CN111337676A - 用于诊断自身免疫性胃炎的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于诊断AIG的方法，其包括检测在包含抗体的样品中是否存在针对胃H⁺/K⁺‑ATP酶的β‑亚基的自身抗体的步骤，其中使用具有固相的在诊断上有用的承载体，在其上固定化有用于特异性地捕获所述自身抗体的工具；以及涉及具有固相的在诊断上有用的承载体，在其上固定化有用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺‑ATP酶的β‑亚基的自身抗体的工具。

Description

用于诊断自身免疫性胃炎的方法

本发明涉及用于诊断AIG的方法，其包括检测在包含抗体的样品中是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的步骤，其中使用具有固相的在诊断上有用的承载体，在其上固定化有用于特异性地捕获所述自身抗体的工具；以及涉及具有固相的在诊断上有用的承载体，在其上固定化有用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具。

公认的是，针对来自壁细胞的该H⁺/K⁺-ATP酶的循环自身抗体，也称为APCA(“抗壁细胞抗体(anti-parietal cell antibodies)”的缩写)，是关于自身免疫性胃炎(AIG)和恶性贫血的诊断标志物。AIG是一种慢性疾病，在总人口中具有大约2％的流行率。在罹患其他自身免疫疾病例如I型糖尿病的患者中，该流行率达到10％。

在胃粘膜的粘膜固有层的壁细胞中的H⁺/K⁺-ATP酶具有泵抽质子并由此维持胃内的酸性环境的任务。它是异二聚体，其由包含催化中心并且实现离子运输的α-亚基(由ATP4A基因编码)和使α-亚基稳定并且对于酶促活性来说必需的β-亚基(由ATP4B编码)组成。

在AIG的情况下，发生胃粘膜的损伤，其被称为萎缩性胃炎(Atrophic bodygastritis，ABG)。在该情况下，粘膜的分解导致减少的或缺乏的胃酸分泌。这也可以由于被幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染而引起。

除了其他可能的原因外，自身免疫性胃炎可以引起恶性贫血(PA)，这是一种基于维生素B12缺乏的贫血。它由于内因子(intrinsic factor)(一种结合所述维生素并使之稳定并且由壁细胞(APCA是针对其的)形成的蛋白质)的缺乏而引起。

为了正确地治疗AIG或PA，必不可少的是区分由自身免疫引起的胃炎、由细菌引起的胃炎或由药物引起的胃炎。在治疗错误或没有治疗的情况下，可以发生胃溃疡或胃穿孔，而且胃癌的风险增加。

因此，存在对于适合于高通量的诊断测试的需求，用其可以以尽可能高的诊断可靠性在容易可得的患者样品材料中检测在诊断上有用的抗体，特别地以尽可能高的灵敏度和/或特异性，特别是相对于基于检测针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的α-亚基或包含α-亚基和β-亚基的异二聚体的自身抗体的测试而言。

需要指出的是，单独的测试结果无法实现诊断，这尤其是因为具有很多其他疾病例如胰腺炎或糖尿病的患者的样品可能具有所述自身抗体。测试结果可以由主治医生与其他症状例如维生素B12缺乏、高色素性贫血、胃粘膜被淋巴细胞浸润一起进行解释并以此支持诊断，而本身不为最终的诊断提供足够的决定基础。

为此，在现有技术中公开了ELISA测试和免疫荧光测试，用其可以检测针对具有ATP4A-亚基和ATP4B-亚基的异二聚体的自身抗体。

自2011年以来，EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG销售一种基于经纯化的具有所述两个亚基的天然哺乳动物ATP4的ELISA。在测试说明书中，详细地陈述了特异性，并且接着指出，通过选择截止值可以优化该特异性(目录号：EA 1361-9601G)。

WO2011/150086公开了针对ATP4A-亚基的自身抗体的检测。

Wenzlau等人公开了检测针对ATP4A的自身抗体以在遭受I型糖尿病之苦的患者中诊断自身免疫性胃炎。采用了放射结合测试(Wenzlau,J.M.,Gardner,T.J.,Frisch,L.M.,Davidson,H.W.和Hutton,J.C.(2011)Development of a novel autoantibody assay forautoimmune gastritis in T1D individuals,Diabetes Metab Res Rev.,27(8):887-90)。

Rusak等人公开，胃H⁺/K⁺-ATP酶的ATP4A-亚基是关于APCA的主要抗原(Rusak,E.,Chobot,A.,Krzywicka,A.和Wenzlau,J.(2016)Anti-parietal cell antibodies-diagnostic significance,Advances in Medical Sciences,61:175-179)。他们指出，用放射免疫测定法可以取得比用ELISA或IFT更好的结果。

与神经学自身免疫疾病相关联地，Scharf等人公开，通过使用免疫荧光测试可以检测针对该ATP酶异二聚体的自身抗体，当使用表达ATP4A或ATP4B的细胞时(Scharf,M.,Miske,R.,Heidenreich,F.,Giess,R.,Landwehr,P.,

I.,Begemann,N.,Denno,Y.,Tiede,S.,

C.,Schlumberger,W.,Unger,M.,Teegen,B.,

W.,Probst,C.,Komorowski,L.(2015)Neuronal Na⁺/K⁺ATPase is an autoantibody targetin paraneoplastic neurologic syndrome,Neurology,84:1-7)。在具有神经学症状的患者的血清中，检测到针对ATP4B(而非针对ATP4A)的抗体。未公开确切使用了哪种类型的抗原和如何施行所述方法。

Lahner等人公开了通过使用发光免疫沉淀系统(LIPS)来检测来自遭受萎缩性胃炎之苦的患者的样品的针对ATP4A和ATP4B的自身抗体。结果表明，可以几乎以相同的高的灵敏度和特异性检测针对ATP4A和ATP4B的自身抗体(Lahner,E.,Brigatti,C.,Marzinotto,I.,Carabotti,M.,Scalese,G.,Davidson,H.W.,Wenzlau,J.M.,Bosi,E.,Piemonti,L.,Annibale,B.和Lampasona,V.(2017)Luminescent ImmunoprecipitationSystem(LIPS)for Detection of Autoantibodies Against ATP4A and ATP4B Subunitsof Gastric Proton Pump H⁺/K⁺-ATPase in Atrophic Body Gastritis Patients,Clinical and Translational Gastroenterology,8(1):e215)。

Burbelo等人研究了在遭受I型糖尿病之苦的患者中针对ATP4B的抗体的出现(Burbelo,P.D.,Lebovitz,E.E.,Bren,K.E.,Bayat,A.,Paviol,S.,Wenzlau,J.M.,Barriga,K.J.,Rewers,M.,Harlan,D.M.和Iadarola,M.J.(2012)ExtrapancreaticAutoantibody Profiles in Type IDiabetes,PLOS ONE,7(9):e45216)。

Kontani等人通过使用小鼠的样品将α-亚基鉴定为在AIG中的主要抗原性蛋白质(Kontani,K.,Taguchi,D.和Takahashi,T.(1992)Involvement of the H+/+-ATPasealpha subunit as a major antigenic protein in autoimmune gastritis induced byneonatal thymectomy inmice,Clin.Exp.Immunol.89,63-67)。

通过使用以细胞提取物形式的未纯化的β-亚基，Ma等人得出结论，不仅α-亚基而且β-亚基均结合来自具有AIG的患者的自身抗体。未进行人α-亚基和β-亚基的直接比较(Ma,J.Y.,Borch,K和Mardh,S.(1994)Human Gastric H,K-Adenosine Triphosphatasebeta-Subunit is a Major Autoantigen in Atrophic Corpus Gastritis,ScandJ.Gastroenterol 29,790-794)。

不仅Lahner等人而且Burbelo等人均指出，仅具有特别高的灵敏度和特异性的测试例如LIPS或放射结合测试就已经适合于可靠的诊断，与具有固相的测试系统相反，用其无法检测许多在诊断上有用的表位。未指出为什么没有选择ATPA4-亚基的原因。

作为本发明基础的任务通过所附的独立和从属权利要求的主题而得到解决。

在第一个方面，作为本发明基础的问题通过用于诊断AIG，任选地用于诊断AIG和/或PA的方法而得到解决，其包括检测在包含抗体的样品中是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的步骤，其中使用具有固相的在诊断上有用的承载体，在其上固定化有用于特异性地捕获所述自身抗体的工具。

在一个优选的实施方案中，所述承载体选自包括下列各项的组：微量滴定板，珠粒，印迹，优选地Western印迹、线印迹或斑点印迹，具有经固定的细胞的免疫荧光测试承载体，其优选地用于显微镜分析，侧流装置，纤维素基聚合物，生物芯片，微阵列，和色谱柱材料。

在一个优选的实施方案中，所述在诊断上有用的承载体为用于ELISA的微量滴定板。

在一个优选的实施方案中，所述样品选自包括下列各项的组：血清、全血、血浆、CSF。

在一个优选的实施方案中，所述方法包括检测在样品中是否存在针对内因子的自身抗体。

在一个优选的实施方案中，所述自身抗体为IgG类别的抗体。

在第二个方面，作为本发明基础的问题通过具有固相的在诊断上有用的承载体而得到解决，在其上固定化有用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具。

在第三个方面，作为本发明基础的问题通过特异性地结合胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的单克隆抗体或经分离的自身抗体而得到解决，其特别优选地以经纯化的形式，但优选地不针对α-亚基。

在第四个方面，作为本发明基础的问题通过用于校准医学产品或控制其质量的方法而得到解决，所述方法包括使根据本发明的承载体与包含根据本发明的抗体的液体相接触的步骤，所述液体优选地以已知浓度包含根据本发明的抗体；随后为检测在所述液体中是否存在所述抗体的步骤，特别优选地通过在所述液体中所述抗体的至少半定量测定。

在第五个方面，作为本发明基础的问题通过包含根据本发明的在诊断上有用的承载体的试剂盒而得到解决，其中所述试剂盒包含一种或多于一种，优选地所有从包括下列各项的组中选择的试剂：洗涤溶液，校准物溶液，针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的抗体，和用于检测所述自身抗体的工具，优选地二抗，更加优选地针对IgG抗体的二抗。

在一个优选的实施方案中，所述二抗具有可检测的标记物。所述可检测的标记优选地选自包括下列各项的组：能够化学发光的、放射性的或包含可检测的同位素的标记物，具有酶促活性的标记物，能够发荧光的标记物，通过NMR-光谱学可检测的化合物，自旋标记-标记物，优选地能够化学发光的标记物，最优选地在合适的化学发光触发溶液中进行温育的情况下产生化学发光信号的能够化学发光的标记物。

在第六个方面，作为本发明基础的问题通过用于检测在样品中是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具，或者根据本发明的承载体，或者根据本发明的抗体用于AIG和/或PA的高度特异性诊断的用途而得到解决。

在第七个方面，作为本发明基础的问题通过用于检测在样品中是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具，或者包含所述工具的承载体在制备用于AIG和/或PA的高度特异性诊断的试剂盒或组合物中的用途而得到解决。

在第八个方面，作为本发明基础的问题通过针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体用于AIG的诊断，优选地高度特异性诊断的用途而得到解决。特别优选地，在该情况下，β-亚基的自身抗体充当唯一的生物标志物，优选地充当在测试运行中唯一的自身免疫生物标志物，更加优选地充当唯一的源自胃H⁺/K⁺-ATP酶的自身免疫生物标志物。这可以意味着，在相同的样品中没有平行地检测到其他自身抗体，特别是没有检测到针对胃H⁺/K⁺-ATP酶(特别是α-亚基)的其他自身抗体。

本发明基于发明人的令人惊讶的发现：以经优化的诊断可靠性(特别是特异性和灵敏度)检测自身抗体可以对AIG的诊断做出贡献，当检测是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基(而非例如针对α-亚基或异二聚体)的自身抗体时。那么，当使用具有固相的在诊断上有用的承载体(即在现有技术中被描述为在诊断上不可靠的测定法形式)时，这也是正确的。

进一步地，本发明基于发明人的令人惊讶的发现：检测针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的细胞外结构域的自身抗体允许特别特异性的诊断。因此，可以以高的水平减少假阳性诊断或检验结果的数目。

在一个优选的实施方案中，所述测试通过使用具有固相的在诊断上有用的承载体来进行，在其上固定化有用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具。在一个更优选的实施方案中，所述工具为包含胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基或其变体的多肽。然而，从其衍生的或模仿β-亚基的主链的分子例如肽模拟物、拟肽、β-肽和具有非天然氨基酸的肽也是可使用的。专业人员熟悉此类分子及其设计(Pelay Gimeno,M.,Glas,A.,Koch,O.,Grossmann,T.N.(2015)Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions:Mimicking peptide binding epitopes.Angewandte ChemieInternational Edition.54(31):8896-8927)。同样地可能的是，通过下述方式来间接地检测β-亚基，即一方面检测是否存在针对包含α-亚基和β-亚基的异二聚体的自身抗体，和另一方面检测是否存在针对α-亚基的自身抗体。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“固定化(或经固定化的)”表示用于检测是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具结合至承载体的固相，优选地通过共价键、静电相互作用，或者通过疏水相互作用，其中所述工具保持暴露于环境，从而使得它对于在液体样品中的自身抗体来说是可接近的。各种各样的合适的承载体，例如纸、聚苯乙烯、金属、硅氧烷或玻璃表面、微观流体通道、膜、珠粒例如磁性珠粒、色谱柱介质、生物芯片、聚丙烯酰胺凝胶等，描述在文献中，例如在Kim,D.和Herr,A.E.(2013),Protein immobilization techniques for microfluidic assays,Biomicrofluidics 7(4),041501中。以这种方式，可以将经固定化的工具与不可溶的承载体一起以简单的方式与水性溶液相分开，例如通过过滤、离心或滗析。经固定化的工具可以是可逆地或不可逆地经固定化的。例如，当所述工具与所述承载体通过离子相互作用(其可以通过添加高浓度的盐而被掩蔽)来相互作用时，或者当所述工具通过可裂解的共价键例如二硫桥(其可以通过添加包含硫羟基的试剂而被裂解)而结合时，所述固定化是可逆的。与之相反，当所述工具通过在水性溶液中不能被裂解的共价键，例如通过环氧基团与氨基基团的反应而形成的键(正如它经常被用于使赖氨酸侧链结合至亲和柱)被固定在所述承载体上时，所述固定化是不可逆的。所述工具，优选地多肽，可以间接地被固定化，例如通过使抗体或对于所述工具具有亲和性的另一种单元固定化，和随后形成复合物，其中具有工具-抗体复合物被固定化的效果。它也可以直接进行固定化，即用于涂覆直接接触的承载体。用于固定化的各种各样的可能性描述在文献中，例如在Kim,D.和Herr,A.E.(2013),Protein immobilizsationtechniques for microfluidic assays,Biomicrofluidics 7(4),041501中。

所述胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基优选地为用UniProtKB-序列条目P51164或在SEQ IDNO:7中所描绘的氨基酸序列，更优选地为由SEQ ID NO:3所描绘的氨基酸序列，其中后者表示细胞外结构域，其不具有跨膜结构域，更加优选地为在SEQ ID NO:5中描绘的片段。根据本发明，可以使用其变体。在该申请中，所有所引用的数据库编号代表Uniprot数据库或其他的数据库，更准确而言，代表其在该申请或其最早优先权申请的提交日之时的版本。特别优选的是，在至少一个来自具有序列SEQ ID NO:4的β-亚基的跨膜结构域的表位和/或至少α-亚基的任何一个表位(其对于来自AIG患者的血清的自身抗体具有反应性)(优选地，α-亚基的任何一个表位)不存在的情况下，使用SEQ ID NO:3或其变体。

所述胃H⁺/K⁺-ATP酶的α-亚基优选地为由UniProtKB-登录号P20648或在SEQ IDNO:9中所描绘的氨基酸序列。所述内因子优选地为由NCBI-Genbank条目NP_005133.2或在SEQ ID NO:10中所描绘的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，“检测在样品中是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体”是指，检测所述样品是否包含针对β-亚基但不针对相同蛋白质的α-亚基的自身抗体。优选地，也不检测仅针对包含α-亚基和β-亚基的复合物的自身抗体。在该情况下特别优选的是，产生第一信号，其指明针对β-亚基的自身抗体已经结合，并且可以区别于由于其他自身抗体与其他自身抗原例如α-亚基或由α-亚基和β-亚基的氨基酸组成的自身抗原相结合而产生的信号。因此，可以辨别，特异于β-亚基的抗体是否与β-亚基相结合，或者是否发生了其他事件，特别是结合α-亚基或由α-亚基和β-亚基组成的复合物(而非单独的β-亚基)的自身抗体的结合。在一个优选的实施方案中，根据本发明，代替用于特异性捕获的工具，使用用于特异性地检测在样品中是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具，其中它优选地是允许检测在样品中是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具。所述用于检测的工具或所述用于特异性捕获的工具可以为用于检测或特异性捕获的多肽或试剂或组合物。

所述自身抗体的检测可以是定性的或定量的。在一个优选的实施方案中，术语“定性(的)”是指，仅检测所述自身抗体是否存在，而不是以何种浓度。特别地，不确定所述自身抗体的浓度是否超过某个值，其带来关于当前疾病的进一步信息，例如关于疾病的严重度、关于发展、关于治疗成果或关于某些症状。在一个优选的实施方案中，术语“定量(的)”是指，作出超越可以检测到所述自身抗体这样程度的陈述。特别地，可以确定一个绝对或相对值，或者至少归属于多个所定义的浓度范围中的一个。

这可以通过下述方式来实现：使用在空间上与其他抗原，优选地自身抗原或此类自身抗原的对于来自AIG患者的样品的自身抗体具有反应性的表位(特别是α-亚基或其变体)相分开的β-亚基或其变体。备选地，可以检测在所述样品中是否存在结合包含胃H⁺/K⁺-ATP酶的α-亚基和β-亚基的复合物的自身抗体，和另外还有在所述样品中是否不存在特异性地结合α-亚基的抗体。如果就是这种情况，那么可以得出结论，存在特异性地结合β-亚基的自身抗体，即使对于所述测试既未使用β-亚基也未使用其变体。最后，还存在这样的可能性，即将所有在样品中存在的所寻找的类别的抗体(优选地IgG)固定化，随后与胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基相接触，所述β-亚基要么本身是经标记的，要么可以通过经标记的配体(优选地，经标记的抗体)而被检测。

为了评估患者是否具有升高的遭受AIG和/或PA之苦或者患病的风险，优选地仅仅通过针对β-亚基的自身抗体的存在或不存在来指示这是否是这种情况。与之相反，并不关注针对α-亚基的自身抗体的检测，因为它不指示这样的升高的风险。

在一个优选的实施方案中，“用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具”是指这样的工具，用其可以捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体，然而可以较不有效地捕获，最优选地不捕获或者以不可检测的程度捕获其他抗体，优选地自身抗体(特别是针对α-亚基的)，从而使得在根据本发明的检测方法的情况下，在使所述工具或包含所述工具的承载体与样品相接触时，它们在样品中保持不被捕获。优选地，用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具与来自AIG患者的样品的针对β-亚基的自身抗体特异性地相结合。在一个优选的实施方案中，在所有针对H⁺/K⁺-ATP酶的自身抗体中，仅使用或者说作为标记物使用结合胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的那些以诊断AIG，特别优选地不使用结合α-亚基的那些。该自身抗体或这些自身抗体充当唯一的用于根据本发明的诊断的自身抗体-标志物。优选地，不存在源自α-亚基的表位，针对α-亚基的自身抗体与之结合，但是结合β-亚基的自身抗体不与之结合。

在一个特别优选的实施方案中，在抗体的情况下，在本文中所使用的术语“特异性地结合”意味着，它在以1×10^-5M，更优选地1×10^-7M，更优选地1×10^-8M，更优选地1×10^-9M，更优选地1×10^-10M，更优选地1×10^-11M，更优选地1×10^-12M的解离常数为特征的结合反应或更强的结合反应中结合相应的抗原。优选地，在该情况下，所述解离常数通过使用Biacore仪器在25℃下和在pH 7的PBS缓冲液中经由表面等离子体共振来测量，并且通过使用制造商所提供的软件来计算。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“诊断”是指这样的程序，在该程序中获得支持评估或总体而言首先允许评估受试者是否遭受疾病之苦或以比平常人更高的概率遭受疾病之苦，或者在过去遭受了或在未来将会遭受疾病之苦，同样地，疾病是否正在进展或者它在未来将会如何发展的信息；或者评估某一治疗是否奏效。优选地，在诊断之前，所述受试者并不知晓其是否罹患所述疾病。

优选地，对于诊断或对于支持诊断来说，仅检测是否存在抗体是足够的，其中可以测定在样品中是否存在可检测的浓度的抗体。在一个优选的实施方案中，测定在待诊断的患者中的抗体的相对浓度是否高于在平常健康者中。可以测定所述浓度是否以1.1倍，更优选地1.2、1.5、1、2、5、10、20、25、50、100、200、500、1000、10000或100000倍高于在平常健康者的样品中。更高的浓度支持诊断出所述样品所来源于的患者罹患AIG，或者表明所述患者以升高的概率罹患AIG。

根据本发明的方法或根据本发明的用途优选地在体外进行。

专业人员将会理解，这样的检测通常单独地并不允许全面的诊断，而是必须考虑其他方面，例如其他的在样品中待测定的参数、病史、临床症状、既往症或成像方法的结果。专业人员将会进一步理解，根据本发明的方法的价值可以在于，可以进行间接诊断或鉴别诊断，其中一种疾病的排除表明，所述患者遭受具有类似症状的其他疾病之苦。在一个优选的实施方案中，根据本发明的产品例如承载体或试剂盒或者根据本发明的方法用于区分由自身免疫引起的胃炎、由细菌引起的胃炎或由药物引起的胃炎，或者用于诊断从包括AIG、恶性贫血、萎缩性胃炎或维生素B12缺乏的组中选择的疾病。

对于检测抗体的情况，待研究的样品为包含患者的代表性的一组抗体的样品，所述患者优选地为哺乳动物，更加优选地人。优选的是，所述样品选自包括下列各项的组：血清、血浆、唾液和CSF。

根据本发明的教导不仅可以通过使用所指出的多肽的野生型序列或参考序列(如将它以SEQ ID NO(此后统称为“全长多肽”)或数据库编号的形式或者以别的方式，任选地含蓄地，在此指出)，而且还可以通过使用这些序列的变体来实施。

在一个特别优选的实施方案中，在该情况下，在本文中所使用的术语“变体”意指全长多肽的至少一个片段，其相对于全长多肽而言在C-末端和/或N-末端处被截短一个或多于一个氨基酸。这样的片段可以包含来自全长多肽序列的5、6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150或200个连续氨基酸的长度，优选地10个或更多个连续氨基酸。

在一个进一步的优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“变体”不仅包括片段，而且还包括这样的多肽，所述多肽具有以优先级渐增的顺序与全长多肽或其片段具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中没有缺失或非保守性地置换对于生物学活性(例如抗原与对于全长多肽抗原来说特异性的抗体相结合的能力)来说必不可少的氨基酸。现有技术公开了用于确定氨基酸序列的序列同一性的方法，例如在Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,Oxford University Press,2008,第三版中。在一个优选的实施方案中，为此利用ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007).Clustal W and Clustal Xversion2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)，其中使用默认设置。

另外，根据本发明所使用的多肽或其变体可以具有化学修饰，例如同位素标记物，共价修饰例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、甲基化、羟基化，等等。在一个特别优选的实施方案中，包含β-亚基或其变体的用于检测针对β-亚基的自身抗体或者以另一种方式来说根据本发明所使用的多肽是经糖基化的。所述糖基化优选地通过在能够进行糖基化的细胞，优选地哺乳动物细胞或昆虫细胞，更优选地哺乳动物细胞中进行表达来完成。

变体也可以是与氨基酸或其他已知的多肽或其变体(优选地与用于纯化的标签，其更加优选地选自包括His标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、链霉抗生物素蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶或其变体的组)的融合蛋白；并且可以是或具有有活性的部分或结构域，其优选地与全长多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个优选的实施方案中，术语“有活性的部分或结构域”是指全长多肽的片段或变体，其保留了全长多肽的至少一部分生物学活性。

必要的是，全长多肽的变体具有生物学活性。在一个优选的实施方案中，所述生物学活性为工具(优选地，多肽)捕获针对β-亚基的自身抗体或与之相结合(优选地，特异性地相结合)的能力，如它存在于患有AIG的患者的样品中那样。作为关于试验的参照，可以获得来自此类样品的自身抗体。用于检测被特异性地捕获的抗体的二抗的变体为所有具有与所述二抗相同的结合特异性(优选地，结合所有的人IgG类别的抗体的能力)的分子。它们例如包括所述二抗的片段和衍生物。

在制备变体或者评估其是否可以显示出生物学活性的情况下，专业人员可以遵循da Silva等人的工作(da Silva,H.D.,Gleeson,P.A.,Toh,B.H.,Van Driel,I.R.和Carbone,F.R.(1999)Identification of a gastritogenic epitope of the H/K ATPasebeta-subunit,Immunology1999,96,145-151)。他们将SEQ ID NO:6鉴定为包含免疫显性表位的肽。这意味着，在SEQ ID NO:5中所描绘的来自人蛋白质的同源序列包含人的表位。通过与其他哺乳动物同源物(例如来自猪、牛，灵长类动物、山羊等的)进行序列比对，专业人员可以容易地预测具有反应性的变体。通过突变和进一步的截短，专业人员可以产生其他变体。如在实施例中那样借助于ELISA来进行，专业人员可以证实生物学活性得到保持。

在该情况下，多肽或其变体不结合或仅低程度地结合针对α-亚基的抗体，优选地其免疫显性表位，例如在SEQ ID NO:8中所描述的。专业人员可以从Nishio等人中获取来自其他同源的哺乳动物酶的同源表位，并且考虑用于变体的设计(Nishio,A.,Hosono,M.,Watanabe,Y.,Sakai,M.,Okuma,M和Masuda,T(1994)Gastroenterology 107,1408-1414)。优选地，针对β-亚基的自身抗体(如它们存在于患者的样品中那样)的结合常数以至少10倍，优选地100倍，更优选地1,000倍，更优选地10,000倍，更优选地100,000倍，更加优选地1,000,000倍，更加优选地10,000,000倍低于针对α-亚基的自身抗体(如它们存在于患者的样品中那样)的结合常数，和结合反应的强度相应地高于针对α-亚基的自身抗体。在该情况下，结合常数表征了各自的针对变体的自身抗体(更准确而言，自身抗体的混合物)(如它们存在于样品中那样)的结合强度。在该情况下，结合常数优选地借助于Biacore在25℃下在PBS缓冲液中来进行测量。例如，在来自样品的针对β-亚基的自身抗体进行结合的情况下，结合常数可以为10^-10M，而来自样品的针对α-亚基的相同自身抗体的结合常数为10^-6M。因此，第一个结合常数比第二个结合常数低10,000倍。这意味着，针对β-亚基的自身抗体比针对α-亚基的自身抗体明显更强地与所述多肽或变体相结合。如果根据本发明使用所述多肽或变体，那么因此仅针对β-亚基的自身抗体(而不是针对α-亚基的自身抗体)被结合和检测。

在一个优选的实施方案中，在本文中所使用的术语“自身抗体”是指这样的抗体，其特异性地与来自产生它的生物的结构(优选地，自身抗原)相结合。这样的自身抗体具有恒定区，如来自相同生物的相同类别的其他抗体所具有的那样。特别优选地，它是哺乳动物自身抗体，更加优选地人自身抗体，更加优选地IgG类别的人自身抗体。可变结构域能够特异性地结合自身抗原。优选地，所述自身抗原为源自β-亚基或在β-亚基中所包含的表位，优选地SEQ ID NO:5或其变体。

在一个优选的实施方案中，所述用于捕获的工具为经分离的和/或经纯化的多肽，其特别优选地是重组的。在该情况下，“经分离的”多肽可以是指，将所述多肽从其天然环境或者它进行表达时所处的环境中移除。在一个优选的实施方案中，“经纯化的”多肽是指通过使用色谱学方法相对于在其天然环境中的浓度和/或纯度而言经富集的多肽，所述色谱学方法优选地选自包括下列各项的组：亲和色谱法、凝胶过滤色谱法和离子交换色谱法。在一个特别优选的实施方案中，多肽是经纯化的，如果它具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或99.5％的纯度(这可以目视地或者优选地通过在考马斯蓝染色后在SDS-PAGE凝胶上的条带的强度测量来判断)。

多肽可以以组织或细胞(优选地，重组组织或重组细胞)的形式来提供。所述细胞优选地为真核细胞，更优选地昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，更加优选地哺乳动物细胞例如人细胞，最优选地HEK293细胞。

作为工具的多肽可以以经折叠的形式或以未折叠的形式来提供，并且优选地是经折叠的。优选地，所述折叠在缓冲液中(例如在处于pH 7的10mM磷酸钠中)借助于CD-光谱学来进行测量，所述缓冲液允许所述测量并且在所述缓冲液中该蛋白质可以采取其三维折叠(参见例如Banaszak L.J.(2008),Foundations of Structural Biology,AcademicsPress；或Teng Q.(2013),Structural Biology:Practical Applications,Springer)。优选地，所述蛋白质采取被待检测的抗体所识别的折叠。

在一个优选的实施方案中，在捕获之后通过从包括下列各项的组中选择的方法来检测抗体：免疫扩散、免疫电泳、光散射、凝集、放射性、酶促活性、(电)化学发光和免疫荧光的测量。在通过放射性、酶促活性、(电)化学发光和免疫荧光进行检测的情况下，可以使用可检测的标记物。优选地，将它安置在与待检测的抗体相结合的二抗上。检测方法例如描述在Zane,H.D.(2001),Immunology-Theoretical&Practical Concepts in LaboratoryMedicine,W.B.Saunders Company中，特别地在第14章中。

根据本发明，提供包含根据本发明的承载体的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多于一种，优选地所有从包括下列各项的组中选择的试剂：洗涤溶液，至少一种校准物溶液，针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的抗体，和用于检测自身抗体的工具，优选地二抗，更加优选地针对IgG抗体或者胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基或其变体的二抗，其优选地具有可检测的标记物，用于稀释样品的稀释缓冲液，阳性对照，化学发光触发溶液，和能够化学发光的底物。代替化学发光触发溶液和能够化学发光的底物，也可以包含用于ELISA的色素原溶液。

所述自身抗体检测可以是定量的或半定量的，优选地半定量的。在一个优选的实施方案中人们理解，“半定量(的)”意指，确定测量结果是否在某一阈值(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40RU/ml)之上。在该情况下，以RU/ml表示的值优选地借助于EUROIMMUNMedizinischeLabordiagnostika AG的ELISA(EA 1361-9601G)来进行测量。

如在根据本发明的方法中所使用的，校准物溶液是指具有确定量的抗体的溶液，所述抗体结合与待检测的自身抗体相同的抗原并且优选地属于与待检测的抗体相同的Ig类别，其中所述抗原优选地为β-亚基。所述校准物可以包含以绝对或相对尺度已知的量的抗体。例如，校准物可以包含十倍于另一种抗体这么多的抗体。以确定量存在的抗体可以为来自样品的自身抗体或重组的单克隆抗体。优选地，将多于两种，优选地3、4、5或6种各自具有不同的抗体浓度的校准物溶液提供在所述试剂盒中或者根据本发明进行使用，特别地与样品相平行地进行研究，从而使得可以绘制出用于半定量或定量测定针对β-亚基的自身抗体的校准曲线。在一个优选的实施方案中，所述校准物包含针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体或抗体，优选地，与之相反，很少包含或不以可检测的量包含或不包含针对α-亚基的自身抗体或抗体。

根据本发明，使用特异性地结合胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的单克隆抗体或经分离的自身抗体，特别优选地以重组的、经分离的和/或经纯化的形式，最优选地针对SEQ ID NO:5。这样的抗体可以充当关于根据本发明的方法的阳性对照，以及充当用于使β-亚基固定化的试剂，或者充当用于竞争性测试形式的试剂，为此它任选地可以具有可检测的标记物。

在一个优选的实施方案中，借助于化学发光来检测所捕获的自身抗体。为此目的，可以使所述自身抗体和与所述自身抗体相结合的能够化学发光的配体相接触。能够化学发光的配体可以为与所述自身抗体的恒定结构域相结合的二抗，或者为与可变结构域相结合的胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基或其变体。能够化学发光的配体可以为能够化学发光的酶，例如萤光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶，其可以使能够化学发光的底物转化而与此同时不被消耗(Kricka,L.J.(2003).Clinical applications ofchemiluminescence.Analytica chimica acta,500(1):279-286)。但是，所述能够化学发光的配体也可以具有没有酶促活性的能够化学发光的有机化合物，其在化学发光触发溶液存在下发射出化学发光信号，例如吖啶酯(acridinium ester)(Weeks,I.,Beheshti,I.,McCapra,F.,Campbell,A.K.,Woodhead,J.S.,Acridinium esters as high specificactivity labels in immunoassay.Clin Chem 29:1474-1479(1983))或鲁米诺或者其能够化学发光的衍生物。该化合物在反应中被消耗。

在吖啶酯的情况下，作为触发溶液，使用由过氧化氢和氢氧化物(例如，以氢氧化钠的形式)组成的混合物。在该情况下，吖啶酯化合物在碱性条件下被氧化，这产生发射光的吖啶酮。所述信号以典型地持续1-5秒的光闪(闪烁发光)的形式被释放。短的发射持续时间要求直接在检测器上进行反应的起始和测量。

优选地，与承载体一起地使用化学发光以作为检测方法，其中所述承载体为珠粒。

在一个进一步的优选的实施方案中，借助于ELISA来检测所捕获的自身抗体。为此目的，将用于特异性捕获的工具在用于ELISA的微量滴定板的至少一个，优选地多个，优选地至少2、4、6、8、10、12、16、20或24个孔中进行固定化。在至少一个孔中提供待分析的样品，在其他孔中提供2、3、4、5或更多种校准物溶液。然后，优选地通过有着具有酶促活性的标记物的二抗来检测所捕获的抗体。

根据本发明，将用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具用于校准医学产品或控制其质量。在一个优选的实施方案中，“校准”是指，通过使用校准溶液来获得测量值，其证实所述仪器在所需的浓度范围内提供可靠的测量值或者允许可靠地划分在样品中存在或不存在所述自身抗体。在一个进一步的优选的实施方案中，“控制”意味着，所验证的是所述仪器在这样的意义上可靠地工作，即包含所述自身抗体的样品确实被测量为阳性，和没有所述自身抗体的样品确实被测量为阴性。在一个进一步的实施方案中，“控制”意味着，所检查的是，一批工具或一个仪器是否在给定的条件下具有结合所述自身抗体的能力，优选地仍然足够地具有结合所述自身抗体的容量。所述医学产品可以为诊断产品，例如根据本发明的承载体。备选地，它可以为治疗装置(例如用于单采血液成分术的)，其同样地包含用于特异性地捕获或检测所述自身抗体的工具。

在一个优选的实施方案中，本发明描绘了试剂或工具或多肽用于检测针对β-亚基的自身抗体的用途，或者编码β-亚基或其变体的核酸或者在严紧条件下与该核酸杂交的核酸或者载体或者包含所述核酸或所述载体的细胞在制备用于诊断疾病的试剂盒中的用途。在一个优选的实施方案中，提供包含所述载体和优选地不包含编码α-亚基或者其表位或变体的载体的细胞，并且在允许所述核酸表达的条件下进行培养，随后分离和/或纯化表达产物，随后在根据本发明的方法或产品中将所述表达产物用作用于特异性地捕获抗体的工具。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于分析患者的样品以检测针对β-亚基的自身抗体的器械，其中所述检测表明了升高的疾病(优选地AIG和/或PAG)的概率，其中所述器械包含下列各项：

a.承载体，其包含用于在当样品与所述承载体相接触时特异性地捕获所述自身抗体的工具，

b.可检测的工具，其能够在当按照a在承载体与样品相接触的情况下捕获所述抗体时与所述抗体相结合，其中所述工具特别地为与所捕获的抗体相结合的经标记的二抗，

c.用于检测所述可检测的工具的存在和用于将在该情况下所获得的结果转换成信号(优选地，电信号)的检测装置，和

d.任选地，这样的工具，其用于接收来自所述检测装置的信号，和用于确定所述信号的水平是否表明升高的疾病的概率，更准确而言通过将所述信号的水平与背景信号或阈值信号的水平或者所输入的用健康个人的样品产生的信号值相比较。

在本专利申请中，列出了新的多肽和/或核酸。它们具有下列序列：

SEQ ID NO:1：spGh*-H6-ATP4B(ec)

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSGPMHHHHHHMSQTVDPYTPDYQDQLRSPGVTLRPDVYGEKGLEIVYNVSDNRTWADLTQTLHAFLAGYSPAAQEDSINCTSEQYFFQESFRAPNHTKFSCKFTADMLQNCSGLADPNFGFEEGKPCFIIKMNRIVKFLPSNGSAPRVDCAFLDQPRELGQPLQVKYYPPNGTFSLHYFPYYGKKAQPHYSNPLVAAKLLNIPRNAEVAIVCKVMAEHVTFNNPHDPYEGKVEFKLKIEK

SEQ ID NO:2：H6-ATP4B(ec)；确实在细胞中存在的和为了实施例经纯化的序列，即细胞外结构域，具有N-末端His-标签

GPMHHHHHHMSQTVDPYTPDYQDQLRSPGVTLRPDVYGEKGLEIVYNVSDNRTWADLTQTLHAFLAGYSPAAQEDSINCTSEQYFFQESFRAPNHTKFSCKFTADMLQNCSGLADPNFGFEEGKPCFIIKMNRIVKFLPSNGSAPRVDCAFLDQPRELGQPLQVKYYPPNGTFSLHYFPYYGKKAQPHYSNPLVAAKLLNIPRNAEVAIVCKVMAEHVTFNNPHDPYEGKVEFKLKIEK

SEQ ID NO:3：ATP4B-亚基的细胞外结构域

QTVDPYTPDYQDQLRSPGVTLRPDVYGEKGLEIVYNVSDNRTWADLTQTLHAFLAGYSPAAQEDSINCTSEQYFFQESFRAPNHTKFSCKFTADMLQNCSGLADPNFGFEEGKPCFIIKMNRIVKFLPSNGSAPRVDCAFLDQPRELGQPLQVKYYPPNGTFSLHYFPYYGKKAQPHYSNPLVAAKLLNIPRNAEVAIVCKVMAEHVTFNNPHDPYEGKVEFKLKIEK

SEQ ID NO:4：ATP4B-亚基的跨膜结构域

SLYYVAFYVVMTGLFALCLYVLM

SEQ ID NO:5：与来自da Silva等人的那种同源的人ATP4B-亚基的免疫显性表位

LLNIPRNAEVAIVCKVMAEHVTFNN

SEQ ID NO:6：按照da Silva等人的鼠类ATP4B-亚基的免疫显性表位

LLNVPKNMQVSIVCKILADHVTFNN

SEQ ID NO:7：以P51164所描绘的ATP4B-亚基的氨基酸序列MAALQEKKTCGQRMEEFQRYCWNPDTGQMLGRTLSRWVWISLYYVAFYVVMTGLFALCLYVLMQTVDPYTPDYQDQLRSPGVTLRPDVYGEKGLEIVYNVSDNRTWADLTQTLHAFLAGYSPAAQEDSINCTSEQYFFQESFRAPNHTKFSCKFTADMLQNCSGLADPNFGFEEGKPCFIIKMNRIVKFLPSNGSAPRVDCAFLDQPRELGQPLQVKYYPPNGTFSLHYFPYYGKKAQPHYSNPLVAAKLLNIPRNAEVAIVCKVMAEHVTFNNPHDPYEGKVEFKLKIEK

SEQ ID NO:8：按照Nishio等人的鼠类ATP4A-亚基的免疫显性表位

PLLCVGLRAQWEDHHLQDL

SEQ ID NO:9：胃H⁺/K⁺-ATP酶的α-亚基，如以UniProtKB-登录号P20648所描绘的

MGKAENYELYSVELGPGPGGDMAAKMSKKKKAGGGGGKRKEKLENMKKEMEINDHQLSVAELEQKYQTSATKGLSASLAAELLLRDGPNALRPPRGTPEYVKFARQLAGGLQCLMWVAAAICLIAFAIQASEGDLTTDDNLYLAIALIAVVVVTGCFGYYQEFKSTNIIASFKNLVPQQATVIRDGDKFQINADQLVVGDLVEMKGGDRVPADIRILAAQGCKVDNSSLTGESEPQTRSPECTHESPLETRNIAFFSTMCLEGTVQGLVVNTGDRTIIGRIASLASGVENEKTPIAIEIEHFVDIIAGLAILFGATFFIVAMCIGYTFLRAMVFFMAIVVAYVPEGLLATVTVCLSLTAKRLASKNCVVKNLEAVETLGSTSVICSDKTGTLTQNRMTVSHLWFDNHIHTADTTEDQSGQTFDQSSETWRALCRVLTLCNRAAFKSGQDAVPVPKRIVIGDASETALLKFSELTLGNAMGYRDRFPKVCEIPFNSTNKFQLSIHTLEDPRDPRHLLVMKGAPERVLERCSSILIKGQELPLDEQWREAFQTAYLSLGGLGERVLGFCQLYLNEKDYPPGYAFDVEAMNFPSSGLCFAGLVSMIDPPRATVPDAVLKCRTAGIRVIMVTGDHPITAKAIAASVGIISEGSETVEDIAARLRVPVDQVNRKDARACVINGMQLKDMDPSELVEALRTHPEMVFARTSPQQKLVIVESCQRLGAIVAVTGDGVNDSPALKKADIGVAMGIAGSDAAKNAADMILLDDNFASIVTGVEQGRLIFDNLKKSIAYTLTKNIPELTPYLIYITVSVPLPLGCITILFIELCTDIFPSVSLAYEKAESDIMHLRPRNPKRDRLVNEPLAAYSYFQIGAIQSFAGFTDYFTAMAQEGWFPLLCVGLRAQWEDHHLQDLQDSYGQEWTFGQRLYQQYTCYTVFFISIEVCQIADVLIRKTRRLSAFQQGFFRNKILVIAIVFQVCIGCFLCYCPGMPNIFNFMPIRFQWWLVPLPYGILIFVYDEIRKLGVRCCPGSWWDQELYY

SEQ ID NO:10：内因子，如以NCBI-Genbank条目NP_005133.2所描绘的

MAWFALYLLSLLWATAGTSTQTQSSCSVPSAQEPLVNGIQVLMENSVTSSAYPNPSILIAMNLAGAYNLKAQKLLTYQLMSSDNNDLTIGQLGLTIMALTSSCRDPGDKVSILQRQMENWAPSSPNAEASAFYGPSLAILALCQKNSEATLPIAVRFAKTLLANSSPFNVDTGAMATLALTCMYNKIPVGSEEGYRSLFGQVLKDIVEKISMKIKDNGIIGDIYSTGLAMQALSVTPEPSKKEWNCKKTTDMILNEIKQGKFHNPMSAIQILPSLKGKTYLDVPQVTCSPDHEVQPTLPSNPGPGPTSASNITVIYTINNQLRGVELLFNETINVSVKSGSVLLVVLEEAQRKNPMFKFETTMTSWGLVVSSINNIAENVNHKTYWQFLSGVTPLNEGVADYIPFNHEHITANFTQY

SEQ ID NO:11：连接到载体pTriEx中的编码ATP4A-亚基的cDNA

[仅包含在序列表中]

SEQ ID NO:12：连接到载体pTriEx中的编码ATP4B-亚基的cDNA

[仅包含在序列表中]

下面将借助实施例通过参照附图来阐明本发明。所描述的实施方案在每个方面仅是示例性的而不应被理解为限制性的，并且所列出的特征的各种各样的组合被包括在本发明的范围中。

图1显示了经考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶，在其上，在分子量标准参照物旁边右侧，以经DTT还原的状态分拆开1μg的经纯化的具有N-末端His-标签的胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的细胞外结构域，和在其右侧，以非还原状态分拆开1μg的经纯化的具有N-末端His-标签的胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的细胞外结构域。

图2显示了关于在实施例3(灵敏度)和表4中所显示的数据的样品分布。Y-轴显示以RLU表示的信号，X-轴的每个数字表示遭受AIG之苦的患者(1-29)或健康血液捐献者(从30开始)。

实施例：

为了研究灵敏度，使用对其作出了AIG诊断的患者的血清。在另一个方面，为了研究特异性，使用对其认为他们未遭受AIG之苦的在临床上正常的血液捐献者的血清。

实施例1：测定通过使用免疫荧光和ELISA借助于作为抗原的胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基来进行的检测的灵敏度

将编码ATP4A-亚基的以Genbank登录号BC167780进行描述的人cDNA连接到载体pTriEx中(产生SEQ ID NO:11)。同样地，将编码ATP4B-亚基的以Genbank登录号BC029059进行描述的人cDNA连接到载体pTriEx中(产生SEQ ID NO:12)。

制备用于间接免疫荧光的基板

借助于25kDa线性聚乙烯亚胺，将在玻璃承载体上在添加有10％(v/v)胎牛血清的D-MEM中进行培养的HEK293细胞用编码ATP4A或ATP4B的质粒DNA单独地以及相组合地进行转染，和此外为了制备阴性对照用pTriEx空载体进行转染，并且在48小时后进行固定。为了固定，首先用PBS洗涤具有粘着在其上的细胞的玻璃承载体，然后备选地在室温下用在PBS中的1.8％福尔马林溶液固定5分钟或在丙酮中固定10分钟。最后，在室温下在添加有1％(w/v)BSA的PBS(PBS(1％w/v BSA))中进行洗涤步骤和封闭步骤5分钟。

所有温育步骤均在室温下进行。

免疫荧光分析

以在PBS(1％w/v BSA)中的1:10稀释度，将待分析的血清样品或血浆样品在所述基板上温育30分钟。然后，将所述基板在PBS(0.2％v/v Tween 20)中洗涤5分钟。在30分钟的温育步骤中，用经荧光素标记的抗人IgG检测经结合的IgG类别的人免疫球蛋白。于在免疫荧光显微镜上进行评价之前，用PBS(0.2％v/v Tween 20)去除过量的缀合物5分钟。

通过以0(无荧光)、痕量(边界值信号)、1(弱阳性)、2、3和4(强阳性)的强度指明特异性荧光信号的强度来半定量地进行免疫荧光的评价。

在HEK293细胞中用载体pTriEx-1进行表达的ATP4B的细胞外结构域(SEQ ID NO:2)的纯化

借助于25kDa线性聚乙烯亚胺，将在添加有10％(v/v)胎牛血清的D-MEM中进行培养的HEK293细胞用编码spGh*-H6-ATP4B(ec)的质粒DNA进行转染。在转染后第5天，移除细胞培养物上清液，通过离心进行澄清，并且用于通过使用标准实验方案经由固定化金属螯合物-亲和色谱法(IMAC)来纯化重组蛋白质。经纯化的、用丽春红S进行染色的蛋白质显示在图1中。

借助于ELISA进行分析

所述试验如在

等人(2013)Development of a standardized ELISAfor the determination of autoantibodies against human M-type phospholipase A2receptor in primary membranous nephropathy,Clinica Chimica Acta 421,213-218中所描述的那样来进行，除了使用ATP4B的细胞外结构域(SEQ ID NO:2)作为抗原外。

简而言之，在4℃下用在PBS中的0.7μg/ml抗原包被微量滴定板(Nunc,Deutschland)过夜，并且用洗涤缓冲液(在PBS中的0.05％(w/v)Tween-20)洗涤三次。通过与在PBS中的0.1％酪蛋白(w/v)一起进行一个小时的温育来封闭非特异性的结合位点。

将人血清样品在样品缓冲液(在PBS中的0.05％(w/v)Tween-20，1％(w/v)酪蛋白)中进行1:100稀释并且温育30分钟，随后为三次用洗涤缓冲液进行的洗涤步骤。除了两个在临床上经表征的患者的阳性样品外，还研究了七个其他的患者样品。

通过与在样品缓冲液中进行1:1000稀释的抗人IgG-HRP缀合物(EUROIMMUN,Deutschland)一起进行半个小时的温育来检测经结合的抗体。然后，如上面所描述的那样进行洗涤，随后为添加3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(EUROIMMUN MedizinischeLabordiagnostika AG)和十五分钟的温育。所有温育步骤均在室温下进行。

在450nm下通过使用自动分光光度计(Spectra Mini,Tecan,Crailsheim,Deutschland)来测量光密度(OD)。通过ROC-曲线分析(灵敏度+特异性的最大总和)来查明截止值。

为了比较，还通过使用常规的抗-PCA ELISA(IgG)(EUROIMMUN MedizinischeLabordiagnostika AG,订货号EA1361G)来进行所述测试。

结果:

表1：借助于ELISA和IFT的灵敏度研究的结果

*相对于功能对照进行标准化，通过来自ROC分析的截止值(0.284)进行的定性评价实施例2：测定通过使用ELISA借助于作为抗原的胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基来进行的检测的特异性，相比于常规测试(现有技术)而言

所述试验如在实施例1中所描述的那样来进行，除了使用在临床上正常的血液捐献者的血清外。

结果：

表2：借助于ELISA的特异性研究的结果，其中使用血液捐献者的样品，比较常规的抗-PCA-ELISA和根据本发明的方法

结论：

结果显示，除了最先提及的患者的样品之外，如果仅使用胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的细胞外结构域作为抗原，那么也可以在遭受AIG之苦的患者的样品中检测针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的自身抗体。

因此，相对于常规ELISA而言，实际上不产生灵敏度损失。

与之相反，通过使用胃H⁺/K⁺-ATP酶的α-亚基，实际上所有样品看起来都是假阴性的。

实施例2的结果显示，可以取得相对于常规测试而言的6％的可观的特异性增益。

需要强调的是，常规ELISA已经显示出93％的可观的特异性。取得在该高水平上的特异性的进一步提高在诊断学中在技术上是苛求的，并且是对现有技术的巨大贡献。

当采用根据本发明的方法时，特异性和诊断可靠性总体得到了提高。

实施例3：测定借助于针对ATP4B的自身抗体的测定来进行的用于诊断AIG的基于化学发光的测定法的灵敏度和特异性

除非另有描述，用与在实施例1中所描述的相同的试剂进行该试验。

在当前ChLIA中，使用经抗原包被的磁性颗粒作为用于特异性地检测针对ATP4B的IgG免疫球蛋白类别的自身抗体的固相。根据制造商的说明书，通过使用经甲苯磺酰基活化的M-280Dynabeads(Invitrogen,目录号14203,14204)来制备所述磁性颗粒。

所述测试的实施在随机访问分析仪(Random Access Analyser)(RA Analyzer10,产品编号YG 0710-0101,EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG)中自动地进行。在第一个分析步骤中，将经包被的磁性颗粒与经稀释的患者样品一起在样品缓冲液(目录号LL9012,EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG)中进行温育。如果所述样品是抗-ATP4B-阳性的，那么在这些条件下特异性抗体与该抗原相结合。

在第二个分析步骤中，添加经吖啶酯标记的抗人IgG(目录号LK0711-G,EUROIMMUNMedizinische Labordiagnostika AG)缀合物，其与所述特异性抗体相结合。

然后，给反应批料掺入诱导化学发光反应的触发溶液(目录号LL0713-1(A)和LL0713-2(B),EUROIMMUN)。

将所产生的光信号以相对光单位(RLU)输出。光信号的强度与经结合的抗体的量成比例。

结果显示在表3中。用20份血液捐献者血清进行的查验显示出100％的特异性，而用常规测定法，它仅为95％。关于灵敏度的数据显示在表4和图2中。在29名遭受自身免疫性胃炎之苦的患者中，灵敏度为96.5％，并且因此高于Ma等人通过使用未纯化的β-亚基用ELISA而取得的值。

表3：根据本发明的测定法(抗-ATP4B-ELISA和抗-ATP4B-ChLIA)的特异性，相比于常规测定法(抗-PCA-ELISA)而言

表4：关于根据本发明的借助于化学发光的测定法(ChLIA)的灵敏度的研究的结果

序列表

<110> EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG

<120> 用于诊断自身免疫性胃炎的方法

<130> 18PP265EP

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> spGh*-H6-ATP4B(ec)

<400> 1

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gly Pro Met His His His His His His Met Ser Gln Thr

20 25 30

Val Asp Pro Tyr Thr Pro Asp Tyr Gln Asp Gln Leu Arg Ser Pro Gly

35 40 45

Val Thr Leu Arg Pro Asp Val Tyr Gly Glu Lys Gly Leu Glu Ile Val

50 55 60

Tyr Asn Val Ser Asp Asn Arg Thr Trp Ala Asp Leu Thr Gln Thr Leu

65 70 75 80

His Ala Phe Leu Ala Gly Tyr Ser Pro Ala Ala Gln Glu Asp Ser Ile

85 90 95

Asn Cys Thr Ser Glu Gln Tyr Phe Phe Gln Glu Ser Phe Arg Ala Pro

100 105 110

Asn His Thr Lys Phe Ser Cys Lys Phe Thr Ala Asp Met Leu Gln Asn

115 120 125

Cys Ser Gly Leu Ala Asp Pro Asn Phe Gly Phe Glu Glu Gly Lys Pro

130 135 140

Cys Phe Ile Ile Lys Met Asn Arg Ile Val Lys Phe Leu Pro Ser Asn

145 150 155 160

Gly Ser Ala Pro Arg Val Asp Cys Ala Phe Leu Asp Gln Pro Arg Glu

165 170 175

Leu Gly Gln Pro Leu Gln Val Lys Tyr Tyr Pro Pro Asn Gly Thr Phe

180 185 190

Ser Leu His Tyr Phe Pro Tyr Tyr Gly Lys Lys Ala Gln Pro His Tyr

195 200 205

Ser Asn Pro Leu Val Ala Ala Lys Leu Leu Asn Ile Pro Arg Asn Ala

210 215 220

Glu Val Ala Ile Val Cys Lys Val Met Ala Glu His Val Thr Phe Asn

225 230 235 240

Asn Pro His Asp Pro Tyr Glu Gly Lys Val Glu Phe Lys Leu Lys Ile

245 250 255

Glu Lys

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> spGh*-H6-ATP4B(ec)细胞外结构域，具有N-末端His-标签

<400> 2

Gly Pro Met His His His His His His Met Ser Gln Thr Val Asp Pro

1 5 10 15

Tyr Thr Pro Asp Tyr Gln Asp Gln Leu Arg Ser Pro Gly Val Thr Leu

20 25 30

Arg Pro Asp Val Tyr Gly Glu Lys Gly Leu Glu Ile Val Tyr Asn Val

35 40 45

Ser Asp Asn Arg Thr Trp Ala Asp Leu Thr Gln Thr Leu His Ala Phe

50 55 60

Leu Ala Gly Tyr Ser Pro Ala Ala Gln Glu Asp Ser Ile Asn Cys Thr

65 70 75 80

Ser Glu Gln Tyr Phe Phe Gln Glu Ser Phe Arg Ala Pro Asn His Thr

85 90 95

Lys Phe Ser Cys Lys Phe Thr Ala Asp Met Leu Gln Asn Cys Ser Gly

100 105 110

Leu Ala Asp Pro Asn Phe Gly Phe Glu Glu Gly Lys Pro Cys Phe Ile

115 120 125

Ile Lys Met Asn Arg Ile Val Lys Phe Leu Pro Ser Asn Gly Ser Ala

130 135 140

Pro Arg Val Asp Cys Ala Phe Leu Asp Gln Pro Arg Glu Leu Gly Gln

145 150 155 160

Pro Leu Gln Val Lys Tyr Tyr Pro Pro Asn Gly Thr Phe Ser Leu His

165 170 175

Tyr Phe Pro Tyr Tyr Gly Lys Lys Ala Gln Pro His Tyr Ser Asn Pro

180 185 190

Leu Val Ala Ala Lys Leu Leu Asn Ile Pro Arg Asn Ala Glu Val Ala

195 200 205

Ile Val Cys Lys Val Met Ala Glu His Val Thr Phe Asn Asn Pro His

210 215 220

Asp Pro Tyr Glu Gly Lys Val Glu Phe Lys Leu Lys Ile Glu Lys

225 230 235

<210> 3

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> ATP4B-亚基的细胞外结构域

<400> 3

Gln Thr Val Asp Pro Tyr Thr Pro Asp Tyr Gln Asp Gln Leu Arg Ser

1 5 10 15

Pro Gly Val Thr Leu Arg Pro Asp Val Tyr Gly Glu Lys Gly Leu Glu

20 25 30

Ile Val Tyr Asn Val Ser Asp Asn Arg Thr Trp Ala Asp Leu Thr Gln

35 40 45

Thr Leu His Ala Phe Leu Ala Gly Tyr Ser Pro Ala Ala Gln Glu Asp

50 55 60

Ser Ile Asn Cys Thr Ser Glu Gln Tyr Phe Phe Gln Glu Ser Phe Arg

65 70 75 80

Ala Pro Asn His Thr Lys Phe Ser Cys Lys Phe Thr Ala Asp Met Leu

85 90 95

Gln Asn Cys Ser Gly Leu Ala Asp Pro Asn Phe Gly Phe Glu Glu Gly

100 105 110

Lys Pro Cys Phe Ile Ile Lys Met Asn Arg Ile Val Lys Phe Leu Pro

115 120 125

Ser Asn Gly Ser Ala Pro Arg Val Asp Cys Ala Phe Leu Asp Gln Pro

130 135 140

Arg Glu Leu Gly Gln Pro Leu Gln Val Lys Tyr Tyr Pro Pro Asn Gly

145 150 155 160

Thr Phe Ser Leu His Tyr Phe Pro Tyr Tyr Gly Lys Lys Ala Gln Pro

165 170 175

His Tyr Ser Asn Pro Leu Val Ala Ala Lys Leu Leu Asn Ile Pro Arg

180 185 190

Asn Ala Glu Val Ala Ile Val Cys Lys Val Met Ala Glu His Val Thr

195 200 205

Phe Asn Asn Pro His Asp Pro Tyr Glu Gly Lys Val Glu Phe Lys Leu

210 215 220

Lys Ile Glu Lys

225

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> ATP4B-亚基的跨膜结构域

<400> 4

Ser Leu Tyr Tyr Val Ala Phe Tyr Val Val Met Thr Gly Leu Phe Ala

1 5 10 15

Leu Cys Leu Tyr Val Leu Met

20

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人ATP4B-亚基的免疫显性表位

<400> 5

Leu Leu Asn Ile Pro Arg Asn Ala Glu Val Ala Ile Val Cys Lys Val

1 5 10 15

Met Ala Glu His Val Thr Phe Asn Asn

20 25

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 鼠类ATP4B-亚基的免疫显性表位

<400> 6

Leu Leu Asn Val Pro Lys Asn Met Gln Val Ser Ile Val Cys Lys Ile

1 5 10 15

Leu Ala Asp His Val Thr Phe Asn Asn

20 25

<210> 7

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> ATP4B-亚基的氨基酸序列 (P51164)

<400> 7

Met Ala Ala Leu Gln Glu Lys Lys Thr Cys Gly Gln Arg Met Glu Glu

1 5 10 15

Phe Gln Arg Tyr Cys Trp Asn Pro Asp Thr Gly Gln Met Leu Gly Arg

20 25 30

Thr Leu Ser Arg Trp Val Trp Ile Ser Leu Tyr Tyr Val Ala Phe Tyr

35 40 45

Val Val Met Thr Gly Leu Phe Ala Leu Cys Leu Tyr Val Leu Met Gln

50 55 60

Thr Val Asp Pro Tyr Thr Pro Asp Tyr Gln Asp Gln Leu Arg Ser Pro

65 70 75 80

Gly Val Thr Leu Arg Pro Asp Val Tyr Gly Glu Lys Gly Leu Glu Ile

85 90 95

Val Tyr Asn Val Ser Asp Asn Arg Thr Trp Ala Asp Leu Thr Gln Thr

100 105 110

Leu His Ala Phe Leu Ala Gly Tyr Ser Pro Ala Ala Gln Glu Asp Ser

115 120 125

Ile Asn Cys Thr Ser Glu Gln Tyr Phe Phe Gln Glu Ser Phe Arg Ala

130 135 140

Pro Asn His Thr Lys Phe Ser Cys Lys Phe Thr Ala Asp Met Leu Gln

145 150 155 160

Asn Cys Ser Gly Leu Ala Asp Pro Asn Phe Gly Phe Glu Glu Gly Lys

165 170 175

Pro Cys Phe Ile Ile Lys Met Asn Arg Ile Val Lys Phe Leu Pro Ser

180 185 190

Asn Gly Ser Ala Pro Arg Val Asp Cys Ala Phe Leu Asp Gln Pro Arg

195 200 205

Glu Leu Gly Gln Pro Leu Gln Val Lys Tyr Tyr Pro Pro Asn Gly Thr

210 215 220

Phe Ser Leu His Tyr Phe Pro Tyr Tyr Gly Lys Lys Ala Gln Pro His

225 230 235 240

Tyr Ser Asn Pro Leu Val Ala Ala Lys Leu Leu Asn Ile Pro Arg Asn

245 250 255

Ala Glu Val Ala Ile Val Cys Lys Val Met Ala Glu His Val Thr Phe

260 265 270

Asn Asn Pro His Asp Pro Tyr Glu Gly Lys Val Glu Phe Lys Leu Lys

275 280 285

Ile Glu Lys

290

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 鼠类ATP4A-亚基的免疫显性表位

<400> 8

Pro Leu Leu Cys Val Gly Leu Arg Ala Gln Trp Glu Asp His His Leu

1 5 10 15

Gln Asp Leu

<210> 9

<211> 1035

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 胃H+/K+-ATP酶的α-亚基 (P20648)

<400> 9

Met Gly Lys Ala Glu Asn Tyr Glu Leu Tyr Ser Val Glu Leu Gly Pro

1 5 10 15

Gly Pro Gly Gly Asp Met Ala Ala Lys Met Ser Lys Lys Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg Lys Glu Lys Leu Glu Asn Met Lys Lys

35 40 45

Glu Met Glu Ile Asn Asp His Gln Leu Ser Val Ala Glu Leu Glu Gln

50 55 60

Lys Tyr Gln Thr Ser Ala Thr Lys Gly Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ala

65 70 75 80

Glu Leu Leu Leu Arg Asp Gly Pro Asn Ala Leu Arg Pro Pro Arg Gly

85 90 95

Thr Pro Glu Tyr Val Lys Phe Ala Arg Gln Leu Ala Gly Gly Leu Gln

100 105 110

Cys Leu Met Trp Val Ala Ala Ala Ile Cys Leu Ile Ala Phe Ala Ile

115 120 125

Gln Ala Ser Glu Gly Asp Leu Thr Thr Asp Asp Asn Leu Tyr Leu Ala

130 135 140

Ile Ala Leu Ile Ala Val Val Val Val Thr Gly Cys Phe Gly Tyr Tyr

145 150 155 160

Gln Glu Phe Lys Ser Thr Asn Ile Ile Ala Ser Phe Lys Asn Leu Val

165 170 175

Pro Gln Gln Ala Thr Val Ile Arg Asp Gly Asp Lys Phe Gln Ile Asn

180 185 190

Ala Asp Gln Leu Val Val Gly Asp Leu Val Glu Met Lys Gly Gly Asp

195 200 205

Arg Val Pro Ala Asp Ile Arg Ile Leu Ala Ala Gln Gly Cys Lys Val

210 215 220

Asp Asn Ser Ser Leu Thr Gly Glu Ser Glu Pro Gln Thr Arg Ser Pro

225 230 235 240

Glu Cys Thr His Glu Ser Pro Leu Glu Thr Arg Asn Ile Ala Phe Phe

245 250 255

Ser Thr Met Cys Leu Glu Gly Thr Val Gln Gly Leu Val Val Asn Thr

260 265 270

Gly Asp Arg Thr Ile Ile Gly Arg Ile Ala Ser Leu Ala Ser Gly Val

275 280 285

Glu Asn Glu Lys Thr Pro Ile Ala Ile Glu Ile Glu His Phe Val Asp

290 295 300

Ile Ile Ala Gly Leu Ala Ile Leu Phe Gly Ala Thr Phe Phe Ile Val

305 310 315 320

Ala Met Cys Ile Gly Tyr Thr Phe Leu Arg Ala Met Val Phe Phe Met

325 330 335

Ala Ile Val Val Ala Tyr Val Pro Glu Gly Leu Leu Ala Thr Val Thr

340 345 350

Val Cys Leu Ser Leu Thr Ala Lys Arg Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val

355 360 365

Val Lys Asn Leu Glu Ala Val Glu Thr Leu Gly Ser Thr Ser Val Ile

370 375 380

Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Gln Asn Arg Met Thr Val Ser

385 390 395 400

His Leu Trp Phe Asp Asn His Ile His Thr Ala Asp Thr Thr Glu Asp

405 410 415

Gln Ser Gly Gln Thr Phe Asp Gln Ser Ser Glu Thr Trp Arg Ala Leu

420 425 430

Cys Arg Val Leu Thr Leu Cys Asn Arg Ala Ala Phe Lys Ser Gly Gln

435 440 445

Asp Ala Val Pro Val Pro Lys Arg Ile Val Ile Gly Asp Ala Ser Glu

450 455 460

Thr Ala Leu Leu Lys Phe Ser Glu Leu Thr Leu Gly Asn Ala Met Gly

465 470 475 480

Tyr Arg Asp Arg Phe Pro Lys Val Cys Glu Ile Pro Phe Asn Ser Thr

485 490 495

Asn Lys Phe Gln Leu Ser Ile His Thr Leu Glu Asp Pro Arg Asp Pro

500 505 510

Arg His Leu Leu Val Met Lys Gly Ala Pro Glu Arg Val Leu Glu Arg

515 520 525

Cys Ser Ser Ile Leu Ile Lys Gly Gln Glu Leu Pro Leu Asp Glu Gln

530 535 540

Trp Arg Glu Ala Phe Gln Thr Ala Tyr Leu Ser Leu Gly Gly Leu Gly

545 550 555 560

Glu Arg Val Leu Gly Phe Cys Gln Leu Tyr Leu Asn Glu Lys Asp Tyr

565 570 575

Pro Pro Gly Tyr Ala Phe Asp Val Glu Ala Met Asn Phe Pro Ser Ser

580 585 590

Gly Leu Cys Phe Ala Gly Leu Val Ser Met Ile Asp Pro Pro Arg Ala

595 600 605

Thr Val Pro Asp Ala Val Leu Lys Cys Arg Thr Ala Gly Ile Arg Val

610 615 620

Ile Met Val Thr Gly Asp His Pro Ile Thr Ala Lys Ala Ile Ala Ala

625 630 635 640

Ser Val Gly Ile Ile Ser Glu Gly Ser Glu Thr Val Glu Asp Ile Ala

645 650 655

Ala Arg Leu Arg Val Pro Val Asp Gln Val Asn Arg Lys Asp Ala Arg

660 665 670

Ala Cys Val Ile Asn Gly Met Gln Leu Lys Asp Met Asp Pro Ser Glu

675 680 685

Leu Val Glu Ala Leu Arg Thr His Pro Glu Met Val Phe Ala Arg Thr

690 695 700

Ser Pro Gln Gln Lys Leu Val Ile Val Glu Ser Cys Gln Arg Leu Gly

705 710 715 720

Ala Ile Val Ala Val Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ser Pro Ala Leu

725 730 735

Lys Lys Ala Asp Ile Gly Val Ala Met Gly Ile Ala Gly Ser Asp Ala

740 745 750

Ala Lys Asn Ala Ala Asp Met Ile Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ala Ser

755 760 765

Ile Val Thr Gly Val Glu Gln Gly Arg Leu Ile Phe Asp Asn Leu Lys

770 775 780

Lys Ser Ile Ala Tyr Thr Leu Thr Lys Asn Ile Pro Glu Leu Thr Pro

785 790 795 800

Tyr Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ser Val Pro Leu Pro Leu Gly Cys Ile

805 810 815

Thr Ile Leu Phe Ile Glu Leu Cys Thr Asp Ile Phe Pro Ser Val Ser

820 825 830

Leu Ala Tyr Glu Lys Ala Glu Ser Asp Ile Met His Leu Arg Pro Arg

835 840 845

Asn Pro Lys Arg Asp Arg Leu Val Asn Glu Pro Leu Ala Ala Tyr Ser

850 855 860

Tyr Phe Gln Ile Gly Ala Ile Gln Ser Phe Ala Gly Phe Thr Asp Tyr

865 870 875 880

Phe Thr Ala Met Ala Gln Glu Gly Trp Phe Pro Leu Leu Cys Val Gly

885 890 895

Leu Arg Ala Gln Trp Glu Asp His His Leu Gln Asp Leu Gln Asp Ser

900 905 910

Tyr Gly Gln Glu Trp Thr Phe Gly Gln Arg Leu Tyr Gln Gln Tyr Thr

915 920 925

Cys Tyr Thr Val Phe Phe Ile Ser Ile Glu Val Cys Gln Ile Ala Asp

930 935 940

Val Leu Ile Arg Lys Thr Arg Arg Leu Ser Ala Phe Gln Gln Gly Phe

945 950 955 960

Phe Arg Asn Lys Ile Leu Val Ile Ala Ile Val Phe Gln Val Cys Ile

965 970 975

Gly Cys Phe Leu Cys Tyr Cys Pro Gly Met Pro Asn Ile Phe Asn Phe

980 985 990

Met Pro Ile Arg Phe Gln Trp Trp Leu Val Pro Leu Pro Tyr Gly Ile

995 1000 1005

Leu Ile Phe Val Tyr Asp Glu Ile Arg Lys Leu Gly Val Arg Cys

1010 1015 1020

Cys Pro Gly Ser Trp Trp Asp Gln Glu Leu Tyr Tyr

1025 1030 1035

<210> 10

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 内因子 (NP_005133.2)

<400> 10

Met Ala Trp Phe Ala Leu Tyr Leu Leu Ser Leu Leu Trp Ala Thr Ala

1 5 10 15

Gly Thr Ser Thr Gln Thr Gln Ser Ser Cys Ser Val Pro Ser Ala Gln

20 25 30

Glu Pro Leu Val Asn Gly Ile Gln Val Leu Met Glu Asn Ser Val Thr

35 40 45

Ser Ser Ala Tyr Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ile Ala Met Asn Leu Ala

50 55 60

Gly Ala Tyr Asn Leu Lys Ala Gln Lys Leu Leu Thr Tyr Gln Leu Met

65 70 75 80

Ser Ser Asp Asn Asn Asp Leu Thr Ile Gly Gln Leu Gly Leu Thr Ile

85 90 95

Met Ala Leu Thr Ser Ser Cys Arg Asp Pro Gly Asp Lys Val Ser Ile

100 105 110

Leu Gln Arg Gln Met Glu Asn Trp Ala Pro Ser Ser Pro Asn Ala Glu

115 120 125

Ala Ser Ala Phe Tyr Gly Pro Ser Leu Ala Ile Leu Ala Leu Cys Gln

130 135 140

Lys Asn Ser Glu Ala Thr Leu Pro Ile Ala Val Arg Phe Ala Lys Thr

145 150 155 160

Leu Leu Ala Asn Ser Ser Pro Phe Asn Val Asp Thr Gly Ala Met Ala

165 170 175

Thr Leu Ala Leu Thr Cys Met Tyr Asn Lys Ile Pro Val Gly Ser Glu

180 185 190

Glu Gly Tyr Arg Ser Leu Phe Gly Gln Val Leu Lys Asp Ile Val Glu

195 200 205

Lys Ile Ser Met Lys Ile Lys Asp Asn Gly Ile Ile Gly Asp Ile Tyr

210 215 220

Ser Thr Gly Leu Ala Met Gln Ala Leu Ser Val Thr Pro Glu Pro Ser

225 230 235 240

Lys Lys Glu Trp Asn Cys Lys Lys Thr Thr Asp Met Ile Leu Asn Glu

245 250 255

Ile Lys Gln Gly Lys Phe His Asn Pro Met Ser Ala Ile Gln Ile Leu

260 265 270

Pro Ser Leu Lys Gly Lys Thr Tyr Leu Asp Val Pro Gln Val Thr Cys

275 280 285

Ser Pro Asp His Glu Val Gln Pro Thr Leu Pro Ser Asn Pro Gly Pro

290 295 300

Gly Pro Thr Ser Ala Ser Asn Ile Thr Val Ile Tyr Thr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Gln Leu Arg Gly Val Glu Leu Leu Phe Asn Glu Thr Ile Asn Val Ser

325 330 335

Val Lys Ser Gly Ser Val Leu Leu Val Val Leu Glu Glu Ala Gln Arg

340 345 350

Lys Asn Pro Met Phe Lys Phe Glu Thr Thr Met Thr Ser Trp Gly Leu

355 360 365

Val Val Ser Ser Ile Asn Asn Ile Ala Glu Asn Val Asn His Lys Thr

370 375 380

Tyr Trp Gln Phe Leu Ser Gly Val Thr Pro Leu Asn Glu Gly Val Ala

385 390 395 400

Asp Tyr Ile Pro Phe Asn His Glu His Ile Thr Ala Asn Phe Thr Gln

405 410 415

Tyr

<210> 11

<211> 8752

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 连接到载体pTriEx中的编码ATP4A-亚基的cDNA

<400> 11

ggggaattgt gagcggataa caattccccg gagttaatcc gggaccttta attcaaccca 60

acacaatata ttatagttaa ataagaatta ttatcaaatc atttgtatat taattaaaat 120

actatactgt aaattacatt ttatttacaa tcaaaggaga tataggccgt caaggcccac 180

catggggaag gccgagaact atgagctcta ctcggtggag ctgggtcctg gccctggcgg 240

ggacatggct gccaagatga gcaagaagaa gaaggcgggt ggcgggggtg gcaagaggaa 300

ggagaagctg gagaacatga agaaggagat ggagattaac gaccaccagc tgtcagtggc 360

ggagctggaa cagaaatacc agaccagtgc caccaagggc ctctctgcga gcctggctgc 420

tgagctgctg ctgcgggatg ggcccaacgc actgcggcca ccacggggca ccccagagta 480

cgtcaagttc gcgaggcagc tggccggggg cctgcagtgc ctcatgtggg ttgccgccgc 540

catctgcctc atcgcctttg ccatccaggc tagtgagggg gacctcacca ccgacgacaa 600

tctgtacctg gcaatcgctc tcattgctgt ggttgtcgtc accggctgct ttggctacta 660

ccaggaattc aagagcacca acatcatcgc cagctttaag aaccttgtgc cacagcaagc 720

cactgtcatc cgcgatggag acaaattcca gatcaacgct gaccaactgg tggtgggcga 780

cctggtggag atgaaaggtg gggacagagt gcccgccgac atccgcatcc tggcggccca 840

gggctgcaag gtggacaact cctcgctgac aggggagtct gagccacaga cccgctcacc 900

cgagtgcacg cacgagagcc ctctggagac ccgcaacatc gccttcttct ccaccatgtg 960

ccttgagggc accgtgcagg gcctggtggt gaacacgggc gaccgcacca tcattgggcg 1020

catcgcatcg ctggcgtcgg gggtggaaaa cgagaagaca cccatcgcta tcgagatcga 1080

gcattttgtg gacatcatcg cgggcctggc cattctcttc ggtgccacat tttttattgt 1140

ggccatgtgc attggctaca ccttcctgcg ggccatggtc ttcttcatgg ccatcgtggt 1200

ggcctatgtg cctgaggggc tgctggccac tgtcacagtc tgcctgtccc tgacagccaa 1260

gcgcctggcc agtaagaact gcgtggtcaa gaacctggag gcggtggaga cattgggctc 1320

cacttcggtg atctgctcgg acaagacagg gactctcact cagaaccgca tgactgtgtc 1380

ccatctgtgg tttgacaacc acatccacac agctgacacc acggaagacc agtcagggca 1440

gacgtttgac cagtcctcgg agacgtggcg ggcgctgtgc cgggtgctca ccctgtgcaa 1500

ccgcgccgcc ttcaagtccg gccaggatgc agtgcctgtg cccaagcgca tcgtgattgg 1560

agacgcatcg gagacggcgc tgctcaagtt ctcggagctg acgctgggca acgccatggg 1620

ctaccgggac cgcttcccaa aagtctgcga gatacccttc aactccacca acaagttcca 1680

gctgtccatc catacgctgg aggacccgcg ggacccgcga cacttgctgg tgatgaaggg 1740

cgcccccgag cgcgtgctgg agcgctgcag ctccatcctt atcaagggcc aggagctgcc 1800

gctggacgag cagtggcgcg aggccttcca gaccgcctac ctcagcctgg gaggcctggg 1860

cgaacgcgtg ctcggcttct gccagctcta cctgaatgag aaggactacc cgcctggcta 1920

tgccttcgac gtagaggcca tgaactttcc atctagcggc ctctgctttg cgggacttgt 1980

atccatgatt gacccacccc gggccaccgt ccctgatgct gtgctcaagt gtcgcaccgc 2040

aggcatccgg gtgatcatgg taacgggtga ccaccccatc accgccaagg ccattgcagc 2100

cagtgtgggc atcatctcgg aaggcagcga gacagtggag gacatcgctg cccgcctccg 2160

tgtgcccgta gaccaggtta atcgcaagga tgcccgtgcc tgtgtgatca atggcatgca 2220

gctgaaggac atggacccat cggaactggt cgaggccctg cgcacccacc ccgagatggt 2280

gtttgcgcgc accagccccc agcagaagct ggtgatcgtg gagagctgcc agcggctggg 2340

tgcgattgtg gccgtcacgg gggatggtgt gaatgactcc ccagctctga agaaggcaga 2400

catcggagta gccatgggca tcgctggctc agatgctgcc aaaaatgcag ctgacatgat 2460

cctgctggat gacaactttg cctccattgt gacaggcgtg gagcagggtc gactgatctt 2520

cgacaacctg aagaagtcta ttgcctacac attgaccaag aacatcccag agctgacacc 2580

ctacctcatc tacatcaccg tcagcgtgcc cctgcccctc gggtgcatca ccatcctctt 2640

catcgaactc tgcactgaca ttttcccatc tgtgtccctg gcatatgaaa aggccgagag 2700

tgacatcatg cacctgcgtc cacgcaaccc aaagcgtgac agattggtca acgagcccct 2760

ggctgcctac tcctacttcc agattggtgc cattcagtcc tttgctggct tcactgacta 2820

cttcacggca atggcccagg agggctggtt cccactgctg tgcgtggggc tgcgggcgca 2880

gtgggaggac caccacctac aagatctgca ggacagctac ggccaggagt ggacattcgg 2940

gcagcgcctg taccagcagt acacctgcta caccgtgttc ttcatcagca ttgaggtgtg 3000

ccagatcgcc gatgtcctca tccgcaagac gcgccgtctc tctgccttcc agcaaggctt 3060

cttcaggaat aagatcctgg tgatcgccat cgtgttccag gtctgcatcg gctgcttcct 3120

gtgctactgc cccggcatgc ccaacatctt caacttcatg cccattcggt tccagtggtg 3180

gctggtcccc ctgccctacg gcatcctcat cttcgtctat gatgagatcc ggaagcttgg 3240

agttcgctgt tgcccaggga gctggtggga ccaggaactc tactattagg gcctcatggg 3300

ccggcgcgcc caccaccacc accaccactg acactaagtg attaacctca ggtgcaggct 3360

gcctatcaga aggtggtggc tggtgtggcc aatgccctgg ctcacaaata ccactgagat 3420

cgatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 3480

ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 3540

ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt 3600

ttagagtttg gcaacatatg cccatatgta actagcataa ccccttgggg cctctaaacg 3660

ggtcttgagg ggttttttgc tgaaagcatg cggaggaaat tctccttgaa gtttccctgg 3720

tgttcaaagt aaaggagttt gcaccagacg cacctctgtt cactggtccg gcgtattaaa 3780

acacgataca ttgttattag tacatttatt aagcgctaga ttctgtgcgt tgttgattta 3840

cagacaattg ttgtacgtat tttaataatt cattaaattt ataatcttta gggtggtatg 3900

ttagagcgaa aatcaaatga ttttcagcgt ctttatatct gaatttaaat attaaatcct 3960

caatagattt gtaaaatagg tttcgattag tttcaaacaa gggttgtttt tccgaaccga 4020

tggctggact atctaatgga ttttcgctca acgccacaaa acttgccaaa tcttgtagca 4080

gcaatctagc tttgtcgata ttcgtttgtg ttttgttttg taataaaggt tcgacgtcgt 4140

tcaaaatatt atgcgctttt gtatttcttt catcactgtc gttagtgtac aattgactcg 4200

acgtaaacac gttaaataga gcttggacat atttaacatc gggcgtgtta gctttattag 4260

gccgattatc gtcgtcgtcc caaccctcgt cgttagaagt tgcttccgaa gacgattttg 4320

ccatagccac acgacgccta ttaattgtgt cggctaacac gtccgcgatc aaatttgtag 4380

ttgagctttt tggaattatt tctgattgcg ggcgtttttg ggcgggtttc aatctaactg 4440

tgcccgattt taattcagac aacacgttag aaagcgatgg tgcaggcggt ggtaacattt 4500

cagacggcaa atctactaat ggcggcggtg gtggagctga tgataaatct accatcggtg 4560

gaggcgcagg cggggctggc ggcggaggcg gaggcggagg tggtggcggt gatgcagacg 4620

gcggtttagg ctcaaatgtc tctttaggca acacagtcgg cacctcaact attgtactgg 4680

tttcgggcgc cgtttttggt ttgaccggtc tgagacgagt gcgatttttt tcgtttctaa 4740

tagcttccaa caattgttgt ctgtcgtcta aaggtgcagc gggttgaggt tccgtcggca 4800

ttggtggagc gggcggcaat tcagacatcg atggtggtgg tggtggtgga ggcgctggaa 4860

tgttaggcac gggagaaggt ggtggcggcg gtgccgccgg tataatttgt tctggtttag 4920

tttgttcgcg cacgattgtg ggcaccggcg caggcgccgc tggctgcaca acggaaggtc 4980

gtctgcttcg aggcagcgct tggggtggtg gcaattcaat attataattg gaatacaaat 5040

cgtaaaaatc tgctataagc attgtaattt cgctatcgtt taccgtgccg atatttaaca 5100

accgctcaat gtaagcaatt gtattgtaaa gagattgtct caagctcgga acgctgcgct 5160

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 5220

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 5280

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 5340

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 5400

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 5460

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt 5520

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 5580

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 5640

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 5700

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg 5760

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 5820

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 5880

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttgt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 5940

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 6000

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 6060

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 6120

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 6180

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 6240

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 6300

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 6360

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 6420

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 6480

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 6540

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 6600

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 6660

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 6720

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 6780

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgtccgcgcg tttcctgcat 6840

cttttaatca aatcccaaga tgtgtataaa ccaccaaact gccaaaaaat gaaaactgtc 6900

gacaagctct gtccgtttgc tggcaactgc aagggtctca atcctatttg taattattga 6960

ataataaaac aattataaat gtcaaatttg ttttttatta acgatacaaa ccaaacgcaa 7020

caagaacatt tgtagtatta tctataattg aaaacgcgta gttataatcg ctgaggtaat 7080

atttaaaatc attttcaaat gattcacagt taatttgcga caatataatt ttattttcac 7140

ataaactaga cgccttgtcg tcttcttctt cgtattcctt ctctttttca tttttctctt 7200

cataaaaatt aacatagtta ttatcgtatc catatatgta tctatcgtat agagtaaatt 7260

ttttgttgtc ataaatatat atgtcttttt taatggggtg tatagtaccg ctgcgcatag 7320

tttttctgta atttacaaca gtgctatttt ctggtagttc ttcggagtgt gttgctttaa 7380

ttattaaatt tatataatca atgaatttgg gatcgtcggt tttgtacaat atgttgccgg 7440

catagtacgc agcttcttct agttcaatta caccattttt tagcagcacc ggattaacat 7500

aactttccaa aatgttgtac gaaccgttaa acaaaaacag ttcacctccc ttttctatac 7560

tattgtctgc gagcagttgt ttgttgttaa aaataacagc cattgtaatg agacgcacaa 7620

actaatatca caaactggaa atgtctatca atatatagtt gctctagtta ttaatagtaa 7680

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 7740

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 7800

tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggactattta 7860

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 7920

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 7980

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatgca tggtcgaggt 8040

gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta 8100

tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggggcgcgc 8160

gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc 8220

agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg 8280

gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct gcgacgctgc cttcgccccg 8340

tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc 8400

cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc cttcgggctg taattagcgc ttggtttaat 8460

gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt 8520

tgtgcggggg gagcggctcg gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg 8580

ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat 8640

gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 8700

catcattttg gcaaagaatt ggatcggacc gaaattaata cgactcacta ta 8752

<210> 12

<211> 6490

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 连接到载体pTriEx中的编码ATP4B-亚基的cDNA

<400> 12

ggggaattgt gagcggataa caattccccg gagttaatcc gggaccttta attcaaccca 60

acacaatata ttatagttaa ataagaatta ttatcaaatc atttgtatat taattaaaat 120

actatactgt aaattacatt ttatttacaa tcaaaggaga tataccatgg cggctctgca 180

ggagaagaag acgtgtggcc agcgcatgga ggagttccag cgttactgct ggaacccgga 240

cacggggcag atgctgggcc gcaccctgtc ccggtgggtg tggatcagcc tgtactacgt 300

ggccttctac gtggtgatga ctgggctctt cgccctgtgc ctctatgtgc tgatgcagac 360

agtggacccg tacacaccgg actaccaaga ccagctacgg tcaccagggg taaccttaag 420

gccggatgtt tacggggaga aaggcctgga aattgtctac aacgtctctg ataacagaac 480

ctgggcagac ctcacacaga ctctccacgc cttcctagca ggctactctc cagcagccca 540

ggaggacagc atcaactgca cctccgagca gtacttcttc caggagagtt tccgcgctcc 600

caaccacacc aagttctcct gcaagttcac ggcagatatg ctgcagaact gctcaggcct 660

ggcggatccc aacttcggct ttgaagaagg aaagccatgt tttattatta aaatgaacag 720

gatcgtcaag ttcctcccca gcaacggctc ggcccccaga gtggactgcg ccttcctgga 780

ccagccccgc gagctcggcc agccgctgca ggtcaagtac taccctccca acggcacctt 840

cagtctgcac tacttccctt attacgggaa gaaagcccag ccccactaca gcaaccccct 900

ggtggcagcg aagctcctca acatccccag gaacgctgag gtcgccatcg tgtgcaaggt 960

catggcagag cacgtgacct tcaacaatcc ccacgacccg tatgaaggga aagtggagtt 1020

caaactcaag attgagaagt gactcgagca ccaccatcac catcaccatc actaagtgat 1080

taacctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa tgccctggct 1140

cacaaatacc actgagatcg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa 1200

gccccttgag catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg 1260

ttggaatttt ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca 1320

tcagaatgag tatttggttt agagtttggc aacatatgcc catatgtaac tagcataacc 1380

ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaagcatgcg gaggaaattc 1440

tccttgaagt ttccctggtg ttcaaagtaa aggagtttgc accagacgca cctctgttca 1500

ctggtccggc gtattaaaac acgatacatt gttattagta catttattaa gcgctagatt 1560

ctgtgcgttg ttgatttaca gacaattgtt gtacgtattt taataattca ttaaatttat 1620

aatctttagg gtggtatgtt agagcgaaaa tcaaatgatt ttcagcgtct ttatatctga 1680

atttaaatat taaatcctca atagatttgt aaaataggtt tcgattagtt tcaaacaagg 1740

gttgtttttc cgaaccgatg gctggactat ctaatggatt ttcgctcaac gccacaaaac 1800

ttgccaaatc ttgtagcagc aatctagctt tgtcgatatt cgtttgtgtt ttgttttgta 1860

ataaaggttc gacgtcgttc aaaatattat gcgcttttgt atttctttca tcactgtcgt 1920

tagtgtacaa ttgactcgac gtaaacacgt taaatagagc ttggacatat ttaacatcgg 1980

gcgtgttagc tttattaggc cgattatcgt cgtcgtccca accctcgtcg ttagaagttg 2040

cttccgaaga cgattttgcc atagccacac gacgcctatt aattgtgtcg gctaacacgt 2100

ccgcgatcaa atttgtagtt gagctttttg gaattatttc tgattgcggg cgtttttggg 2160

cgggtttcaa tctaactgtg cccgatttta attcagacaa cacgttagaa agcgatggtg 2220

caggcggtgg taacatttca gacggcaaat ctactaatgg cggcggtggt ggagctgatg 2280

ataaatctac catcggtgga ggcgcaggcg gggctggcgg cggaggcgga ggcggaggtg 2340

gtggcggtga tgcagacggc ggtttaggct caaatgtctc tttaggcaac acagtcggca 2400

cctcaactat tgtactggtt tcgggcgccg tttttggttt gaccggtctg agacgagtgc 2460

gatttttttc gtttctaata gcttccaaca attgttgtct gtcgtctaaa ggtgcagcgg 2520

gttgaggttc cgtcggcatt ggtggagcgg gcggcaattc agacatcgat ggtggtggtg 2580

gtggtggagg cgctggaatg ttaggcacgg gagaaggtgg tggcggcggt gccgccggta 2640

taatttgttc tggtttagtt tgttcgcgca cgattgtggg caccggcgca ggcgccgctg 2700

gctgcacaac ggaaggtcgt ctgcttcgag gcagcgcttg gggtggtggc aattcaatat 2760

tataattgga atacaaatcg taaaaatctg ctataagcat tgtaatttcg ctatcgttta 2820

ccgtgccgat atttaacaac cgctcaatgt aagcaattgt attgtaaaga gattgtctca 2880

agctcggaac gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 2940

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 3000

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 3060

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 3120

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 3180

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 3240

aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3300

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3360

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3420

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3480

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3540

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3600

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgtta ccaatgctta 3660

atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 3720

cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 3780

ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 3840

agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 3900

tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 3960

gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 4020

caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 4080

ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 4140

gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 4200

tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 4260

tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 4320

cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 4380

cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 4440

gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 4500

atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 4560

tccgcgcgtt tcctgcatct tttaatcaaa tcccaagatg tgtataaacc accaaactgc 4620

caaaaaatga aaactgtcga caagctctgt ccgtttgctg gcaactgcaa gggtctcaat 4680

cctatttgta attattgaat aataaaacaa ttataaatgt caaatttgtt ttttattaac 4740

gatacaaacc aaacgcaaca agaacatttg tagtattatc tataattgaa aacgcgtagt 4800

tataatcgct gaggtaatat ttaaaatcat tttcaaatga ttcacagtta atttgcgaca 4860

atataatttt attttcacat aaactagacg ccttgtcgtc ttcttcttcg tattccttct 4920

ctttttcatt tttctcttca taaaaattaa catagttatt atcgtatcca tatatgtatc 4980

tatcgtatag agtaaatttt ttgttgtcat aaatatatat gtctttttta atggggtgta 5040

tagtaccgct gcgcatagtt tttctgtaat ttacaacagt gctattttct ggtagttctt 5100

cggagtgtgt tgctttaatt attaaattta tataatcaat gaatttggga tcgtcggttt 5160

tgtacaatat gttgccggca tagtacgcag cttcttctag ttcaattaca ccatttttta 5220

gcagcaccgg attaacataa ctttccaaaa tgttgtacga accgttaaac aaaaacagtt 5280

cacctccctt ttctatacta ttgtctgcga gcagttgttt gttgttaaaa ataacagcca 5340

ttgtaatgag acgcacaaac taatatcaca aactggaaat gtctatcaat atatagttgc 5400

tctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 5460

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 5520

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 5580

caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 5640

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 5700

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 5760

accatgcatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc 5820

cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg 5880

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 5940

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 6000

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 6060

gacgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct 6120

gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct tcgggctgta 6180

attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg 6240

ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gctgtccgcg gggggacggc 6300

tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct 6360

agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg 6420

ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattgg atcggaccga aattaatacg 6480

actcactata 6490

Claims (15)

1.用于诊断AIG的方法，其包括检测在包含抗体的样品中是否存在针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的步骤，其中使用具有固相的在诊断上有用的承载体，在其上固定化有用于特异性地捕获所述自身抗体的工具。

2.根据权利要求1的方法，其中所述承载体选自包括下列各项的组：微量滴定板，珠粒，印迹，优选地Western印迹、线印迹或斑点印迹，具有经固定的细胞的免疫荧光测试承载体，其优选地用于显微镜分析，侧流装置，纤维素基聚合物，生物芯片，微阵列，和色谱柱材料。

3.根据权利要求2的方法，其中所述在诊断上有用的承载体为用于ELISA的微量滴定板。

4.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述样品选自包括下列各项的组：血清、全血、血浆、CSF。

5.根据权利要求1至4之一的方法，其进一步包括检测在样品中是否存在针对内因子的自身抗体。

6.根据权利要求1至5之一的方法，其中所述自身抗体为IgG类别的抗体。

7.具有固相的在诊断上有用的承载体，在其上固定化有用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具。

8.根据权利要求7的承载体，其选自包括下列各项的组：微量滴定板，珠粒，印迹，优选地Western印迹、线印迹或斑点印迹，具有经固定的细胞的免疫荧光测试承载体，其优选地用于显微镜分析，侧流装置，纤维素基聚合物，生物芯片，微阵列，和色谱柱材料。

9.根据权利要求8的承载体，其中所述承载体为用于ELISA的微量滴定板。

10.特异性地结合胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的单克隆抗体或经分离的自身抗体，其特别优选地以经纯化的形式。

11.用于校准医学产品或控制其质量的方法，所述方法包括使根据权利要求7至9之一的承载体与包含根据权利要求10的抗体的液体相接触的步骤，所述液体优选地以已知浓度包含根据权利要求10的抗体；随后为检测在所述液体中是否存在所述抗体的步骤，特别优选地通过在所述液体中所述抗体的至少半定量测定。

12.包含根据权利要求7至9之一的在诊断上有用的承载体的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多于一种，优选地所有从包括下列各项的组中选择的试剂：洗涤溶液，校准物溶液，针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的抗体，和用于检测所述自身抗体的工具，优选地二抗，更加优选地针对IgG抗体或者胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基或其变体的二抗，其优选地具有可检测的标记物。

13.根据权利要求12的试剂盒，其中所述二抗具有可检测的标记物，其优选地选自包括下列各项的组：能够化学发光的、放射性的或包含可检测的同位素的标记物，具有酶促活性的标记物，能够发荧光的标记物，通过NMR-光谱学可检测的化合物，自旋标记-标记物，优选地能够化学发光的标记物，最优选地在合适的化学发光触发溶液中进行温育的情况下产生化学发光信号的能够化学发光的标记物。

14.用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具，或者根据权利要求7至9之一的承载体，或者根据权利要求10的抗体，或者包含胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的多肽，优选地胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的细胞外结构域或其变体，或者编码此的核酸用于AIG的高度特异性诊断的用途。

15.用于特异性地捕获针对胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的自身抗体的工具，或者包含所述工具的承载体，或者胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基，优选地胃H⁺/K⁺-ATP酶的β-亚基的细胞外结构域或其变体，或者编码此的核酸在制备用于AIG的高度特异性诊断的试剂盒中的用途。

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