CN107028987A - 一种微生物黏附率调节剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物黏附率调节剂及其应用,涉及生物技术领域。该微生物黏附率调节剂,适于调节微生物与黏膜或皮肤的黏附率,其含有表面活性剂,该表面活性剂的浓度低于其临界胶束浓度(CMC)。该微生物黏附率调节剂可提高微生物接触黏膜细胞或皮肤细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了微生物的细胞表面疏水性,提高了有益微生物与黏膜上皮细胞或皮肤角质层的黏附率,易于这些微生物定植在黏膜或皮肤,有利微生物持续长久地发挥功能,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种微生物黏附率调节剂及其应用。
背景技术
自然界中的很多微生物都能寄居在动物的黏膜和皮肤的表面及附近,直接影响宿主的健康。按照对宿主健康的影响好坏和程度,这些微生物中的细菌和真菌,一般分为致病菌,条件致病菌,益生菌。从这个意义上看,益生菌就是对宿主的健康有益的细菌和真菌。
通过黏附和定植,外源给予的益生菌,对宿主可产生多种有益效果:包括调整免疫应答,防治过敏,抗癌,抑制有害菌,降血压,降胆固醇,降血脂,调节神经系统、抗衰老,维护黏膜健康等多种生物功效。
然后,无论是活的益生菌,还是致病菌,条件致病菌,甚至是灭活的益生菌,在给予后对黏膜和皮肤的黏附都是其发挥生物功效的前提和基础。黏附率的高低直接关系到益生菌或致病菌生物功效的有无和大小。
外源给予的益生菌通常也被称为微生态制剂。现有的微生态制剂包括益生菌全冻干菌株的给予,和益生菌菌株与糖类合并给予两大类方式。前者包括冻干益生菌胶囊,包埋粉剂和益生菌片剂,后者包括酸奶,乳酸菌饮料,合生元等产品。
益生菌全冻干菌株给予方式的微生态制剂,给予后的黏附率当然由益生菌本身的黏附率决定。菌株与糖类合并给予的微生态制剂,由于碳水化合物会结合在益生菌的黏附位点上,各种糖类对菌种的黏附具有或多或少的减弱作用。这种微生态制剂所含益生菌的黏附率比菌株本身的黏附率更低,(对于大部分单糖常常还低很多,甚至完全失去黏附能力)。其中益生菌的生物功效与单独给予益生菌相比实际上并未提高。
这两类微生态制剂给予的益生菌都不高于益生菌本身的黏附率。对于要求特定生物功效的情况,常常因为顾忌菌种本身黏附率的限制,以至于在选择菌种时,不得不以黏附率为重点选择(诱变)菌株的考量。这提高了工艺难度,也会影响到基于菌株本身生物功效的选择。
事实上,很多菌株在具有特定的生物功效时,却没有较高的黏附率,这些给予方式就极大地制约了微生态制剂发挥生物功效的精准性和效率。这是目前整个益生菌市场存在的技术瓶颈。
因此,现有的微生态制剂存在所含益生菌的黏附率不高于菌体本身黏附率的不足。
另一个方面,致病菌的防治,通常的办法就是消毒灭杀和完全清洗,这些没有选择性的抑菌方式,带来了致病菌抗药性的进化,以及益生菌缺失引起菌群失调的长期危害。这些技术问题同样是源于致病菌的黏附率没有得到(选择性)改变的不足。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物黏附率调节剂,其适于调节微生物的黏附率,使相应的益生菌具有更高的黏附率以及更容易定植在黏膜或皮肤上。其中,相应的益生菌包括外源给予的益生菌,以及已经存在黏膜或皮肤上但未定植的内源益生菌。
本发明的另一目的在于提供上述的微生物黏附率调节剂在调节微生物的黏附率中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述的微生物黏附率调节剂在制备益生菌制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种益生菌制剂,该益生菌制剂含有上述的微生物黏附率调节剂,能提高相应的益生菌的黏附率。
本发明的另一目的在于提供一种用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗细菌性胃炎的药物。
本发明的另一目的在于提供上述的益生菌制剂在制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗细菌性胃炎的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种治疗鼻炎或治疗哮喘或治疗过敏性皮炎或治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病、毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗细菌性胃炎的方法。
本发明的另一目的在于提供一种益生菌制剂的储运方法,该方法可使益生菌制剂保存期长达24个月,且其中活性益生菌含量及遗传稳定性可靠,不会再产生涨袋和后酸化等技术问题。本发明是这样实现的:
一种微生物黏附率调节剂,适于调节微生物的黏附率,其含有表面活性剂,表面活性剂的浓度低于所述表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)。
上述的微生物黏附率调节剂在调节微生物的黏附率中的应用。
上述的微生物黏附率调节剂在制备益生菌制剂中的应用。
一种益生菌制剂,用于作用于黏膜或皮肤,其包括益生菌和上述的微生物黏附率调节剂。
一种用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗细菌性胃炎的药物,其含有上述的益生菌制剂。
上述的益生菌制剂在制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗细菌性胃炎的药物中的应用。
一种治疗鼻炎或治疗哮喘或治疗过敏性皮炎或治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗细菌性胃炎的方法,其包括:用上述的益生菌制剂接触个体的黏膜。
一种益生菌制剂的储运方法,其包括以下步骤:
步骤a:将上述的微生物黏附率调节剂消毒灭菌并定量密封包装;
步骤b:将步骤a中包装后的微生物黏附率调节剂与定量包装的冻干益生菌以非混合状态储存和运输;
步骤c:使用时,将微生物黏附率调节剂与冻干益生菌,在72小时内共同给予作用部位。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明提供的微生物黏附率调节剂,适于调节微生物的黏附率,其含有表面活性剂,表面活性剂的浓度低于表面活性的临界胶束浓度。该表面活性剂可对黏膜的黏液层和皮肤的脂质膜产生改性,提高了微生物例如益生菌接触黏膜细胞或皮肤细胞的概率和速度。同时该表面活性剂还可改变微生物例如益生菌的细胞表面疏水性,提高了益生菌与黏膜上皮细胞或皮肤表皮细胞的黏附率,易于使益生菌定植在黏膜或皮肤表面,有利益生菌持续长久地发挥功能。此外,通过提高益生菌的黏附可以拮抗致病微生物和条件致病微生物的黏附,从而减小致病微生物和条件致病微生物进一步的定植和感染,实现了少用或不用抗生素的情况下预防和治疗大量疾病的作用,该微生物黏附率调节剂具有广阔的应用前景。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种微生物黏附率调节剂及其应用进行具体说明。
一方面,本发明提供了一种微生物黏附率调节剂,适于调节微生物的黏附率,其含有表面活性剂,该表面活性剂的浓度低于其临界胶束浓度(Critical MicelleConcentration,CMC)。
其中,适于调节微生物的黏附率可理解为该微生物黏附率调节剂适于提高目标部位(例如黏膜或皮肤)已有益生菌的黏附率,或者其适于降低目标部位上的致病菌的黏附率,或者是提高外源给予的益生菌作用在目标部位上的黏附率。
表面活性剂,其对黏膜的黏液和皮肤表面脂质膜(Hydro-lipid film)产生改性,可提高微生物例如益生菌接触黏膜细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了益生菌的细胞表面疏水性(CSH),提高了这些益生菌与黏膜上皮细胞的黏附率,从而解决了现有技术中益生菌的生物功效受到黏附率限制的技术瓶颈。
因此,本发明提供的微生物黏附率调节剂能够促使益生菌在黏膜或皮肤上具有较高的黏附率,易于定植在黏膜或皮肤上,有利持续长久地发挥生物功效。相应地,通过提高对益生菌在黏膜或皮肤上的定植,产生占位拮抗效应,使得致病菌或条件致病菌的黏附率降低,或者是促进黏膜或皮肤上原有的非定植益生菌的黏附,形成拮抗黏附,降低致病菌或条件致病菌的黏附率,进而实现对微生物黏附率的调节即可提高益生菌的黏附率,又可降低致病菌的黏附率。
在通常认知中,表面活性剂可以彻底清洗黏膜和皮肤表面,是完全去黏附的物质。事实上,也常常作为洗涤剂(其浓度高于临界胶束浓度)用于黏膜和皮肤表面的清洁去污。但是,发明申请人,在实际工作中惊讶地发现,表面活性剂的浓度低于临界胶束浓度时,对于益生菌却是促进黏附的作用,尤其是其表面张力处于合适的范围内,能够进一步地促进益生菌黏附。
这种作用的机制表现在两个方面:一方面,表面活性剂改变了黏膜和皮肤的表面附着层的物理特性,使微生例如益生菌物接触黏膜细胞和皮肤表皮细胞的几率和速度发生了改变。具体而言,对于黏膜,这种表面活性剂,是对黏膜分泌的黏液进行改性,使没有运动能力的益生菌能更容易,更快地接触黏膜细胞。对于皮肤,这种表面活性剂,则是对皮肤表面的脂质膜进行改性,方便了益生菌的接触。另一方面,表面活性剂产生的表面张力提高了益生菌的细胞表面疏水性(CSH),这种提高在一个具体的数值时最大,而在远离这一数值的情况下(包括更大或更小)则会减弱,甚至变成降低。这一数值范围,发明申请人惊讶的发现,对于大多数益生菌而言均处于40-60mN/m。细菌的细胞表面疏水性(CSH)会增加细菌与细胞的疏水相互作用,这种远距离的作用力对于没有运动能力的益生菌而言,会直接带来黏附率的提高。通过这两方面的作用,尤其是后者的作用,表面张力处于合适范围的表面活性剂实现了提高益生菌的黏附率的效果。
黏膜和皮肤表面的黏附位点是有限的,当益生菌的黏附率提高后,自然会产生黏附拮抗,导致致病菌等有害微生物黏附率的降低,甚至发生已黏附的致病菌去黏附的现象。从而实现了降低了致病菌的黏附率。这种拮抗可以由外源给予的益生菌实现,也可以由存在黏膜或皮肤附近未黏附的益生菌实现。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述微生物黏附率调节剂的表面张力小于65mN/m,可选地,上述微生物黏附率调节剂的表面张力为40-60mN/m。进一步可选地,上述微生物黏附率调节剂的表面张力为55mN/m。
将微生物黏附率调节剂的表面张力控制在小于65mN/m的范围下,有助于提高益生菌与黏膜细胞的黏附率,也利于益生菌的定植,使其持续发挥生物功效。
微生物黏附率调节剂的表面张力为40-60mN/m的范围内,这样的微生物黏附率调节剂可进一步提高益生菌与黏膜细胞的的黏附率,利于益生菌的定植,使其持续发挥生物功效。这样,由微生物黏附率调节剂和益生菌制成的微生态制剂发挥生物功效的精准性和效率更高。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述表面活性剂选自生物表面活性剂或植物性表面活性剂中的至少一种。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述生物表面活性剂包括糖脂和脂肽中的至少一种;上述植物性表面活性剂包括皂甙和其他具有表面活性功能的糖苷中的至少一种。
也可以理解为,在本发明的一些实施方案中,上述表面活性剂是糖脂、脂肽、皂甙和其他具有表面活性功能的糖苷中的一种或几种的组合。
糖脂可以是鼠李糖脂、海藻糖脂、槐糖脂以及甘露糖赤藓糖醇脂中的一种或几种的组合;
脂肽可以是表面活性素、地衣素、伊枯草素类、芬芥素、大侧柏素、螺旋形素以及张力素中的一种或几种的组合;
皂甙可以是人参皂甙、茶皂甙、黄芪皂甙、甘草皂甙、大豆皂甙、皂荚皂甙、无患子皂苷、麦冬皂苷、薯蓣皂甙、黄花败酱皂甙中的一种或几种的组合;
糖苷可以是葡萄糖苷和半乳糖苷中的一种或两种的组合。
需要说明的是,本发明所述的表面活性剂可以是纯度高的单一成分或多种成分的组合,也可以是含有上述表面活性剂的植物提取物或者是微生物培养物。
例如,在本发明的一些实施方案中,上述微生物黏附率调节剂包括辛夷提取物,辛夷提取物含有表面活性剂,表面活性剂为糖苷。
例如,在本发明的一些实施方案中,上述微生物黏附率调节剂包括人参提取物,人参提取物含有表面活性剂,表面活性剂为皂甙。
容易理解,人参提取物的主要成分为皂甙,因此人参提取物可以作为表面活性剂即皂甙的来源,人参提取物可用于调节微生物黏附率,将其作为本发明微生物黏附率调节剂的成分,属于本发明的保护范围。
人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物,三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。包括人参皂甙Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf、Rg等,视为人参,三七,西洋参等中药具有广泛生物功效的物质,但人参皂甙具体产生生物功效的分子生物学机理不详。本发明应用于益生菌制剂从另一个方面阐述了这些中药成分产生生物功效的一种分子生物学机制。
例如,在本发明的一些实施方案中,上述微生物黏附率调节剂包括细菌培养上清液,该细菌培养上清液为嗜酸乳酸杆菌或/和植物乳酸杆菌的产益生菌表面活性剂(E-BS)的益生菌培养液上清液,该微生物黏附率调节剂的表面张力为49-60mN/m。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述微生物黏附率调节剂包括细菌培养上清液,该细菌培养上清液含有表面活性剂,该微生物黏附率调节剂的表面张力为55mN/m。
可选地,在本发明的一些实施方案中,细菌培养上清液为嗜酸乳酸杆菌的培养上清液、植物乳酸杆菌的培养液上清液和芽孢杆菌的培养上清液中的一种或几种的组合。
嗜酸乳酸杆菌、植物乳酸杆菌以及芽孢杆菌等高黏附率的乳酸菌,其本身代谢的过程可以产生脂肽和糖脂等表面活性剂,将这些菌(嗜酸乳酸杆菌、植物乳酸杆菌以及芽孢杆菌)的培养上清液的表面张力减低到60mN/m以下。这种作用除了能促进它们自身的黏附定植外,对其他低黏附率的乳杆菌也具有提高黏附率促进定植的作用。然而就具体的生物功效,如抗过敏、促进巨噬细胞吞噬能力等功效而言,这些高黏附率的乳杆菌却相对较弱,甚至没有。通过产表面活性剂的菌种的培养上清液使其他具特定生物功效的菌种黏附定植在黏膜上是发挥益生菌更大作用的革命性、创造性方案。添加其他表面活性剂或去离子水将表面张力调整到合理的范围,会使该促黏附作用进一步提高。
作为上述方案的补充,优选的为去掉菌体的培养液,其次是裂解灭活的培养液。活的高黏附率乳杆菌菌体对黏膜的占位作用,无疑会降低生物功效较高的(低黏附率)目标乳酸菌的黏附定植率,也就会降低本方案提高目标益生菌黏附率的技术效果。但是,不抛弃产E-BS乳酸菌菌体的这种方式无疑会减少成本和工艺难度,某些状况下也不失为一类次选方案。
可选的,在本发明的一些实施方案中,上述微生物黏附率调节剂包括NaCl,NaCl在所述微生物黏附率调节剂中的含量为2-60g/Kg或2-60g/L。适宜浓度的NaCl可调整微生物黏附率调节剂作用在黏膜时的渗透压,防止使用本发明提供的微生物黏附率调节剂作用在黏膜时发生水肿。
可选的,在本发明的一些实施方案中,上述微生物黏附率调节剂的pH为3-7,微生物黏附率调节剂的pH可通过添加柠檬酸或乳酸等物质调节。低pH环境有助于提高微生物例如益生菌的生长。
另一方面,本发明提供了上述微生物黏附率调节剂在调节微生物的黏附率中的应用。
可选的,在本发明的一些实施方案中,调节微生物的黏附率是指调节微生物作用在黏膜或皮肤上的黏附率。
可选的,在本发明的一些实施方案中,上述微生物为益生菌,调节微生物的黏附率是指提高上述益生菌作用在黏膜或皮肤上的黏附率。
本发明的微生物黏附率调节剂在调节微生物的黏附率应用中的使用方式包括如下:将益生菌在微生物黏附率调节剂中浸泡1-10h,取出后,将浸泡后的益生菌作用在黏膜上;或者是,将益生菌与微生物黏附率调节剂混合后,形成益生菌制剂,将该益生菌制剂作用在黏膜上。或者是;将微生物黏附率调节剂单独作用在黏膜上。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述微生物为致病菌或条件致病菌,调节微生物的黏附率是指降低上述致病菌或条件致病菌与黏膜或皮肤的黏附率。
可选的,在本发明的一些实施方案中,上述黏膜包括呼吸道黏膜、消化道黏膜、阴道黏膜、口腔黏膜和眼角膜中的至少一种。
另一方面,本发明还提供了上述的微生物黏附率调节剂在制备益生菌制剂中的应用。
进一步地,该益生菌制剂含有上述的微生物黏附率调节剂和益生菌。
另一方面,本发明还提供了一种益生菌制剂(或者称为微生态制剂),用于作用于黏膜或皮肤,其包括益生菌和上述的任一种微生物黏附率调节剂。
可选的,在本发明的一些实施方案中,上述益生菌制剂的作用位置即黏膜包括呼吸道黏膜、消化道黏膜、阴道黏膜、口腔黏膜和眼角膜中的至少一种。
可选的,在本发明的一些实施方案中,上述益生菌制剂包括呼吸道益生菌制剂。
呼吸道黏膜上的呼吸道黏液纤毛传输系统(Mucociliary Transport System、MCT),由不断传输动力的纤毛与黏液的溶胶层、凝胶层构成。纤毛越过溶胶层不断刷动凝胶层,承载呼吸道异物的凝胶层不断移向咽部或鼻孔,而排出呼吸道。这一过程并不是太长,通常在10-30分钟左右。通过糖精实验等手段很容易测得。如果发生神经反射导致的喷嚏或咳嗽时,这一排出异物的速度会更加迅速。
这样的移动速度,对于直接作用呼吸道,通过水悬液及其雾滴投放的益生菌。在短时间内接触到呼吸道黏膜细胞,并与其黏附受体形成黏附,是益生菌定植呼吸道,发挥其生物活性的基础。
基于此,为了克服现有的直接作用呼吸道黏膜的益生菌制剂存在难以黏附的不足,一方面,本发明提供的益生菌制剂包括呼吸道益生菌制剂,其用于直接作用于呼吸道黏膜。
该呼吸道益生菌制剂含有上述的表面活性剂,其对呼吸道黏液的溶胶层和凝胶层产生改性,提高了益生菌接触呼吸道黏膜细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了益生菌的细胞表面疏水性(CSH),提高了这些益生菌与呼吸道黏膜上皮细胞的黏附率,从而解决了现有技术中益生菌难以在纤毛传输系统驱除下定植于呼吸道黏膜的技术瓶颈。因此,本发明提供的呼吸道益生菌制剂中的所含益生菌在呼吸道黏膜上具有较高的黏附率,易于定植在呼吸道黏膜,有利持续长久地发挥生物功效。
可选的,在本发明的一些实施方案中,上述益生菌制剂还包括消化道益生菌制剂、阴道益生菌制剂,口腔益生菌制剂、皮肤益生菌制剂和眼角膜益生菌制剂中的至少一种。
其中,呼吸道益生菌制剂适于作用于呼吸道黏膜,消化道益生菌制剂适于作用于消化道黏膜,阴道益生菌制剂适于作用于阴道黏膜,口腔益生菌制剂适于作用于口腔黏膜,眼角膜益生菌制剂适于作用于眼角膜。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述益生菌是乳酸菌,上述益生菌制剂中上述乳酸菌的含量为1×104~1×1012个/g。
采用乳酸菌的益生菌制剂能作用于黏膜(例如黏膜包括呼吸道黏膜、消化道黏膜、阴道黏膜、口腔黏膜和眼角膜),调整黏膜微生态,与黏膜细胞交互作用产生生物功效的乳酸菌较多,研究比较多的包括以下乳酸菌:唾液乳杆菌可降低IgE,用于抗过敏;干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌,用于提高巨噬细胞的吞噬能力;戊糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌,用于吸附苯并芘;婴儿双歧杆菌,用于自行移行抑制癌细胞;乳酸链球菌,可产生抑菌素,用于抑制有害菌;大部分乳酸菌都能在黏膜表面形成生物膜云屏障,占位拮抗有害菌的定植,减少黏膜与抗原的接触,是黏膜不可或缺的有益微生物。
需要说明的是,本发明上述提供的益生菌制剂中的益生菌的类别并不限于上述类别的乳酸菌,设计者可根据菌的特性或用途,采用相应的菌作为益生菌。例如益生菌可以是乳酸杆菌或酵母菌、芽孢杆菌等,甚至是其他类别的菌,更甚至是灭活的益生菌或灭活的条件致病菌,更甚至是DNA重组菌,其均属于本发明的保护范围。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述益生菌为重组乳酸菌。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述重组乳酸菌为含有外源DNA的婴儿双歧杆菌。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述益生菌为干酪乳酸杆菌。
干酪乳杆菌的脂磷壁酸(LTA)和胞外多糖(EPS)既能促进巨噬细胞的吞噬中性红的量。这意味着干酪乳杆菌及其灭活体可以提高黏膜免疫能力,即对病毒和病菌的杀伤能力,这是对抗感冒,抗疾病传染的有力手段。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述益生菌为乳酸杆菌。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述乳酸杆菌为唾液乳酸杆菌。
另一方面,本发明提供了一种用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗牙周炎或治疗细菌性胃炎的药物,其含有上述的益生菌制剂。
另一方面,本发明提供了上述的益生菌制剂在制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗牙周炎或治疗细菌性胃炎的药物中的应用。
另一方面,本发明提供了一种治疗鼻炎或治疗哮喘或治疗过敏性皮炎或治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗牙周炎或治疗细菌性胃炎的方法,其包括:用上述的益生菌制剂接触个体的黏膜。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述黏膜包括呼吸道黏膜、消化道黏膜、阴道黏膜、口腔黏膜和眼角膜中的一种。
可选地,在本发明的一些实施方案中,上述呼吸道黏膜包括鼻腔黏膜、气管黏膜或支气管内表面的黏膜中的一种或几种。
上述的益生菌制剂的储运方法,其包括以下步骤:
步骤a:将上述的微生物黏附率调节剂消毒灭菌并定量密封包装;
步骤b:将步骤a中包装后的微生物黏附率调节剂与定量包装的冻干益生菌以非混合状态储存和运输;
步骤c:使用时,将微生物黏附率调节剂与冻干益生菌,在72小时内共同给予作用部位。
本发明提供的益生菌制剂的储运方法,保存期可长达24个月,且其中活性益生菌含量及遗传稳定性可靠,不会再产生涨袋和后酸化等技术问题。
综上,本发明提供的微生物黏附率调节剂,适于调节微生物的黏附率,其含有表面活性剂,表面活性剂的浓度低于表面活性的临界胶束浓度。该表面活性剂可对黏膜的黏液层和皮肤的脂质膜产生改性,提高了微生物例如益生菌接触黏膜细胞或皮肤细胞的概率和速度。同时该表面活性剂还可改变微生物例如益生菌的细胞表面疏水性,提高了益生菌与黏膜上皮细胞或皮肤表皮细胞的黏附率,易于使益生菌定植在黏膜和皮肤表面,有利益生菌持续长久地发挥功能。此外,通过提高益生菌的黏附可以拮抗致病微生物和条件致病微生物的黏附,从而减小致病微生物和条件致病微生物进一步的定植和感染,实现了少用或不用抗生素的情况下预防和治疗大量疾病的作用,该微生物黏附率调节剂具有广阔的应用前景。
该微生物黏附率调节剂可用于提高益生菌在呼吸道黏膜、消化道黏膜、阴道黏膜、口腔黏膜、眼角膜以及皮肤上的黏附率,也可用于制备益生菌制剂例如呼吸道益生菌制剂、消化道益生菌制剂、阴道益生菌制剂,口腔益生菌制剂、皮肤益生菌制剂以及眼角膜益生菌制剂,所制得益生菌制剂中的益生菌具有较高的黏附率。尤其是呼吸道益生菌制剂,其对呼吸道黏液的溶胶层和凝胶层产生改性,提高了益生菌接触呼吸道黏膜细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了益生菌的细胞表面疏水性,提高了这些益生菌与呼吸道黏膜上皮细胞的黏附率,从而解决了现有技术中益生菌难以在纤毛传输系统驱除下定植于呼吸道黏膜的技术瓶颈。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,其含有表面活性剂,表面活性剂为地衣素(lichenysin)。该微生物黏附率调节剂为液体型,其表面张力为55mN/m。
1.1该微生物黏附率调节剂参考如下方法制备:
1.1.1选取唾液乳杆菌菌株(Lactobacillus salivarius,ATCC 11741)进行培养。培养条件:28℃,接种量为5%,培养基采用MRS,厌氧培养,MRS培养基初始pH为5.5,培养15h。
1.1.2培养结束后,4500rpm离心10min,收取唾液乳杆菌菌体。
1.1.3选取地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis,ATCC 39307)进行培养,以获取含脂肽尤其是含地衣素的培养液(来自微生物的天然表面活性剂)。培养基配方:可溶性淀粉20.0g/L,NH4NO3 4.0g/L,KH2PO4 3.0g/L,Na2HPO4 3.0g/L,酵母粉0.5g/L,FeSO46.8μmol/L,ZnSO4 0.038mmol/L,CaCl2 0.5mmol/L,MgSO4 0.2mmol/L,MnSO40.02mmol/L,EDTA50μmol/L,pH 7.4;500ml三角瓶的装液量为200ml,接种量5.0%,培养温度37℃,培养时间48h左右。
1.1.4培养到预定时间,确定培养液的表面张力下降到50mN/m以下后,取培养液,8000rpm离心20min,除菌体两次,取上清液。所获的上清液用浓HCl调pH至2.0,出现絮状沉淀,4℃静置过夜,10000rpm离心30min收集沉淀,用pH2.0的酸水洗涤一次。随后将该沉淀溶于NaOH溶液,使pH值为7.0,冷冻干燥,得地衣素(lichenysin)粗品。然将上述粗品置CH2Cl2中抽提后,减压蒸干,稀NaOH溶液溶解,形成多泡液体,使用JYN2200A自动界面张力仪确定表面张力为35.0mN/m左右。用WhatmanNo.4滤纸过滤上述多泡液体,滤液再次加HCl调pH至2.0后离心,取沉淀物。真空干燥去除沉淀物残留水分得纯化的地衣素。
通过对上述纯化的地衣素成分分析,确定该表面活性剂为:
环-[L-Gln1→D-Leu2→L-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7-β-OH脂肪酸]。(cyclo-[L-Gln1→D-Leu2→L-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7-β-OH fattyacid])
1.1.5将上述纯品地衣素0.5mg溶解在100ml去离子水中,配制成含地衣素5mg/L的溶液。在25℃的条件下使用JYN 2200A自动界面张力仪测量上述溶液的表面张力为55mN/m,加入NaCl 0.9g,加入乳酸调pH,用pH仪确定pH值为5.5,从而得到本实施例的微生物黏附率调节剂,其中,地衣素的含量为5mg/L,低于其临界胶束浓度(CMC)27mg/L。
此外,本实施例还提供了一种益生菌制剂,该益生菌制剂含有益生菌和本实施例提供的微生物黏附率调节剂。
本实施例提供的益生菌制剂通过如下方法制成:取本实施例得到的微生物黏附率调节剂溶液100ml,加入步骤1.1.2得到的唾液乳杆菌菌体混匀,并用分光光度仪确定唾液乳杆菌含量为1×108CFU/ml,从而得到本实施例的可作用于呼吸道的益生菌制剂。
本实施例提供的益生菌制剂其用于直接作用于呼吸道黏膜,包含表面活性剂和益生菌。其中,益生菌为唾液乳杆菌,表面活性剂为地衣素(lichenysin),其中,唾液乳杆菌浓度为1x108CFU/ml,地衣素含量为5mg/L,表面张力为55mN/m,NaCl含量为9g/kg,pH为5.5。该益生菌制剂为水悬剂。
1.2本实施例提供了上述地衣素对益生菌的细胞表面疏水性(CSH)影响的检测
1.2.1采用碳烃化合物黏着技术(WATH)检测上述唾液乳杆菌菌体的疏水性:
取前述步骤1.1.2得到的唾液乳酸菌菌体用无菌的NaCl溶液洗涤4次(溶液以去离子水配制为0.5mol/L)。真空冷冻干燥后,称取100mg唾液乳杆菌菌体,在50ml含100mmol/L的NaHCO3溶液中,30℃,震荡处理1h后。加1ml正十六烷至上述溶液中,37℃,振荡处理1h,4000rpm离心6min,将沉淀真空冷冻干燥后准确称量得到重量为C,计算黏附率B=(100-C)%。重复3次,结果取平均值,以(平均值±标准方差)%来表示。
结果测得上述唾液乳杆菌菌体的细胞表面疏水性为(22.62±1.63)%。
将前述步骤1.1.2收取的唾液乳酸菌菌体用无菌的NaCl溶液洗涤4次(NaCl溶液以双去离子水配制,浓度0.5mol/L)。真空冷冻干燥后,称取100mg唾液乳杆菌菌体,混合在50ml含100mmol/L的NaHCO3且含地衣素5mg/L的溶液中,30℃,震荡处理1h。加1ml正十六烷至上述溶液中,37℃,振荡处理1h,4000rpm离心6min,将沉淀真空冷冻干燥后准确称量得到重量为C(mg),计算黏附率B=(100-C)%。重复3次,结果取平均值,结果以平均值±标准方差来表示。结果测得经含5mg/L地衣素溶液处理的唾液乳杆菌,表面疏水性为(71.61±2.35)%。
结果表明,经过含地衣素5mg/L、表面张力为55mN/m的溶液处理的唾液乳杆菌,表面疏水性显著高于未经地衣素溶液处理的唾液乳杆菌。差异具有统计学意义(p<0.05)。益生菌的细胞表面疏水性的提高意味着其黏附率的提高。
1.3本实施例提供了上述微生物黏附率调节剂提高益生菌对人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率检测
1.3.1人鼻息肉手术时取鼻息肉黏膜。用PBS冲洗,去除黏液、血液、坏死组织和黏膜下组织,留取黏膜层。用4℃无菌PBS溶液反复冲洗浸泡3遍。加入0.1%胶原酶Ⅰ型吹打后,在37℃消化30min。轻轻吹打消化后的黏膜组织,使上皮细胞脱落,移除黏膜块。将细胞悬液进行1000rpm,4℃,离心5min。弃上清。向沉淀中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1,含1×105U/L青霉素,100mg/L链霉素)培养液。轻轻吹打后将细胞悬液接种于培养板中,置37℃饱和湿度CO2细胞培养箱中培养。每2天换一次培养液,培养7天。
1.3.2将上述培养好的人鼻黏膜细胞(HNE)用胰酶-EDTA消化液进行消化,之后用DMEM完全营养液调整细胞浓度为1.0×105个/ml,装于6孔组织培养板的3个孔中,每孔2ml,于5%CO2,95%空气培养箱中37℃孵育至细胞长至单层。弃去组织培养板中各孔的DMEM营养液,并用无菌PBS缓冲液洗培养板2遍。
1.3.3其中1个孔用0.5ml胰酶-EDTA消化液进行消化后,加入0.5ml PBS,用微量振荡器振荡并用移液枪吹打,使细胞完全消化下来并混匀,血球计数板计算细胞浓度。另外两个孔,一孔再加入1ml DMEM原液和1ml无菌FBS缓冲液调整的唾液乳杆菌菌悬液(1×108CFU/ml),作为对照;另一孔加入1ml DMEM原液和1ml本实施例提供的益生菌制剂(唾液乳杆菌浓度为1×108CFU/ml,含微生物黏附率调节剂)。两孔用移液枪吹打混合,于厌氧培养箱中,37℃孵育2h。
1.3.4孵育后弃去组织培养板中各孔的混合液,用无菌PBS缓冲液洗涤5次,以除去未黏附的益生菌。加入0.4ml胰酶-EDTA消化液进行消化后,加入0.6ml无菌PBS缓冲液,进行梯度稀释,甲醇固定15min,革兰氏染色,平板计数计算黏附的细菌数。按照以下公式计算不同菌悬液的黏附率:黏附率(CFU/cel1)=黏附细菌数/细胞数。结果如下。
本实施例提供的益生菌制剂中的唾液乳杆菌,对人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率为(3.17±0.23)CFU/cell。而对照组用不含本实施例提供的微生物黏附率调节剂调整的唾液乳杆菌,黏附率为(1.78±0.17)CFU/cell。
由此可见,含有脂肽表面活性剂即地衣素(Lichenysin)的唾液乳杆菌菌悬液(即本实施例的益生菌制剂)中益生菌(唾液乳杆菌)对人鼻黏膜细胞的黏附率,高于不含该表面活性剂的菌悬液。差异有统计学意义(p<0.05)。
益生菌对黏膜细胞黏附率的提高意味着其生物效应的成倍提升。同时也意味着,益生菌有更多机会在黏液纤毛传输系统的快速驱除下定植黏膜,并发生作用。
已有的研究显示,唾液乳杆菌作用于黏膜可以提高IFN-γ的表达,降低血清IgE,具有较好的抗过敏功效。但是唾液乳杆菌较低的黏附率,直接作用于包含鼻腔的呼吸道黏膜有较大的技术障碍。而本发明通过加入表面活性剂例如脂肽尤其例如地衣素提高了唾液乳杆菌对鼻上皮细胞的黏附率,克服了这一技术障碍。因此,本实施例提供的益生菌制剂中的益生菌对呼吸道黏膜细胞尤其是鼻腔黏膜细胞具有更高的黏附率,易于定植在呼吸道黏膜,有利益生菌持续长久地发挥功能。也说明,本实施例提供的微生物黏附率调节剂尤其是浓度适当的地衣素提高了益生菌尤其是唾液乳杆菌在呼吸道黏膜尤其是人鼻腔黏膜细胞上的黏附率。
1.4本实施例提供的益生菌制剂的空白糖精试验
选3个月内无流鼻涕,无连续咳嗽,无连续打喷嚏现象的健康受试者36例。第1天全部进行空白糖精试验测试黏膜纤毛传输时间;休息6天,于第7天,再全部用生理盐水浸洗鼻腔后,间隔5min进行糖精试验测试黏膜纤毛传输时间;再休息6天,于第14天,则全部用本实施例提供的益生菌制剂浸洗鼻腔后,间隔5min进行糖精试验测试黏膜纤毛传输速率。第7天和第14天的浸洗鼻腔的液体用量均为200ml,浸洗时间均不低于15分钟。
比较3次糖精试验的黏膜纤毛传输速率。结果:用本实施例提供的呼吸道益生菌制剂浸洗鼻腔后黏膜纤毛传输速率为(13.97±2.15)mm/min,显著大于空白糖精试验(10.64±3.25)mm/min以及用生理盐水浸洗鼻后腔的黏膜纤毛传输速率(11.02±5.13)mm/min。差异均具有统计学意义(p<0.05)。
由此表明,本实施例提供的的益生菌制剂通过浸洗鼻黏膜直接作用于呼吸道,纤毛毒性比生理盐水更小(即本实施例提供的益生菌制剂没有纤毛毒性)。含生物表面活性剂的益生菌制剂还可以不断产生ATP供给纤毛细胞更多能量,促进其活动。本实验也说明,本实施例提供的益生菌制剂应用于呼吸道护理,可促进鼻黏膜纤毛传输系统从呼吸道排出有害异物。
1.5本实施例提供的益生菌制剂对变应性疾病患者血清中总IgE的影响
选血清IgE水平异常的变应性疾病患者36人。19人为变应性鼻炎患者,12人为变应性鼻炎合并哮喘患者,5人为过敏皮炎患者。纳入条件:各自的过敏症状明显,用酶联免疫吸附测定(ELISA)的血清IgE水平半年内未测得低于100IU/ml。排除条件:3个月内使用糖皮质激素等免疫抑制剂,3个月内服用益生菌制剂,益生菌食品。
将变应性疾病患者随机分为三组(实验组和盐水对照一组、无表面活性剂对照二组),每组12人。采用酶联免疫吸附(ELISA)测定血清IgE水平:常规空腹抽取静脉血2ml,置于未加抗凝剂的试管中,血凝后静置10min,经3000rpm,离心10min,分离血清,20℃冷藏备检。利用酶联免疫检测仪进行检测。运用统计软件SPSS13.0进行数据处理,结果以平均值表示。采用上述方法,于第1天检测三组的血清IgE水平,检测结果:实验组为:(511±93.54)IU/ml;盐水对照一组为:(507±95.32)IU/ml。无表面活性剂对照二组为(520±89.44)IU/ml
盐水对照一组连续21天,每天1次用生理盐水200ml浸洗每个患者的鼻腔下部。浸洗时间均不低于15分钟。于第22天,检测血清IgE水平。检测结果为(493±90.18)IU/ml。
无表面活性剂对照二组连续21天,每天1次用不含表面活性剂,唾液乳杆菌含量为1×108CFU/ml,NaCl 0.9g/L,ph值为5.5.的益生菌菌悬液200ml浸洗每个患者的鼻腔下部。浸洗时间均不低于15分钟。于第22天,检测血清IgE水平。检测结果为(302±98.01)IU/ml。
实验组则连续21天,每天1次用本实施例提供的益生菌制剂200ml浸洗每个患者的鼻腔下部。浸洗时间均不低于15分钟。于第22天,检测血清IgE水平,检测结果为(183±56.18)IU/ml。
根据上述检测结果可知:本实施例提供的益生菌制剂通过作用于鼻腔黏膜显著地降低了有IgE介导的变应性疾病患者的血清IgE水平(p<0.05)。本实施例提供的益生菌制剂比生理盐水降低IgE介导的变应性疾病的血清IgE水平更有效。差异具有统计学意义(p<0.05)。本实施例提供的益生菌制剂比不含表面活性剂的益生菌制剂降低IgE介导的变应性疾病的血清IgE水平也更有效。差异具有统计学意义(p<0.05)。
在鼻腔中,唾液乳杆菌不会面对消化液的灭杀。其对黏膜细胞的黏附率,在表面活性剂的作用下得到提升后,就能克服纤毛黏液传输的驱除而可靠地定植在呼吸道黏膜。这也表明本发明实施例提供的益生菌制剂作用于呼吸道,可应用来治疗IgE介导的变应性疾病,例如包括变应性鼻炎、变应性哮喘、变应性皮炎等疾病。
实施例2
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,其含有表面活性剂,NaCl,乳酸。表面活性剂为表面活性素(surfactin),含量为14.5mg/L,低于其临界胶束浓度(CMC)69mg/L,该微生物黏附率调节剂的表面张力为55mN/m,pH值为5.5。
2.1该微生物黏附率调节剂及相关益生菌制剂参考如下方法制备:
2.1.1选用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,ATCC 393)。接种过夜培养的新鲜菌液,接种至MRS培养基,接种量1%,培养温度28℃,培养箱中静置厌氧培养,培养15小时左右。培养结束后,4500rpm离心10min,收集干酪乳杆菌菌体。
2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,ATCC2233),在150ml三角瓶内装50ml培养液,灭菌后接种12h种子培养物,接种量2%,在37℃,静止培养。其中,斜面种子培养基(g/L)成分:牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、琼脂20、pH7.0;发酵种子培养基配方(按g/L计):葡萄糖10g/L、NH4NO3 4g/L、KH2PO4 4g/L、Na2HPO4·12H2O 12g/L、Mg2SO4 0.2g/L、CaCl21×10-3g/L、FeSO4 6×10-2g/L、MnSO4 6×10-1g/L、酵母膏1g/L、牛肉膏1g/L;发酵培养基(g/L)成分:葡萄糖40g/L、NH4NO3 4g/L、KH2PO4 4g/L、Na2HPO4·12H2O 12g/L、MgSO4 0.2g/L、CaCl2 1×10-3g/L、FeSO4 6×10-2g/L、MnSO4 6g/L、酵母膏1g/L、牛肉膏1g/L。培养42h后,4500rpm离心10min,去掉菌体。80℃水浴2小时,获得含表面活性素的培养液上清。通过用去离子水稀释无菌培养液上清,并用自动界面张力仪确定,获得表面张力为55mN/m的无菌培养液上清稀释液,比对表面活性素(surfactin)的“浓度-表面张力”曲线,确定上述培养液上清稀释液,表面活性素的对应浓度为14.5mg/L。
取上述含表面活性素14.5mg/L,表面张力为55mN/m的稀释无菌培养液上清100ml,加入NaCl 0.9g,加入乳酸,用pH仪确定pH值为5.5,从而得到本实施例提供的微生物黏附率调节剂。
本实施例还提供了一种益生菌制剂,其含有上述的微生物黏附率调节剂和干酪乳杆菌。其中,该益生菌制剂的表面张力为55mN/m,pH为6,NaCl含量为9g/L,表面活性素含量为14.5mg/L,干酪乳杆菌含量为1×108CFU/ml。
本实施例还提供的益生菌制剂按如下方法制备:取上述微生物黏附率调节剂100ml,加入干酪乳杆菌菌体,使其终浓度为1×108CFU/ml,用分光光度仪确定干酪乳杆菌含量为1×108CFU/ml,从而得到可作用于黏膜的益生菌制剂。
2.2本实施例提供的微生物黏附率调节剂对益生菌的表面疏水性检测:检测方法同步骤1.2。
结果:本实施例提供的经表面活性素处理的干酪乳杆菌的细胞表面疏水性(CSH)为(59.01±3.12)%,明显高于未经表面活性素处理的干酪乳杆菌的细胞表面疏水性(26.73±2.37)%。差异具有统计学意义(p<0.05)。
2.3本实施例提供的益生菌制剂的黏附率检测:方法同步骤1.3。
结果:本实施例提供的微生物黏附率调节剂处理的干酪乳杆菌对人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率为(5.13±0.21)CFU/cell,明显高于不含表面活性素(surfactin)的FBS缓冲液调整的干酪乳杆菌的黏附率为(2.11±0.38)CFU/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
2.4本实施例提供的益生菌制剂的抗呼吸道疾病传染实验
体外细胞实验显示:干酪乳杆菌的脂磷壁酸(LTA)和胞外多糖(EPS),都能促进巨噬细胞吞噬中性红的量。说明干酪乳杆菌具有激发和增强机体对病毒和病菌杀伤能力。可将本实施例的益生菌制剂作用在呼吸道,应用于防治病毒和/或病菌导致的感冒。当传染性感冒发生初期,将本实施例的益生菌制剂雾化喷洒在空中。陆生脊椎动物吸入后,雾滴中的干酪乳杆菌定植在呼吸道上,产生促进巨噬细胞吞噬的功效。本实施例的益生菌制剂可以保护吸入者,防治呼吸道感染,提高机体对感冒的抵抗力。
选择已发生了两位同学(2人)感冒的小学班级九个,每个班人数30人,学生年龄7-8岁。6个班级分为对照一组、对照二组和实验组,各3个。对照一组的2个班级,学生进教室前喷洒含乳酸的生理盐水,pH值为5.5。对照二组的2个班级,学生进教室前喷洒含干酪乳杆菌1×108CFU/ml和乳酸的生理盐水,pH值为5.5。实验组的2个班级,在学生进教室前喷洒本实施例的益生菌制剂。一周后,对照一组,后续发生感冒的人数,为(4.3±1.2)位。对照二组,后续发生过感染冒的人数,为(3.1±1.6)位。实验组,后续发生感染的人数,平均为(1.3±0.7)位。使用本实施例的益生菌制剂喷洒的班级,后续发生感冒的人数显著小于使用干酪乳杆菌菌悬液的班级。差异具有统计学意义(p<0.05)。更显著小于使用含乳酸生理盐水的班级。差异具有统计学意义(p<0.05)。
本实施例提供的益生菌制剂,可作为呼吸道益生菌制剂,应用于呼吸道疾病的防治,阻止感冒的蔓延。
2.5本实施例提供的益生菌制剂对消化道黏膜的黏附率检测。
将大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)复苏后,置于含有DMEM完全培养液的培养瓶中,于37℃、5%CO2培养箱中孵育,待细胞生长良好时,用消化液消化后传代。传代5次备用。
将培养好的大鼠小肠上皮细胞IEC-6用胰酶-EDTA消化液进行消化,之后用DMEM完全营养液调整细胞浓度为1.0×104个/ml,装于6孔组织培养板的4个孔中,每孔2ml,于5%CO2,95%空气培养箱中37℃孵育至细胞长至单层。弃去组织培养板中各孔的DMEM营养液,并用无菌PBS缓冲液洗培养板2遍。
其中1个孔用0.5ml胰酶一EDTA消化液进行消化后,加入0.5mlPBS,用微量振荡器振荡并用移液枪吹打,使细胞完全消化下来并混匀,血球计数板计算细胞浓度。
另外三个孔,其中第一孔再加入1mlDMEM原液,和1ml无菌FBS缓冲液调整的唾液乳杆菌菌悬液(1×108CFU/ml);其中第二孔则加入1ml DMEM原液,和1ml含有10g/L半乳糖的无菌FBS缓冲液调整的唾液乳杆菌菌悬液(1×108CFU/ml);其中第三孔则加入1ml DMEM原液和1ml本实施例提供的益生菌制剂。
三孔用移液枪吹打混合,于厌氧培养箱中,37℃孵育2h。孵育后弃去组织培养板中各孔的混合液,用无菌PBS缓冲液洗涤5次,以除去未黏附的益生菌。加入0.4ml胰酶-EDTA消化液进行消化后,加入0.6ml无菌PBS缓冲液,进行梯度稀释,平板计数计算黏附的细菌数。
结果,本实施例的益生菌制剂所含的干酪乳杆菌,对大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)的黏附率为(4.32±0.51)CFU/cell。
用FBS缓冲液调整的干酪乳杆菌,黏附率为(2.08±0.37)CFU/cell。
用含半乳糖的FBS缓冲液调整的干酪乳杆菌,黏附率为(0.58±0.13)CFU/cell。
由此可见,本实施例的益生菌制剂所含干酪乳杆菌,对大鼠小肠上皮细胞的黏附率显著高于单独给予干酪乳杆菌和低聚半乳糖共同给予的干酪乳杆菌的黏附率。差异具有统计学意义(p<0.05)。
本实施例的微生态制剂所含干酪乳杆菌,对大鼠小肠上皮细胞的黏附率更是显著高于合并糖类给予干酪乳杆菌的黏附率。差异具有统计学意义(p<0.05)。
由此可见,本实施例提供的益生菌制剂可作为消化道益生菌制剂,作用于消化道黏膜,提高益生菌例如干酪乳杆菌在消化道黏膜例如小肠细胞的黏附率。也说明,本实施例提供的微生物黏附率调节剂可以用于提高干酪乳杆菌作用在小肠细胞上的黏附率。
2.6本实施例提供的益生菌剂的调整免疫应答实验
选6周龄雄性昆明小鼠,分5组(10只/组):(1)空白组:全程PBS灌胃,(2)对照1组:全程干酪乳杆菌悬液灌胃(1×108CFU/d);(3)对照2组:全程含混合半乳糖10g/L的干酪乳杆菌悬液灌胃(1×108CFU/d);(4)对照3组:全程1:1干酪乳杆菌与嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)混合菌悬液灌胃(各1×108CFU/d);(5)实验组:全程采用本实施例提供的益生菌制剂(1ml/d)。
在实验第21天收集每只小鼠新鲜粪便,称重,用PBS以1:10稀释后室温孵育30min,混合后离心,按试剂盒说明以ELISA法测定sIgA。统计分析采用SPSS13.0软件进行统计处理。
结果,空白组小鼠粪便sIgA含量为(26.46±0.25)pg/ml,对照1组小鼠粪便sIgA含量为(27.11±0.20)pg/ml,对照2组小鼠粪便sIgA含量为(26.87±0.15),对照3组小鼠粪便sIgA含量为(26.56±0.32),实验组小鼠粪便sIgA含量为(28.97±0.24)pg/ml。
本实施例的细益生菌制剂作用于消化道,提高了sIgA分泌量,大于使用干酪乳杆菌单独给予时作用消化道,和混合半乳糖给予作用消化道,以及混合其他乳酸菌给予时,升高sIgA的分泌量。差异均具有统计学意义(p<0.05)。
本发明人出人意料地发现,本实施例的提供的益生菌制剂用于制备免疫系统调节药物,作用于消化道,对免疫系统的调节作用(产生的生物功效例如提高sIgA含量),比单独给予益生菌和混合糖类给予,以及混合其他低效乳酸菌给予时都更高。
2.7本实施例的微生物黏附率调节剂降低有害真菌对人皮肤角质层黏附率的实验
选取成年男性12人和成年女性9人,纳入条件:2年内未因真菌病接受治疗;排除条件:半年内服用和涂抹抗真菌药物、激素。
每位测试者采用胶带撕脱法各制备3条皮肤角质层剥离条,共30条置于玻片上,用作在人体皮肤角质层培养真菌的培养基。
红色毛癣菌(Trichophyton rubrum ATCC28188)培养活化后,用生理盐水稀释,并用8层纱布过滤,滤掉菌丝,镜下仅见孢子,配成最终菌含量控制在1×105个细胞/ml的菌悬液。
将30条皮肤角质层剥离条培养基,分为对照一组,对照二组,实验组,每组10条。
对照一组取红色毛癣菌菌悬液250μl,分别接种于前述皮肤角质层剥离条的中央,放于玻片上,收集后放置于玻璃平皿内的U型管上,放入少量生理盐水,并盖上盖子。置于37℃温箱孵育7d,相对湿度控制在90%。样本常规PAS染色后,观察。
对照二组,取红色毛癣菌含量为1×105个/ml,干酪乳杆菌含量为1×108CFU/ml的生理盐水混合菌悬液250μl,分别接种于前述皮肤角质层剥离条的中央,放于玻片上,收集后放置于玻璃平皿内的U型管上,放入少量生理盐水,并盖上盖子。置于37℃恒温箱孵育7d,相对湿度控制在90%。样本常规PAS染色后,观察。
实验组,取含红色毛癣菌1×105个/ml,干酪乳杆菌1×108CFU/ml的本实施例提供的微生物黏附率调节剂250μl,分别接种于前述皮肤角质层剥离条的中央,放于玻片上,收集后放置于玻璃平皿内的U型管上,放入少量生理盐水,并盖上盖子。置于相对湿度控制在90%,37℃恒温箱孵育7d。用生理盐水冲洗5遍,去掉未黏附的真菌菌丝。样本常规PAS染色后,观察测试。
光学显微镜中病菌涂片样品的图像经CCD摄像头转换为视频信号,传输到计算机中的图像采集卡,并转换为数字图像由计算机进行处理、储存。在4倍镜头下采取整个菌丝图形的全局图作为标准对照;然后换到40倍高倍镜头下,开始采集第1幅图像;此后在系统提示下,分别向上、向右、向下、向下、向左、向左、向上、向上移动标尺各2mm,分别采集上述部位的图像,以获得固定位置下的9幅图像。采用锐化法将图像中需要分离的菌丝部分与背景之间的对比度增强;采用高通滤波将图像的高频部分即菌丝面积进行保留,将低频部分滤除掉;采用阈值分割使图像二值化,即图中只剩黑白两色,黑色即是菌丝;采用中值滤波将背景中大部分的椒盐噪声消除,得到图像A。最后采用双阈值分割分离菌丝,首先将原始图像直接进行阈值分割,这次阈值分割的要求就是尽量用最大的阈值将没有噪声的菌丝图像分离出来。假设这次得到的图像为B。将B中的点作为种子点,利用这些点在图像A中寻找与之相连的像素,这样就可以通过这些种子点找出需要进行分离的菌丝图像。计算菌丝像素点的个数以代表菌丝的面积,实现对真菌样本图像的精确测量。
实验组和对照二组分别与实验一组的像素点差值,为其菌丝(面积)改变。
结果:实验组毛癣菌菌丝像素点数(面积)改变为176,894±16,580,大于实验二组的菌丝像素点数(面积)改变63,845±10,312,差异具有统计学意义p<0.05。
可见,本实施例的提供的含微生物黏附率调节剂的益生菌制剂,可以大幅减少致病真菌对皮肤角质层的黏附生长,比单独使用益生菌降低致病真菌黏附生长的能力更强。
2.8本实施例的益生菌制剂治疗脚癣的实验
选取脚癣患者360例,,男性185例,女性175例,年龄12~65岁,平均46.7岁,病程1个月~26年,平均5.2年,病位在双侧趾间272例,单侧趾问44例,足跟4例。随机分为三组:对照一组,对照二组,实验组,各120例。
三组每天温水洗脚,晾干后用安慰剂或药液涂搽患处一次,再次晾干。
洗脚晾干后,对照一组用消毒棉签蘸取生理盐水涂擦患处一遍;对照二组用消毒棉签蘸取含干酪乳杆菌1×108CFU/ml的生理盐水涂擦患处一遍;实验组,用消毒棉签蘸取本实施例提供的益生菌制剂涂擦患处一遍。连用7天。
按中国卫生部制定发布的标准判定。临床治愈:皮损、瘙痒、糜烂完全消失,皮屑镜检和真菌培养阴性。显效:皮损、瘙痒、浸渍糜烂基本消退,表面留有少许脱屑,未有新皮疹,皮屑镜检阴性或有少量破碎变形的孢子、菌丝,真菌培养阴性。有效:皮损、瘙痒、浸渍糜烂部分消退,皮屑镜检有少量孢子、菌丝,真菌培养阳性。无效:和治疗前相比较,各方面均无进步。
结果如下表1:
表1益生菌制剂抗黏附治疗脚癣7日疗效表
从表1可见,本实施例提供的益生菌制剂可用于抗有害菌对皮肤的黏附感染,疗效比单独使用益生菌菌悬液更好。
实施例3
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,其含有表面活性剂,NaCl,乳酸。表面活性剂为表面活性素,含量为16mg/L,低于其临界胶束浓度(CMC)69mg/L,该微生物黏附率调节剂的表面张力为40mN/m,pH为5.5,NaCl含量为9g/L。
3.1本实施例提供的微生物黏附率调节剂的制备方法同与实施例2中的步骤2.1基本相同。
此外,本实施例还提供了一种益生菌制剂,其含有上述的微生物黏附率调节剂和灭活的干酪乳杆菌。该益生菌制剂的表面张力为40mN/m,pH为5.5,NaCl含量为9g/L,表面活性素含量为16mg/L,灭活益生菌含量为1×108个/ml。
3.2本实施例提供的益生菌制剂的制备方法与实施例2中的步骤2.1基本相同,不同的是本实施例收取干酪乳杆菌菌体后,80℃热灭活20分钟,再将灭活的干酪乳杆菌菌体与无菌培养液上清制成益生菌制剂。
3.3本实施例提供的益生菌制剂中益生菌的细胞表面疏水性检测:检测方法同步骤1.2。益生菌选用含量为1×108个/ml的灭活干酪乳杆菌。
结果:本实施例提供的经表面活性素处理的灭活干酪乳杆菌的细胞表面疏水性为(57.38±6.32)%明显高于未经表面活性素处理的灭活干酪乳杆菌的细胞表面疏水性(29.37±7.02)%。差异具有统计学意义(p<0.05)。
3.4本实施例提供的益生菌制剂与呼吸道细胞-鸡气管上皮细胞(CTE)的黏附率检测:
CTE培养液:在DMEM/F12中加入终浓度分别为10μg/ml INS、0.1μg/ml HC、1mmo1/L谷氨酰胺、l0μg/m TF、25ng/ml人表皮细胞生长因子(EGF)牛垂体提取物(BP)、100IU/ml青霉素,100μg/ml链霉素、50IU/ml两性霉素B及10IU/ml庆大霉素,5%的胎牛血清。
鸡气管上皮细胞(chicken trachea epithelium,CTE)分离培养:选1日龄非免疫健康雏鸡。无菌取气管到肺门,细心剥离气管表面筋膜。用冰冷PBS反复冲洗,以气管苍白且无黏液为准。无菌棉线结扎支气管下端肺门处,从另一端向气管腔内注射0.1%链霉蛋白酶,气管充盈后结扎然后浸入冰冷DMEM/F12中,4℃消化10h,然后取出气管剪掉一端,收集细胞悬液,加10%胎牛血清终止酶反应,悬液分别经过400目筛、40μm滤器过滤,收集滤液,然后1000rpm离心8min。吸弃上清收集细胞沉淀。用CTE培养液把细胞吹打成悬液,接种到90mm细胞培养皿中,置37℃、体积分数为5%CO2培养箱中静置培养至72h时换液,以后每隔2~3d换液1次。培养7天。
将培养好的鸡气管上皮细胞(CTE)用胰酶-EDTA消化液进行消化,之后用无胎牛血清的CTE培养液调整细胞浓度为1.0×105个/ml,装于6孔组织培养板的3个孔中,每孔2ml,于5%CO2,95%空气培养箱中37℃孵育至细胞长至单层。弃去组织培养板中各孔的CTE培养液,并用无菌PBS缓冲液洗培养板2遍。
其中1个孔用0.5ml胰酶-EDTA消化液进行消化后,加入0.5ml PBS,用微量振荡器振荡并用移液枪吹打,使细胞完全消化下来并混匀,血球计数板计算细胞浓度。
另外两个孔,一孔再加入1ml无胎牛血清的CTE培养液,和1ml无菌FBS缓冲液调整的灭活干酪乳杆菌菌悬液(1×108个/ml);一孔再加入1ml无胎牛血清的CTE培养液和1ml本实施例的益生菌制剂。
两孔用移液枪吹打混合,于厌氧培养箱中,37℃孵育2h。孵育后弃去组织培养板中各孔的混合液,用无菌PBS缓冲液洗涤5次,以除去未黏附的益生菌。加入0.4ml胰酶-EDTA消化液进行消化后,加入0.6ml无菌PBS缓冲液,进行梯度稀释,甲醇固定15min,革兰氏染色,平板计数计算黏附的细菌数。
按照以下公式计算不同菌悬液的黏附率:黏附率(个/cel1)=黏附细菌数/细胞数
结果,用本实施例提供的微生物黏附率调节剂调整的灭活干酪乳杆菌,对鸡气管上皮细胞(CTE)的黏附率为(1.37±0.36)个/cell。
用不含表面活性素的FBS缓冲液调整的灭活干酪乳杆菌,黏附率为(0.59±0.15)个/cell。
由此可见,本实施例益生菌制剂中含有表面活性素(surfactin),表面张力为40mN/m处理的灭活干酪乳杆菌,对鸡气管上皮细胞(CTE)的黏附率显著高于不含该表面活性剂的灭活干酪乳杆菌单独与CTE的黏附率。差异具有统计学意义(p<0.05)。
3.5本实施例提供的益生菌制剂的抗呼吸道疾病传染实验
随机分配500只7日龄健康肉公鸡,到9个鸡舍。每个鸡舍50只鸡。随机选3个鸡舍作为对照一组,3个鸡舍作为对照二组,3个鸡舍作为实验组。所有鸡舍中喷洒含大肠杆菌的喷雾。当一个鸡舍有2只鸡出现禽大肠杆菌病症状后,停止喷洒大肠杆菌喷雾。对照一组,喷洒含乳酸的生理盐水,pH值为5.5。对照二组,喷洒含乳酸,且含灭活干酪乳杆菌(1×108个/ml)的生理盐水,pH值为5.5。3个实验组,喷洒本实施例的益生菌制剂。所有鸡舍每天喷洒3次,每次500ml。7天后,对照一组继续出现感染大肠杆菌的鸡只发病数为(13.2±3.6)。对照二组继续出现感染大肠杆菌的鸡只发病数为(8.4±4.2)。实验组的鸡只继续发病数为(1.4±0.8)。
上述结果显示:喷洒本实施例的益生菌制剂的鸡群继续发病的数量显著低于喷洒乳酸生理盐水和灭活干酪乳酸菌菌悬液的两个对照组。差异具有统计学意义(p<0.05)。这说明本实施例提供的益生菌制剂作用在呼吸道,灭活的干酪乳杆菌的脂磷壁酸(LTA)和胞外多糖(EPS),仍然可促进巨噬细胞的吞噬能力。有效地阻止了禽大肠杆菌疾病的传染,这也说明本实施例的益生菌制剂可应用于畜禽类例如鸡呼吸道疾病的防治。
实施例4
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,含有表面活性剂,NaCl,柠檬酸。表面活性剂为酸氯已定和表面活性素的复配,含醋酸氯已定为5mg/L,表面活性素浓度为14.5mg/L,低于两者复配的临界胶束浓度70μmol/L,该微生物黏附率调节剂的表面张力为40mN/m。
4.1本实施例提供的微生物黏附率调节剂的制备方法:取步骤2.1所述含表面活性素浓度为15mg/L的培养液上清稀释液100ml,按6g/100ml的比例加入NaCl后,再加入醋酸氯已定5mg/L,用自动界面张力仪确定表面张力,表面张力低于40mN/m用去离子水稀释调整,表面张力高于40mN/m则用培养液上清液调整,获取表面张力为40mN/m的复配型表面活性剂溶液。加入柠檬酸调pH,用pH仪确定pH值为6,从而得到微生物黏附率调节剂。
此外,本实施例还提供了一种益生菌制剂,其含有上述的微生物黏附率调节剂和灭活的干酪乳杆菌。
4.2本实施例提供的益生菌制剂的制备方法:取上述步骤4.1得到的微生物黏附率调节剂加入灭活干酪乳杆菌,并用分光光度仪确定干酪乳杆菌含量为1x109个/ml,从而得到可作用于呼吸道的益生菌制剂。本实施例提供的益生菌制剂含有灭活干酪乳杆菌1x109个/ml、醋酸氯已定为5mg/L,表面活性素浓度为15mg/L、表面张力为40mN/m,pH为6,NaCl浓度为60g/L。
4.3本实施例提供的益生菌制剂的表面疏水性检测:检测方法同步骤3.2,如下。
结果:经本实施例的复配表面活性剂处理的灭活干酪乳杆菌的细胞表面疏水性为:(52.47±5.54)%,明显高于未经表面活性素处理的灭活干酪乳杆菌的细胞表面疏水性(29.37±7.02)%。差异具有统计学意义(p<0.05)。
4.4本实施例提供的益生菌制剂的黏附率检测:方法同步骤3.3。结果用本实施例提供的微生物黏附率调节剂调整的灭活干酪乳杆菌,对鸡气管上皮细胞(CTE)的黏附率为(1.53±0.32)个/cell。显著高于不含表面活性剂的FBS缓冲液调整的灭活干酪乳杆菌黏附率(0.59±0.15)个/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
4.5本实施例用于治疗猪高热综合症的效果实验
猪高热综合症,是一种发病率和死亡率均较高的疾病,病猪临床主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲不振或废绝,呼吸困难、喘气,部分猪伴有皮肤发红变紫等症状,少数毛孔有出血点。猪病死前会出现肺炎症状。
选猪高热综合征的小猪48只,随机分3组治疗。对照一组16只,在小猪发高烧1天内,采用头孢,肌肉注射,每KG体重按0.15ml注射1次。换在干净的猪舍正常喂养,每天用生理盐水20ml,雾化喷入鼻孔三次;对照二组16只,在小猪发高烧1天内,采用头孢,肌肉注射,每KG体重按0.15ml注射1次,换入干净的猪舍,每天用灭活干酪乳杆菌含量为1x108个/ml的菌悬液20ml,雾化喷入鼻孔三次;实验组16只,在小猪发高烧1天内,采用头孢,肌肉注射,每KG体重按0.15ml注射1次,换入干净的猪舍,每天用本实施例的定植益生菌制剂20ml,雾化喷入鼻孔三次。
7天后,观察高热综合征的小猪进展,发生肺炎的比例。对照一组发生肺炎的比例为56.3%。对照二组发生肺炎的比例为31.3%。实验组为12.5%。头孢注射结合本实施例的益生菌制剂雾化治疗的高热综合征小猪肺炎发生率,显著低于单独使用头孢与头孢结合灭活干酪乳杆菌菌悬液雾化的对照组的肺炎发生率。
这说明本实施例提供的益生菌制剂作用呼吸道,有效地阻止了猪高热综合症的进程,这也说明本实施例的益生菌制剂可应用于畜禽类例如猪的呼吸道相关疾病的防治。
实施例5
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,其含有表面活性剂,表面活性剂为嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌产生的益生菌表面活性剂(E-BS)与鼠李糖脂(RL)的复配,低于其复配的临界胶束浓度62μmol/l,表面张力为55mN/m。
5.1本实施例提供的微生物黏附率调节剂的制备方法:
将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus ATCC4356)与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ATCC8014)分别接种到MRS培养基,37℃培养24h,活化2~3次。
植物培养基:木兰10g/L,茖葱10g/L,松茸10g/L,人参100g/L,萝卜100g/L;植物原料切碎后加入去离子水;臭氧消毒20分钟,静置30min,再加入低聚麦芽糖80g/L,NaCl38g/L,成为植物培养基。
在植物培养基中接种1%活化后的嗜酸乳杆菌菌种和1%活化后的植物乳杆菌菌种,在32℃厌氧培养24h。转入25℃厌氧培养12d以上。
用三层滤布过滤培养物,将滤液4500rpm离心20min,去除菌体。获得嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的耗尽培养液上清后。加入4倍去离子水稀释。
用JYN 2200A自动界面张力仪测试培养稀释液的表面张力。并用去离子水或鼠李糖脂调整发酵液的表面张力到55mN/m。得到本实施例的微生物黏附率调节剂。
此外,本实施例还提供了一种益生菌制剂,其含有唾液乳杆菌和本实施例提供的微生物黏附率调节剂。
5.2本实施例提供的益生菌制剂的制备方法:取本实施例的微生物黏附率调节剂,加入实施例1所述的唾液乳杆菌,并用分光光度仪确定唾液乳杆菌含量为1×107CFU/ml,加入乳酸调pH,用pH仪确定pH值为5.5,从而得到可作用于呼吸道的益生菌制剂。
本实施例提供的益生菌制剂,其用于直接作用于呼吸道黏膜,包括含表面活性剂的微生物黏附率调节剂、益生菌以及NaCl。其中,益生菌为唾液乳杆菌,表面活性剂为嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌产生的益生菌表面活性剂(E-BS)与鼠李糖脂(RL)的复配。该益生菌制剂表面张力为55mN/m,益生菌浓度1x107CFU/ml。
唾液乳杆菌有很好的抗过敏生物功效,但是黏附率低。嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌有很高的黏附率,但抗过敏的生物功效低。嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌产生的益生菌表面活性剂可以促进几乎整个乳酸杆菌属的菌株的黏附。因为培养过程的条件变化,益生菌表面活性剂的种类和配比复杂。在稀释后通常不一定是促进目标菌体黏附效果最佳的表面张力55mN/m,采用鼠李糖脂或去离子水调整,可以克服这一工艺障碍。
需要说明的是,鼠李糖脂也可以用下列表面活性剂中的一种或多种组合代替:海藻糖脂(trehalose lipids),槐糖脂(sophorolipid),甘露糖赤藓糖醇脂(MEL),表面活性素(Surfactin),地衣素(lichenysin),伊枯草素类(iturin),芬芥素(fengicin),大侧柏素(plipastatin),螺旋形素(spiroidesin),贝克塞雷(Bacircines),力波素(Liposan),张力素(Tensin),晕菌素(Halobacillin),标晕菌素(Isohalobacillin),代托西汀(Daitocidin),普米拉西汀(Pumilacidin),人参皂甙,茶籽皂甙,黄芪皂甙,无患子皂素,黄花败酱皂甙。
5.2本实施例提供的益生菌制剂中益生菌的细胞表面疏水性检测:检测方法同步骤1.2。选用1x107CFU/ml含量的唾液乳杆菌菌悬液测试。
结果:本实施例中的复配表面活性剂处理后的唾液乳杆菌表面疏水性为(93.31±4.24)%。显著高于不用益生菌表面活性剂处理的唾液乳杆菌(27.35±1.48)%。差异具有统计学意义(p<0.05)。
5.3本实施例提供的益生菌制剂的黏附率检测:方法同步骤1.3。用PBS调整的菌悬液含量选用1×107CFU/ml。
结果:本实施例提供的益生菌制剂中益生菌与人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率为(8.94±0.51)CFUcell,高于不含表面活性剂的菌悬液对人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率(1.13±0.28)CFU/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
5.4本实施例的益生菌制剂治疗变应性鼻炎的效果实验
以中华医学会耳鼻咽喉科分会的变应性鼻炎的诊断标准,选确诊为变应性鼻炎的120例患者,其中男67例,女53例;年龄最小者5岁,最大者56岁,平均35岁;病程最长十年,最短2年。排出条件:3个月内使用过抗生素,3个月内使用过糖皮质激素,服用过益生菌制剂者。
患者随机分为实验组(益生菌制剂浸洗组)40例,对照一组(生理盐水浸洗组)4例,对照二组(含益生菌的生理盐水浸洗组)40例。3组病例在性别、年龄、病程方面均无显著差别,具有可比性。
实验组,每天使用100ml本实施例所提供的益生菌制剂,浸洗鼻腔下部及后部。液体温度35℃,两个鼻孔交替灌洗,直到制剂到达口腔或另一个鼻孔,仰头让益生菌制剂流过鼻腔后部(鼻咽部)。洗完后带上口罩孵育半小时。连续浸洗7天,第9天进行体检。
对照一组,则使用生理盐水100ml,同上述方式浸洗,孵育7天,第9天体检。
对照二组,则使用含唾液乳杆菌1×107CFU/ml的生理盐水100ml,同上述方式浸洗,孵育7天,第9天体检。
参照变应性鼻炎疗效评定标准,症状按体征分级:下鼻甲与鼻底、鼻中膈紧靠,见不到中鼻甲,或中鼻甲黏膜息肉样变,息肉形成,记录3分;下鼻甲与鼻中膈(或鼻底)紧靠,下鼻甲与鼻底(或鼻中膈)之间尚有小缝隙,记录为2分;下鼻甲轻度肿胀,鼻中膈、中鼻甲尚可见,记录为1分。
根据治疗前后症状和体征记分的总和,改善的百分率按下列公式评定疗效:百分率=[(治疗前总分一治疗后总分)/治疗前总分]x100。如果百分率≥51为显效,21≦百分率介于≦50为有效,百分率≤20为无效。
从第9天的观测显示,治疗组:显效30例,有效8例,无效2例,显效率为75%,总有效率为95%;对照一组:显效2例,有效4例,无效34例,显效率为5%,总有效率为15%。对照二组:显效6例,有效15例,无效19例,显效率为15%,总有效率为52.5%。治疗组的显效率大于两个对照组。差异具有统计学意义(p<0.05)。
本实施例的益生菌制剂,其中的唾液乳杆菌具有提高鼻黏膜相关免疫组织IFN-γ表达,降低IgE的生物功效。另外,其在鼻黏膜上形成的益生菌菌膜,重建了鼻腔的微生物屏障。使鼻黏膜不直接面对刺激和抗原,可提高过敏原耐受阈值。本实施例的益生菌制剂用于治疗变应性鼻炎,有直击根本的功效。
其中,最典型的一位女性是十年的老鼻炎患者。先做了鼻甲手术,1年后复发,喷糖皮质激素,未见好转,后改为口服,后亦失效。当她的医生建议她注射糖皮质激素,并再做一次鼻甲手术时,被该女性拒绝。该女性患者参加了对比试验,被分到实验组。实验完毕,该女士的所有症状完全消失。患者声称:益生菌制剂救了她的鼻子。
参加治疗组的很多患者,有些已经并发哮喘或鼻窦炎,但是仍然得到改善。显效的患者,持续改善最长时间是3年不复发,最短的不复发时间也在3个月以上。普遍可以做到1年不复发。(经观察随访,复发原因,可能与雾霾加重和抗生素使用,导致鼻腔益生菌再次被破坏有关。复发患者用本实施例的益生菌制剂再次浸洗后,不到7天均很快好转)。
本实施例的益生菌制剂,用于治疗过敏鼻炎,具有特效。
实施例6
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,其含有表面活性剂,NaCl。NaCl含量为9g/L。表面活性剂为人参皂甙,人参皂甙含量为0.4g/L,低于其临界胶束浓度(CMC)5.8g/L。该微生物黏附率调节剂的表面张力为60mN/m。
6.1本实施例提供的微生物黏附率调节剂的制备方法:取去离子水100ml加入人参皂甙40mg。加入NaCl 0.9g,得到本实施例的微生物黏附率调节剂。
此外,本实施例提供了一种益生菌制剂,其含有重组婴儿双歧杆菌和本实施例提供的微生物黏附率调节剂。
6.2本实施例提供的益生菌制剂的制备方法:取本实施例的微生物黏附率调节剂,加入重组婴儿双歧杆菌菌体,并用分光光度仪确定重组婴儿双歧杆菌含量为1×107CFU/ml,得到用于抗癌的益生菌制剂。
其中,重组婴儿双歧杆菌通过如下方法制得:
核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因及PGEX-4T-1质粒分别取30μl,在10×buffer反应体系中使用EcoR I、Not I内切酶进行双酶酶切2h,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。根据DNA Marker的标志,使用刀片切取1.1kbp及5.0kbp长度的DNA凝胶片段。并将两段凝胶装入EP管中,分别利用凝胶提取纯化试剂盒说明回收其中所含的DNA基因。将回收的PGEX-4T-1目的载体和DCN目的基因分别取l0μl、30μl,加入到含2μl LT4DNA连接酶,5μl 10×buffer、3μl PEG4000反应体系中,22℃连接,4℃水浴过夜。获得质粒PGEX-4T-1-DCN。
将过夜培养的婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis ATCC 15697)接种于PYG培养基中。37℃厌氧培养至OD600=0.6,低温离心收集菌体。预冷去离子水清洗3次,10%甘油洗涤一次。然后加入7μl质粒PGEX-4T-1-DCN,补加10%甘油至100μl。将混合液盛于预冷的电击杯中,并置于冰上5min。将电穿孔仪调节至电场强度:20kV/cm、电容:25μF、电阻:200Ω,电击后使重组质粒转化入婴儿双歧杆菌。电击完毕,即刻向电击杯中加入lml PYG液体培养基,充分混匀,后将液体移至1.5ml EP管中,37℃厌氧培养1h,待目的载体充分表达后,将余下菌液平铺至一含氨苄青霉素的Bs固体培养基中,37℃厌氧环境培养。待72h后,从培养基中挑选出一生长良好的单菌菌落,接种至含氨苄青霉素的PYG液体培养基的试管中,37℃厌氧培养过夜,次日取出试管。获得DCN基因重组婴儿双歧杆菌。
本实施例提供的益生菌制剂表面张力为60mN/m,pH为7,含NaCl浓度为9g/L、含人参皂甙20mg/L。
6.3本实施例提供的益生菌制剂的疏水性检测:检测方法同步骤1.2。
结果:含人参皂甙0.4g/L的重组婴儿双歧杆菌(1×107CFU/ml)表面疏水性为(65.11±6.43)%,大于不含表面活性剂人参皂甙的重组婴儿双歧杆菌菌悬液(1×107CFU/ml)的表面疏水性(53.72±5.94)%。差异具有统计学意义(p<0.05)。
6.4本实施例提供的益生菌制剂的黏附率检测:
人鼻咽癌细胞株CNE-2培养在RPMI1640培养基中,加10%胎牛血清,青霉素100IU/ml,链霉素100ng/ml。培养条件:5%CO2,37℃。20ml玻璃培养小瓶接种20万细胞株CNE-2,24小时后达对数生长期,去旧液,2.5g/L胰蛋白酶消化成单个细胞悬液。
用RPMI1640培养基加10%胎牛血清的完全培养液调整CNE-2细胞浓度为1.0×105个/ml,装于6孔组织培养板的3个孔中,每孔2ml,在37℃,5%CO2培养24小时。孵育至细胞长至单层。弃去组织培养板中各孔的营养液,并用无菌PBS缓冲液洗培养板2遍。
其中1个孔用0.5ml胰酶-EDTA消化液进行消化后,加入0.5ml PBS,用微量振荡器振荡并用移液枪吹打,使细胞完全消化下来并混匀,血球计数板计算细胞浓度。
另外两个孔,一孔再加入1ml RPMI1640培养液,和1ml无菌FBS缓冲液调整的重组婴儿双歧杆菌悬液(1×107CFU/ml);一孔再加入1ml RPMI1640培养液和1ml本实施例的益生菌制剂。
两孔用移液枪吹打混合,于厌氧培养箱中,37℃孵育2h。孵育后弃去组织培养板中各孔的混合液,用无菌PBS缓冲液洗涤5次,以除去未黏附的益生菌。加入0.4ml胰酶-EDTA消化液进行消化后,加入0.6ml无菌PBS缓冲液,进行梯度稀释,甲醇固定15min,革兰氏染色,平板计数计算黏附的细菌数。
按照以下公式计算不同菌悬液的黏附率:黏附率(CFU/cell)=黏附细菌数/细胞数。
结果,本实施例的益生菌制剂中(含本实施例的微生物黏附率调节剂)的重组婴儿双歧杆菌对鼻咽癌细胞的黏附率为(6.58±0.32)CFU/cell,大于不含表面活性剂的重组婴儿双歧杆菌对鼻咽癌细胞的黏附率(4.87±0.44)CFU/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
6.5本实施例的益生菌制剂靶向治疗鼻咽癌的效果实验
选中国南方人鼻咽癌患者16位。纳入条件:CT扫描病灶尺寸在5mm-8mm,未扩散,未做放化疗。
随机分为三组。(重组婴儿双歧杆菌)对照一组8名,每天使用不含表面活性剂质的重组婴儿双歧杆菌1×107CFU/ml菌悬液10ml向鼻腔喷雾,一天2次。(人参皂甙)对照组8名,每天使用含人参皂甙0.4g/L的悬液10ml向鼻腔喷雾,一天2次。实验组,选用本实施例的益生菌制剂10ml向鼻腔喷雾,一天2次。
三组连续治疗1年,再次用CT扫描病灶尺寸。病灶尺寸不变或减小,不发生扩散者与小组人数的比率可视为1年保守治疗的显效率。本实施例提供的益生菌制剂的显效率达87.5%,显著大于(重组婴儿双歧杆菌)对照一组的显效率50%,和人参皂甙对照二组的显效率37.5%。
本实施例的益生菌制剂可用于靶向治疗鼻咽癌。通过鼻腔给药于咽部比通过注射更加安全有效。
实施例7
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,其含有表面活性剂,表面活性剂为辛夷提取物,该微生物黏附率调节剂的表面张力为65mN/m,辛夷提取物浓度为6.0g/L,低于其临界胶束浓度(CMC)16.2g/L,NaCl浓度为2g/L。
7.1本实施例提供的微生物黏附率调节剂的制备方法:取去离子水100ml,加入辛夷提取物0.6g,再加入NaCl 0.2g,溶解分散均匀,得到本实施例的微生物黏附率调节剂。
辛夷提取物中的香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷、3-甲氧基-4-羟基苯-1-O-β-D-葡萄糖苷、香草酸葡萄糖酯、苄基-O-β-D-半乳糖苷、3,4,5-三甲氧基苯-1-O-β-D-葡萄糖苷、苄基-O-β-D-葡萄糖苷是植物性表面活性剂物质。
本实施例还提供了一种益生菌制剂,其含有本实施例提供的微生物黏附率调节剂和乳酸乳球菌。其中,乳酸乳球菌浓度为1x105CFU/ml,益生菌制剂表面张力为65mN/m,辛夷提取物浓度为6.0g/L,NaCl浓度为2g/L。
7.2本实施例提供的益生菌制剂的制备方法:取本实施例的微生物黏附率调节剂100ml,加入含乳酸乳球菌(Lactococcus lactis EU147310)1×107CFU/g的冻干菌粉1g,得到本实施例的益生菌制剂。
7.3本实施例提供的益生菌制剂中益生菌的细胞表面疏水性检测:检测方法同步骤1.2。
结果:经过本实施例的辛夷提取物处理的乳酸乳球菌的细胞表面疏水性为(32.51±5.21)%,显著高于未经表面活性剂处理的乳酸乳球菌(1x105CFU/ml)的表面疏水性(22.31±1.67)%。差异具有统计学意义(p<0.05)。
7.4本实施例提供的益生菌制剂的黏附率检测:方法同步骤1.3。
结果:本实施例的益生菌制剂中乳酸乳球菌与人鼻黏膜细胞的黏附率为(2.21±0.07)CFU/cell,高于未经表面活性剂处理的乳酸乳球菌(1x105CFU/ml)的黏附率(1.07±0.14)CFU/cell。
7.5本实施例提供的益生菌制剂效果实验
选健康豚鼠20只,雌雄各半,体重350~450g。将豚鼠按体重随机分为实验与对照二组,每组10只。鼻超敏反应造模:先以10%二异氰酸甲苯酯(TDI)橄榄油溶液l0μl,用加样器滴入2组豚鼠双侧前鼻孔,每侧5μl,每日1次,连续5~7d后改为隔日给药1次。
造模成功后,对观察组豚鼠给予本实施例的益生菌制剂10μl,用加样器滴入豚鼠双侧前鼻孔,每侧各5μl.每日4次,连续10d。对照组以生理盐水滴入鼻孔,方法同上,给药时间同步。
鼻部症状观察从第1d给药开始,观察鼻部症状如鼻痒、喷嚏、流涕等症状出现的时间及轻重,并按以下标准评分记录:①鼻痒轻度:轻擦鼻几次,计1分;鼻痒中度:搔抓鼻面不止.计2分;鼻痒重度:鼻痒而四处擦碰计3分。②喷嚏,1~3个计1分,4~10个计2分,多于10个计3分。③流涕,流至鼻前孔计1分,超过鼻前孔计2分,涕流满面计3分。记录时以叠加法计总分,总共超过5分者为模型成功。于给药当时、给药后2h各观察30min.
结果显示,经过10d,动物计分>5者,实验组2只,对照组7只;计分≤5者,实验组8只,对照组3只。差异有显著意义(P<0.01)。
本实施例的益生菌制剂对过敏鼻炎有治疗作用。
实施例8
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,包含表面活性剂、NaCl,辛夷提取物,不含水。
本实施例还提供了另一种益生菌制剂,其用于直接作用于呼吸道黏膜,上述微生物黏附率调节剂,以及冻干益生菌;不含水。
将NaCl 0.2g,辛夷提取物0.5g混合均匀,辛夷提取物的浓度低于其临界胶束浓度(CMC)69mg/L。获得本实施例的微生物黏附率调节剂。该微生物黏附率调节剂为粉剂。
将含量1×107CFU/g的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis EU147310)包埋冻干菌粉1g,与上述微生物黏附率调节剂均匀混合在一起,获得本实施例的粉状益生菌制剂。该益生菌制剂也为粉剂。
使用时直接喷入鼻腔,或按质量比为1:50的比例(益生菌制剂与去离子水的比)将粉状的益生菌制剂分散在去离子水后,再喷入鼻腔。
本实施例提供的益生菌制剂干粉,按质量体积比为1:50的比例(益生菌制剂与去离子水的比)将粉状的益生菌制剂分散在去离子水后,获得与实施例7相同的液体益生菌制剂,与其属性功效相同。
实施例9
本实施例提供一种微生物黏附率调节剂和益生菌制剂。
本实施例提供的黏附率调剂节含有表面活性素、NaCl,表面活性素(surfactin)含量为14.5mg/L,低于其临界胶束浓度(CMC)27mg/L,NaCl含量为2g/L。
本实施例提供的益生菌制剂用于作用于消化道黏膜,含上述微生物黏附率调节剂、益生菌。其中,益生菌为干酪乳杆菌冻干粉,该益生菌制剂益生菌含量为1×109CFU/ml,溶解在100ml去离子水中的表面张力约为55mN/m。
9.1本实施例提供的益生菌制剂制备方法如下:
9.1.1将实施例2的干酪乳杆菌菌体制作为冻干菌粉。
配制冻干保护剂:甘氨酸1.0g/L,脱脂乳10.0g/L,海藻糖7.0g/L,山梨醇1.0g/L。将实施例2所述收取的干酪乳杆菌菌体分散在保护剂中。菌悬液预冻后冷冻干燥:分装厚度为4mm,预冻温度为-80℃,预冻时间为12h,冻干时间为8h。
9.1.2从实施例2中所述枯草芽孢杆菌培养液提取表面活性素制备微生物黏附率调节剂。
将实施例2获得的枯草芽孢杆菌培养液,离心去掉枯草芽孢杆菌菌体后,用浓盐酸将发酵液pH调到2,于4℃过夜,次日离心收集沉淀,并用二氯甲烷抽提,减压去除溶剂,而后通过重结晶进一步纯化,先将二氯甲烷提取物溶解蒸馏水中,并用NaOH将pH值调到7,然后用滤液过滤后,并用浓HCl将pH调至2,最后离心收集沉淀,获得表面活性素。
将上述表面活性素1.45mg,NaCl 200mg混合均匀,获得本实施例的微生物黏附率调节剂。
9.1.3将上述含干酪乳杆菌1×1011CFU/g的冻干干酪乳杆菌1g,上述本实施例的微生物黏附率调节剂全部装入肠溶胶囊中,从而得到本实施例的可作用于消化道的益生菌制剂。
需要说明的是,在其他的实施例中,可将干酪乳杆菌换为植物乳杆菌,嗜酸乳杆菌,鼠李糖杆菌,唾液乳杆菌、乳酸乳球菌,串珠明球菌,婴儿乳杆菌,青春乳杆菌等其他乳酸菌中的一种或多种组合的冻干菌粉,获得各种黏附率经过调节的益生菌制剂;
表面活性素(surfactin)可换成地衣素lichenysin,伊枯草素类(iturin),芬芥素(fengicin),大侧柏素(plipastatin),螺旋形素(spiroidesin),贝克塞雷(Bacircines),力波素(Liposan),张力素(Tensin),晕菌素(Halobacillin),标晕菌素(Isohalobacillin),代托西汀(Daitocidin),普米拉西汀(Pumilacidin),鼠李糖脂(Rhamnolipid),海藻糖脂(trehaloselipids),槐糖脂(sophorolipid),甘露糖赤藓糖醇脂(MEL),人参皂甙(Ginsenoside),茶皂甙(Teasaponin),黄芪皂甙(Astragaloside),大豆皂甙(soyasaponins),皂荚皂甙(gleditsiasaponin),无患子皂苷(SoapnutSaponin),麦冬皂苷(ophiopogonin),薯蓣皂甙(Dioscin),黄花败酱皂甙(scabioside)等表面活性剂物质中的一种或多种组合,控制其含量在溶解于100ml去离子水中,表面张力为40-60mN/m即可;
根据作用消化道的位置,可分别将本实施例提供的益生菌制剂制成粉剂,小肠溶解片,小肠溶解胶囊,大肠缓释包埋等剂型。可以得到多种生物功效,靶向作用于多个消化道器官的益生菌制剂。
9.2本实施例提供的益生菌制剂中干酪乳杆菌的疏水性检测:
将本实施例的益生菌制剂内容物分散在100ml去离子水中,作为本实施例所含益生菌的最终使用状态。检测方法同步骤1.2。
结果:本实施例提供的地衣素处理的干酪乳杆菌的表面疏水性为(42.39±4.36)%,高于单独给予的干酪乳杆菌的表面疏水性(25.12±1.38)%。差异具有统计学意义(p<0.05)。
9.3本实施例提供的益生菌制剂的黏附率检测:
将本实施例的益生菌制剂内容物分散在100ml去离子水中,作为本实施例所含益生菌的最终使用状态。检测方法同步骤2.5。
结果:本实施例的益生菌制剂所含的干酪乳杆菌,对大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)的黏附率为(3.76±0.49)CFU/cell。
用FBS缓冲液调整的干酪乳杆菌,黏附率为(2.08±0.37)CFU/cell。
用含半乳糖的FBS缓冲液调整的干酪乳杆菌,黏附率仅为(0.58±0.13)CFU/cell。
由此可见,本实施例的益生菌制剂所含干酪乳杆菌,对大鼠小肠上皮细胞的黏附率,高于单独给予干酪乳杆菌和低聚半乳糖共同给予的干酪乳杆菌的黏附率。差异具有统计学意义(p<0.05)。
本实施例的益生菌制剂所含干酪乳杆菌,对大鼠小肠上皮细胞的黏附率更是显著高于合并糖类给予的干酪乳杆菌的黏附率。差异具有统计学意义(p<0.05)。
9.4本实施例提供的益生菌制剂的调整免疫应答实验
按以下标准选取轮状病毒肠胃炎患儿180名①年龄1-2岁;②急性起病,病程2天内;③每日大便>4次,且粪便含水量较多;④大便镜检白细胞<5个/HP,志贺菌、沙门菌、空肠弯曲菌等均阴性,轮状病毒阳性。
180名患儿随机分为观察组60例、对照1组60例、对照2组60例
三组患儿均不使用干扰素,暂停乳类及双糖类食物。吐泻较重时用止吐剂及镇静剂。口服补液以纠正水和电解质紊乱。
实验组采用对症补液,并给予本实施例的益生菌制剂,1粒/次,3次/d,持续3天。对照一组采用对症补液,并口服空壳胶囊,持续3天。对照二组给予含干酪乳杆菌冻干菌粉1011CFU/粒的胶囊,1粒/次,3次/d,,持续3天。
疗效判定标准为显效:治疗72h内粪便性状及次数恢复正常;有效:治疗72h内粪便性状及次数明显好转;无效:治疗72h内粪便性状、次数及全身症状均无好转甚至恶化。
结果:实验组(显效48人)显效率80%,显著高于对照1组的(显效9人)显效率15%;也高于对照2组(显效19人)显效率31.7%。
对照1组(有效58人)总有效率96.7%,显著高于对照组的(有效23人)总有效率38.3%;也高于对照2组(有效29人)总有效率48.3%。
三组儿童于第3天,用采样瓶采集儿童清晨第一次粪便,准确称取待测粪便0.1g,加生理盐水lml成l:10稀释(重量比),置4度冰箱冻融稀释,以3000rmp,离心15分钟,取上清液0.l ml,加入盛有0.9ml生理盐水中.成1:100稀释液(体积比)。采用放射免疫(双抗体pEG)法测定SIgA。
测定结果为:实验组患儿第三天粪便中SIgA含量为(694.5±448.2)μg/g,大于对照二组的(369.4±147.6)μg/g,也显著大于对照一组的(292.3±102.4)μg/g。
可见,本实施例中的提供的益生菌制剂中的干酪乳杆菌更容易黏附于肠道黏膜,调整免疫更有效。进一步说明,本实施例的益生菌制剂可作为消化道益生菌制剂,可用于调整肠道菌群,调整肠道免疫,治疗轮状病毒性肠炎等消化道疾病。
实施例10
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,还提供了一种作用于阴道黏膜的益生菌制剂。
本实施例提供的益生菌制剂,其用于作用于阴道黏膜,其含微生物黏附率调节剂、益生菌。其中,益生菌为卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌,益生菌总含量为2×108CFU/ml。微生物黏附率调节剂含地衣素(lichenysin),NaCl和乳酸。该益生菌制剂的表面张力为40mN/m,地衣素含量为16mg/L,低于其临界胶束浓度(CMC)27mg/L,NaCl含量为9g/L,pH值为3.5。
其中,本实施例的微生物黏附率调节剂的制备方法如下:将1.6mg地衣素,0.9gNaCl,溶解在100ml去离子水中,加乳酸调整pH值,用pH仪确定pH值为3.5。
10.1本实施例提供的益生菌制剂制备方法如下:
10.1.1选用卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus ATCC33197),接种过夜培养的新鲜菌液,至MRS培养基,接种量2%,培养温度37℃,培养箱中静置厌氧培养,培养15小时左右。其中,MRS培养基成分:蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母膏5g,葡萄糖5g,乙酸钠5g,柠檬酸二胺2g,吐温-80 1g,磷酸氢二钾2g,硫酸镁0.2g,碳酸钙20g,琼脂20g,蒸馏水1L,初始pH6.8。培养结束后,4500rpm离心10min,收集卷曲乳杆菌菌体。
另选取詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii ATCC25258),采用上述相同方法和参数,获得詹氏乳杆菌菌体。
10.1.2按实施例1中的步骤1.1的相同方法,从地衣芽孢杆菌制备出地衣素(lichenysin)。
10.1.3在100ml本实施例提供的上述微生物黏附率调节剂中,加入等量的卷曲乳杆菌和詹氏乳杆菌,并用分光光度仪确定益生菌总含量为2×108CFU/ml,从而得到本实施例可作用于阴道的益生菌制剂。
10.2本实施例提供的益生菌制剂中卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌的平均疏水性检测:检测方法同步骤1.2。作为对比的卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌合并的菌体使用各50mg,共100mg替代。
结果:测得上述卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌1:1混合菌体的平均表面疏水性为(79.43±2.63)%。本实施例提供的表面活性剂,地衣素处理的卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌1:1混合菌体的平均表面疏水性为(96.25±0.33)%;显著高于卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌1:1混合菌体本来的平均表面疏水性。差异具有统计学意义(p<0.05)。
10.3本实施例提供的益生菌制剂的黏附率检测:
雌性新西兰大白兔,5月龄,体重2-3kg。肌注安定0.75mg/kg、氯胺酮25mg/kg。麻醉后,下腹部碘伏消毒。在耻骨联合上方,沿腹白线做5cm切口,暴露阴道,剪取1cm2阴道黏膜组织。用刀背轻刮标本黏膜表面,洗必泰浸泡5分钟,置于含双抗的D-Hanks液中漂洗。胶原酶IV 4℃消化过夜。将标本转移至超净台中,用眼科镊分离黏膜上皮层。胶原酶IV和胰蛋白酶混合消化液37℃消化30分钟,胎牛血清终止消化,D-Hanks液洗涤,过筛网。接种于K-SFM(含表皮生长因5ng/ml和牛垂体后叶素50μg/ml)培养液中,添加胰岛素10μg/ml,置于37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱静置培养。
第五天首次换液,以后每3天换液一次,细胞生长增殖至80-90%融合时进行传代。传代时弃去培养基,向培养皿中加人适量消化液0.25%胰蛋白酶,置于37℃中约5分钟,观察到细胞间隙增大,胞质回缩,细胞呈圆形、部分悬浮于消化液中时,胎牛血清中止消化。反复吹打培养皿底部,D-Hanks液冲洗,细胞悬液离心(1000rpm,5分钟)细胞计数后以1:3或1:4接种于新培养皿中,置于孵育箱培养6天。
将上述培养好的兔阴道上皮细胞用0.25%胰蛋白酶进行消化,之后用K-SFM培养液调整细胞浓度为1.0×105个/ml,装于6孔组织培养板的3个孔中,每孔2ml,于5%CO2,95%空气培养箱中37℃孵育至细胞长至单层。弃去组织培养板中各孔的K-SFM培养液,并用D-Hanks液洗培养板2遍。
其中1个孔用0.5ml 0.25%胰蛋白酶进行消化后,加入0.5ml D-Hanks,用微量振荡器振荡并用移液枪吹打,使细胞完全消化下来并混匀,血球计数板计算细胞浓度。
另外两个孔,一孔再加入1ml的K-SFM原液和1mlD-Hanks液调整的卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌1:1混合菌悬液(2×108CFU/ml),作为对照;另一孔加入1ml的K-SFM原液和1ml本实施例提供的益生菌制剂。两孔用移液枪吹打混合,于厌氧培养箱中,37℃孵育2h。
孵育后弃去组织培养板中各孔的混合液,用D-Hanks液洗涤5次,以除去未黏附的益生菌。加入0.4ml 0.25%胰蛋白酶进行消化后,加入0.6ml D-Hanks液,进行梯度稀释,平板计数计算黏附的细菌数
按照以下公式计算不同菌悬液的黏附率:黏附率(CFU/cel1)=黏附细菌数/细胞数。结果如下。
本实施例提供的益生菌制剂中的卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌1:1混合菌,对兔阴道上皮细胞的黏附率为(1.63±0.31)CFU/cell。显著大于对照组用D-Hanks液调整的卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌1:1混合菌,黏附率为(0.36±0.12)CFU/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
10.4本实施例提供的益生菌制剂治疗细菌性阴道炎的效果实验
选出符合育龄妇女、非经期限、妊娠期限、哺乳期条件的细菌性阴道病(BV)患者180例。平均年龄为(32.2±7.2)岁,病程为3d~3个月,平均18d。
筛选标准:符合以下四项标准中三项,第四项为必要条件:1)牛奶样白带;2)分泌物遇10%KOH呈鱼腥昧;3)pH>4.5;4)革兰氏染色找到线索细胞(Cluecell)。
实验组患者每晚睡前30分钟用本实施例的益生菌制剂100ml灌洗阴道,连用10天。用药期间禁止性生活,避免全身应用抗生素及阴道内用药。对照一组,换用乳酸林格氏液(Lactated Ringer's solution)100ml,灌洗阴道。对照二组,换用含卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌1:1混合菌体共2x108CFU/ml的乳酸林格氏液100ml灌洗阴道。
停药后3d复查临床症状、实验室检查。治愈:症状、体征消失,线索细胞(-),阴道pH值<4.5,10%KOH实验阴性;显效:症状、体征大部分消失,线索细胞(-),阴道pH值<4.5或10%KOH实验(-);有效:症状、体征部分消失,线索细胞(-);无效:症状、体征无改变,线索细胞(+),pH>4.5。
结果:实验组治愈42例,显效16例,有效1例,总有效率98.3%,无效1例;
对照二组治愈19例,显效22例,有效3例,总有效率73.3%,无效16例;
对照一组显效治愈2例,显效13例,有效6例,总有效率35%,无效39例;
由此可见,本实施例的益生菌制剂,治疗细菌性阴道炎的总有效率高达96.7%,显著大于使用同含量卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌1:1混合菌体的乳酸林格氏液的总有效率,也显著大于乳酸林格氏液的总有效率。均具有统计学意义。
10.5本实施例的益生菌制剂的其他形态
本实施例的益生菌制剂,也可以将1.6mg地衣素,0.9g的NaCl,含卷曲乳杆菌与詹氏乳杆菌1:1混合菌体1011CFU/g的冻干菌粉1g,固体乳酸(乳酸55%,乳酸钙45%)0.31g,装入胶囊中,制备而成。
内容物融化在100ml的无菌水中灌洗,或者优选为直接塞入阴道用药。
实施例11
本实施例提供了一种微生物黏附率调节剂,同时提供了一种益生菌制剂,其作用于口腔黏膜。
本实施例的微生物黏附率调节剂包括黄花败酱皂甙,NaCl。黄花败酱皂甙含量为55mg/L,低于其临界胶束浓度(CMC)7.5g/L,NaCl含量为2g/L,用自动表面张力仪测定该微生物黏附率调节剂的表面张力为45mN/m。
本实施例的提供的益生菌制剂,含上述微生物黏附率调节剂、益生菌。其中,益生菌为嗜酸乳杆菌,该益生菌制剂的表面张力为45mN/m,黄花败酱皂甙含量为55mg/L,益生菌含量为1×108CFU/ml。
11.1本实施例提供的益生菌制剂制备方法如下:
11.1.1选用嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus ATCC4356)接种于MRS培养基,挑取MRS平板上生长良好的单菌落接种于5ml MRS肉汤中,37℃静置培养过夜后,以体积百分数为2%的MRS菌液接种于5ml新鲜的MRS肉汤中,37℃静置培养5~7小时。以65℃水浴灭活30min,4500rpm离心lOmin,收取灭活的嗜酸乳杆菌菌体。
11.1.2黄花败酱的根茎用70%乙醇浸泡12h,加热回流3h,趁热过滤,浓缩滤液,回收乙醇。水溶液用正丁醇萃取3次(正丁醇:水=3:1),直至水溶液颜色变浅或无为止,合并正丁醇液进行减压蒸馏,回收正丁醇,直至正丁醇蒸干为止,得棕色黄花败酱总皂甙。
11.1.3称取上述黄花败酱皂甙5.5mg,在100ml去离子水中混匀,使用JYN2200A自动界面张力仪测量上述溶液的表面张力确定为45mN/m。
上述黄花败酱皂甙溶液中加入NaCl 0.2g,从而制备出本实施例的微生物黏附率调节剂。
在上述微生物黏附率调节剂100ml中,加入上述灭活嗜酸乳杆菌菌体混匀,并用分光光度仪确定灭活嗜酸乳杆菌含量为1×108个/ml,从而得到可作用于口腔黏膜的益生菌制剂。
11.2本实施例提供的益生菌制剂中干酪乳杆菌的疏水性检测:检测方法同步骤1.2。
结果测得用植物性表面活性剂,本实施例提供的黄花败酱皂甙处理的灭活嗜酸乳杆菌,表面疏水性为(72.11±5.82)%。显著大于未经皂甙处理的灭活嗜酸乳杆菌的表面疏水性(57.48±6.32)%。差异具有统计学意义(p<0.05)。
11.3本实施例提供的益生菌制剂的黏附率检测:
选用口腔上皮细胞株KB细胞,以步骤6.4中的方法培养细胞,后检测两种状态的嗜酸乳杆菌的黏附率。结果:本实施例提供的益生菌制剂中灭活嗜酸乳杆菌对口腔上皮细胞的黏附率为(8.57±1.03)个/cell,大于不含表面活性剂的灭活嗜酸乳杆菌对口腔上皮细胞的黏附率(5.26±0.54)个/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)
11.4本实施例的益生菌制剂治疗口腔疾病,防癌
按下列条件选取健康的成年男女自愿者180名,对其进行检查。纳入条件:(1)全身健康状况良好;(2)年龄在18~70周岁;(3)改良Quigley—Hein菌斑指数(plaqueindex,PLI)≥1.5;(5)L6e—Silness龈炎指数(gingivalindex,GI)≥1.0。排除条件:(1)过敏患者;(2)正在服用其他的药物;(3)在参加研究之前1个月内使用抗生素;(4)妊娠和辅乳期妇女。
随机分为3组;试验组,对照一组,对照二组各60人。全部试验对象进行洁牙后,每天使用相同牙膏刷牙一次,牙膏不含益生菌,不含中药成分。要求试验过程中不使用任何其他口腔卫生用品,如其他种类的牙膏、牙刷、漱口液、牙线。对饮食和抽烟不作限制。
实验组每天饭后和刷牙后,用本实施例的益生菌制剂20ml漱口,时间为30秒。实验一组,改用NaCl含量2g/L的去离子水溶液20ml漱口。实验二组改用NaCl含量2g/L,灭活嗜酸乳杆菌含量为1×108个/ml的去离子水配置的菌悬液20ml漱口。
3个月后,再次检测龈炎指数(GI)。结果:实验组,试验前龈炎指数(GI)为(1.57±0.32),3个月后龈炎指数(GI)为(1.01±0.21)。差异具有统计学意义(p<0.05)。对照一组,试验前龈炎指数(GI)为(1.48±0.22),3个月后龈炎指数(GI)为(1.43±0.31)。对照二组,试验前龈炎指数(GI)为(1.42±0.28),3个月后龈炎指数(GI)为(1.21±0.33)。
可见用本实施例提供的益生菌制剂漱口,显著减轻和消除了患者的牙龈炎。
灭活嗜酸乳杆菌,具有降低口腔致病菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)黏附的作用,用含有灭活嗜酸乳杆菌的菌悬液漱口,可以起到减少牙菌斑,抑制牙龈炎,达到促进口腔健康的作用。但是灭活嗜酸乳杆菌的对口腔黏膜细胞的黏附影响到这一生物效能的发挥,本实施例的益生菌制剂,使用了黏附率调剂剂,其中的表面活性剂,提高了灭活嗜酸乳杆菌的黏附率,因此提高了这一生物功效。鉴于具核梭杆菌明确的致癌作用,用本实施例提供的益生菌制剂漱口可有效防癌。
实施例12
本实施例提供的微生物黏附率调节剂,其用于直接作用于黏膜,包含表面活性剂,乳酸,NaCl。其中,表面活性剂为表面活性素(surfactin),含量为17mg/L,低于其临界胶束浓度(CMC)69mg/L,NaCl含量为2g/kg。该微生物黏附率调节剂为水溶液,表面张力为50mN/m。
12.1本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂的制备方法:
在100ml去离子水中加入表面活性素(surfactin)1.7mg,再加入NaCl 0.2g,从而获得表面张力为50mN/m的微生物黏附率调节剂。
12.2本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂降低幽门螺旋杆菌黏附率的实验
选取模式菌株幽门螺旋杆菌(Hp ATCC 43504),培养基为含8%羊血的幽门螺旋杆菌BHI培养基。培养时的气体条件为5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。
选取ATCC的HGC-27人胃癌细胞(Human Gastric Cancer cells),将含有1ml细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4ml培养基混合均匀。1000rpm离心4分钟,弃去上清液,补加2ml培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。细胞培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640(Gibco BRL)完全培养液,细胞置于含5%CO2、95%空气的CO2孵箱中,在37℃、95%湿度条件下培养。
将上述HGC-27人胃癌细胞接种于内置载玻片的含20%胎牛血清的RPMI1640培养液的6孔培养板中,待细胞密度达80%时,用无菌PBS缓冲液冲洗2次。
其中一个孔加入含幽门螺旋杆菌1×108CFU/ml的RPMI1640培养液,混匀作为基准对照组。另一个孔加入含表面活性素17mg/L,NaCl 2g/L(本实施例提供的微生物黏附率调节剂),含幽门螺旋杆菌1×108CFU/ml的RPMI 1640培养液,混匀作为实验组。
将上述6孔培养板在37℃,5%CO2环境中培养1h,然后洗涤3次,计数HP对HGC-27人胃癌细胞的黏附指数。用SPSS13.0处理数据。
结果:实验组的Hp对HGC-27人胃癌细胞的黏附指数为(4.39±2.84)CFU/cell,显著小于对照组的Hp对HGC-27人胃癌细胞的黏附指数为(13.92±4.36)CFU/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
可见,本实施例的微生物黏附率调节剂,可显著降低幽门螺旋杆菌对胃癌细胞的黏附率。微生物黏附率调节剂可直接用于降低致病菌对黏膜细胞的黏附率。
12.3本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂用于根除幽门螺旋杆菌的临床实验
选取消化性溃疡、慢性胃炎患儿186例。其中男102例,女84例;年龄7~16岁,平均(10.5±1.7)岁。慢性胃炎81例,消化性溃疡105例。将186例患儿随机分为三组,每组各62例。纳入标准:Hp检查阳性,均内镜黏膜活检及C-呼气试验证实;近1个月内未接受PPI及抗菌药物治疗;排除标准:严重的心肝肾功能障碍,PPI及相关药物过敏者。
所有患儿均采用标准三联疗法:埃索美拉唑镁肠溶片20mg空腹服用,2次/d,克拉霉素500mg餐后服用,2次/d,阿莫西林胶囊1g餐后服用,每天1次;对照组,增加饮用含NaCl0.2%的淡盐水,3次/d;实验组,增加饮用本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂20ml,3次/d。
治疗结束两周后复查Hp,记录三组患儿的HP根除率。并在1年后再次复查,观察三组患儿的复发率。结果:实验组患儿Hp根除率为89.7%,显著高于对照组的71.0%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。实验组患儿Hp一年复发率为19.7%,显著低于对照一组的34.9%,差异具有统计学意义(P<0.05)。
可见,本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂,配合标准三联疗法,可以提高对幽门螺旋杆菌的根除率,减少其复发。本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂直接作用于胃黏膜可用于治疗胃炎,胃溃疡,预防胃癌。
实施例13
本实施例提供的微生物黏附率调节剂,其用于改变益生菌的黏附率。其包含表面活性剂,NaCl。其中,表面活性剂为地衣素(lichenysin),含量为5mg/L,低于其临界胶束浓度(CMC)27mg/L,表面张力为55mN/m,NaCl含量为60g/kg,该细胞微生物黏附率调节剂为水悬剂。
13.1本实施例提供的微生物黏附率调节剂的制备方法:
按实施例1中步骤1.1.3-1.1.4的方法获取地衣素(lichenysin)0.5mg。溶解在100ml的去离子水中。加入6g的NaCl,从而获得微生物黏附率调节剂。其用于浸泡益生菌,其表面张力为55mN/m。
13.2本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂改变细菌表面疏水性检测
13.2.1按实施例1中步骤1.1.1-1.1.2的方法获得唾液乳杆菌菌体。
13.2.2将50g上述唾液乳杆菌菌体悬浮在本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂中。将上述细菌悬液置30℃,震荡处理1.5h。4500rpm离心20min,再次收集唾液乳杆菌菌体,获得经过本实施例的微生物黏附率调节剂进行表面处理过的唾液乳杆菌。
13.2.3如步骤1.2的方法分别测试经过本实施例提供的微生物黏附率调节剂浸泡再收取的唾液乳杆菌的表面疏水性,与未经浸泡的唾液乳杆菌的表面疏水性对比。实验中均不加入本实施例提供的微生物黏附率调节剂。
结果:经过本实施例提供的微生物黏附率调节剂浸泡处理的唾液乳杆菌的表面疏水性为(47.32±1.53)%。显著大于未经浸泡的唾液乳杆菌的表面疏水性(22.62±1.63)%。差异具有统计学意义(p<0.05)。
13.3本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂的黏附率调整效果检测
按步骤1.3的方法进行检测,结果显示,经过本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂浸泡处理后的唾液乳杆菌,用(不含地衣素的)FBS缓冲液调整后,对人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率为(2.67±0.16)CFU/cell。显著大于未经本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂浸泡处理过的唾液乳杆菌的黏附率(1.78±0.17)CFU/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
本实施例的细胞微生物黏附率调节剂浸泡上述唾液乳杆菌,在30℃,震荡处理益生菌1.5h。即使将黏附剂与益生菌分开,仍可改变益生菌的细胞表面疏水性,提高其与黏膜细胞的黏附率。
13.4本实施例的替代方案
本实施例的地衣素可以更换为其他表面活性剂的一种及组合。控制其浓度使溶液的表面张力为55mN/m,对益生菌浸泡于30℃,震荡处理1.5h,离心收取菌体后同样能改变益生菌的细胞表面疏水性,从而调整其对黏膜细胞的黏附率。相较于直接将表面活性剂与菌体混合后给予,本实施例的方法对表面活性剂的消耗量更小(本实施例提供的微生物黏附率调节剂可反复使用),而且避免了某些表面活性剂对黏膜的刺激和毒副作用。
可用于替换地衣素的表面活性剂至少包括下列表面活性剂的一种或多种组合:鼠李糖脂(Rhamnolipid),海藻糖脂(trehalose lipids),槐糖脂(sophorolipid),甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)、脂肽(Lipopeptide):表面活性素(Surfactin),地衣素(lichenysin),伊枯草素类(iturin),芬芥素(fengicin),大侧柏素(plipastatin),螺旋形素(spiroidesin),贝克塞雷(Bacircines),力波素(Liposan),张力素(Tensin),晕菌素(Halobacillin),标晕菌素(Isohalobacillin),代托西汀(Daitocidin),普米拉西汀(Pumilacidin),人参皂甙(Ginsenoside),茶皂甙(Tea saponin),黄芪皂甙(Astragaloside),甘草皂甙(Potenline),大豆皂甙(soyasaponins),皂荚皂甙(gleditsia saponin),无患子皂苷(Soapnut Saponin),麦冬皂苷(ophiopogonin),薯蓣皂甙(Dioscin),黄花败酱皂甙(scabioside)。
13.5本实施例提供的益生菌制剂的制备
配制冻干保护剂:甘氨酸1.0g/L,脱脂乳10.0g/L,海藻糖7.0g/L,山梨醇1.0g/L。将上述经过本实施例提供的细胞微生物黏附率调节剂浸泡处理的唾液乳杆菌菌体分散在保护剂中。菌悬液预冻后冷冻干燥:分装厚度为4mm,预冻温度为-80℃,预冻时间为12h,冻干时间为8h。可得到1×1011CFU/g的包埋冻干菌粉。将上述唾液乳杆菌包埋冻干粉0.1g装入肠溶胶囊,从而获得用于作用肠道黏膜的益生菌制剂。
13.5本实施例提供的益生菌制剂治疗咳嗽合并变应性哮喘的实验
选取咳嗽-变异性哮喘患者180例。男性97例,女性83例。年龄19~70岁,平均35.9岁,病程2-12个月,平均5.3个月.病情轻度49例,中度87例,重度44例。选取标准(1)周无明显诱因持续性咳嗽达个月以上,运动、冷空气及上呼吸道感染诱发其加重(2)组织胺或乙酞胆碱激发试验阳性(3)抗生素和止咳药均无效,用支气管解痉药或皮质类固醇类药物治疗有效(4)体格检查无阳性体征,胸片正常,肺通气功能正常,五官科检查未发现异常,既往无食管返流史和慢性支气管炎病史,受试前1个月未使用过类固醇激素治疗,未服用益生菌制剂。
随机分为三组。对照一组60例,服用空白胶囊每天三次,1枚/次。对照二组60例,服用含未经微生物黏附率调节剂浸泡处理的唾液乳杆菌冻干菌粉胶囊,每天三次,1枚/次。每枚含唾液乳杆菌1x108CFU。实验组60例,服用本实施例提供的益生菌制剂,每天3次,每次1枚。三组连续服用四周,为一个疗程。
治疗前后分别观察咳嗽状况,咳嗽按以下分度。轻度(+):间断咳嗽,不影响正常生活工作。中度(++):介于轻度和重度咳嗽之间。重度(+++):昼夜咳嗽频繁或阵咳,影响工作和睡眠。
疗效判定标准如下。治愈:咳嗽症状消失或不够轻度标准。显效:咳嗽症状由(+++)转为(++)或由(++)转为(-)。有效:咳嗽症状由(+++)转为(++)或由(++)转为(+)。无效:症状无变化或加重。
结果,实验组治愈率71.7%、总有效率90%分;对照一组,治愈率3.3%,总有效率8.3%;对照二组,治愈率51.7%,总有效率76.7%。实验组的治愈率和总有效率,都显著大于对照一组,对照二组。
可见,本实施例提供的唾液乳杆菌,经过本实施例提供的微生物黏附率调节剂浸泡处理后,生物功效得到了显著提高,可应用于治疗和防治变应性疾病,胃肠道和免疫性疾病。
本实施例中的益生菌及可反复使用的微生物黏附率调节剂,并不限于本实施例提供的菌种及表面活性剂。其他的乳酸菌,其他的生物表面活性剂或/和植物性表面活性剂,短暂的相互作用都可以长久改变益生菌的表面性质,提高其黏附率。本实施例对于提升益生菌的生物功效,提供了一个简单的捷径(相对于诱变和选育)。
实施例14
14.1本实施例的黏附率调节剂
按5.1提供的方法获得含表面活性剂的益生菌培养液,将其进行灭菌处理并定量密封装瓶,从而得到本实施例的黏附率调节剂。这种灭菌处理可在装瓶前或装瓶后进行,在本实施优选为装瓶后进行。灭菌参数优选为80℃,灭菌20min。
益生菌培养液,在本实施中,优选为去除菌体的培养上清液,在其他的实施例中也可保留菌体。
14.2本实施例提供了一种益生菌制剂的制备和储运方法。
按1.1的方法获得的唾液乳杆菌菌体,按9.1.1的方法制备为冻干菌粉,使用水溶胶囊或复合袋定量包装。将上述经灭菌的微生物黏附率调节剂与上述益生菌冻干菌粉分别保存。直到使用时在72h内进行混合(在其他的实施例中可优选为使用时在0.5h内混合),从而获得本实施例提供的益生菌制剂。
本实施例的益生菌制剂,在具有更好的粘附率及活性的同时,还具有良好的变异稳定性,(不会因为菌株在液体状态因过多的传代而影响生物活性及安全性)。同时还具有更长的保质期。
本实施例提供了一种益生菌制剂的储运方法,其特征在于包括下列步骤:
步骤a:将本实施例的微生物黏附率调节剂消毒灭菌并定量密封包装;
步骤b:将步骤a中包装后的微生物黏附率调节剂与定量包装的本实施提供的冻干益生菌以非混合状态储存和运输;
步骤c:使用时,将微生物黏附率调节剂与冻干益生菌,在72小时内共同给予作用部位。
上述微生物粘附率调节剂,包括含表面活性剂的细菌培养液。尤其包括含植物成分或/和动物乳汁的益生菌培养液。所述冻干益生菌不限于本实施例提供的菌株,尤其还包括可产表面活性剂的益生菌本身。所述共同给予包括将两者混合,以及在一定时间内分别或同时给予作用部位。
本实施例提供的益生菌制剂的储运方法,保存期可长达24个月,且其中活性益生菌含量及遗传稳定性可靠,不会再产生涨袋和后酸化等技术问题。
综上,本发明提供的微生物黏附率调节剂,适于调节微生物的黏附率,其含有表面活性剂,表面活性剂在微生物黏附率调节剂中的浓度低于表面活性的临界胶束浓度。该表面活性剂可对黏膜的黏液层和皮肤的脂质膜产生改性,提高了微生物例如益生菌接触黏膜细胞或皮肤细胞的概率和速度。同时该表面活性剂还可改变微生物例如益生菌的细胞表面疏水性,提高了益生菌与黏膜上皮细胞或皮肤表皮细胞的黏附率,易于使益生菌定植在黏膜或皮肤表面,有利益生菌持续长久地发挥功能。其可用于提高益生菌在呼吸道黏膜、消化道黏膜、阴道黏膜、口腔黏膜、眼角膜以及皮肤上的黏附率,也可用于制备益生菌制剂例如呼吸道益生菌制剂、消化道益生菌制剂、阴道益生菌制剂,口腔益生菌制剂、皮肤益生菌制剂和眼角膜益生菌制剂,所制得益生菌制剂中的益生菌具有较高的黏附率,尤其是呼吸道益生菌制剂,其对呼吸道黏液的溶胶层和凝胶层产生改性,提高了益生菌接触呼吸道黏膜细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了益生菌的细胞表面疏水性,提高了这些益生菌与呼吸道黏膜上皮细胞的黏附率,从而解决了现有技术中益生菌难以在纤毛传输系统驱除下定植于呼吸道黏膜的技术瓶颈。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种微生物黏附率调节剂,其特征在于,其适于调节微生物的黏附率,其含有表面活性剂,所述表面活性剂的浓度低于所述表面活性剂的临界胶束浓度。
2.根据权利要求1所述的微生物黏附率调节剂,其特征在于,所述微生物黏附率调节剂的表面张力小于65mN/m,可选地,所述微生物黏附率调节剂的表面张力为40-60mN/m。
3.根据权利要求1或2所述的微生物黏附率调节剂,其特征在于,所述表面活性剂选自生物表面活性剂和植物性表面活性剂中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的微生物黏附率调节剂,其特征在于,所述生物表面活性剂包括糖脂和脂肽中的至少一种,所述植物性表面活性剂包括糖苷和皂甙中的至少一种。
5.根据权利要求1或2所述的微生物黏附率调节剂,其特征在于,所述微生物黏附率调节剂包括细菌培养上清液,所述细菌培养上清液含有所述表面活性剂,所述微生物黏附率调节剂的表面张力为49-60mN/m。
6.权利要求1-5中任一项所述的微生物黏附率调节剂在调节微生物的黏附率中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,调节所述微生物的黏附率是指调节微生物作用在黏膜或皮肤上的黏附率。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述微生物为益生菌,调节所述微生物的黏附率是指提高所述益生菌作用在所述黏膜或所述皮肤上的黏附率。
9.根据权利要求7中所述的应用,其特征在于,所述微生物为致病菌或条件致病菌,调节所述微生物的黏附率是指降低所述致病菌或所述条件致病菌与所述黏膜或所述皮肤的黏附率。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的应用,其特征在于,所述黏膜包括呼吸道黏膜、消化道黏膜、阴道黏膜、口腔黏膜和眼角膜中的至少一种。
11.权利要求1-5中任一项所述的微生物黏附率调节剂在制备益生菌制剂中的应用。
12.一种益生菌制剂,其特征在于,用于作用于黏膜或皮肤,其包括益生菌和权利要求1-5中任一项所述的微生物黏附率调节剂。
13.权利要求12所述的益生菌制剂在制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗细菌性胃炎的药物中的应用。
14.一种用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病或调整免疫应答或治疗病毒性肠炎或治疗细菌性阴道炎或治疗细菌性口腔炎或治疗细菌性胃炎的药物,其特征在于,其含有权利要求12所述的益生菌制剂。
15.一种益生菌制剂的储运方法,其特征在于,其包括以下步骤:
步骤a:将权利要求1-5中任一项所述的微生物黏附率调节剂消毒灭菌并定量密封包装;
步骤b:将步骤a中包装后的所述微生物黏附率调节剂与定量包装的冻干益生菌以非混合状态储存和运输;
步骤c:使用时,将所述微生物黏附率调节剂与所述冻干益生菌,在72小时内共同给予作用部位。
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