0,152.0,147.4,133.1,131.4,127.0,125.1,124.7,122.4,119.0,116.6,112.8,104.0,57.8,31.9.HRMS(EI-TOF):m/zCalcd.for C17H10N2O3S[M+Na]+:322.0321,found 322.0319.
实施例4：
将1mmol丁醛，1mmol 4-羟基香豆素和4mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入40mg脂肪酶TLIM，5mL二甲基亚砜，65℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。50h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为淡黄色固体，收率为75％，m p 244℃-245℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(t,J＝7.8Hz,1H),7.46(t,J＝7.7Hz,2H),7.28(s,2H),3.48–3.38(m,1H),1.71(tt,J＝10.9,5.4Hz,1H),1.54(td,J＝13.7,12.3,4.8Hz,1H),1.25(ddt,J＝18.6,13.1,6.7Hz,2H),0.86(t,J＝7.2Hz,3H).13CNMR(75MHz,DMSO-d6)δ159.9,159.4,154.0,152.0,132.6,124.5,122.1,119.6,116.5,112.9,104.3,55.2,36.2,30.7,17.6,13.8.HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C16H14N2O3[M+Na]+:282.1007,found 282.1003.
实施例5：
将1mmol4-三氟甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和1mmol氰基乙酸乙酯，加入10mL反应瓶中，然后加入45mgTLIM，5mL含水50％的二甲基亚砜，55℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。72h后，反应液中加二甲基亚砜，溶解粗品，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为98％，m p 208℃-210℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.87(d,J＝7.8Hz,2H),7.63–7.51(m,4H),7.36(d,J＝6.9Hz,3H),7.33–7.22(m,3H),6.37(s,1H),5.12(s,3H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ169.2,161.8,160.3,156.7,153.6,144.0,132.2,129.7,127.0,125.5,125.5,125.4,125.4,123.3,116.8,110.0,107.4,80.7,59.4,32.7,14.2.HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C22H16F3NO5[M+Na]+:431.0913,found431.0909.
实施例6：
将1mmol4-甲基苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和1mmol氰基乙酸乙酯，加入10mL反应瓶中，然后加入150mg脂肪酶TLIM，5mL含水20％的二甲基亚砜，35℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。20h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为98％，m p118℃-119℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.47(s,3H),7.90(d,J＝7.8Hz,2H),7.59(t,J＝7.7Hz,2H),7.45–7.21(m,4H),7.03(s,4H),6.31(s,1H),2.24(s,3H).HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C22H19NO5[M+Na]+:377.1212,found 377.1207.
实施例7：
将1mmol 2-噻吩醛，1mmol 4-羟基香豆素和2mmol氰基乙酸乙酯，加入10mL反应瓶中，然后加入150mg脂肪酶人TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，25℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。30h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为棕色固体，收率为92％，m p 224℃-225℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.85(s,3H),7.89(d,J＝7.8Hz,2H),7.57(t,J＝8.2Hz,2H),7.38–7.26(m,4H),7.21(d,J＝5.0Hz,1H),6.93–6.75(m,1H),6.67(d,J＝3.1Hz,1H),6.47(s,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ169.1,162.6,157.5,156.6,153.6,144.7,132.2,130.4,127.0,126.0,123.9,123.3,116.8,110.0,104.9,83.6,59.4,36.8,14.2.HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C19H15NO5S[M+Na]+:369.0613,found 369.0611.
实施例8：
将1mmol4-硝基苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和3mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入20mg脂肪酶TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，40℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。30h后，加二甲基亚砜溶解粗品，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为黄色固体，收率为95％，m p 258℃-260℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.18(d,J＝8.4Hz,2H),7.92(d,J＝7.7Hz,1H),7.73(t,J＝7.7Hz,1H),7.60(d,J＝8.5Hz,2H),7.49(dd,J＝15.8,7.6Hz,4H),4.68(s,1H).HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C19H11N3O5[M+Na]+:361.0709,found 361.0711.
实施例9：
将1mmol4-氰基苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和4mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入100mgTLIM，5mL含水30％的二甲基亚砜，25℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。12h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为黄色固体，收率为82％，m p289℃-290℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.91(d,J＝7.7Hz,1H),7.78(d,J＝8.0Hz,2H),7.71(d,J＝7.5Hz,1H),7.59–7.41(m,6H),4.60(s,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ159.5,158.0,153.9,152.2,148.7,133.0,132.4,128.8,124.6,122.5,118.8,118.6,116.5,112.9,109.9,104.1,56.9,37.0.HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C20H11N3O3[M+Na]+:341.0812,found 341.0811.
实施例10：
将1mmol4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和1mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入60mg脂肪酶TLIM，5mL含水30％的二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。72h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为93％，m p252℃-253℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.89(d,J＝7.7Hz,1H),7.71(t,J＝7.5Hz,1H),7.55–7.42(m,2H),7.30(s,2H),6.81(s,1H),6.70(d,J＝8.1Hz,1H),6.61(d,J＝9.2Hz,1H),4.36(s,1H),3.73(s,3H),3.30(s,1H).HRMS(EI-TOF):m/zCalcd.for C20H14N2O5[M+Na]+:362,0909,found 362.0910.
实施例11：
将1mmol4-甲氧基苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和2.5mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入45mg脂肪酶TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，65℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。18h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为90％，m p 240℃-241℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.91–7.87(m,2H),7.62–7.53(m,2H),7.37(s,2H),7.05(d,J＝8.4Hz,2H),6.78(d,J＝8.7Hz,2H),6.28(s,1H),3.70(s,3H).HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C20H14N2O4[M+Na]+:346.1005,found 346.1001.
实施例12：
将1mmol4-羟基苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和1mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入5mg脂肪酶TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。24h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为99％，m p 260℃-261℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.33(s,1H),7.89(d,J＝7.8Hz,1H),7.70(t,J＝7.8Hz,1H),7.56–7.40(m,2H),7.31(s,2H),7.04(d,J＝8.0Hz,2H),6.69(d,J＝7.9Hz,2H),4.33(s,1H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ159.4,157.8,156.4,152.9,152.0,133.6,132.7,128.6,124.6,122.3,119.2,116.5,115.1,113.0,104.5,58.4,36.1.HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C19H12N2O4[M+Na]+:332.0811,found332.0880.
实施例13：
将1mmol4-叔丁基苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和1mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入25mg脂肪酶TLIM，5mL含水50％的二甲基亚砜，65℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。72h后，将反应液离心，沉淀加二甲基亚砜洗，过滤，滤渣为脂肪酶，可回收利用，滤液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为95％，m p 262℃-263℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.89(d,J＝7.7Hz,2H),7.58(t,J＝7.5Hz,1H),7.39–7.28(m,4H),7.23(d,J＝8.2Hz,1H),7.05(d,J＝8.1Hz,2H),6.30(s,1H),1.24(s,9H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ161.8,159.2,157.1,153.6,150.7,140.1,132.2,129.4,127.0,126.6,123.3,119.4,116.8,110.0,107.7,57.6,39.5,34.5,31.1.HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C23H20N2O3[M+Na]+:372.1405,found372.1407.
实施例14：
将1mmol4-甲基苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和1mmol氰基乙酸乙酯，加入10mL反应瓶中，然后加入15mg脂肪酶TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，65℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。40h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为98％，m p 118℃-119℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.47(s,3H),7.90(d,J＝7.8Hz,2H),7.59(t,J＝7.7Hz,2H),7.45–7.21(m,4H),7.03(s,4H),6.31(s,1H),2.24(s,3H).HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C22H19NO5[M+Na]+:377.1212,found 377.1207.
实施例15：
将1mmol4-氯苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和2mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入45mg脂肪酶TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。36h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为99％，m p 260℃-261℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.95–7.86(m,1H),7.76–7.68(m,1H),7.59–7.44(m,2H),7.44(d,J＝6.2Hz,2H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H),7.30(d,J＝8.5Hz,2H),4.49(s,1H).HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C19H11ClN2O3[M+Na]+:350.0401,found350.0404.
实施例16：
将1mmol4-氯苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和2mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入45mg已使用过1次的脂肪酶TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。36h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为94％，m p260℃-261℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.95–7.86(m,1H),7.76–7.68(m,1H),7.59–7.44(m,2H),7.44(d,J＝6.2Hz,2H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H),7.30(d,J＝8.5Hz,2H),4.49(s,1H).HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C19H11ClN2O3[M+Na]+:350.0401,found 350.0404.
实施例17：
将1mmol4-氯苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和2mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入45mg已使用过3次脂肪酶TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。36h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为87％，m p260℃-261℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.95–7.86(m,1H),7.76–7.68(m,1H),7.59–7.44(m,2H),7.44(d,J＝6.2Hz,2H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H),7.30(d,J＝8.5Hz,2H),4.49(s,1H).HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C19H11ClN2O3[M+Na]+:350.0401,found 350.0404.
实施例18：
将1mmol4-氯苯甲醛，1mmol 4-羟基香豆素和2mmol丙二腈，加入10mL反应瓶中，然后加入45mg已使用过4次的脂肪酶TLIM，5mL含水10％的二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(乙酸乙酯/正己烷，2/1，v/v))监测反应进程。36h后，将反应液离心，沉淀为脂肪酶，可回收利用，上清液减压旋蒸，所得固体在乙醇中重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为84％，m p260℃-261℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.95–7.86(m,1H),7.76–7.68(m,1H),7.59–7.44(m,2H),7.44(d,J＝6.2Hz,2H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H),7.30(d,J＝8.5Hz,2H),4.49(s,1H).HRMS(EI-TOF):m/z Calcd.for C19H11ClN2O3[M+Na]+:350.0401,found 350.0404.
实施例19：
表1不同来源的酶对反应的影响
a反应条件：酶(50mg)，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，正己烷(5mL)，45℃，24h。
bHPLC收率。
c反应条件：PPL(30mg)，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，溶剂(5mL，乙醇/水，v/v＝4/1)，35℃，1h。
d反应条件：RMIM(50mg)，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，水(5mL)，45℃，20h。
e反应条件：TLIM(50mg)，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，正己烷(5mL)，35℃，12h。
f变性TLIM：丙酮处理24h。
首先，我们考察了之前报道过的酶促反应条件(来自Bioorganic Chemistry,2018,80(2018):555-559./来自Tetrahedron.2011,67(49):9582-9587./来自Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2019,29(2019):1236-1240.)是否适用于4-氯苯甲醛，4-羟基香豆素，丙二腈的反应，实验结果并不理想，因此有必要开发一种新的适用于三组分反应的实验条件。无催化剂存在时，没有检测到产物的生成。脂肪酶如Novozym435，Hlip-F，BCL，RMIM，PPL，DF，LPL，CRL和TLIM都可以推动反应的进行，脂肪酶TLIM表现出了最佳的催化效果。非脂肪酶类如木瓜蛋白酶和BSA也可催化模型反应获得35％和42％收率的目标产物。变性的脂肪酶TLIM的催化活性显著降低，只可获得29％收率的目标产物。我们推测主要是酶的官能团而不是其活性中心对该反应有催化作用。
表2不同反应介质和水含量对反应的影响
a反应条件：TLIM(50mg)，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，溶剂(5mL)，45℃，24h。
bHPLC收率。
c反应条件：TLIM(50mg)，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，DMSO(4.5mL)，水(0.5mL)，45℃，24h。
d反应条件：TLIM(50mg)，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，DMSO(3.75mL)，水(1.25mL)，45℃，24h。
e反应条件：TLIM(50mg)，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，DMSO(2.5mL)，水(2.5mL)，45℃，24h。
有文献报道脂肪酶RMIM在纯水相中可高效催化4-羟基香豆素与醛的反应，脂肪酶TLIM在纯水相中催化4-氯苯甲醛，4-羟基香豆素，丙二腈的反应，只可获得26％收率的目标产物。
表3酶量，温度和反应时间对反应的影响
a反应条件：TLIM，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，DMSO(4.5mL)，水(0.5mL)。
bHPLC收率。
传统酶催化反应需要较高的酶量。比如150mg/mmol醛(来自Amino acids，2013，45：937-945)，200mg/mmol醛(Eur.J.Org.Chem，2017，31：4571-4579)。本发明的优选酶量为45mg/mmol醛，远低于一般酶催化反应所需的酶量。
表4 TLIM催化合成色烯类化合物
a反应条件：TLIM(45mg)，醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈/氰乙酸乙酯(1mmol)，DMSO(4.5mL)，水(0.5mL)，45℃。
b分离收率。
c反应条件：TLIM(450mg)，4-氯苯甲醛(10mmol)，4-羟基香豆素(10mmol)，丙二腈(10mmol)，DMSO(45mL)，水(5mL)，45℃。
图8是脂肪酶TLIM的重复使用情况a反应条件：TLIM(45mg)，4-氯苯甲醛(1mmol)，4-羟基香豆素(1mmol)，丙二腈(1mmol)，DMSO(4.5mL)，水(0.5mL)，45℃。bHPLC收率。
吸电子基团取代的芳香醛与推电子基团取代的芳香醛皆可与4-羟基香豆素和丙二腈发生Knoevenagel-Michael级联反应，获得较高收率的目标产物(80-99％)。推电子基团取代的芳香醛比吸电子基团取代的芳香醛需要更长的反应时间。值得一提的是，当底物为杂环醛如2-噻吩醛时，反应16h后，也可获得91％收率的目标产物。脂肪醛如丁醛或含有空间位阻较大的取代基的芳香醛如4-叔丁基苯甲醛则需要反应更长的时间，才可获得较高收率的目标产物。将底物由丙二腈替换为氰乙酸乙酯，同样可获得令人满意的实验结果。将反应规模扩大10倍，脂肪酶TLIM的催化活性几乎不变，仍可获得95％收率的目标产物。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：包括：以式I醛类化合物、式II 4-羟基香豆素、式Ⅲ(1)丙二腈)/式Ⅲ(2)氰基乙酸乙酯为底物利用脂肪酶TLIM催化进行级联反应生成色烯类化合物式Ⅳ(1)或式Ⅳ(2)，反应方程式为：
其中，X为4-ClC6H4，3-NO2C6H4，4-NO2C6H4，4-OHC6H4，2-OHC6H4，4-CNC6H4，2-FC6H4，4-CF3C6H5，C6H5，4-MeC6H4，4-OMeC6H4，2-OH-3-OMeC6H3，2,6-Cl2C6H3，4-t-C4H9C6H4，2-SC4H3，3-NC8H6，4-OH-3-OMe，C5H11或C3H7。所述反应的溶剂为含水0-50％的二甲基亚砜。
2.根据权利要求1所述脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：所述的式Ⅰ化合物，式II化合物和式Ⅲ化合物的摩尔比为1:1:0.5～4。
3.根据权利要求1所述的脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：所述的脂肪酶在所述反应中总体积浓度为c，其中0＜c≤30mg/mL。
4.根据权利要求1所述脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：所述反应的反应温度为25-65℃。
5.根据权利要求1所述脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：所述反应的反应时间为2-72h。
6.根据权利要求1所述脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：式Ⅰ化合物，式II化合物和式Ⅲ化合物的摩尔比为1:1:1，所述的脂肪酶在所述反应中浓度为45mg/mmol醛，所述反应的反应温度为为45℃，所述反应的溶剂为含水10％的二甲基亚砜。
7.根据权利要求1所述脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：将脂肪酶加入式Ⅰ化合物，式II化合物和式Ⅲ化合物的混合溶液中，催化反应生成色烯类化合物。
8.根据权利要求7所述脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：还包括反应完毕后过滤并回收溶剂或回收酶的步骤。
9.根据权利要求8所述脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：所述的回收酶包括：离心反应液，回收酶。
10.根据权利要求9所述脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，其特征在于：所述脂肪酶催化合成色烯类化合物的方法，还包括反应完毕的后处理步骤，包括：
(1)将反应完毕后的反应混合液离心；
(2)收集上清液
(3)将步骤(2)得到的上清液蒸除溶剂，所余固体产物在乙醇中重结晶即得目标产物。
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