CN111454320A - 一种利用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然产物技术领域，具体公开了一种利用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇的方法；所述的方法包含如下步骤：提取步骤：取干燥的忧遁草全草用乙醇提取，得忧遁草醇提物；萃取步骤：将忧遁草醇提物先分散于水中，然后用石油醚萃取，再经乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取部位得乙酸乙酯萃取物；高速逆流色谱分离步骤：将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离，得羽扇豆醇粗制品。本发明首次利用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇；该方法分离步骤少、制备效率高，且得到的羽扇豆醇纯度高。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物技术领域，具体涉及一种利用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇的方法。
背景技术
爵床科(Acanthaceae)鳄嘴花属(ClinacanthusNees)植物忧遁草(Clinacanthusnutans(Burm.f.)Lindau)，别名鳄嘴花、黎王草、青箭等，主要分布于中国、泰国、马来西亚等热带地区，药理研究表明忧遁草提取物具有显著的抗肿瘤、免疫调节及抗氧化等功效。忧遁草的药用价值一直未受到重视，直至2011年马来西亚某淋巴癌末期患者服用忧遁草康复后，其药用价值受到了世界各国医药科研工作者的广泛关注。
研究表明忧遁草中含有的三萜类化合物羽扇豆醇，羽扇豆醇具有广泛的医药用途，如具有抗氧化、抗炎症、促进皮肤愈合等作用，且对乳腺癌、前列腺癌以及小鼠的黑色素瘤有一定的抑制作用。
目前，尚无从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇的报道。由于忧遁草中化学成分复杂，其中含有众多的三萜类、黄酮类、含硫糖苷类以及植物甾醇类化合物；因此，要想从忧遁草中分离出纯度高的羽扇豆醇并非易事，其步骤十分复杂；往往需要采用多种色谱技术进行反复柱层析分离才能得到。因此，开发一种制备步骤少的制备羽扇豆醇的方法具有重要的意义。
高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术。目前尚无采用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇的报道。
发明内容
为了克服现有技术中从忧遁草中制备羽扇豆醇的技术不足；本发明提供了种利用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇的方法。该方法首次采用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备羽扇豆醇，该方法分离步骤少，得到的羽扇豆醇纯度高。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种利用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇的方法，其包含如下步骤：
提取步骤：取干燥的忧遁草全草用醇提取，得忧遁草醇提物；
萃取步骤：将忧遁草醇提物先分散于水中，然后用石油醚萃取，再经乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取部位得乙酸乙酯萃取物；
高速逆流色谱分离步骤：将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离，得羽扇豆醇粗制品。
优选地，高速逆流色谱法中采用的溶剂由环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水组成；其中环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水的体积比为4～6:1～2:3～5:1～2。
高速逆流色谱法中溶剂的组成以及用量比对于是否能得到羽扇豆醇含量高的粗制品起着决定性因素。本发明发明人经大量的实验摸索发现，当所述的溶剂采用上述比例的环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水组成时，能够使得忧遁草中的羽扇豆醇和其它三萜类、黄酮类以及植物甾醇类化合物最大程度的进行分离，得到的羽扇豆醇粗制品中羽扇豆醇的含量达70％以上。尤其是，当所述的溶剂采用上述比例的环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水组成时，其制备得到的羽扇豆醇粗制品中其它杂质的极性都大于羽扇豆醇的极性，大大较少了后续硅胶柱层析的精制难度；由于羽扇豆醇粗制品中羽扇豆醇的极性最小，在后续的硅胶柱层析过程中，羽扇豆醇最先被洗脱下来，因此，大大节约了羽扇豆醇精制的时间，提高了后续硅胶柱层析精制羽扇豆醇的效率。
最优选地，环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水的体积比为5:2:4:1。溶剂中环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水的该比例是最佳比例；在该比例下制备得到的羽扇豆醇粗制品中羽扇豆醇的含量达80％以上。
优选地，高速逆流色谱法中高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为800～1000rpm；固定相保留值为：60％～80％，流动相的流速为1～2ml/min；分离温度为20～30℃；紫外检测波长为205～235nm；进样后收集33～36min的洗脱部位，将洗脱部位浓缩干燥后即得羽扇豆醇粗制品。
最优选地，高速逆流色谱法中高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为850rpm；固定相保留值为：75％，流动相的流速为1.5ml/min；分离温度为25℃；紫外检测波长为210nm；进样后收集33～36min的洗脱部位，将洗脱部位浓缩干燥后即得羽扇豆醇粗制品。
优选地，提取步骤中采用体积分数为70～95％的乙醇进行加热回流提取。
优选地，乙醇的用量为干燥的忧遁草全草的8～15倍量。
优选地，羽扇豆醇粗制品进一步经硅胶柱层析进行精制；其中硅胶柱层析的具体方法为：
将羽扇豆醇粗制品上硅胶柱，用体积比为92～95:8～5的氯仿和甲醇组成的混合溶剂进行洗脱；洗脱液用TLC板进行点板追踪，当检测到洗脱液中出现第二个化合物时，停止洗脱；将洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得羽扇豆醇纯品。
由于上述高速逆流色谱技术制备得到的羽扇豆醇粗制品中其它杂质的极性都大于羽扇豆醇的极性；因此，羽扇豆醇在硅胶柱中首先被洗脱出来，在上述硅胶柱层析条件下可以快速高效的制备到纯度大于95％的羽扇豆醇。
最优选地，所述硅胶柱层析的具体方法为：
将羽扇豆醇粗制品上硅胶柱，用体积比为93:7的氯仿和甲醇组成的混合溶剂进行洗脱；洗脱液用TLC板进行点板追踪，当检测到洗脱液中出现第二个化合物时，停止洗脱；将洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得羽扇豆醇纯品。上述硅胶柱层析条件是最佳的洗脱条件；在该硅胶柱层析条件下可以快速高效的制备到纯度大于98％的羽扇豆醇。
有益效果：本发明首次利用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇；该方法分离步骤少、制备效率高，且得到的羽扇豆醇纯度高。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但并不能将实施例理解为对本发明的具体限制。
本实施例中采用的忧遁草产地为广西；经过广东省农业科学院药用作物研究所的专家鉴定为忧遁草。
本发明实施例中羽扇豆醇含量测定采用标准曲线法进行测定；即先用羽扇豆醇标准品在HPLC条件下制定峰面积-样品浓度标准曲线；然后测试待测样品的峰面积，根据峰面积换算出羽扇豆醇的含量。其中，HPLC条件为：采用C18分析柱，柱温为25℃，紫外检测波长为206nm，进样量为10μL，流速为1.0ml/min，流动相为甲醇-水(体积比为9:1)。
实施例1
(1)提取步骤：取400g干燥的忧遁草全草用4L体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取2h后将提取液浓缩干燥后得忧遁草醇提物68g；
(2)萃取步骤：将忧遁草醇提物先分散于500mL水中，然后用石油醚萃取3次，每次石油醚的用量为200mL；再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯的用量为200mL，浓缩乙酸乙酯萃取部位得乙酸乙酯萃取物31g；
(3)高速逆流色谱分离步骤：将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离；高速逆流色谱法中高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为850rpm；固定相保留值为：75％，流动相的流速为1.5ml/min；分离温度为25℃；紫外检测波长为210nm；进样后收集33～36min的洗脱部位，将洗脱部位浓缩干燥后即得羽扇豆醇粗制品1.6g(纯度为89％)；高速逆流色谱法中采用的溶剂由环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水组成，其中环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水的体积比为5:2:4:1。
(4)羽扇豆醇精制步骤：将羽扇豆醇粗制品上硅胶柱(硅胶柱中选用200-300目的硅胶，硅胶的重量为羽扇豆醇粗制品的30倍)，用体积比为93:7的氯仿和甲醇组成的混合溶剂进行洗脱；洗脱液用TLC板进行点板追踪，当检测到洗脱液中出现第二个化合物时，停止洗脱；将洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得羽扇豆醇纯品1.3g(纯度为99％)。
该实施例表明，高速逆流色谱法中采用由环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水组成的溶剂，其制备得到的羽扇豆醇粗制品中羽扇豆醇的纯度高达89％；羽扇豆醇粗制品中羽扇豆醇含量高，杂质少；后续仅需一步硅胶柱层析步骤即可制备得到纯度为99％的羽扇豆醇纯品，且在所述的硅胶柱层析中羽扇豆醇最先被洗脱下来，硅胶柱无需采用梯度洗脱或反复硅胶洗脱，纯化效率高。
对比例1
(1)提取步骤：取400g干燥的忧遁草全草用4L体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取2h后将提取液浓缩干燥后得忧遁草醇提物65g；
(2)萃取步骤：将忧遁草醇提物先分散于500mL水中，然后用石油醚萃取3次，每次石油醚的用量为200mL；再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯的用量为200mL，浓缩乙酸乙酯萃取部位得乙酸乙酯萃取物28g；
(3)高速逆流色谱分离步骤：将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离；高速逆流色谱法中高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为850rpm；固定相保留值为：75％，流动相的流速为1.5ml/min；分离温度为25℃；紫外检测波长为210nm；进样后收集33～36min的洗脱部位，将洗脱部位浓缩干燥后即得羽扇豆醇粗制品2.2g(纯度为51％)；高速逆流色谱法中采用的溶剂由环己烷、乙酸乙酯和乙腈组成，其中环己烷、乙酸乙酯、乙腈的体积比为5:2:4。
对比例1与实施例1的不同之处在于，高速逆流色谱法中采用的溶剂组成不同；对比例1的溶剂与实施例1相比，仅仅由环己烷、乙酸乙酯和乙腈组成，溶剂中不含水；结果制备得到的羽扇豆醇粗制品虽然含量由2.2g，但在该溶剂体系下制备得到羽扇豆醇粗制品中其它杂质含量多，羽扇豆醇的纯度仅仅为56％；通过TLC板点板发现，杂质的极性有比羽扇豆醇大的也有比羽扇豆醇小的；羽扇豆醇并不是最先被洗脱下来，增加了硅胶柱的分离难度，不利于后续的精制纯化，后续也无法通过一步硅胶柱纯化得到高纯度的羽扇豆醇。
对比例2
(1)提取步骤：取400g干燥的忧遁草全草用4L体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取2h后将提取液浓缩干燥后得忧遁草醇提物70g；
(2)萃取步骤：将忧遁草醇提物先分散于500mL水中，然后用石油醚萃取3次，每次石油醚的用量为200mL；再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯的用量为200mL，浓缩乙酸乙酯萃取部位得乙酸乙酯萃取物32g；
(3)高速逆流色谱分离步骤：将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离；高速逆流色谱法中高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为850rpm；固定相保留值为：75％，流动相的流速为1.5ml/min；分离温度为25℃；紫外检测波长为210nm；进样后收集33～36min的洗脱部位，将洗脱部位浓缩干燥后即得羽扇豆醇粗制品1.1g(纯度为42％)；高速逆流色谱法中采用的溶剂由环己烷、乙腈以及水组成，其中环己烷、乙腈以及水的体积比为5:4:1。
对比例1与实施例1的不同之处在于，高速逆流色谱法中采用的溶剂组成不同；对比例1的溶剂与实施例1相比，仅仅由环己烷、乙腈以及水组成，溶剂中不含乙酸乙酯；结果制备得到的羽扇豆醇粗制品中其它杂质含量多，羽扇豆醇的纯度仅仅为42％；通过TLC板点板发现，杂质的极性有比羽扇豆醇大的也有比羽扇豆醇小的；羽扇豆醇并不是最先被洗脱下来，增加了硅胶柱的分离难度，不利于后续的精制纯化，后续也无法通过一步硅胶柱纯化得到高纯度的羽扇豆醇。
对比例3
(1)提取步骤：取400g干燥的忧遁草全草用4L体积分数为95％的乙醇进行加热回流提取2h后将提取液浓缩干燥后得忧遁草醇提物64g；
(2)萃取步骤：将忧遁草醇提物先分散于500mL水中，然后用石油醚萃取3次，每次石油醚的用量为200mL；再用乙酸乙酯萃取3次，每次乙酸乙酯的用量为200mL，浓缩乙酸乙酯萃取部位得乙酸乙酯萃取物29g；
(3)高速逆流色谱分离步骤：将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离；高速逆流色谱法中高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为850rpm；固定相保留值为：75％，流动相的流速为1.5ml/min；分离温度为25℃；紫外检测波长为210nm；进样后收集33～36min的洗脱部位，将洗脱部位浓缩干燥后即得羽扇豆醇粗制品1.5g(纯度为63％)；高速逆流色谱法中采用的溶剂由环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水组成，其中环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水的体积比为9:1:4:3。
对比例3与实施例1的不同之处在于，高速逆流色谱法中采用的溶剂组成比例不同；结果制备得到的羽扇豆醇粗制品中其它杂质含量多，羽扇豆醇的纯度仅仅为63％不利于后续的精制纯化，后续也无法通过一步硅胶柱纯化得到高纯度的羽扇豆醇。
Claims (9)
1.一种利用高速逆流色谱技术从忧遁草中制备三萜类化合物羽扇豆醇的方法，其特征在于，包含如下步骤：
提取步骤：取干燥的忧遁草全草用醇提取，得忧遁草醇提物；
萃取步骤：将忧遁草醇提物先分散于水中，然后用石油醚萃取，再经乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯萃取部位得乙酸乙酯萃取物；
高速逆流色谱分离步骤：将乙酸乙酯萃取物采用高速逆流色谱法进行分离，得羽扇豆醇粗制品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高速逆流色谱法中采用的溶剂由环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水组成；其中环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水的体积比为4～6:1～2:3～5:1～2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，环己烷、乙酸乙酯、乙腈以及水的体积比为5:2:4:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高速逆流色谱法中高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为800～1000rpm；固定相保留值为：60％～80％，流动相的流速为1～2ml/min；分离温度为20～30℃；紫外检测波长为205～235nm；进样后收集33～36min的洗脱部位，将洗脱部位浓缩干燥后即得羽扇豆醇粗制品。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，高速逆流色谱法中高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为850rpm；固定相保留值为：75％，流动相的流速为1.5ml/min；分离温度为25℃；紫外检测波长为210nm；进样后收集33～36min的洗脱部位，将洗脱部位浓缩干燥后即得羽扇豆醇粗制品。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取步骤中采用体积分数为70～95％的乙醇进行加热回流提取。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，乙醇的用量为干燥的忧遁草全草的8～15倍量。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，羽扇豆醇粗制品进一步经硅胶柱层析进行精制；其中硅胶柱层析的具体方法为：
将羽扇豆醇粗制品上硅胶柱，用体积比为92～95:8～5的氯仿和甲醇组成的混合溶剂进行洗脱；洗脱液用TLC板进行点板追踪，当检测到洗脱液中出现第二个化合物时，停止洗脱；将洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得羽扇豆醇纯品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述硅胶柱层析的具体方法为：
将羽扇豆醇粗制品上硅胶柱，用体积比为93:7的氯仿和甲醇组成的混合溶剂进行洗脱；洗脱液用TLC板进行点板追踪，当检测到洗脱液中出现第二个化合物时，停止洗脱；将洗脱下来的洗脱液浓缩干燥后即得羽扇豆醇纯品。
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