CN111394304A - 一种修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液及其制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液，该干细胞条件培养上清液通过以下步骤制备而成：取传达次数为5‑8代的间充质干细胞，去除原培养基，加入与原培养基等量的条件培养基放置于培养箱中，在温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％、饱和湿度的条件下培养24小时，条件培养基为含工作浓度为0.005‑0.015M的HEPES缓冲盐溶液的无酚红DMEM培养基，收集上清液，离心15‑25min，弃去沉淀，即得干细胞条件培养上清液；本发明提供的干细胞条件培养上清液具有修复呼吸系统损伤的功效。

Description

一种修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液及其制剂
技术领域
本发明属于中药及干细胞技术领域技术领域，特别涉及一种修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液及其制剂。
背景技术
心血管疾病、肿瘤、代谢性疾病和呼吸系统疾病，已经成为威胁全世界的四大慢性疾病，对于前三者，都得到了很好的重视，唯独呼吸系统疾病在老百姓当中的知晓率依然很低，呼吸系统疾病包含：哮喘病、气管炎、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、肺心病、肺结核等，呼吸系统疾病(不包括肺癌)在城市的死亡病因中占第四位(13.1％)，在农村占第三位(16.4％)，由于大气污染、吸烟、工业经济发展导致的理化因子、生物因子吸入、感染性疾病以及人口年龄老化等因素，使近年来呼吸系统疾病如肺癌、支气管哮喘的发病率明显增加，慢性阻塞性肺疾病居高不下(40岁以上人群中超过8％)，从2002年底以来，在中国及世界范围内暴发的传染性非典型肺炎(严重急性呼吸综合征，SARS，COVID-19)疫情，由于多发生于中青年，其传染性强，病死率高，又缺乏针对性的药物，目前在多个国家出现的人禽流感病死率超过60％。而禽流感病毒侵人体内主要的靶器官也是肺，这正说明呼吸系统疾病对中国人民健康危害仍是很大的，其防治任务艰巨。
相较西医对症治疗的方式，中医、生物治疗已成为治疗慢性、损伤性疾病的新策略，能起到修复受损细胞结构及功能的作用，因此我们将结合中药有效成分和生物治疗，制备一种修复呼吸系统损伤的制品。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液，该干细胞条件培养上清液通过以下步骤制备而成：取传达次数为5-8代的间充质干细胞，去除原培养基，加入与原培养基等量的条件培养基放置于培养箱中，在温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％、饱和湿度的条件下培养24小时，条件培养基为含工作浓度为0.005-0.015M的HEPES缓冲盐溶液的无酚红DMEM培养基，收集上清液，离心15-25min，弃去沉淀，即得干细胞条件培养上清液。
优选地，去除原培养基后使用0.9％氯化钠注射液清洗，然后再加入条件培养基培养。
进一步地，间充质干细胞传代及上清收获时的细胞密度均在90％以上。
其中，间充质干细胞包括所有间充质干细胞，如脐带间充质干细胞；本发明提供的方法制备的干细胞条件培养上清液能够调节免疫，针对过度炎症反应有显著调节作用，同时也能起到修复损伤、抗衰老的作用，因此上清液本身能够起到修复呼吸系统损伤的作用，既可单独使用，也可以与其他活性成分合用，也可以与辅料制备其他剂型使用，使用以上方法制备的干细胞条件培养上清液中含有多种活性成分：包括TSG-6、HGF、GM-CSF、KGF、VEGF、血管生成素-1(Ang-1)、前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素-10(IL-10)等多种细胞因子，MSC还通过释放大量的细胞外小囊泡(EV)参与肺组织的修复，这些囊泡包裹着细胞因子、生长因子、信号脂质、功能性mRNA和microRNAs，这些有效成分均会随着培养过程释放到条件培养上清液中。
本发明还提供了一种由修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液和附加成分制成的鼻咽喷雾敷剂，附加成分主要包括人参与黄芪的混合提取物和生理盐水，干细胞条件培养上清液和人参与黄芪的混合提取物在生理盐水中的体积浓度分别为8％-10％、1％-4％。
人参能够增强体力，治疗免疫功能低下，有抗冷热应激作用，同时具有增强人体表面细胞的活力，抑制衰老等作用；黄芪具有显著降低血糖、糖化血红蛋白和尿蛋白的作用，可降低肾皮质和血清中的AGEs，具有抗氧化、增强免疫力、增强能量、抗疲劳、抗突变、保肝、抑制破骨细胞的作用，是抗病毒中药有效成分。
进一步地，人参与黄芪的混合提取物的制备方法为：取黄芪和人参原料，清洗、干燥、粉碎，接入菌种液后摇床培养发酵45天，黄芪和人参的重量比为1-2:1-2，黄芪和人参的总重量与菌种液的重量比为1:1-2摇床培养的条件为：ph＝3-5、温度为35-40℃；发酵后在4800r/min条件下离心20min，取上清液，在100℃水浴下灭菌20-40min，即得人参与黄芪的混合提取物，其中，菌种液是将质量比2:2:1的黑曲霉、植物乳酸杆菌和酿酒酵母菌用水配置成总浓度为0.17％的混合菌液。
进一步地，附加成分还包括吐温-80和海藻糖，吐温-80和海藻糖在生理盐水中的浓度分别为0.2-0.4％、0.5-1.5％。
海藻糖：海藻糖对生物体具有保护作用，是因为海藻糖在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征，这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分。
进一步地，附加成分还包括薄荷冰，薄荷冰在生理盐水中的质量浓度为0.04％-0.05％。
薄荷冰在鼻咽喷雾敷剂中的作用主要是刺激皮肤粘膜，在止痒、消炎、止痛的同时，局部具有凉感。
进一步地，附加成分还包括壳聚糖，壳聚糖在生理盐水中的质量浓度为0.5-1.5％。
壳聚糖的化学结构中含有活性自由氨基，溶于酸后糖链上的胺基与H结合形成强大的正电荷离子团，有利于改善酸性体质，强化人体免疫功能，排除体内有害物质等，维持机体正常pH，壳聚糖与人体细胞具有融合性，使其具有多种生物活性和生物相容性，已发现壳低聚糖具有抗肿瘤的生理功能，可被人体吸收。
进一步地，鼻咽喷雾敷剂的制备方法包括以下步骤：
制备干细胞条件培养上清液；
制备人参与黄芪的混合提取物；
将人参与黄芪的混合提取物用生理盐水稀释至体积浓度为1％-4％，添加质量浓度为0.04％-0.05％的薄荷冰和质量浓度为0.2-0.4％的吐温-80，值得第一混合液，将第一混合液高温高压灭菌，再加入质量浓度为0.5-1.5％的海藻糖和体积浓度为8％-10％的干细胞条件培养上清液混合均匀，分装入雾化吸入器内，即得鼻咽喷雾敷剂。
进一步地，上清液的离心速度为4000-4400rpm。
本发明的鼻咽喷雾敷剂的给药方式是：将导管一头接在雾化器出口，一头接在雾化杯底部，然后在雾化杯中倒进雾化药液(建议在2-88ml以内)，在佩戴上面罩或咬上咬嘴即可进行雾化。
本发明提供的干细胞条件培养上清液具有以下功效：
1.促进肺泡表面活性物质的合成，从而加强纤毛的摆动和粘液运输系统的功能，促进有害物质的排出。
2.调节肺部终末支气管内腺体组织的分泌，改变黏液和浆液的分泌比例，加强有害物质的清除。
3.通过抗炎因子和抗菌多肽的作用，降低肺部炎症反应，减伤中性粒细胞的浸润，减少胶原沉积，从而减轻有害物质对肺泡细胞的伤害。
4.通过抑制有害物质对肺泡上皮细胞中Na+运输的减少作用，恢复肺上皮细胞顶侧膜对Na+的运输，从而减轻肺水肿。
5.通过诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖能力，加速修复受损的肺部细胞，改善肺功能。
6.通过各种生长因子的修复作用，促进受损的肺部组织修复与再生。
说明书附图
图1.大鼠血浆细胞因子水平测定结果；
图2.大鼠BALF细胞因子水平测定结果；
图3.肺湿/干质量比；
图4.大鼠肺组织髓过氧化物酶活性。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液，该干细胞条件培养上清液通过以下步骤制备而成：取传达次数为7代的脐带间充质干细胞，去除原培养基，用0.9％氯化钠注射液清洗，加入与原培养基等量的条件培养基放置于培养箱中，在温度为37.0℃、CO2浓度为5.0％、饱和湿度的条件下培养24小时，条件培养基为含工作浓度为0.01M的HEPES缓冲盐溶液的无酚红DMEM培养基，收集上清液，离心20min，弃去沉淀，即得干细胞条件培养上清液；脐带间充质干细胞传代及上清收获时的细胞密度均在90％以上。
实施例2
本实施例提供了一种制剂，该制剂为鼻咽喷雾敷剂，该鼻咽喷雾敷剂包括干细胞条件培养上清液和附加成分，附加成分包括100ml的人参与黄芪的混合提取物、10000ml的生理盐水、20g的吐温-80、50g海藻糖、4g薄荷冰和50g壳聚糖；
该鼻咽喷雾敷剂的制备方法包括以下步骤：
使用实施例1的方法制备干细胞条件培养上清液；
制备人参与黄芪的混合提取物：人参与黄芪的混合提取物的制备方法为：取黄芪和人参原料，清洗、干燥、粉碎，接入菌种液后摇床培养发酵45天，黄芪和人参的重量比为1:2，黄芪和人参的总重量与菌种液的重量比为1:1摇床培养的条件为：ph＝3、温度为35℃；发酵后在4800r/min条件下离心20min，取上清液，在100℃水浴下灭菌20min，即得人参与黄芪的混合提取物，其中，菌种液是将质量比2:2:1的黑曲霉、植物乳酸杆菌和酿酒酵母菌用水配置成总浓度为0.17％的混合菌液；
将人参与黄芪的混合提取物放置于生理盐水中混合均匀，再添加薄荷冰和吐温-80，制得第一混合液，将第一混合液高温高压灭菌，再加入海藻糖和干细胞条件培养上清液混合均匀，分装入5ml/瓶的配套微网雾化吸入器内，即得鼻咽喷雾敷剂。
实施例3
本实施例提供了一种制剂，该制剂为鼻咽喷雾敷剂，该鼻咽喷雾敷剂包括干细胞条件培养上清液和附加成分，附加成分包括200ml的人参与黄芪的混合提取物、10000ml的生理盐水、30g的吐温-80、100g海藻糖、4.5g薄荷冰和100g壳聚糖；
该鼻咽喷雾敷剂的制备方法包括以下步骤：
使用实施例1的方法制备干细胞条件培养上清液；
制备人参与黄芪的混合提取物：人参与黄芪的混合提取物的制备方法为：取黄芪和人参原料，清洗、干燥、粉碎，接入菌种液后摇床培养发酵45天，黄芪和人参的重量比为1:1，黄芪和人参的总重量与菌种液的重量比为1:1.5摇床培养的条件为：ph＝4、温度为37℃；发酵后在4800r/min条件下离心20min，取上清液，在100℃水浴下灭菌30min，即得人参与黄芪的混合提取物，其中，菌种液是将质量比2:2:1的黑曲霉、植物乳酸杆菌和酿酒酵母菌用水配置成总浓度为0.17％的混合菌液；
将人参与黄芪的混合提取物放置于生理盐水中混合均匀，再添加薄荷冰和吐温-80，制得第一混合液，将第一混合液高温高压灭菌，再加入海藻糖和干细胞条件培养上清液混合均匀，分装入5ml/瓶的配套微网雾化吸入器内，即得鼻咽喷雾敷剂。
实施例4
本实施例提供了一种制剂，该制剂为鼻咽喷雾敷剂，该鼻咽喷雾敷剂包括干细胞条件培养上清液和附加成分，附加成分包括400ml的人参与黄芪的混合提取物、10000ml的生理盐水、40g的吐温-80、150g海藻糖、5g薄荷冰和150g壳聚糖该鼻咽喷雾敷剂的制备方法包括以下步骤：
使用实施例1的方法制备干细胞条件培养上清液；
制备人参与黄芪的混合提取物：人参与黄芪的混合提取物的制备方法为：取黄芪和人参原料，清洗、干燥、粉碎，接入菌种液后摇床培养发酵45天，黄芪和人参的重量比为2:1，黄芪和人参的总重量与菌种液的重量比为1:2摇床培养的条件为：ph＝5、温度为40℃；发酵后在4800r/min条件下离心20min，取上清液，在100℃水浴下灭菌40min，即得人参与黄芪的混合提取物，其中，菌种液是将质量比2:2:1的黑曲霉、植物乳酸杆菌和酿酒酵母菌用水配置成总浓度为0.17％的混合菌液；
将人参与黄芪的混合提取物放置于生理盐水中混合均匀，再添加薄荷冰和吐温-80，制得第一混合液，将第一混合液高温高压灭菌，再加入海藻糖和干细胞条件培养上清液混合均匀，分装入5ml/瓶的配套微网雾化吸入器内，即得鼻咽喷雾敷剂。
试验例1对急性肺损伤模型的保护作用实验
实验分组：
选择健康雄性Wistar大鼠56只，体重220-250g，随机分为7组(n＝8)：NT组为生理盐水对照组；LPS组为脂多糖(LPS，055：B_5，Sigma公司，美国)组；治疗组1为LPS造模后用实施例1的干细胞条件培养上清液治疗组；治疗组2低为LPS造模后用实施例2的鼻咽喷雾敷剂治疗组；治疗组2中为LPS造模后用实施例3的鼻咽喷雾敷剂治疗组；治疗组2高为LPS造模后用实施例4的鼻咽喷雾敷剂治疗组，中药组为专利号为CN200610059815.2的用于治疗肺炎和上呼吸道感染的中药喷雾剂。
造模预处理：
对各组大鼠通过腹腔注射浓度为3％的戊巴比妥钠进行麻醉，注射量为20mg/kg，建立尾静脉通路用于给药和输液，NT组：尾静脉输注生理盐水3ml；其他组把脂多糖(LPS)溶于生理盐水中稀释2倍，将其经大鼠尾静脉输入制备大鼠ALI模型，给药量为5mg/kg。
实验处理：
治疗组1和治疗组2低、中、高分别将实施例1的细胞条件培养上清液和实施例2-4的鼻咽喷雾敷剂通过雾化方式吸入，雾化器将其雾化成1-5um的小微粒，通入20cm*9cm的雾化箱，雾化箱另一头接真空泵，维持气体流速15ml/min，将治疗组1和治疗组2低、中、高组的大鼠在对应的雾化箱中放置30分钟，中药组的喷雾剂使用喷雾给药器给药，给药剂量为1ml/kg。
检测指标：
治疗后12h心脏取血用于检测，抽取血液5ml，置于4℃离心机中离心10min，3000r/min，封装后保存于-80℃冰箱中用于集中检测，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中TNF-a，IL-6，IL-10细胞因子水平，结果见图1；
后将大鼠处死，从气管插入塑料导管，同时开胸结扎右主支气管，缓慢注入3ml/kg的4℃生理盐水，在肺内停留30s后吸出。重复灌洗肺组织3次，合并3次收集的肺泡灌洗液(BALF)，酶联免疫吸附法(ELISA)检测BALF中TNF-a，IL-6，IL-10等细胞因子，结果见图2；
取右上肺进行肺含水量(LWR)检测。生理盐水漂洗，滤纸吸干肺组织表面水分，称取肺组织湿质量，肺组织放入烘箱中70℃干燥48h，再次称取肺干质量，肺湿质量除以肺干质得出肺湿/干质量比，结果见图3；
髓过氧化物酶活性测定：取左肺制备10％肺组织匀浆，4℃离心机，4000r/min，离心10min，取上清-80℃保存备用，用髓过氧化物酶试剂盒测定肺组织髓过氧化物酶活性，结果见图4。
由图1可以看出，治疗组1、治疗组2低、中、高与LPS组相比，TNF-a、IL-6水平均明显降低，血浆IL-10水平均明显升高，且，治疗组2低、中、高组的治疗效果显示本发明的鼻咽喷雾敷剂呈剂量依赖性，而中药组的效果则明显不如治疗组1和治疗组2低、中、高；由图2可以看出，治疗组1、治疗组2低、中、高的肺泡灌洗液与LPS组相比，TNF-a、IL-6水平均明显降低，肺泡灌洗液中IL-10水平明显升高，同样呈剂量依赖性，而中药组的效果则明显不如治疗组1和治疗组2低、中、高；由图3可以看出，治疗组1、治疗组2低、中、高的肺干湿质量比与LPS组相比均明显降低，而中药组的效果则明显不如治疗组1和治疗组2低、中、高；由图4可以看出，LPS组肺组织髓过氧化物酶活性比NT照组显著增加；治疗组1、治疗组2低、中、高肺组织髓过氧化物酶活性明显降低，且治疗组2低、中、高的治疗效果优于治疗组1，治疗组1的治疗效果远远优于中药组。
总结，细胞条件培养上清液和由细胞条件培养上清液制备的鼻咽喷雾敷剂均可以减轻内毒素诱导的急性肺损伤模型的损伤程度；鼻咽喷雾敷剂与急性肺损伤组比较，肺干湿质量比、肺组织髓过氧化物酶活性、血浆和BALF中TNF-a，IL-6水平均明显降低，血浆IL-10水平明显升高；说明鼻咽喷雾敷剂对内毒素性急性肺损伤模型有保护作用；其保护机制可能为间充质干细胞分泌因子和中药成分能维持肺内炎性递质和抗炎递质平衡。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液，其特征在于，所述干细胞条件培养上清液通过以下步骤制备而成：取传达次数为5-8代的间充质干细胞，去除原培养基，加入与原培养基等量的条件培养基放置于培养箱中，在温度为37.0±0.5℃、CO2浓度为5.0±0.2％、饱和湿度的条件下培养24小时，所述条件培养基为含工作浓度为0.005-0.015M的HEPES缓冲盐溶液的无酚红DMEM培养基，收集上清液，离心15-25min，弃去沉淀，即得干细胞条件培养上清液。
2.如权利要求1所述的修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液，其特征在于，所述间充质干细胞传代及上清收获时的细胞密度均在90％以上。
3.一种由权利要求1或2所述的修复呼吸系统损伤的干细胞条件培养上清液和附加成分制成的鼻咽喷雾敷剂，所述附加成分主要包括人参与黄芪的混合提取物和生理盐水，所述干细胞条件培养上清液和所述人参与黄芪的混合提取物在生理盐水中的体积浓度分别为8％-10％、1％-4％。
4.如权利要求3所述的鼻咽喷雾敷剂，其特征在于，所述人参与黄芪的混合提取物的制备方法为：取黄芪和人参原料，清洗、干燥、粉碎，接入菌种液后摇床培养发酵45天，黄芪和人参的重量比为1-2:1-2，黄芪和人参的总重量与菌种液的重量比为1:1-2摇床培养的条件为：ph＝3-5、温度为35-40℃；发酵后在4800r/min条件下离心20min，取上清液，在100℃水浴下灭菌20-40min，即得人参与黄芪的混合提取物。
5.如权利要求3所述的鼻咽喷雾敷剂，其特征在于，所述附加成分还包括吐温-80和海藻糖，所述吐温-80和海藻糖在生理盐水中的浓度分别为0.2-0.4％、0.5-1.5％。
6.如权利要求5所述的鼻咽喷雾敷剂，其特征在于，所述附加成分还包括薄荷冰，所述薄荷冰在生理盐水中的质量浓度为0.04％-0.05％。
7.如权利要求3所述的鼻咽喷雾敷剂，其特征在于，所述附加成分还包括壳聚糖，所述壳聚糖在生理盐水中的质量浓度为0.5-1.5％。
8.如权利要求6所述的鼻咽喷雾敷剂，其特征在于，所述鼻咽喷雾敷剂的制备方法包括以下步骤：
制备干细胞条件培养上清液；
制备人参与黄芪的混合提取物；
将人参与黄芪的混合提取物用生理盐水稀释至体积浓度为1％-4％，添加质量浓度为0.04％-0.05％的薄荷冰和质量浓度为0.2-0.4％的吐温80，制得第一混合液，将所述第一混合液高温高压灭菌，再加入质量浓度为0.5-1.5％的海藻糖和体积浓度为8％-10％的干细胞条件培养上清液混合均匀，分装入雾化吸入器内，即得鼻咽喷雾敷剂。
9.如权利要求1所述的鼻咽喷雾敷剂，其特征在于，所述上清液的离心速度为4000-4400rpm。
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