CN106890197B - 一种定植益生菌制剂及其应用和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种定植益生菌制剂及其应用和药物，涉及生物技术领域。本发明公开的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，定植益生菌制剂包括表面活性剂和益生菌。表面活性剂对呼吸道黏液的溶胶层和凝胶层产生改性，提高了益生菌接触呼吸道黏膜细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了益生菌的细胞表面疏水性，提高了这些益生菌与呼吸道黏膜上皮细胞的黏附率，从而解决了现有技术中益生菌难以在黏液纤毛传输系统驱除下定植于呼吸道黏膜的技术瓶颈；该定植益生菌制剂可在制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的药物等领域中应用。

Description

一种定植益生菌制剂及其应用和药物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种定植益生菌制剂及其应用和药物。
背景技术
人，畜，禽等陆生脊椎动物的呼吸道，长期流通着含微生物的空气。分布在呼吸道内表面的黏膜不停过滤着空气中的微生物。因此，陆生动物的呼吸道不可避免地存在种类繁多的微生物。这些微生物彼此影响，同时也与呼吸道黏膜交互作用，形成了一个可持续的微生态。
由于呼吸道的连通性，同一个体的呼吸道上分布的微生物种群是基本相同的。但是由于呼吸道黏液纤毛传输系统(Mucociliary Transport System、MCT)的作用，呼吸道上部(鼻腔)的微生物数量远远多于呼吸道下部(支气管)。
呼吸道的微生物，按照对宿主健康的影响。分为致病菌，条件致病菌和益生菌三大类。益生菌通过对黏膜的定植，能不断抑制致病菌、约束条件致病菌、平衡宿主呼吸道黏膜免疫。
简单的实验表明，缺少益生菌的无菌小鼠和无菌家兔，一旦暴露于大气之中，不是被少数几个葡萄球菌或霉菌很快杀死，就是发生严重的超敏反应迅速灭亡。
显然，就维持呼吸道健康而言，定植呼吸道黏膜的益生菌起着不可或缺的关键作用。现有的研究表明，呼吸道益生菌以乳酸菌为主，同时不排除部分芽孢杆菌。当呼吸道的益生菌水平(因为环境空气污染，抗生素和消毒剂暴露等原因)降低时，上述作用就会减弱，从而导致各种各样的呼吸道疾病。上述一系列事件发生在上呼吸道，则表现为(包括变应性鼻炎在内的)各种鼻炎。发生在下呼吸道时，则表现为气管炎、支气管炎和变应性哮喘。由于益生菌黏膜的交互作用，呼吸道黏膜的益生菌菌膜的减少，会导致黏膜免疫的失衡，尤其是Th1类型免疫与Th2类型免疫的失衡，产生IgE介导的I型超敏反应。由于免疫系统的连通，炎性因子会作用于呼吸道黏膜，皮肤，肠道，导致多种变应性疾病。
目前，公知的提高呼吸道益生菌水平的方法，最有效的是用含有益生菌的水悬液直接作用呼吸道黏膜。以水剂或雾剂的形态，通过浸鼻，或洗鼻，或滴鼻，或喷鼻实现。使用雾剂时，常常也通过口鼻同吸或经口直接吸入下呼吸道来提高呼吸道益生菌水平。
益生菌直接作用在呼吸道黏膜可以调整呼吸道微生态，进一步调整局部或全身免疫。益生菌不限于活菌，灭活的益生菌一样可以产生上述调整作用。所述益生菌也不局限于呼吸道原籍菌种。承载了疫苗基因的乳酸菌制剂也可以通过直接作用呼吸道来完成投放，实现接种。
然而，现有作用于呼吸道黏膜的益生菌制剂，在呼吸道黏液输送下，仅仅10多分钟就可以被纤毛驱动的黏液毯带离呼吸道，因此，现有直接作用于呼吸道黏膜的益生菌制剂存在难以黏附即黏附率低的问题，进而导致相应益生菌的功能难以充分发挥。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，该定植益生菌制剂的益生菌在呼吸道黏膜的黏附率比单独作用时更高。
本发明的另一目的在于提供一种用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的药物，上述的药物直接作用于呼吸道黏膜后，其在呼吸道黏膜的黏附率高，活性成分停留时间长，药效发挥功能的时间长，有助于提高对应治疗的疾病的治愈效果。
本发明的再一目的在于提供上述的定植益生菌制剂在制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述的定植益生菌制剂用于治疗鼻炎或治疗哮喘或治疗过敏性皮炎或治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病。
本发明的另一目的在于提供一种治疗鼻炎或治疗哮喘或治疗过敏性皮炎或治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的方法。
本发明是这样实现的：
一种定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，所述定植益生菌制剂包括表面活性剂和益生菌。
一种用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的药物，其含有上述的定植益生菌制剂。
上述的定植益生菌制剂在制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的药物中的应用。
上述的定植益生菌制剂用于治疗鼻炎或治疗哮喘或治疗过敏性皮炎或治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病。
一种治疗鼻炎或治疗哮喘或治疗过敏性皮炎或治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的方法，其包括：用上述的定植益生菌制剂接触个体的呼吸道黏膜。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，其包括表面活性剂和益生菌，表面活性剂对呼吸道黏液的溶胶层和凝胶层产生改性，提高了益生菌接触呼吸道黏膜细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了益生菌的细胞表面疏水性，提高了这些益生菌与呼吸道黏膜上皮细胞的黏附率，从而解决了现有技术中益生菌难以在纤毛传输系统驱除下定植于呼吸道黏膜的技术瓶颈。因此，本发明提供的定植益生菌制剂在呼吸道黏膜上具有更高的黏附率，易于定植在呼吸道黏膜，有利益生菌持续长久地发挥功能，具有广阔的应用前景，其可应用于制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的药物等诸多领域中。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种定植益生菌制剂及其应用和药物进行具体说明。
呼吸道黏膜上的纤毛传输系统，由不断传输动力的纤毛与黏液的溶胶层、凝胶层构成。纤毛越过溶胶层不断刷动凝胶层，承载呼吸道异物的凝胶层不断移向咽部或鼻孔，而排出呼吸道。这一过程并不是太长，通常在10-30分钟左右。通过糖精实验等手段很容易测得。如果发生神经反射导致的喷嚏或咳嗽时，这一排出异物的速度会更加迅速。
这样的移动速度，对于直接作用呼吸道，通过水悬液及其雾滴投放的益生菌，在短时间内接触到呼吸道黏膜细胞，并与其黏附受体形成黏附，是益生菌定植呼吸道，发挥其生物活性的前提。
基于此，为了克服现有的直接作用呼吸道黏膜的益生菌制剂存在难以黏附的不足，一方面，本发明提供了一种定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，上述定植益生菌制剂包含表面活性剂和益生菌。
由于本发明提供的定植益生菌制剂含有表面活性剂，其对呼吸道黏液的溶胶层和凝胶层产生改性，提高了益生菌接触呼吸道黏膜细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了益生菌的细胞表面疏水性(CSH)，提高了这些益生菌与呼吸道黏膜上皮细胞的黏附率30％以上，从而解决了现有技术中益生菌难以在纤毛传输系统驱除下定植于呼吸道黏膜的技术瓶颈。因此，本发明提供的定植益生菌制剂中的所含益生菌在呼吸道黏膜的黏附率更高，更易于定植在呼吸道黏膜，有利持续长久地发挥生物功效。
本发明提供的定植益生菌制剂中的表面活性剂发挥其促进或提高益生菌黏附率使其易于定植的作用主要有以下几个方式：(1)对于凝胶层，表面活性剂可使凝胶层的黏多糖发生溶胀，在呼吸道黏液表面的凝胶层造孔。从而使益生菌更容易通过移动的凝胶层进入溶胶层，与呼吸道黏膜细胞接触。(2)对于呼吸道黏液的溶胶层，表面活性剂可改变溶胶黏度，产生促渗透作用使益生菌能更有效地凝集，黏附在呼吸道黏膜细胞，形成菌膜。(3)加入在本发明提供的定植益生菌制剂中的表面活性剂，本身还可以改变益生菌的细胞表面疏水性(CSH)，提高益生菌与呼吸道黏膜上皮细胞的黏附率。
表面活性剂通过上述三种作用方式，可以单独发生，也可以协同发生。从而实现促使益生菌更易于黏附呼吸道黏膜、达到提高黏附率的技术效果。
需要说明的是，本发明提供的定植益生菌制剂可以是粉剂、水悬剂或喷雾剂等剂型。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述定植益生菌制剂的表面张力小于65mN/m。
需要说明的是，如果定植益生菌制剂为粉剂，定植益生菌制剂的表面张力按如下方法测试：按质量体积比为1:50的比例将定植益生菌制剂与去离子水混合后，再采用精度0.1mN/m的自动界面张力仪测量。
将定植益生菌制剂的表面张力控制在小于65mN/m的范围下，有助于提高定植益生菌制剂中益生菌与黏膜细胞的黏附率，也利于益生菌的定植，使其持续发挥生物功效。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述定植益生菌制剂的表面张力为40-60mN/m。在表面张力为40-60mN/m的范围内，上述定植益生菌制剂中益生菌与黏膜细胞的黏附率进一步地提高，更利于益生菌的定植，使其持续发挥生物功效。
再可选地，在本发明的一些实施方案中，定植益生菌制剂的表面张力为55mN/m。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述表面活性剂选自生物表面活性剂和植物性表面活性剂中的至少一种。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述生物表面活性剂包括糖脂和脂肽中的至少一种；上述植物性表面活性剂包括皂甙和其他具有表面活性功能的糖苷中的至少一种。
也可以理解为，在本发明的一些实施方案中，上述表面活性剂是糖脂、脂肽、皂甙和其他具有表面活性功能的糖苷中的一种或几种的组合。
其中，糖脂可以是鼠李糖脂、海藻糖脂、槐糖脂以及甘露糖赤藓糖醇脂中的一种或几种的组合；
脂肽可以是表面活性素、地衣素、伊枯草素、芬芥素、大侧柏素、螺旋形素以及张力素中的一种或几种的组合；
皂甙可以是人参皂甙、茶皂甙、黄芪皂甙、大豆皂甙、皂荚皂甙、无患子皂苷、麦冬皂苷、薯蓣皂甙、黄花败酱皂甙中的一种或几种的组合；
糖苷可以是具有表面活性功能的葡萄糖苷和半乳糖苷中的一种或两种的组合。
需要说明的是，本发明所述的表面活性剂可以是纯度高的单一成分或多种成分的组合，也可以是含有上述表面活性剂的植物提取物或者是微生物培养物。这些植物提取物或微生物培养物含有一种或多种成分的表面活性剂。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述定植益生菌制剂包括辛夷提取物，上述辛夷提取物含有表面活性剂，表面活性剂为糖苷。
容易理解，辛夷提取物的成分含多种糖苷，因此辛夷提取物可以作为表面活性剂的来源，将辛夷提取物用于与益生菌配制成本发明的定植益生菌制剂，属于本发明的保护范围。
通过对辛夷提取物成分的分析，辛夷提取物含有香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷；3-甲氧基-4-羟基苯-1-O-β-D-葡萄糖苷；咖啡酸；3，4，5-三甲氧基苯-1-O-β-D-葡萄糖苷；苄基-O-β-D-葡萄糖苷；苄基-O-β-D-半乳糖苷；香草酸葡萄糖酯；7-甲氧基香豆素-6-O-β-D-葡萄糖苷等糖苷类物质。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述定植益生菌制剂包括人参提取物，人参提取物含有表面活性剂，表面活性剂为皂甙。
容易理解，人参提取物的主要成分为皂甙，因此人参提取物可以作为表面活性剂即皂甙的来源，将人参提取物用于与益生菌配制成本发明的定植益生菌制剂，也属于本发明的保护范围。
人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，三萜皂苷。主要存在于人参属药材中。包括人参皂甙Ra、Rb、Rc、Rd、Re、Rf、Rg等，视为人参，三七，西洋参等中药具有广泛生物功效的物质，但人参皂甙具体产生生物功效的分子生物学机理不详。本发明应用于益生菌制剂从另一个方面阐述了这些中药成分产生生物功效的一种分子生物学机制。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述益生菌是乳酸菌，上述定植益生菌制剂中上述乳酸菌的含量为1×104-1×1012个/g。
采用乳酸菌的定植益生菌制剂能作用于黏膜，调整黏膜微生态，与黏膜细胞交互作用产生生物功效的乳酸菌较多，研究比较多的包括以下乳酸菌：唾液乳杆菌可降低IgE，用于抗过敏；干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌，用于提高巨噬细胞的吞噬能力；戊糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌，用于吸附苯并芘；婴儿双歧杆菌，用于自行移行抑制癌细胞；乳酸链球菌，可产生抑菌素，用于抑制有害菌；大部分乳酸菌都能在黏膜表面形成生物膜云屏障，占位拮抗有害菌的定植，减少黏膜与抗原的接触，是黏膜不可或缺的有益生物。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述定植益生菌制剂包括NaCl，上述NaCl在上述定植益生菌制剂中的含量为2-60g/Kg。NaCl有助于平衡定植益生菌制剂作用在呼吸道黏膜时的渗透压，防止使用本发明提供的定植益生菌制剂时黏膜发生水肿。更可选地，在本发明的一些实施方案中，NaCl在上述定植益生菌制剂中的含量为9g/Kg或9g/L。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述定植益生菌制剂的pH为3.5-7。低pH环境有助于提高定植益生菌制剂中的益生菌的生存能力或存在时间。更可选地，在本发明的一些实施方案中，定植益生菌制剂的pH为5.5-6。
需要说明的是，本发明上述提供的定植益生菌制剂中的益生菌的类别并不限于上述类别的乳酸菌，设计者可根据菌的特性或用途，采用相应的菌作为益生菌。例如益生菌可以是乳酸菌或酵母菌、芽孢杆菌等，甚至是其他类别的菌，更甚至是灭活的益生菌或灭活的条件致病菌，更甚至是DNA重组菌，其均属于本发明的保护范围。
基于此，可选地，在本发明的一些实施方案中，上述益生菌为重组乳酸菌。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述重组乳酸菌为含有外源DNA的婴儿双歧杆菌。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述益生菌为干酪乳酸杆菌。
干酪乳杆菌的脂磷壁酸(LTA)和胞外多糖(EPS)都能促进巨噬细胞吞噬中性红的数量。这意味着干酪乳杆菌及其灭活体可以提高黏膜免疫能力，即对病毒和病菌的杀伤能力，这是对抗感冒，抗疾病传染的有力手段。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述益生菌为乳酸杆菌。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述乳酸杆菌为唾液乳酸杆菌，上述定植益生菌制剂还包括细菌培养上清液，该细菌培养上清液含有表面活性剂，上述定植益生菌制剂的表面张力60-49mN/m。更可选地，上述定植益生菌制剂的表面张力55mN/m。
可选地，在本发明的一些实施方案中，细菌培养上清液为嗜酸乳酸杆菌的培养上清液、植物乳酸杆菌的培养液上清液和芽孢杆菌的培养上清液中的一种或几种的组合。
嗜酸乳酸杆菌、植物乳酸杆菌以及芽孢杆菌等高黏附率的乳酸菌，其本身代谢的过程可以产生脂肽和/或糖脂等表面活性剂，将这些菌(嗜酸乳酸杆菌、植物乳酸杆菌以及芽孢杆菌)的培养液表面张力减低到60mN/m以下。这种作用除了能促进它们自身的黏附定植外，对其他低黏附率的乳杆菌也具有提高黏附率促进定植的作用。然而就具体的生物功效，如抗过敏、促进巨噬细胞吞噬能力等功效而言，这些高黏附率的乳杆菌却相对较弱，甚至没有。通过产表面活性剂的菌种的培养液使高生物功效的菌种黏附定植在黏膜上是发挥益生菌更大作用的革命性、创造性方案。
作为上述方案的补充，优选的为去掉菌体的培养液，其次是裂解灭活的培养液。活的高黏附率乳杆菌菌体对黏膜的占位作用，无疑会降低生物功效较高的(低黏附率)目标乳酸菌的黏附定植率，也就会降低本方案提高目标益生菌黏附率的技术效果。但是，不抛弃产E-BS乳酸菌菌体的这种方式无疑会减少成本和工艺难度，某些状况下也不失为一类次选方案。
结合上述方面，在另一方面，本发明还提供了一种用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的药物，其含有上述任一项的定植益生菌制剂。
细菌性鼻炎由有害菌过度繁殖引起，乳杆菌定植在黏膜上后，可以抑制这些有害菌，解除其定植，进一步消除感染。
本发明提供的上述的任意一种定植益生菌制剂都能达成这一功效，尤其是含有表面活性剂和干酪乳杆菌的益生菌制剂为强。过敏鼻炎，过敏哮喘和过敏皮炎是IgE介导的变应性疾病。含地衣素和唾液乳杆菌的益生菌制剂作用于黏膜后，一方面形成的乳杆菌生物膜可以隔离抗原与黏膜的实际接触，另一方面则可以刺激黏膜免疫系统提高INF-γ的分泌，减少IL-4的分泌，降低局部乃至血清的IgE水平，从而消除变应性疾病产生的根本。婴儿乳杆菌在表面活性剂的促进黏附作用下，从鼻腔定植于鼻咽部，距离鼻咽部癌变厌氧区非常近，有更大概率移行过去对鼻咽癌形成抑制疗效。如果携带有重组的DCN基因，聚集于鼻咽癌厌氧区的婴儿乳杆菌表达出抑制肿瘤，促进其凋亡的蛋白，这样的抗癌作用更强。由于陆生脊椎动物呼吸道与大脑基本结构的相似性，益生菌对不同陆生脊椎动物或许存在功效对应关系差异、菌株性能差异，但是基于克服陆生脊椎动物共同具有的黏液纤毛传输系统驱除的技术问题，本技术方案具有共同的技术效果
再一方面，本发明提供了上述的任一项定植益生菌制剂在制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的药物中的应用。
还有一方面，本发明提供了上述的定植益生菌制剂用于治疗鼻炎或治疗哮喘或治疗过敏性皮炎或治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病。
再一方面，本发明还提供了一种治疗鼻炎或治疗哮喘或治疗过敏性皮炎或治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的方法，其包括：用上述任一项上述的定植益生菌制剂接触个体的呼吸道黏膜。
可选地，在本发明的一些实施方案中，上述呼吸道黏膜包括鼻腔黏膜、气管黏膜或支气管内表面的黏膜中的一种或几种。
综上，本发明提供的定植益生菌制剂，通过加入的表面活性剂对呼吸道黏液的溶胶层和凝胶层产生改性，提高了定植益生菌制剂中的益生菌接触呼吸道黏膜细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了益生菌的细胞表面疏水性，提高了这些益生菌与呼吸道黏膜上皮细胞的黏附率，从而解决了现有技术中益生菌难以在黏液纤毛传输系统驱除下定植于呼吸道黏膜的技术瓶颈。本发明提供的定植益生菌制剂在呼吸道黏膜上具有较高的黏附率，易于定植在呼吸道黏膜，有利益生菌持续长久地发挥功能，具有广阔的应用前景。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，包含表面活性剂和益生菌。其中，益生菌为唾液乳杆菌，表面活性剂为地衣素(lichenysin)，其中，唾液乳杆菌浓度为1x108CFU/ml，地衣素含量为5mg/L，表面张力为55mN/m，NaCl含量为9g/kg，pH为5.5。该定植益生菌制剂为水悬剂。
1.1本实施例提供的定植益生菌制剂的制备方法：
1.1.1选取唾液乳杆菌菌株(Lactobacillus salivarius，ATCC 11741)进行培养。培养条件：28℃，接种量为5％，培养基采用MRS，厌氧培养，MRS培养基初始pH为5.5，培养15h。
1.1.2培养结束后，4500rpm离心10min，收取唾液乳杆菌菌体。
1.1.3选取地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus licheniformis，ATCC 39307)进行培养，以获取含脂肽尤其是含地衣素的培养液(来自微生物的天然表面活性剂)。培养基配方：可溶性淀粉20.0g/L，NH4NO3 4.0g/L，KH2PO4 3.0g/L，Na2HPO4 3.0g/L，酵母粉0.5g/L，FeSO46.8μmol/L，ZnSO4 0.038mmol/L，CaCl2 0.5mmol/L，MgSO4 0.2mmol/L，MnSO4 0.02mmol/L，EDTA 50μmol/L，pH 7.4；500ml三角瓶的装液量为200ml，接种量5.0％，培养温度37℃，培养时间48h左右。
1.1.4培养到预定时间，确定培养液的表面张力下降到50mN/m以下后，取培养液，8000rpm离心20min，除菌体两次，取上清液。所获的上清液用浓HCl调pH至2.0，出现絮状沉淀，4℃静置过夜，10000rpm离心30min收集沉淀，用pH2.0的酸水洗涤一次。随后将该沉淀溶于NaOH溶液，使pH值为7.0，冷冻干燥，得地衣素(lichenysin)粗品。然将上述粗品置CH2Cl2中抽提后，减压蒸干，稀NaOH溶液溶解，形成多泡液体，使用JYN2200A自动界面张力仪确定表面张力为35.0mN/m左右。用WhatmanNo.4滤纸过滤上述多泡液体，滤液再次加HCl调pH至2.0后离心，取沉淀物。真空干燥去除沉淀物残留水分得纯化的地衣素。
通过对上述纯化的地衣素成分分析，确定该表面活性剂为：
环-[L-Gln1→D-Leu2→L-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7-β-OH脂肪酸]。
1.1.5将上述纯品地衣素0.5mg溶解在100ml去离子水中，配制成含地衣素5mg/L的溶液。在25℃的条件下使用JYN 2200A自动界面张力仪测量上述溶液的表面张力，为55mN/m。
1.1.6取上述溶液100ml，加入NaCl 0.9g，加入唾液乳杆菌菌体混匀，得唾液乳杆菌悬液，并用分光光度仪确定唾液乳杆菌含量为1×108CFU/ml，加入乳酸，用pH仪确定pH值为5.5(如果pH值高于5.5则加乳酸，低于5.5则添加上述唾液乳杆菌悬液)，从而得到可作用于呼吸道的定植益生菌制剂。
1.2本实施例提供的定植益生菌制剂中益生菌的细胞表面疏水性(CSH)检测
1.2.1采用碳烃化合物黏着技术(WATH)检测上述唾液乳杆菌菌体的疏水性：
取前述步骤1.1.2得到的唾液乳酸菌菌体用无菌的NaCl溶液洗涤4次(溶液以去离子水配制为0.5mol/L)。真空冷冻干燥后，称取100mg唾液乳杆菌菌体，在50ml含100mmol/L的NaHCO3溶液中，30℃，震荡处理1h后。加1ml正十六烷至上述溶液中，37℃，振荡处理1h，4000rpm离心6min，将沉淀真空冷冻干燥后准确称量得到重量为C，计算黏附率B＝(100-C)％。重复3次，结果取平均值，以(平均值±标准方差)％来表示。
结果测得上述唾液乳杆菌菌体的细胞表面疏水性为(22.62±1.63)％。
将前述步骤1.1.2收取的唾液乳酸菌菌体用无菌的NaCl溶液洗涤4次(NaCl溶液以双去离子水配制，浓度0.5mol/L)。真空冷冻干燥后，称取100mg唾液乳杆菌菌体，混合在50ml含100mmol/L的NaHCO3和含地衣素5mg/L的无菌培养上清稀释溶液中，30℃，震荡处理1h。加1ml正十六烷至上述溶液中，37℃，振荡处理1h，4000rpm离心6min，将沉淀真空冷冻干燥后准确称量得到重量为C(mg)，计算黏附率B＝(100-C)％。重复3次，结果取平均值，结果以平均值±标准方差来表示。结果测得经含5mg/L地衣素溶液处理的唾液乳杆菌，表面疏水性为(71.61±2.35)％。
结果表明，经过含地衣素5mg/L的溶液处理的唾液乳杆菌，表面疏水性显著高于未经地衣素溶液处理的唾液乳杆菌。差异具有统计学意义(p<0.05)。益生菌表面疏水性的提高意味着其黏附率的提高。
1.3本实施例提供的定植益生菌制剂中益生菌对人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率检测
1.3.1人鼻息肉手术时取鼻息肉黏膜。用PBS冲洗，去除黏液、血液、坏死组织和黏膜下组织，留取黏膜层。用4℃无菌PBS溶液反复冲洗浸泡3遍。加入0.1％胶原酶Ⅰ型吹打后，在37℃消化30min。轻轻吹打消化后的黏膜组织，使上皮细胞脱落，移除黏膜块。将细胞悬液进行1000rpm，4℃，离心5min。弃上清。向沉淀中加入含10％胎牛血清的DMEM/F12(1：1，含1×105U/L青霉素，100mg/L链霉素)培养液。轻轻吹打后将细胞悬液接种于培养板中，置37℃饱和湿度CO2细胞培养箱中培养。每2天换一次培养液，培养7天。
1.3.2将上述培养好的人鼻黏膜细胞(HNE)用胰酶-EDTA消化液进行消化，之后用DMEM完全营养液调整细胞浓度为1.0×105个/ml，装于6孔组织培养板的3个孔中，每孔2ml，于5％CO2，95％空气培养箱中37℃孵育至细胞长至单层。弃去组织培养板中各孔的DMEM营养液，并用无菌PBS缓冲液洗2遍。
1.3.3其中1个孔用0.5ml胰酶-EDTA消化液进行消化后，加入0.5ml PBS，用微量振荡器振荡并用移液枪吹打，使细胞完全消化下来并混匀，血球计数板计算细胞浓度。另外两个孔，一孔再加入1ml DMEM原液和1ml无菌FBS缓冲液调整的唾液乳杆菌菌悬液(1×108CFU/ml)，作为对照；另一孔加入1ml DMEM原液和1ml本实施例提供的定植益生菌制剂(唾液乳杆菌浓度为1×108CFU/ml)。两孔用移液枪吹打混合，于厌氧培养箱中，37℃孵育2h。
1.3.4孵育后弃去组织培养板中各孔的混合液，用无菌PBS缓冲液洗涤5次，以除去未黏附的益生菌。加入0.4ml胰酶-EDTA消化液进行消化后，加入0.6ml无菌PBS缓冲液，进行梯度稀释，甲醇固定15min，革兰氏染色，平板计数计算黏附的细菌数。按照以下公式计算不同菌悬液的黏附率：黏附率(CFU/cel1)＝黏附细菌数/细胞数。结果如下。
本实施例提供的定植益生菌制剂中的唾液乳杆菌，对人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率为(3.17±0.23)CFU/cell。而对照组用不含地衣素的FBS缓冲液调整的唾液乳杆菌，黏附率为(1.78±0.17)CFU/cell。
由此可见，含有脂肽表面活性剂即地衣素(Lichenysin)的唾液乳杆菌菌悬液(即本实施例的定植益生菌制剂)中益生菌(唾液乳杆菌)对人鼻细胞的黏附率，高于不含该表面活性剂的菌悬液。差异有统计学意义，(p<0.05)。
益生菌对黏膜细胞黏附率的提高意味着其生物效应的成倍提升。同时也意味着，益生菌有更多机会在黏液纤毛传输系统的快速驱除下定植黏膜，并发生作用。
已有的研究显示，唾液乳杆菌作用于黏膜可以提高IFN-γ的表达，降低血清IgE，具有较好的抗过敏功效。但是唾液乳杆菌较低的黏附率，直接作用于包含鼻腔的呼吸道黏膜有较大的技术障碍。而本发明通过加入表面活性剂例如脂肽尤其例如地衣素提高了唾液乳杆菌对鼻上皮细胞的黏附率，克服了这一技术障碍。因此，本实施例提供的定植益生菌制剂中的益生菌对呼吸道黏膜细胞尤其是鼻腔黏膜细胞具有更高的黏附率，易于定植在呼吸道黏膜，有利益生菌持续长久地发挥功能。
1.4本实施例提供的定植益生菌制剂的空白糖精试验
选健康受试者36例，第1天全部进行空白糖精试验测试黏膜纤毛传输时间；休息6天，于第7天，再全部用生理盐水浸洗鼻腔后，间隔5min进行糖精试验测试黏膜纤毛传输时间；再休息6天，于第14天，则全部用本实施例提供的定植益生菌制剂浸洗鼻腔后，间隔5min进行糖精试验测试黏膜纤毛传输时间。第7天和第14天的浸洗鼻腔的液体用量均为200ml，浸洗时间均不低于15分钟。
比较3次糖精试验的黏膜纤毛传输速率。结果：用本实施例提供的定植益生菌制剂浸洗鼻腔后黏膜纤毛传输速率为(13.97±2.15)mm/min，显著大于空白糖精试验(10.64±3.25)mm/min以及用生理盐水浸洗鼻后腔的黏膜纤毛传输速率(11.02±5.13)mm/min。差异均具有统计学意义(p<0.05)。
由此表明，本实施例提供的的定植益生菌制剂通过浸洗鼻黏膜直接作用于呼吸道，纤毛毒性比生理盐水更小。含生物表面活性剂的益生菌制剂还可以不断产生ATP供给纤毛细胞更多能量，促进其活动。本实验也说明，本实施例提供的定植益生菌制剂应用于呼吸道护理，可促进鼻黏膜纤毛传输系统从呼吸道排出有害异物。
1.5本实施例提供的定植益生菌制剂对变应性疾病患者血清中总IgE的影响
选血清IgE水平异常的变应性疾病患者36人。19人为变应性鼻炎患者，12人为变应性鼻炎合并哮喘患者，5人为过敏皮炎患者。纳入条件：各自的过敏症状明显，3个月内未使用糖皮质激素等免疫抑制剂，用酶联免疫吸附测定(ELISA)的血清IgE水平半年内未测得低于100IU/ml。
将变应性疾病患者随机分为三组(实验组和盐水对照一组、无表面活性剂对照二组)，每组12人。采用酶联免疫吸附(ELISA)测定血清IgE水平：常规空腹抽取静脉血2ml，置于未加抗凝剂的试管中，血凝后静置10min，经3000rpm，离心10min，分离血清，20℃冷藏备检。利用酶联免疫检测仪进行检测。运用统计软件SPSS13.0进行数据处理，结果以平均值表示。采用上述方法，于第1天检测三组的血清IgE水平，检测结果：实验组为：(511±93.54)IU/ml；盐水对照一组为：(507±95.32)IU/ml。无表面活性剂对照二组为(520±89.44)IU/ml。
盐水对照一组连续21天，每天1次用生理盐水200ml浸洗每个患者的鼻腔下部。浸洗时间均不低于15分钟。于第22天，检测血清IgE水平。检测结果为(493±90.18)IU/ml。
无表面活性剂对照二组连续21天，每天1次用不含表面活性剂，唾液乳杆菌含量为1×108CFU/ml，NaCl 0.9g/L，ph值为5.5.的益生菌菌悬液200ml浸洗每个患者的鼻腔下部。浸洗时间均不低于15分钟。于第22天，检测血清IgE水平。检测结果为(302±98.01)IU/ml。
实验组则连续21天，每天1次用本实施例提供的定植益生菌制剂200ml浸洗每个患者的鼻腔下部。浸洗时间均不低于15分钟。于第22天，检测血清IgE水平，检测结果为(183±56.18)IU/ml。
根据上述检测结果可知：本实施例提供的定植益生菌制剂通过作用于鼻腔黏膜显著地降低了有IgE介导的变应性疾病患者的血清IgE水平(p<0.05)。本实施例提供的定植益生菌制剂比生理盐水降低IgE介导的变应性疾病的血清IgE水平更有效。差异具有统计学意义(p<0.05)。本实施例提供的定植益生菌制剂比不含表面活性剂的益生菌制剂降低IgE介导的变应性疾病的血清IgE水平也更有效。差异具有统计学意义(p<0.05)。
在鼻腔中，唾液乳杆菌不会面对消化液的灭杀。其对黏膜细胞的黏附率，在表面活性剂的作用下得到提升后，就能克服纤毛黏液传输的驱除而可靠地定植在呼吸道黏膜。这也表明本发明实施例提供的益生菌制剂作用于呼吸道，可应用来治疗IgE介导的变应性疾病，例如包括变应性鼻炎、变应性哮喘、变应性皮炎等疾病。
实施例2
本实施例提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，包含表面活性剂和益生菌。其中，益生菌为干酪乳杆菌，表面活性剂为表面活性素(surfactin)，该定植益生菌制剂的表面张力为55mN/m，pH为6，NaCl含量为9g/L，表面活性素(surfactin)含量为14.5mg/L，益生菌含量为1×108CFU/ml。
2.1本实施例提供的定植益生菌制剂制备方法如下：
2.1.1选用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，ATCC 393)。接种过夜培养的新鲜菌液，接种至MRS培养基，接种量1％，培养温度28℃，培养箱中静置厌氧培养，培养15小时左右。培养结束后，4500rpm离心10min，收集干酪乳杆菌菌体。
2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，ATCC2233)，在150ml三角瓶内装50ml培养液，灭菌后接种12h种子培养物，接种量2％，在37℃，静止培养。其中，斜面种子培养基(g/L)成分：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、琼脂20、pH7.0；发酵种子培养基配方(按g/L计)：葡萄糖10g/L、NH4NO3 4g/L、KH2PO4 4g/L、Na2HPO4·12H2O 12g/L、Mg2SO4 0.2g/L、CaCl2 1×10- 3g/L、FeSO4 6×10-2g/L、MnSO4 6×10-1g/L、酵母膏1g/L、牛肉膏1g/L；发酵培养基(g/L)成分：葡萄糖40g/L、NH4NO3 4g/L、KH2PO4 4g/L、Na2HPO4·12H2O 12g/L、MgSO4 0.2g/L、CaCl2 1×10-3g/L、FeSO4 6×10-2g/L、MnSO4 6g/L、酵母膏1g/L、牛肉膏1g/L。培养42h后，4500rpm离心10min，去掉菌体。80℃水浴2小时，获得含表面活性素的培养液上清。通过用去离子水稀释无菌培养液上清，并用自动界面张力仪确定，获得表面张力为55mN/m的无菌培养液上清稀释液。比对表面活性素(surfactin)的“浓度-表面张力”曲线，可确定上述培养液上清稀释液中表面活性素(surfactin)的对应浓度为14.5mg/L。
2.1.3取上述培养液上清稀释液100ml，加入NaCl 0.9g，加入干酪乳杆菌菌体，并用分光光度仪确定干酪乳杆菌含量为1×108CFU/ml，加入乳酸，用pH仪确定pH值为5.5，从而得到可作用于呼吸道的定植益生菌制剂。
2.2本实施例提供的定植益生菌制剂的表面疏水性检测：检测方法同步骤1.2。
结果：本实施例提供的经表面活性素处理的干酪乳杆菌的细胞表面疏水性(CSH)为(59.01±3.12)％，明显高于未经表面活性素处理的干酪乳杆菌的细胞表面疏水性(26.73±2.37)％。差异具有统计学意义(p<0.05)。
2.3本实施例提供的定植益生菌制剂的黏附率检测：方法同步骤1.3。
结果：本实施例提供的定植益生菌制剂中的干酪乳杆菌对人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率为(5.13±0.21)CFU/cell，明显高于不含表面活性素(surfactin)的FBS缓冲液调整的干酪乳杆菌的黏附率(2.11±0.38)CFU/cell)。差异具有统计学意义(p<0.05)。
2.4本实施例提供的定植益生菌制剂的抗呼吸道疾病传染实验
体外细胞实验显示：干酪乳杆菌的脂磷壁酸(LTA)和胞外多糖(EPS)，都能促进巨噬细胞吞噬中性红的量。说明干酪乳杆菌具有激发和增强机体对病毒和病菌杀伤能力。可将本实施例的益生菌制剂作用在呼吸道，应用于防治病毒和/或病菌导致的感冒。当传染性感冒发生初期，将本实施例的定植益生菌制剂雾化喷洒在空中。陆生脊椎动物吸入后，雾滴中的干酪乳杆菌定植在呼吸道上，产生促进巨噬细胞吞噬的功效。本实施例的定植益生菌制剂可以保护吸入者，防治呼吸道感染，提高机体对感冒的抵抗力。
选择已发生了两位同学(2人)感冒的小学班级九个，每个班人数不低于30人，学生年龄7-8岁。6个班级分为对照一组、对照二组和实验组，各3个。对照一组的2个班级，学生进教室前喷洒含乳酸的生理盐水，pH值为5.5。对照二组的2个班级，学生进教室前喷洒含干酪乳杆菌1×108CFU/ml和乳酸的生理盐水，pH值为5.5。实验组的2个班级，在学生进教室前喷洒本实施例的定植益生菌制剂。一周后，对照一组，后续发生感冒的人数，为(4.3±1.2)位。对照二组，后续发生过感染冒的人数，为(3.1±1.6)位。实验组，后续发生感染的人数，平均为(1.3±0.7)位。使用本实施例的定植益生菌制剂喷洒的班级，后续发生感冒的人数显著小于使用干酪乳杆菌菌悬液的班级。差异具有统计学意义(p<0.05)。更显著小于使用含乳酸生理盐水的班级。差异具有统计学意义(p<0.05)。
本实施例提供的定植益生菌制剂可应用于呼吸道疾病的防治，可阻止感冒的蔓延。
实施例3
本实施例提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，包含表面活性剂和益生菌。其中，益生菌为灭活干酪乳杆菌，表面活性剂为表面活性素，该定植益生菌制剂的表面张力为40mN/m，pH为5.5，NaCl含量为9g/L，表面活性素含量为16mg/L，灭活益生菌含量为1×108个/ml。
3.1本实施例提供的定植益生菌制剂的制备方法：
本实施例提供的定植益生菌制剂的制备方法与实施例2中的步骤2.1基本相同，不同的是本实施例收取干酪乳杆菌菌体后，80℃热灭活20分钟，再将灭活的干酪乳杆菌菌体与无菌培养液上清制成定植益生菌制剂。
3.2本实施例提供的定植益生菌制剂中益生菌的细胞表面疏水性检测：检测方法同步骤1.2。益生菌选用含量为1×108个/ml的灭活干酪乳杆菌。
结果：本实施例提供的经表面活性素处理的灭活干酪乳杆菌的细胞表面疏水性为(57.38±6.32)％明显高于未经表面活性素处理的灭活干酪乳杆菌的细胞表面疏水性(29.37±7.02)％。差异具有统计学意义(p<0.05)。
3.3本实施例提供的定植益生菌制剂与呼吸道细胞-鸡气管上皮细胞(CTE)的黏附率检测：
CTE培养液：在DMEM/F12中加入终浓度分别为10μg/ml INS、0.1μg/ml HC、1mmo1/L谷氨酰胺、l0μg/m TF、25ng/ml人表皮细胞生长因子(EGF)牛垂体提取物(BP)、100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素、50IU/ml两性霉素B及10IU/ml庆大霉素，5％的胎牛血清。
鸡气管上皮细胞(chicken trachea epithelium，CTE)分离培养：选1日龄非免疫健康雏鸡。无菌取气管到肺门，细心剥离气管表面筋膜。用冰冷PBS反复冲洗，以气管苍白且无黏液为准。无菌棉线结扎支气管下端肺门处，从另一端向气管腔内注射0.1％链霉蛋白酶，气管充盈后结扎然后浸入冰冷DMEM/F12中，4℃消化10h，然后取出气管剪掉一端，收集细胞悬液，加10％胎牛血清终止酶反应，悬液分别经过400目筛、40μm滤器过滤，收集滤液，然后1000rpm离心8min。吸弃上清收集细胞沉淀。用CTE培养液把细胞吹打成悬液，接种到90mm细胞培养皿中，置37℃、体积分数为5％CO2培养箱中静置培养至72h时换液，以后每隔2～3d换液1次。培养7天。
将培养好的鸡气管上皮细胞(CTE)用胰酶-EDTA消化液进行消化，之后用无胎牛血清的CTE培养液调整细胞浓度为1×105个/ml，装于6孔组织培养板的3个孔中，每孔2ml，于5％CO2，95％空气培养箱中37℃孵育至细胞长至单层。弃去组织培养板中各孔的CTE培养液，并用无菌PBS缓冲液洗培养板2遍。
其中1个孔用0.5ml胰酶-EDTA消化液进行消化后，加入0.5ml PBS，用微量振荡器振荡并用移液枪吹打，使细胞完全消化下来并混匀，血球计数板计算细胞浓度。
另外两个孔，一孔再加入1ml无胎牛血清的CTE培养液，和1ml无菌FBS缓冲液调整的灭活干酪乳杆菌菌悬液(1×108个/ml)；一孔再加入1ml无胎牛血清的CTE培养液和1ml本实施例的定植益生菌制剂。
两孔用移液枪吹打混合，于厌氧培养箱中，37℃孵育2h。孵育后弃去组织培养板中各孔的混合液，用无菌PBS缓冲液洗涤5次，以除去未黏附的益生菌。加入0.4ml胰酶-EDTA消化液进行消化后，加入0.6ml无菌PBS缓冲液，进行梯度稀释，甲醇固定15min，革兰氏染色，平板计数计算黏附的细菌数。
按照以下公式计算不同菌悬液的黏附率：黏附率(个/cel1)＝黏附细菌数/细胞数
结果，用含表面活性素的无菌培养液上清调整的灭活干酪乳杆菌，对鸡气管上皮细胞(CTE)的黏附率为(1.37±0.36)个/cell。
用不含表面活性素的FBS缓冲液调整的灭活干酪乳杆菌，黏附率为：
(0.59±0.15)个/cell。
由此可见，本实施例益生菌制剂中含有表面活性素(surfactin)，表面张力为40mN/m处理的灭活干酪乳杆菌，对鸡气管上皮细胞(CTE)的黏附率显著高于不含该表面活性剂的灭活干酪乳杆菌单独与CTE的黏附率。差异具有统计学意义(p<0.05)。
3.4本实施例提供的定植益生菌制剂的抗呼吸道疾病传染实验
随机分配500只7日龄健康肉公鸡，到9个鸡舍。每个鸡舍50只鸡。随机选3个鸡舍作为对照一组，3个鸡舍作为对照二组，3个鸡舍作为实验组。所有鸡舍中喷洒含大肠杆菌1×105个/ml的喷雾500ml/d。当一个鸡舍有2只鸡出现禽大肠杆菌病症状后，停止喷洒大肠杆菌喷雾。对照一组，喷洒含乳酸的生理盐水，pH值为5.5。对照二组，喷洒含乳酸，且含灭活干酪乳杆菌(1×108个/ml)的生理盐水，pH值为5.5。3个实验组，喷洒本实施例的定植益生菌制剂。所有鸡舍每天喷洒各自的试剂3次，每次500ml。
7天后，对照一组继续出现感染大肠杆菌的鸡只发病数为(13.2±3.6)。对照二组继续出现感染大肠杆菌的鸡只发病数为(8.4±4.2)。实验组的鸡只继续发病数为(1.4±0.8)。
上述结果显示：喷洒本实施例的定植益生菌制剂的鸡群继续发病的数量显著低于喷洒乳酸生理盐水和灭活干酪乳酸菌菌悬液的两个对照组。差异具有统计学意义(p<0.05)。这说明本实施例提供的定植益生菌制剂作用在呼吸道，灭活的干酪乳杆菌的脂磷壁酸(LTA)和胞外多糖(EPS)，仍然可促进巨噬细胞的吞噬能力。有效地阻止了鸡大肠杆菌疾病的传染，这也说明本实施例的定植益生菌制剂可应用于畜禽类例如鸡呼吸道疾病的防治。
实施例4
本实施例提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，包含表面活性剂、益生菌以及NaCl，柠檬酸。其中，益生菌为灭活干酪乳杆菌1x108个/ml，表面活性剂为醋酸氯已定与表面活性素复配。含醋酸氯已定为5mg/L，表面活性素浓度为14.5mg/L，该定植益生菌制剂表面张力为40mN/m，pH为6，NaCl浓度为60g/L。
4.1本实施例提供的定植益生菌制剂制备方法：取步骤2.1所述含表面活性素浓度为14.5mg/L的培养液上清稀释液100ml，加入6g NaCl，加入醋酸氯已定5mg/L，用自动界面张力仪确定表面张力，表面张力低于40mN/m用去离子水稀释调整，表面张力高于40mN/m则用培养液上清液调整，获取表面张力为40mN/m的复配表面活性剂溶液。
加入灭活干酪乳杆菌，得到干酪乳杆菌悬液，并用分光光度仪确定干酪乳杆菌含量为1x109个/ml，加入柠檬酸调pH(如果pH高于6则添加柠檬酸，低于6则添加上述干酪乳杆菌悬液)，用pH仪确定pH值为6从而得到可作用于呼吸道的定植益生菌制剂。
4.2本实施例提供的定植益生菌制剂的表面疏水性检测：检测方法同步骤3.2，如下。
结果：经本实施例的复配表面活性剂处理的灭活干酪乳杆菌的细胞表面疏水性为：(52.47±5.54)％，明显高于未经表面活性素处理的灭活干酪乳杆菌的细胞表面疏水性(29.37±7.02)％。差异具有统计学意义(p<0.05)。
4.3本实施例提供的定植益生菌制剂的黏附率检测：方法同步骤3.3。
结果，本实施例提供的定植益生菌制剂中的灭活干酪乳杆菌，对鸡气管上皮细胞(CTE)的黏附率为(1.53±0.32)个/cell。显著高于不含表面活性剂的FBS缓冲液调整的灭活干酪乳杆菌黏附率(0.59±0.15)个/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
4.4本实施例用于治疗猪高热综合症的效果实验
猪高热综合症，是一种发病率和死亡率均较高的疾病，病猪临床主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲不振或废绝，呼吸困难、喘气，部分猪伴有皮肤发红变紫等症状，少数毛孔有出血点。猪病死前会出现肺炎症状。
选猪高热综合征的小猪48只，随机分3组治疗。对照一组16只，在小猪发高烧1天内，采用头孢，肌肉注射，每KG体重按0.15ml注射1次。换在干净的猪舍正常喂养，每天用生理盐水20ml，雾化喷入鼻孔三次；对照二组16只，在小猪发高烧1天内，采用头孢，肌肉注射，每KG体重按0.15ml注射1次，换入干净的猪舍，每天用灭活干酪乳杆菌含量为1x108个/ml的菌悬液20ml，雾化喷入鼻孔三次；实验组16只，在小猪发高烧1天内，采用头孢，肌肉注射，每KG体重按0.15ml注射1次，换入干净的猪舍，每天用本实施例的定植益生菌制剂20ml，雾化喷入鼻孔三次。
7天后，观察高热综合征的小猪进展，发生肺炎的比例。结果：对照一组发生肺炎的比例为56.3％。对照二组发生肺炎的比例为31.3％。实验组为12.5％。可见，头孢注射结合本实施例的定植益生菌制剂雾化治疗的高热综合征小猪肺炎发生率，显著低于单独使用头孢与头孢结合灭活干酪乳杆菌菌悬液雾化的对照组的肺炎发生率。
这说明本实施例提供的定植益生菌制剂作用呼吸道，有效地阻止了猪高热综合症的进程，这也说明本实施例的定植益生菌制剂可应用于畜禽类例如猪的呼吸道相关疾病的防治。
实施例5
本实施例提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，包含表面活性剂、益生菌以及NaCl。其中，益生菌为唾液乳杆菌，表面活性剂为嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌产生的益生菌表面活性剂(E-BS)与鼠李糖脂(RL)的复配。该定植益生菌制剂表面张力为55mN/m，益生菌浓度为1x107CFU/ml，pH为5.5，NaCl浓度为7.6g/L。
5.1本实施例提供的定植益生菌制剂制备方法：
将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus ATCC4356)与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ATCC8014)分别接种到MRS培养基，37℃培养24h，活化2～3次。
植物培养基：木兰10g/L，茖葱10g/L，松茸10g/L，人参100g/L，萝卜100g/L，苦瓜10g/L；植物原料切碎后加入去离子水；臭氧消毒20分钟，静置30min，再加入低聚异麦芽糖80g/L，NaCl 38g/L，成为植物培养基。
在植物培养基中接种1％活化后的嗜酸乳杆菌菌种和1％活化后的植物乳杆菌菌种，在32℃厌氧培养24h。转入25℃厌氧培养12d以上。
用三层滤布过滤培养物，将滤液4500rpm离心20min，去除菌体。获得嗜酸乳杆菌的培养液上清后。加入4倍去离子水稀释。
用JYN 2200A自动界面张力仪测试培养稀释液的表面张力。并用去离子水和鼠李糖脂调整培养稀释液的表面张力到55mN/m。表面张力高于55mN/m则加入鼠李糖脂，低于55mN/m则加入NaCl终浓度为7.6g/L的NaCl去离子水溶液。
往培养稀释液中加入实施例1中的唾液乳杆菌，得唾液乳杆菌悬液，并用分光光度仪确定唾液乳杆菌含量为1×107CFU/ml，加入乳酸调pH(用pH仪确定pH值为5.5，如果高于5.5就继续加入乳酸，如果低于5.5则添加上述菌悬液)，从而得到可作用于呼吸道的益生菌制剂。
唾液乳杆菌有很好的抗过敏生物功效，但是黏附率低。嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌有很高的黏附率，但抗过敏的生物功效低。嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌产生的益生菌表面活性剂可以促进几乎整个乳酸杆菌属的菌株的黏附。因为培养过程的条件变化，益生菌表面活性剂的种类和配比复杂。在稀释后通常不一定是促进目标菌体黏附效果最佳的表面张力55mN/m，采用鼠李糖脂或去离子水调整，可以克服这一工艺障碍。
需要说明的是，鼠李糖脂也可以用下列表面活性剂中的一种或多种组合代替：海藻糖脂(trehalose lipids)，槐糖脂(sophorolipid)，甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)，表面活性素(Surfactin)，地衣素(lichenysin)，伊枯草素类(iturin)，芬芥素(fengicin)，大侧柏素(plipastatin)，螺旋形素(spiroidesin)，贝克塞雷(Bacircines)，力波素(Liposan)，张力素(Tensin)，晕菌素(Halobacillin)，标晕菌素(Isohalobacillin)，代托西汀(Daitocidin)，普米拉西汀(Pumilacidin)，人参皂甙，茶籽皂甙，黄芪皂甙，无患子皂素，黄花败酱皂甙。
5.2本实施例提供的定植益生菌制剂中益生菌的细胞表面疏水性检测：检测方法同步骤1.2。选用1x107CFU/ml含量的唾液乳杆菌菌悬液测试。
结果：本实施例中的复配表面活性剂处理的唾液乳杆菌表面疏水性为(93.31±4.24)％。显著高于不含益生菌表面活性剂的唾液乳杆菌的表面疏水性(27.35±1.48)％。差异具有统计学意义(p<0.05)。
5.3本实施例提供的定植益生菌制剂的黏附率检测：方法同步骤1.3。用PBS调整的菌悬液含量选用1×107CFU/ml。
结果：本实施例提供的定植益生菌制剂中益生菌与人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率为(8.94±0.51)CFU/cell，高于不含表面活性剂的菌悬液对人鼻黏膜细胞(HNE)的黏附率(1.13±0.28)CFU/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
5.4本实施例的定植益生菌制剂治疗变应性鼻炎的效果实验
以中华医学会耳鼻咽喉科分会的变应性鼻炎的诊断标准，选确诊为变应性鼻炎的120例患者，其中男67例，女53例；年龄最小者5岁，最大者56岁，平均35岁；病程最长十年，最短2年。排出条件:3个月内使用过抗生素，3个月内使用过糖皮质激素，服用益生菌制剂者。
患者随机分为实验组(益生菌制剂浸洗组)40例，对照一组(生理盐水浸洗组)40例，对照二组(含益生菌的生理盐水浸洗组)40例。3组病例在性别、年龄、病程方面均无显著差别，具有可比性。
实验组，每天使用100ml本实施例所提供的定植益生菌制剂，浸洗鼻腔下部及后部。液体温度35℃，两个鼻孔交替灌洗，直到制剂到达口腔或另一个鼻孔，仰头让益生菌制剂流过鼻腔后部(鼻咽部)。洗完后带上口罩孵育半小时。连续浸洗7天，第9天进行体检。
对照一组，则使用生理盐水100ml，同上述方式浸洗,孵育7天，第9天体检。
对照二组，则使用含唾液乳杆菌1×107CFU/ml的生理盐水100ml，同上述方式浸洗，孵育7天，第9天体检。
参照变应性鼻炎疗效评定标准，症状按体征分级：下鼻甲与鼻底、鼻中膈紧靠，见不到中鼻甲，或中鼻甲黏膜息肉样变，息肉形成，记录3分；下鼻甲与鼻中膈(或鼻底)紧靠，下鼻甲与鼻底(或鼻中膈)之间尚有小缝隙，记录为2分；下鼻甲轻度肿胀，鼻中膈、中鼻甲尚可见，记录为1分。
根据治疗前后症状和体征记分的总和，改善的百分率按下列公式评定疗效：百分率＝[(治疗前总分一治疗后总分)/治疗前总分]x100。如果百分率≥51为显效，21≦百分率介于≦50为有效，百分率≤20为无效。
从第9天的观测显示，治疗组：显效30例，有效8例，无效2例，显效率为75％，总有效率为95％；对照一组：显效2例，有效4例，无效34例，显效率为5％，总有效率为15％。对照二组：显效6例，有效15例，无效19例，显效率为15％，总有效率为52.5％。治疗组的显效率大于两个对照组。差异具有统计学意义(p<0.05)。
本实施例的益生菌制剂，其中的唾液乳杆菌具有提高鼻黏膜相关免疫组织IFN-γ表达，降低IgE的生物功效。另外，其在鼻黏膜上形成的益生菌菌膜，重建了鼻腔的微生物屏障。使鼻黏膜不直接面对刺激和抗原，可提高过敏原耐受阈值。本实施例的定植益生菌制剂用于治疗变应性鼻炎，有直击根本的功效。
其中，最典型的一位女性是多年的老鼻炎患者。先做了鼻甲手术，1年后复发，喷糖皮质激素，未见好转，后改为口服，亦失效。当她的医生建议她注射糖皮质激素，并再做一次鼻甲手术时，被该女士拒绝。该女性患者参加了对比试验，被分到实验组。实验完毕，该女士的所有症状完全消失。患者声称:益生菌制剂救了她的鼻子。
参加治疗组的很多患者，有些已经并发哮喘或鼻窦炎，但是仍然得到改善。显效的患者，持续改善最长时间是3年不复发，最短的不复发时间也在3个月以上。普遍可以做到1年不复发。(经观察随访，复发原因，可能与雾霾加重和抗生素使用，导致鼻腔益生菌再次被破坏有关。复发患者用本实施例的益生菌制剂再次浸洗后，不到7天均很快好转)。
本实施例的定植益生菌制剂,用于治疗过敏鼻炎，具有特效。
实施例6
本实施例提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，包含表面活性剂、益生菌以及NaCl。其中，益生菌为DCN基因重组婴儿双歧杆菌，菌含量为1×107CFU/ml，表面活性剂为含人参皂甙。该定植益生菌制剂表面张力为60mN/m，pH为7，NaCl浓度为9g/L。
6.1本实施例提供的定植益生菌制剂制备方法：
核心蛋白聚糖(decorin，DCN)基因及PGEX-4T-1质粒分别取30μl，在10×buffer反应体系中使用EcoR I、Not I内切酶进行双酶酶切2h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。根据DNA Marker的标志，使用刀片切取1.1kbp及5.0kbp长度的DNA凝胶片段。并将两段凝胶装入EP管中，分别利用凝胶提取纯化试剂盒说明回收其中所含的DNA基因。将回收的PGEX-4T-1目的载体和DCN目的基因分别取l0μl、30μl，加入到含2μl LT4DNA连接酶，5μl 10×buffer、3μl PEG4000反应体系中，22℃连接，4℃水浴过夜。获得质粒PGEX-4T-1-DCN。
将过夜培养的婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis ATCC 15697)接种于PYG培养基中。37℃厌氧培养至OD600＝0.6，低温离心收集菌体。预冷去离子水清洗3次，10％甘油洗涤一次。然后加入7μl质粒PGEX-4T-1-DCN，补加10％甘油至100μl。将混合液盛于预冷的电击杯中，并置于冰上5min。将电穿孔仪调节至电场强度：20kV/cm、电容：25μF、电阻：200Ω，电击后使重组质粒转化入婴儿双歧杆菌。电击完毕，即刻向电击杯中加入lml PYG液体培养基，充分混匀，后将液体移至1.5ml EP管中，37℃厌氧培养1h，待目的载体充分表达后，将余下菌液平铺至一含氨苄青霉素的Bs固体培养基中，37℃厌氧环境培养。待72h后，从培养基中挑选出一生长良好的单菌菌落，接种至含氨苄青霉素的PYG液体培养基的试管中，37℃厌氧培养过夜，次日取出试管。获得DCN基因重组婴儿双歧杆菌。
将上述婴儿双歧杆菌按5％接菌量进行接种，在下述培养基中，37℃厌氧培养12h。
婴儿双歧杆菌发酵培养基(CPT)为：大豆蛋白胨1.67％，酪蛋白胨0.83％，乳糖0.5％，酵母浸出粉0.5％，低聚糖0.7％，胡萝卜汁5％。
培养到预定时间后，4500rpm离心10min，收取重组婴儿双歧杆菌菌体。
用NaCl 0.9g和去离子水100ml配成盐溶液。加入上述婴儿双歧杆菌菌体，并用分光光度仪确定唾液乳杆菌含量为1×107CFU/ml，加入人参皂甙40mg，从而得到可作用于抗癌的定植益生菌制剂。
6.2本实施例提供的定植益生菌制剂的疏水性检测：检测方法同步骤1.2。
结果：本实施例所用含人参皂甙0.4g/L的重组婴儿双歧杆菌(1×107CFU/ml)表面疏水性为(65.11±6.43)％，大于不含表面活性剂人参皂甙的重组婴儿双歧杆菌菌悬液(1×107CFU/ml)的表面疏水性(53.72±5.94)％。
6.3本实施例提供的定植益生菌制剂的黏附率检测：
人鼻咽癌细胞株CNE-2培养在RPMI1640培养基中，加10％胎牛血清，青霉素100IU/ml，链霉素100ng/ml。培养条件：5％CO2，37℃。20ml玻璃培养小瓶接种20万细胞株CNE-2，24小时后达对数生长期，去旧液，2.5g/L胰蛋白酶消化成单个细胞悬液。
用RPMI1640培养基加10％胎牛血清的完全培养液调整CNE-2细胞浓度为1.0×105个/ml，装于6孔组织培养板的3个孔中，每孔2ml，在37℃，5％CO2培养24小时。孵育至细胞长至单层。弃去组织培养板中各孔的营养液，并用无菌PBS缓冲液洗培养板2遍。
其中1个孔用0.5ml胰酶-EDTA消化液进行消化后，加入0.5ml PBS，用微量振荡器振荡并用移液枪吹打，使细胞完全消化下来并混匀，血球计数板计算细胞浓度。
另外两个孔，一孔再加入1ml RPMI1640培养液，和1ml无菌FBS缓冲液调整的重组婴儿双歧杆菌悬液(1×107CFU/ml)；一孔再加入1ml RPMI1640培养液和1ml本实施例的定植益生菌制剂。
两孔用移液枪吹打混合，于厌氧培养箱中，37℃孵育2h。孵育后弃去组织培养板中各孔的混合液，用无菌PBS缓冲液洗涤5次，以除去未黏附的益生菌。加入0.4ml胰酶-EDTA消化液进行消化后，加入0.6ml无菌PBS缓冲液，进行梯度稀释，甲醇固定15min，革兰氏染色，平板计数计算黏附的细菌数。
按照以下公式计算不同菌悬液的黏附率：黏附率(CFU/cell)＝黏附细菌数/细胞数。
结果，本实施例的定植益生菌制剂中的重组婴儿双歧杆菌对鼻咽癌细胞的黏附率为(6.58±0.32)CFU/cell，大于不含表面活性剂的重组婴儿双歧杆菌对对鼻咽癌细胞的黏附率(4.87±0.44)CFU/cell。差异具有统计学意义(p<0.05)。
6.4本实施例的定植益生菌制剂靶向治疗鼻咽癌的效果实验
选中国南方人鼻咽癌患者16位。纳入条件：CT扫描病灶尺寸在5mm-8mm，未扩散，未做放化疗。
随机分为三组。(重组婴儿双歧杆菌)对照一组8名，每天使用不含表面活性剂质的重组婴儿双歧杆菌1×107CFU/ml菌悬液10ml向鼻腔喷雾，一天2次。(人参皂甙)对照组8名，每天使用含人参皂甙0.4g/L的溶液10ml向鼻腔喷雾，一天2次。实验组，选用本实施例的益生菌制剂10ml向鼻腔喷雾，一天2次。
三组连续治疗1年，再次用CT扫描病灶尺寸。病灶尺寸不变或减小，不发生扩散者与小组人数的比率可视为1年保守治疗的显效率。本实施例提供的定植益生菌制剂的显效率达87.5％，显著大于(重组婴儿双歧杆菌)对照一组的显效率50％，和人参皂甙对照二组的显效率37.5％，
本实施例的定植益生菌制剂可用于靶向治疗鼻咽癌。通过鼻腔给药于咽部比通过注射更加安全有效。
实施例7
本实施例提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，包含表面活性剂、益生菌以及NaCl。其中，益生菌为乳酸乳球菌，浓度1x105CFU/ml，表面活性剂为辛夷提取物。该定植益生菌制剂表面张力为65mN/m以下，辛夷提取物浓度为6.0g/L，pH为7，NaCl浓度为2g/L。
7.1本实施例提供的定植益生菌制剂制备方法：
将含量1×107CFU/g的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis EU147310)包埋冻干菌粉1g，NaCl 0.2g，加入100ml双去离子水中混匀，加入辛夷提取物0.6g，从而获得本实施例的定植益生菌制剂。
辛夷提取物中的香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷、3-甲氧基-4-羟基苯-1-O-β-D-葡萄糖苷、香草酸葡萄糖酯、苄基-O-β-D-半乳糖苷、3，4，5-三甲氧基苯-1-O-β-D-葡萄糖苷、苄基-O-β-D-葡萄糖苷是植物性表面活性剂物质。
7.2本实施例提供的定植益生菌制剂中益生菌的细胞表面疏水性检测：检测方法同步骤1.2。
结果：经过本实施例的辛夷提取物处理的乳酸乳球菌的细胞表面疏水性为(32.51±5.21)％显著高于未经表面活性剂处理的乳酸乳球菌(1x105CFU/ml)的表面疏水性(22.31±1.67)％。差异具有统计学意义(p<0.05)。
7.3本实施例提供的定植益生菌制剂的黏附率检测：方法同步骤1.3。
结果：本实施例的定植益生菌制剂中乳酸乳球菌与人鼻黏膜细胞的黏附率为(2.21±0.07)CFU/cell，高于未经表面活性剂处理的乳酸乳球菌(1x105CFU/ml)的黏附率(1.07±0.14)CFU/cell。
7.4本实施例提供的定植益生菌制剂效果实验
选健康豚鼠20只，雌雄各半，体重350～450g。将豚鼠按体重随机分为实验与对照二组，每组10只。鼻超敏反应造模：先以10％二异氰酸甲苯酯(TDI)橄榄油溶液l0μl，用加样器滴入2组豚鼠双侧前鼻孔，每侧5μl，每日1次，连续5～7d后改为隔日给药1次。
造模成功后，对观察组豚鼠给予本实施例的益生菌制剂10μl，用加样器滴入豚鼠双侧前鼻孔，每侧各5μl.每日4次，连续10d。对照组以生理盐水滴入鼻孔，方法同上，给药时间同步。
鼻部症状观察从第1d给药开始，观察鼻部症状如鼻痒、喷嚏、流涕等症状出现的时间及轻重，并按以下标准评分记录：①鼻痒轻度：轻擦鼻几次，计1分；鼻痒中度：搔抓鼻面不止.计2分；鼻痒重度：鼻痒而四处擦碰计3分。②喷嚏，1～3个计1分，4～10个计2分，多于10个计3分。③流涕，流至鼻前孔计1分，超过鼻前孔计2分，涕流满面计3分。记录时以叠加法计总分，总共超过5分者为模型成功。于给药当时、给药后2h各观察30min.
结果显示，经过10d，动物计分>5者，实验组2只，对照组7只；计分≤5者，实验组8只，对照组3只。差异有显著意义(P<0.01)。
本实施例的定植益生菌制剂对过敏鼻炎有治疗作用。
实施例8
本实施例提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，包含表面活性剂、益生菌以及NaCl，辛夷提取物；不含水。
将含量1×107CFU/g的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis EU147310)包埋冻干菌粉1g，NaCl 0.2g，辛夷提取物0.5g，均匀混合在一起，获得本实施例的粉状的定植益生菌制剂。
使用时直接喷入鼻腔，或按质量体积比为1:50的比例(定植益生菌制剂与去离子水的比)将粉状的定植益生菌制剂分散在去离子后，再喷入鼻腔。
本实施例提供的定植益生菌制剂干粉，按质量体积比为1:50的比例(定植益生菌制剂与去离子水的比)将粉状的定植益生菌制剂分散在去离子水后，获得与实施例7相同的液体益生菌制剂，与其属性功效相同。
综上，本发明提供的定植益生菌制剂，其用于直接作用于呼吸道黏膜，其包括表面活性剂和益生菌，表面活性剂对呼吸道黏液的溶胶层和凝胶层产生改性，提高了益生菌接触呼吸道黏膜细胞的概率和速度。同时表面活性剂改变了益生菌的细胞表面疏水性，提高了这些益生菌与呼吸道黏膜上皮细胞的黏附率，从而解决了现有技术中益生菌难以在黏液纤毛传输系统驱除下定植于呼吸道黏膜的技术瓶颈。
因此，本发明提供的定植益生菌制剂所含益生菌对呼吸道黏膜上具有更高的黏附率，其更易于定植在呼吸道黏膜，有利于上述益生菌持续长久地发挥功能。本发明提供的定植益生菌制剂具有广阔的应用前景，其可应用于制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或用于治疗过敏性皮炎或用于治疗脑神经疾病或抗鼻咽癌或抗肺癌或抗感冒或预防或治疗呼吸道传染病的药物等诸多领域中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种定植益生菌制剂，其特征在于，其用于直接作用于呼吸道黏膜，所述定植益生菌制剂包括表面活性剂和益生菌；所述定植益生菌制剂的表面张力小于65 mN/m，所述表面活性剂为生物表面活性剂，所述生物表面活性剂包括糖脂和脂肽中的至少一种。
2.一种定植益生菌制剂，其特征在于，其用于直接作用于呼吸道黏膜，所述定植益生菌制剂包括表面活性剂和益生菌；所述定植益生菌制剂的表面张力小于65 mN/m，所述表面活性剂为植物性表面活性剂，所述植物性表面活性剂包括糖苷和皂甙中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的定植益生菌制剂，其特征在于，所述定植益生菌制剂的表面张力为40-60 mN/m。
4.根据权利要求3所述的定植益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌是乳酸菌，所述定植益生菌制剂中所述乳酸菌的含量为1x104-1x1012个/g。
5.根据权利要求3所述的定植益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌为乳酸杆菌。
6.根据权利要求5中所述的定植益生菌制剂，其特征在于，所述乳酸杆菌为唾液乳酸杆菌，所述定植益生菌制剂还包括细菌培养上清液，所述细菌培养上清液含有所述表面活性剂，所述定植益生菌制剂的表面张力为49-60 mN/m。
7.根据权利要求6中所述的定植益生菌制剂，其特征在于，所述定植益生菌制剂的表面张力为55 mN/m。
8.一种用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或预防或治疗呼吸道传染病的药物，其特征在于，其含有权利要求1-7中任一项所述的定植益生菌制剂。
9.权利要求1-7中任一项所述的定植益生菌制剂在制备用于治疗鼻炎或用于治疗哮喘或预防或治疗呼吸道传染病的药物中的应用。
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