CN111328346B - 基于人铁蛋白和蛋白酶可切割肽的融合蛋白及其作为化学治疗载体的用途 - Google Patents

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Abstract

融合蛋白、由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒及其用途。描述了基于人铁蛋白重链的融合蛋白，所述融合蛋白在蛋白质的N末端包含至少一个金属蛋白酶切割序列和经修饰的PAS多肽，所述经修饰的PAS多肽充当提高蛋白质药物稳定性的掩蔽聚合物，以及由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒，编码所述融合蛋白的核酸及其诊断和治疗应用。

Description

基于人铁蛋白和蛋白酶可切割肽的融合蛋白及其作为化学治 疗载体的用途
技术领域
本发明涉及融合蛋白、由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒、编码所述融合蛋白的核酸及其诊断和治疗应用。本发明涉及融合蛋白、由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒及其用途。描述了一种基于人铁蛋白重链的融合蛋白，所述融合蛋白在蛋白质的N末端包含至少一个金属蛋白酶切割序列和经修饰的PAS多肽，所述经修饰的PAS多肽充当提高蛋白质药物稳定性的掩蔽聚合物，以及由所述融合蛋白的多个单体构成的纳米颗粒、编码所述融合蛋白的核酸及其诊断和治疗应用。
背景技术
在疾病区域选择性释放治疗剂是改善当前疗法特别是在抗癌疗法中最重要的挑战之一。在这种情况下，使用纳米颗粒作为治疗剂的载体(纳米载体)潜在地允许绕过可能存在于施用位点和最终靶标之间的生物屏障，并且更特别地，以选择性方式在疾病区域而不是正常组织中积累药物。作为基本前提，纳米载体必须能够以有效方式结合大量药物。在用于靶向药物释放的已知载体中，基于铁蛋白(Ft)的纳米颗粒由于其优异的生物相容性特征、穿过生物屏障的能力、功能化的多功能性以及结合某些类型药物的能力而变得越来越引人注意。Ft是由24个亚基组成的高度对称的多聚体蛋白质结构，这些亚基组装成具有基本球形外壳的分子结构，该外壳封闭了在生理上用于存储铁的腔。外径和内径分别为12和8nm。这样的壳状分子结构在下文中将被称为“纳米颗粒”或“HFt纳米颗粒”。与其它药物释放系统相比，基于人铁蛋白重链(HFt)的纳米颗粒显示出许多优势，尤其是在体内人体应用方面。实际上，HFt分子被设计为穿过生物屏障(最小直径20nm)，并且在生理条件下既存在于细胞内也存在于血液中，尽管浓度较低(约20μg/L)。
作为天然成分，其不太可能引起强烈的非自身(外部)抗体和/或T细胞免疫反应。此外，HFt是少数能够自身以有效和选择性的方式结合肿瘤细胞的天然纳米颗粒之一。实际上，通过使用用于靶向癌症治疗的最具吸引力的分子之一转铁蛋白受体1(TfR1)，已证明HFt被内化。TfR1确实在许多类型的癌症表面上调(是正常细胞的多至100倍高)，并被有效地内化。在超过474个临床组织样品中已证明，HFt而非人铁蛋白的轻链(LFt)被TfR1内化并且与非肿瘤组织相比以98％的灵敏度和95％的特异性特异性地识别多种类型的肿瘤(即肝、肺、胰腺、结肠、宫颈、卵巢、前列腺、乳腺、肉瘤和胸腺癌)(Fan K,Cao C,Pan Y,Lu D,Yang D,Feng J等人Magnetoferritin nanoparticles for targeting and visualizingtumour tissues.Nat Nanotechnol.2012；7:459-64)。但是，天然HFt具有一些缺点。首先，其能够结合某些类型的药物例如多柔比星(具有广泛抗肿瘤谱的抗肿瘤药之一)的产率很低，并且这可能限制其可能的用途和临床开发。其次，当通过全身途径注射时，天然HFt的血浆半衰期非常短，约2-3小时。最后，其天然的亚铁氧化酶活性可能会抑制人成骨细胞的发育和成熟，并导致矿化降低、骨质减少和骨质疏松症(Zarjou A,Jeney V,Arosio P,PoliM,Zavaczki E,Balla G,Balla J.Ferritin ferroxidase activity:a potent inhibitorof osteogenesis.J Bone Miner Res.2010,25:164-72)。因此，建议使用通过位点特异性突变获得的缺少亚铁氧化酶活性的没有抑制作用的HFt变体(以下称为vHFt)。
最近，为了提高天然HFt的体内半衰期和HFt-药物复合物的稳定性二者，在WO2016051340A1中公开了一种适用于药物递送的新的基于HFt的构建体，名为HFt-MP-PAS。在该构建体中，每个HFt亚基的N末端与以下进行基因融合：i)PAS多肽序列，即富含脯氨酸(P)、丙氨酸(A)和丝氨酸(S)残基的序列；和ii)插入到每个HFt亚基和外部PAS多肽之间的对肿瘤蛋白酶(MMP)的蛋白水解切割有响应的肿瘤选择性序列(MP)。PAS屏蔽物旨在在药物封装过程(优选对于药物多柔比星)中增加蛋白质的稳定性，并增加蛋白质-药物复合物的稳定性。PAS的存在还能够掩盖蛋白质表面，从而延长其血浆半衰期。MP序列允许通过肿瘤微环境中存在的刺激(即，对该序列特异性的MMP)选择性地去除PAS屏蔽物，从而使得所得的未掩蔽的HFt可以与癌细胞中过表达的TfR1自由地相互作用并被其内化。HFt-MP-PAS构建物被证明：i)与野生型HFt相比，将三倍多的多柔比星(DOX)封装在内腔中，ii)形成更稳定的复合物(即药物渗漏可忽略不计)，并且iii)具有更高的体内循环时间。重要的是，负载DOX的HFt-MP-PAS(HFt-MP-PAS-DOX)在体内人胰腺癌模型中显示出优异的治疗功效，显著提高了整体动物存活率。这归因于PAS屏蔽，HFt的DOX封装、蛋白质-药物复合物稳定性和血浆中循环时间增加。然而，仍然需要提供改进的纳米颗粒作为治疗剂的载体(纳米载体)。
发明内容
发明人惊奇地发现，在PAS结构域中插入的至少一个选自谷氨酸或天冬氨酸的带负电荷的残基极大地改善了融合蛋白HFt-MP-PAS的性质，如从本公开内容的实例和附图中报道的实验数据清楚地表明的。特别地，发明人出乎意料地发现，在PAS结构域中插入带负电荷的残基(例如谷氨酸)的新构建体(HF-MP-PASE)在用于封装药物的反应结束时回收的蛋白质的量方面优于天然HFt和HFt-MP-PAS蛋白二者。而且，与天然HFt和HFt-MP-PAS相比，新构建体HF-MP-PASE显示出药物在细胞核中更高的积累、更高的血清稳定性和更高的肿瘤积累。
因此，本发明的第一个目的是一种融合蛋白，该融合蛋白包含至少三个结构域，其中：
(a)第一结构域包含天然人铁蛋白重链的氨基酸序列，或者与天然人铁蛋白重链的氨基酸序列具有至少90％同一性的其变体；
(b)第二结构域包含基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列；并且
(c)第三N末端结构域由具有至少20个氨基酸残基的多肽的氨基酸序列组成，并且其基本上由或由脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和至少一个选自谷氨酸或天冬氨酸的带负电荷的残基组成。
本发明还提供了包含本发明化合物以及用于治疗应用的特定用途的组合物。该目的和其它目的通过如所附权利要求1中限定的融合蛋白来完成。其它独立权利要求和从属权利要求涉及构成说明书组成部分的本发明其它方面和特定实施例。
为了改善和促进铁蛋白腔内的药物结合，发明人决定从蛋白质表面去除半胱氨酸残基，并在蛋白质腔中引入额外的半胱氨酸残基。以这种方式，可以以非常有效的方式将每个包含巯基反应性基序的分子(例如药物、接头、荧光团等)结合至内腔(参见实例和附图)。
因此，本发明的另一个目的是天然人铁蛋白重链的突变蛋白，其中所述突变蛋白在蛋白质表面上没有任何半胱氨酸残基，并且在蛋白质内腔中具有至少一个半胱氨酸。
另外，为了改善和促进铁蛋白腔内正电药物的结合，发明人决定从蛋白质表面去除半胱氨酸残基，并在蛋白质腔中引入额外的选自谷氨酸或天冬氨酸的带负电荷的残基。以这种方式，可以以非常有效的方式将包含带正电基序的分子(例如药物、接头、荧光团等)结合至内腔(参见实例和附图)。
因此，本发明的另一个目的是天然人铁蛋白重链的突变蛋白，其中所述突变蛋白在蛋白质表面上没有任何半胱氨酸残基，并且在蛋白质内腔中具有至少一个额外的谷氨酸或天冬氨酸残基。
本发明的另一个目的是根据本文公开的任一实施例的分离的编码融合蛋白的核酸或纳米颗粒。
本发明的另一个目的是包含所述核酸的载体和包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。
从参考附图的以下详细描述中，本发明的进一步的特征和优点将变得明显，提供以下详细描述仅是出于说明目的，而不是作为限制，其中：
附图说明
图1是基于HFt的纳米颗粒的制备的示意图，其中24个单体中的每一个的N末端基因结合至可切割肽序列和基本上由脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸和谷氨酸组成的序列(PASE)。
图2显示了天然琼脂糖凝胶电泳带迁移谱。泳道HFt-MP-PAS(15μg)；泳道2，HFt-MP-PASE(15μg)。
图3是含有药物米托蒽醌(MIT)或匹杉琼(pixantrone，PIX)的HFt-MP-PASE的合成的示意图。为了清楚起见，仅显示了24个经修饰的HFt N末端中的4个。
图4显示了与新HFt-MP-PASE蛋白和来自文献的其它数据相比，以前的HFt构建体(HFt-MP-PAS)封装米托蒽醌或匹杉琼的能力。相对产率根据蛋白质回收％和结合的药物分子数目表示。可以看出，与天然HFt或经修饰的HFt(HFt-MP-PAS)相比，在蛋白质回收方面，本专利的构建体主题令人惊讶且出乎意料地具有优异的产率。
图5显示了基于HFt的构建体的凝胶过滤洗脱谱(SEC)和粒径分布(DLS)。(A)负载MIT的HFt-MP-PAS(黑色)和HFt-MP-PASE(红色)构建体的SEC分析。分别在280nm(实线)和610nm(虚线)处同时根据蛋白质和MIT贡献获得洗脱谱。(B)相同构建体的DLS谱。
图6显示了从HFt-MP-PASE-MIT复合物的药物释放。将负载MIT的纳米载体在PBS中存储在4℃和37℃下，并在指定时间通过SEC分析其米托蒽醌含量。通过比较在280nm和610nm同时收集的洗脱谱评估米托蒽醌渗漏的百分比。
图7显示了3小时孵育后HFt-MP-PASE-MIT(20μM MIT浓度)在SW480(上图)和SW620(下图)结肠癌细胞系中的定位。左图：核纤层蛋白(Lamin)A/C染色(核膜标志物，绿色)；中间图：MIT(蓝色)；右图：合并。白条表示10μm长度。
图8显示了3小时孵育后MIT(图A、B)、HFt-MP-PAS-MIT(图C、D)和HFt-MP-PASE-MIT(图E、F)在SW480(图A、C和E)和SW620(图B、D和F)结肠癌细胞系中的定位。在所有实验中，MIT浓度为20μM。白条表示20μm长度。
图9显示了MIT和HFt-MP-PASE-MIT对人细胞系PaCa-44、Capan-1和MiaPaCa2(胰腺癌)、HT1080(纤维肉瘤)、MDA-MB-231(乳腺癌)以及SW480和SW620(结直肠癌)的杀伤效力。平均值±S.E.M.(n＝3)
图10显示了对含有多柔比星的化合物进行的生物分布实验的结果。在具有人胰腺肿瘤(异种移植物)的小鼠中静脉内注射裸药物多柔比星或封装在基于铁蛋白的化合物(天然HFt、HFt-MP-PAS和HFt-MP-PASE)中的多柔比星之后24小时，计算多柔比星的血浆浓度。
图11是基于HFt的纳米颗粒的制备的示意图，其中除先前显示的N末端修饰(HFt-MP-PAS)外，还将天然半胱氨酸残基用丝氨酸残基替换，并且在内腔中包含非天然半胱氨酸或谷氨酸残基(红色球体)(HFt-Cys-MP-PASE或HFt-Glu-MP-PASE)。
图12是包含与半胱氨酸的巯基反应的药物(例如马来酰亚胺)或含正电基序的药物的HFt-Cys-MP-PASE或HFt-Glu-MP-PASE的合成的示意图。为了清楚起见，仅显示了24个经修饰的HFt N末端中的4个。蛋白质内腔中的非天然半胱氨酸残基显示为红色。
图13显示了新的HFt-Cys2-MP-PASE蛋白(每个单体包含4个非天然半胱氨酸，每个24聚体96个)封装多柔比星的6-马来酰亚胺基己酰基腙衍生物(DOX-EMCH)或马来酰亚胺基丙酸和Genz-644282的组合的能力，或者HFt-Glu-MP-PASE(每个单体包含4个非天然谷氨酸，每个24聚体96个)封装天然米托蒽醌或Genz-644282的能力。相对产率以蛋白质回收％和结合的药物分子数目表示。
具体实施方式
作为本发明主题的融合蛋白包含至少三个结构域。
第一结构域包含人铁蛋白的重链的氨基酸序列。这样的氨基酸序列是具有至少90％序列同一性的天然序列。由于人铁蛋白的重链具有183个氨基酸的长度(SEQ ID NO:1)，所以与天然序列相比，具有至少90％序列同一性的变体包含多至19个氨基酸替换。
在一个实施例中，人铁蛋白的重链是突变蛋白，其中去除了来自蛋白质表面的半胱氨酸残基，并且在蛋白质的内腔中插入至少一个半胱氨酸或负电(天冬氨酸或谷氨酸)残基，优选地在蛋白质的内腔中插入两个、三个或四个半胱氨酸或天冬氨酸或谷氨酸。来自蛋白质表面的天然半胱氨酸残基被不具有巯基反应性基团的残基替换，优选地半胱氨酸被丝氨酸替换。人铁蛋白的蛋白质表面在本文中定义为暴露于溶剂的任何残基。人铁蛋白的内腔在本文中定义为未暴露于溶剂的任何残基。
例如，在一个实施例中，插入半胱氨酸以替换赖氨酸71、赖氨酸143和/或甘氨酸182。
在一个优选的实施例中，人铁蛋白的重链是HFt变体(HFt-Cys1)的氨基酸序列SEQID NO:2，该变体缺少天然半胱氨酸残基并且在内腔中包含三个非天然半胱氨酸残基，其代表了另一种变体。HFt-Cysl的氨基酸序列的特征在于六个氨基酸替换：丝氨酸替换半胱氨酸90、丝氨酸替换半胱氨酸102、丝氨酸替换半胱氨酸130、半胱氨酸替换赖氨酸71、半胱氨酸替换赖氨酸143和半胱氨酸替换甘氨酸182。
在一个优选的实施例中，人铁蛋白的重链缺少天然半胱氨酸残基，并且在内腔中包含四个非天然半胱氨酸残基，其代表了另一种变体(HFt-Cys2)。该另外的变体的氨基酸序列的特征在于七个氨基酸替换：丝氨酸替换半胱氨酸90、丝氨酸替换半胱氨酸102、丝氨酸替换半胱氨酸130、半胱氨酸替换赖氨酸53、半胱氨酸替换赖氨酸71、半胱氨酸替换苏氨酸135和半胱氨酸替换赖氨酸143。
在一个优选的实施例中，人铁蛋白的重链缺少天然半胱氨酸残基，并且在内腔中包含四个非天然谷氨酸残基，其代表另一种变体(HFt-Glu)。该另外的变体的氨基酸序列的特征在于七个氨基酸替换：丝氨酸替换半胱氨酸90、丝氨酸替换半胱氨酸102、丝氨酸替换半胱氨酸130、谷氨酸替换赖氨酸53、谷氨酸替换赖氨酸71、谷氨酸替换苏氨酸135和谷氨酸替换赖氨酸143。
本文公开的人铁蛋白的所有突变蛋白/变体是本发明的目的。本文公开的人铁蛋白重链的所有实施例可以用作根据本发明的融合蛋白中的第一结构域。
天然HFt的氨基酸序列为(考虑到第一个甲硫氨酸是编码区的开始，并且在以后的蛋白质加工中可以被除去)：
Figure BDA0002479195930000061
在一些实施例中，本发明的融合蛋白HFt包含HFt变体(HFt Cys1)，该HFt变体(HFtCys1)在外表面上缺少天然半胱氨酸残基并且在内腔中包含三个非天然半胱氨酸残基。在一个实施例中，变体HFt Cys1的氨基酸序列为：
Figure BDA0002479195930000062
变体HFt Cys2的氨基酸序列为：
Figure BDA0002479195930000071
在一些实施例中，本发明的融合蛋白HFt包含HFt变体(HFt Glu)，该HFt变体(HFtGlu)在外表面上缺少天然半胱氨酸残基并且在内腔中包含四个非天然谷氨酸残基。在一个实施例中，变体HFt Glu的氨基酸序列为：
Figure BDA0002479195930000072
本发明融合蛋白的第二结构域包含至少一个基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列，特别是MMP 2、MMP 3、MMP 7或MMP 9。作为非限制性实例，下文中列出了模拟胶原链的切割序列并且被MMP 2和MMP 9以特别有效的方式切割的一些肽：
Figure BDA0002479195930000073
包含预期酶的切割位点的氨基酸序列也可以以使切割位点重复多次的方式构建，例如如下所示的序列：
Figure BDA0002479195930000074
所有先前提到的氨基酸序列都是根据本发明的融合蛋白和纳米颗粒的制备的代表性而非限制性实例。
连接至N末端的本发明融合蛋白的第三结构域基本上由或由富含脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和至少一个负电氨基酸(例如谷氨酸或天冬氨酸)的多肽的氨基酸序列组成(为简洁起见，称为“PASE”)，目的是与缺少负电氨基酸的多肽(PAS)相比，提高蛋白质在药物封装过程中的稳定性，尤其是对于可促进蛋白质蛋白质聚集的药物，以及提高蛋白质药物复合物的稳定性。
多肽PASE基本上由富含Pro、Ala和Ser和至少一个或多个Glu和/或Asp的氨基酸序列组成，其形成带负电荷的非结构化聚合物，其长度优选小于80个氨基酸残基，更多优选包含20至80个氨基酸残基，还更优选包含30至70个氨基酸残基。在一个优选的实施例中，上述多肽PASE的脯氨酸残基占多肽PASE的总氨基酸残基的10 40％。
根据一个实施例，PASE结构域包含1、2、3或4个谷氨酸和/或天冬氨酸。在一个优选的实施例中，PASE结构域在PAS结构域的15、16、17、18、19或20个残基内包含不多于一个谷氨酸或天冬氨酸。
以下是特别适合在本发明范围内使用并因此优选的PASE多肽的实例：
Figure BDA0002479195930000081
本文公开的所有PASE结构域都是本发明的目的。
在本说明书中，术语“多肽基本上由富含Pro、Ala和Ser的氨基酸序列组成”定义为形成由Pro、Ala和Ser组成的稳定无规卷曲构象的多肽，其中1至5％的Pro、Ala和Ser残基被不改变该多肽的稳定无规卷曲构象的其它氨基酸(例如甘氨酸)替换。如上所述，本发明的生物合成无规卷曲多肽(或无规卷曲多肽片段)仅由脯氨酸和丙氨酸残基和至少一个谷氨酸或天冬氨酸残基组成，并且形成稳定无规卷曲构象。如本文所用，术语“无规卷曲”通常涉及聚合物分子(包括氨基酸聚合物/氨基酸序列/多肽)的任何构象，其中形成所述聚合物结构的各个单体元件基本上随机地朝向相邻的单体元件取向，同时仍与所述相邻单体元件化学键合。特别地，采用/具有/形成“无规卷曲构象”的多肽、氨基酸序列或氨基酸聚合物基本上缺乏确定的二级和三级结构。多肽无规卷曲的性质及其实验鉴定方法是本领域技术人员已知的，并且已经在科学文献中进行了描述(Cantor(1980)Biophysical Chemistry,第2版,W.H.Freeman和Company,New York；Creighton(1993)Proteins—Structures andMolecular Properties,第2版,W.H.Freeman和Company,New York；Smith(1996)Fold Des1:R95 R106)。
通过如先前提及的包含一个或多个金属蛋白酶切割位点的短肽序列将稳定和掩蔽PASE多肽添加到HFt的表面，从而为本发明的融合蛋白提供可置换的掩蔽。实际上，可以通过细胞外基质金属蛋白酶(MMP)在靶组织处选择性去除PASE多肽。MMP 2和MMP 9被显示是在肿瘤微环境中过表达并参与血管生成、侵袭和肿瘤转移的关键金属蛋白酶。
本发明的又一个目的是一种融合蛋白，其中PASE或PAS结构域和MMP可切割结构域连接在HFt蛋白的C末端而不是N末端。根据一个实施例，融合蛋白具有SEQ ID NO:16或SEQID NO:17。
Figure BDA0002479195930000091
在本发明范围内在铁蛋白的多聚体表面上使用PASE多肽提供了优于现有技术的多个优点。为了在蛋白质药物复合物形成过程中获得更高的产率和单分散的材料，我们通过在PAS序列中添加谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)残基对先前报道的HFt MP PAS进行了基因改造，并获得了新的构建体，称为HFt MP PASE。由于这种修饰，基于铁蛋白的蛋白质可以以比天然HFt或经修饰的HFt MP PAS对应物更易溶和更单分散的方式与促进蛋白质聚集的药物(例如米托蒽醌和匹杉琼)形成复合物。
本发明人通过使用基因融合技术和重组蛋白的生产技术二者来构建基于人铁蛋白的重链(HFt)的纳米颗粒，出人意料且意外的实现了不同于多柔比星(例如，米托蒽醌和匹杉琼)的蛋白质药物复合物封装产率的稳定性的这种改善。特别地，如将在与实例有关的部分中详细描述的，制备了基因构建体，该基因构建体在一个单核酸序列(例如DNA)中编码图1中所示三个序列：i)HFt；ii)可被MMP 2/9切割的短肽序列(MP)；iii)富含Pro、Ser、Ala和Glu的非结构化多肽序列(PASE)，其长度优选在20至80个残基之间。序列ii)和iii)结合至HFt的N末端以对其进行可逆掩蔽。
如上所述，由本发明人获得的HFt融合蛋白自发形成能够携带治疗剂(化学化合物、单克隆抗体、肽等)的HFt纳米颗粒(图2)。
在一个实施例中，一种或多种(优选5种)治疗和/或诊断分子被封装在HFt纳米颗粒的内腔中或共价结合至HFt纳米颗粒的表面或共价结合至HFt的内腔。由于存在PASE多肽，与未经修饰的蛋白质(HFt)或与PAS修饰的蛋白质(HFt MP PAS)相比，结合的药物量和蛋白质药物复合物本身的均质性大幅提高。所获得的材料的均质性在制药领域是非常理想的属性，因为其表明没有负面影响，例如沉淀、聚集和携带治疗分子的最终产品的损失。
治疗分子是例如药物活性成分。如本文所用，表述“药物活性成分”或更简单地“活性成分”是指任何药物活性分子(化学化合物、单克隆抗体、肽等)，例如可用于癌症治疗的分子。用于在本发明中使用的优选的活性成分是例如但不限于多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹杉琼(pixantrone)、Genz 644282、紫杉醇(paclitaxel)、奥利斯他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、吉西他滨(gemcitabine)和铂基活性成分。也可以使用上面列出的活性成分的前体。
在治疗应用中，可以通过任何合适的施用途径将作为靶向载体系统的本发明的HFt纳米颗粒施用于受试者或患者，例如口服、肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、作为栓剂、病灶内、鼻内或皮下、淋巴内(intralymphatically)、通过吸入微滴或通过植入缓释装置(例如渗透泵)。如本文所用，术语“受试者”涉及动物，例如哺乳动物，包括人类、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠等。
如本文所用，术语“治疗”是指在治疗某些疾病、病变、病症或症状或在某些情况下预防症状或病症的发作中成功或改善的证据。
在治疗应用中，本发明的HFt纳米颗粒用于施用治疗有效剂量的药物活性成分。“治疗有效剂量”旨在表示对其施用对象产生治疗效果的剂量。确切剂量将取决于多种因素，包括治疗的目的、受试者、待治疗的疾病等，并且可以由本领域普通技术人员使用本身已知的方法容易地确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1 3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins)。
本发明的HFt纳米颗粒可用于治疗需要施用药物成分的任何疾病，例如通过将活性成分隔离在纳米颗粒的腔内或通过将其共价结合至纳米颗粒表面。通过将显像剂隔离在纳米颗粒的腔内或通过将其共价结合到纳米颗粒表面，纳米颗粒还可用于疾病的诊断，更特别是成像。
可以将本发明的HFt纳米颗粒施用于受试者以治疗任何疾病，优选过度增殖性疾病，包括癌症，例如：癌、神经胶质瘤、间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆癌(hepatobiliarycancer)、膀胱癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、胆囊癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、宫颈癌、阴道癌、子宫癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、内分泌胰腺癌、类癌肿瘤、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(对于其它癌症类型，参见CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE(DeVita,V.T.等人.2008版))。
根据一个实施例，使用例如插入内腔的一个或多个半胱氨酸将HFt纳米颗粒结合至每个包含巯基反应性基序的分子，例如药物、接头、荧光团等。根据一个优选的实施例，使用插入内腔的一个或多个半胱氨酸，使HFt纳米颗粒封装多柔比星的6-马来酰亚胺基己酰基腙衍生物(DOX EMCH)或接头马来酰亚胺基丙酸和药物Genz 644282。
提供以下实例仅用于说明目的，而不是对如所附权利要求所限定的本发明范围的限制。
实例
实例1用于HFt-MP-PASE融合蛋白的表达载体的构建
为了减少蛋白质聚集并增加稳定性，决定在与每个HFt亚基融合的外屏蔽形成PAS序列中引入带负电荷的残基。对先前获得的HFt-MP-PAS构建体的分析确实表明，在40个残基的PAS序列中引入两个谷氨酸残基会引起足够的静电排斥，以防止不同的24聚体组装体之间聚集，而不会影响24聚体内部的亚基组装。为了使负电荷尽可能多地分布在构建体的表面，将谷氨酸残基以20个残基的距离设置。
通过将以下三个不同序列组合为一个单一序列得到了HFt-MP-PASE基因：HFt(SEQID NO:1)、MP(SEQ ID NO:5)和PASE(SEQ ID NO:10)。该构建体与先前公开的HFt-MP-PAS构建体(之前称为HFt MMP PAS40；WO2016051340)的区别仅在于PAS序列中的两个氨基酸替换：谷氨酸替换丙氨酸13和谷氨酸替换丙氨酸33。使用这两种构建体进行了该新专利中公开的每个比较实验。
通过使用GENEART AG(日耳曼尼亚)合成了包含HFt-MP-PASE基因的pET 11a表达载体。在考虑用于大肠杆菌(Escherichia coli)中高表达水平的密码子优化的情况下进行基因合成。
类似于HFt-MP-PAS，融合蛋白HFt MP PASE通过重组蛋白技术获得，并从细胞可溶性级分中以高产率纯化(每升大肠杆菌细胞培养物约150mg)。通过在天然条件下进行琼脂糖凝胶电泳，评估插入蛋白质表面的带负电荷的谷氨酸残基(每个蛋白质48个)对蛋白质迁移率的影响(图1)。在利用变性剂SDS PAGE的变化形式中，天然电泳中的蛋白质迁移率取决于蛋白质电荷和分子质量二者。假设对于HFt MP PAS和HFt MP PASE来说分子质量是可比较的，则观察到的蛋白质迁移率差异必须归因于HFt-MP-PASE构建体中的额外负电荷(图2)。
实例2携带化学治疗药物的HFt-MP-PAS和HFt-MP-PASE的制备
作为化学治疗剂，发明人报道了其中使用了药物米托蒽醌(MIT)或匹杉琼(PIX)的实例。根据Falvo等人,2016,Biomacromolecules.17(2):514 22中公开的方案，通过利用作为pH函数的蛋白质解偶联偶联过程将这些药物封装在融合蛋白的蛋白质腔内。分解/重组装过程如图3所示。
实例3测试药物米托蒽醌和匹杉琼的封装产率
将HFt-MP-PASE中的MIT或PIX封装效率与天然HFt和HFt MP PAS中的效率进行了比较(图4)。在进行的所有实验中，就反应结束时回收的蛋白质量而言，HFt-MP-PASE均优于天然HFt和HFt-MP-PAS蛋白质两者。这表明HFt-MP-PASE更稳定，并且在蛋白质药物复合物形成过程中不会从溶液中聚集/沉淀出来。
实例4测试蛋白质米托蒽醌复合物的均质性和稳定性
负载有MIT的HFt-MP-PASE复合物比HFt-MP-PAS对应物更加可溶和单分散，在溶液中没有更高分子量物质(图5)。动态光散射(DLS)实验表明，HFt-MP-PASE-MIT样品与我们先前报道的HFt-MP-PAS-DOX(包含多柔比星作为药物)具有大致相同的尺寸，平均直径为17.0±1.1nm(图5B)。这些结果表明，与HFt-MP-PAS对应物相比，HFt-MP-PASE-MIT中谷氨酸残基的插入出人意料地导致了更高的蛋白溶解度和均质性，可能阻止了溶液中MIT介导的蛋白质蛋白质相互作用。此外，HFt-MP-PAS与HFt-MP-PASE相比，每个24聚体观察到稍微更高的MIT分子数目(55.0vs 49.0)，这可能归因于前一种构建体表面上存在MIT分子，其可能会促进蛋白质蛋白质聚集。
通过将溶液在4℃或37℃的PBS中储存2个月并且每7天通过尺寸色谱(SEC)分析评估其MIT含量来测试HFt-MP-PASE-MIT复合物的稳定性。HFt-MP-PASE-MIT表现出出色的稳定性，在4℃下储存2个月后释放的MIT不到10％(图6)，并且没有混浊或沉淀的迹象。
实例5基于HFt的纳米载体的细胞内化和定位的测试
为了确定含MIT的基于HFt的构建体是否经历细胞表面结合和/或内化，将其与结肠癌细胞SW480和SW620在37℃孵育1或3小时，并通过共聚焦显微镜观察与MIT相关的荧光。
图7显示了HFt MP PASE MIT在SW480(上图)和SW620(下图)细胞系中的定位。3小时孵育后，HFt-MP-PASE-MIT大量积聚在两种细胞系的细胞核中，如用核膜标志物核纤层蛋白A/C染色(绿色)所示。特别地，如先前针对结肠癌和乳腺癌细胞所提出的，MIT基于尺寸、位置和形状定位在假定为核仁的核内结构中。
图8显示了用游离MIT、HFt-MP-PAS-MIT或HFt-MP-PASE MIT处理的细胞之间的比较。在所有情况下，MIT定位在细胞核内部，但是在游离MIT和HFt-MP-PAS-MIT的情况下，药物也部分存在于细胞质中。总体而言，用HFt-MP-PASE-MIT处理的细胞在细胞核中显示出最高的MIT积累。
实例6 HFt MP PASE MIT的体外抗增殖作用
为了评估负载有MIT的HFt-MP-PASE在体外杀伤癌细胞的能力，我们对不同来源的多种人癌细胞进行了XTT活力测定：纤维肉瘤HT1080；三阴性乳腺MDA MB 231；胰腺PaCa44、Capan 1和MiaPaCa2；结直肠SW480和SW620癌细胞。
封装在HFt MP PASE构建体中后，MIT不仅保留了其药理活性，而且负载MIT的纳米载体在所有测试细胞系中的IC50值均与裸MIT相似，在一些情况下甚至更低(参见图9)。这是值得注意的，因为裸药物可以自由扩散到细胞中，而HFt-MP-PASE构建体只能通过经历速率受限的受体介导的摄取来递送MIT。此外，新的纳米系统HFt-MP-PASE-MIT在胰腺细胞系上显示出的杀伤效力是目前使用的吉西他滨药物约十倍高(即对于Paca44、Capan 1和MiaPaCa2细胞分别为0.43vs 6.75μM、0.10vs 2.8μM和0.07vs 1.15μM)。
实例7包含多柔比星的化合物在小鼠中的生物分布实验
为了比较HFt-MP-PASE与HFt-MP-PAS在肿瘤和器官中药物积累方面的比较，将两种融合蛋白均用药物封装。选择药物多柔比星(DOX)的原因是，与米托蒽醌药物相比，两种融合蛋白对其具有类似的封装能力。在具有人胰腺肿瘤(异种移植物)的小鼠中静脉内注射裸药物Dox或封装在基于铁蛋白的化合物(天然HFt、HFt-MP-PAS和HFt-MP-PASE)中的多柔比星之后24小时，计算Dox的血浆浓度。图10显示HFt-MP-PASE在血清中具有较高的稳定性，并且也具有较高的肿瘤积累。
实例8用于HFt-MP-PASE-Cys或Glu融合蛋白的表达载体的构建
为了改善和促进铁蛋白腔内的药物结合，决定从蛋白质表面除去半胱氨酸残基，并在蛋白质腔内引入额外的半胱氨酸或谷氨酸残基。这样，就有可能将每个包含巯基反应性或带正电荷基序的分子(例如药物、接头、荧光团等)结合至内腔。图11和图12是基于HFt的纳米颗粒的制备和合成的示意图，其中除先前显示的N末端修饰(HFt-MP-PAS)外，还将天然半胱氨酸残基用丝氨酸残基替换，并且在内腔中包含非天然半胱氨酸或谷氨酸残基(红色球体)(HFt-Cys-MP-PASE或HFt Glu MP PASE)。图13显示了新的HFt-Cys2-MP-PASE蛋白(每个单体包含4个非天然半胱氨酸，每个24聚体96个)封装多柔比星的6马来酰亚胺基己酰基腙衍生物(DOX EMCH)的能力。在同一图中还显示了HFt-Cys-MP-PASE封装接头马来酰亚胺基丙酸和药物Genz 644282的能力。在同一图中还显示了HFt-Glu-MP-PASE封装游离药物米托蒽醌或Genz644282的能力。根据Falvo等人,2016,Biomacromolecules.17(2):514 22中公开的方案并具有一个修改，通过利用作为pH函数的蛋白质解偶联偶联过程将所有这些药物封装在融合蛋白的蛋白质腔内。在使用含马来酰亚胺的分子的反应中，在pH酸步骤后在pH 6.5 7.5下加入，以避免由于低pH值而可能损坏分子。另外，在使用接头马来酰亚胺基丙酸和药物Genz 644282的反应中，前者以1.2:1的接头/巯基比在药物之前加入。
相对产率以蛋白质回收％和结合的药物分子数目表示。
实例9 HFt-Glu-MP-PASE Genz 644282的体外抗增殖作用
为了测试增殖，将人肉瘤(HT 1080和A204)、人乳腺癌(MDA MB 231)、人黑素瘤(Colo38)和人胰腺癌(PaCa44和MiaPaCa2)细胞在37℃下在200μl完全培养基中以约5×103/孔在96孔15个板中铺板。第二天，孔以不同的Genz 644282浓度一式三份接受Genz644282或HFt Glu MP PASE Genz 644282，并将细胞培养72小时。在培养的最后4小时期间，通过3(4,5二甲基噻唑2基)2,5二苯基溴化四唑(MTT)的还原来评估细胞活力。将总计1mg/mL的MTT加入每个孔中，并将样品在37℃下孵育30分钟。洗涤之后，将甲臜晶体溶解在100μL的二甲基亚砜中。在550nm处测量吸光度。
HFt Glu MP PASE Genz 644282对培养的癌细胞的抗增殖作用如图14所示。结果表明，HFt Glu MP PASE Genz 644282以浓度依赖性方式有效抑制体外生长的癌细胞，与裸药物相比IC50值相同或甚至更低。鉴于潜在的治疗应用，这些结果具有重要意义。使用构建体HFt-Cys-MP-PASE Genz 644282也获得了相同的结果。
HFt Glu MP PASE Genz 644282的体内抗增殖作用
向五周龄的雌性CD1裸小鼠(Charles River Laboratories,莱切,意大利)皮下注射(即右胁腹)4x106 PaCa-44细胞，该细胞重悬于200μl RPMI 1640培养基加1％BSA中。当肿瘤达到约100mm3的体积时，将小鼠随机分成六只动物的组并静脉内注射200μL生理盐水、Genz-644282(1.9mg/Kg)或HFt-Glu-MP-PASE-Genz(0.95或1.9mg/Kg)。向小鼠每周两次注射，持续三周；每周两次用数字卡尺测量肿瘤体积，并且监测小鼠体重。当小鼠的肿瘤达到≥1500mm3的体积时，处死动物。在图15中报告了距最后一次治疗约两周后的肿瘤生长曲线。在此图中，很明显的是HFt-Glu-MP-PASE-Genz能够显著降低癌症进展，并观察到100％的完全肿瘤响应。在图16中示出了动物的总体存活。用HFt-Glu-MP-PASE-Genz处理的所有动物均无疾病，并且从治疗开始的100天后仍存活，表明受试化合物的高功效。
序列表
<110> 西纳生物技术有限公司（Thena Biotech S.r.l.）
<120> 基于人铁蛋白和蛋白酶可切割肽的新融合蛋白及其作为化学治疗载体的用途
<130> BI5162R
<160> 18
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> >1 天然HFt的氨基酸序列
<400> 1
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 2
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >2 HFT变体
<400> 2
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Cys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Cys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Cys
180
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >SEQ 3
<400> 3
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 4
<400> 4
Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >SEq 5
<400> 5
Pro Leu Gly Leu Ala Gly
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 6
<400> 6
Pro Val Gly Leu Ile Gly
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 7
<400> 7
Cys Gly Leu Asp Asp
1 5
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 8
<400> 8
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln
1 5 10 15
<210> 9
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 9
<400> 9
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Glu Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Glu
35 40
<210> 10
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 10
<400> 10
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Glu Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
20 25 30
Glu Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
35 40
<210> 11
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 11
<400> 11
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Glu Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Glu Ala Ser Pro Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Glu Ala
50 55 60
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser
65 70
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 12
<400> 12
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Asp Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Asp
35 40
<210> 13
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 13
<400> 13
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Asp Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
20 25 30
Asp Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
35 40
<210> 14
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 14
<400> 14
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Asp Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Asp Ala Ser Pro Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Asp Ala
50 55 60
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser
65 70
<210> 15
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 15
<400> 15
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Cys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Cys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Cys His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Cys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180
<210> 16
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 16
<400> 16
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ala Ser Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
195 200 205
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Pro Ser Ala Pro Ala
225
<210> 17
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> >seq 17
<400> 17
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ala Ser Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Glu Pro Ala Pro Ser Ala Pro
195 200 205
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Glu Pro Ala
210 215 220
Pro Ser Ala Pro Ala
225
<210> 18
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HFt Glu SEQ ID NO 18
<400> 18
Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp
1 5 10 15
Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala
35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Glu Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg
50 55 60
Glu His Ala Glu Lys Leu Met Glu Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
65 70 75 80
Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Ser Asp Asp Trp Glu Ser
85 90 95
Gly Leu Asn Ala Met Glu Ser Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn
100 105 110
Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro
115 120 125
His Leu Ser Asp Phe Ile Glu Glu His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Glu
130 135 140
Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly
145 150 155 160
Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu
165 170 175
Gly Asp Ser Asp Asn Glu Ser
180

Claims (17)

1.一种融合蛋白，由三个结构域组成，其中：
(a)第一结构域由天然人铁蛋白重链的氨基酸序列或其变体组成；
(b)第二结构域由基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列组成；并且
(c)第三N末端结构域由具有至少20个氨基酸残基的多肽的氨基酸序列组成，并且其由脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸和至少一个选自谷氨酸或天冬氨酸的带负电荷的残基组成，
其中所述第一结构域包含：
SEQ ID NO:1的天然人铁蛋白重链的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2的人铁蛋白的重链变体的氨基酸序列；或
在蛋白质表面没有任何半胱氨酸残基并且在蛋白质的内腔中具有两个、三个或四个半胱氨酸或天冬氨酸或谷氨酸的人铁蛋白重链变体的氨基酸序列，
其中所述第三N末端结构域在所述第三N末端结构域的15至20个残基内包含不多于一个谷氨酸或天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第三N末端结构域具有小于80个氨基酸残基的长度。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述第三N末端结构域具有20至80个氨基酸残基的长度。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述第三N末端结构域具有40至75个氨基酸残基的长度。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二结构域为选自由MMP 2、MMP 3、MMP 7和MMP 9组成的组的基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述基质金属蛋白酶(MMP)切割位点的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8组成的组。
7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第三N末端结构域在所述第三N末端结构域的20个残基内包含不多于一个谷氨酸或天冬氨酸。
8.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第三N末端结构域多肽的脯氨酸残基占其总氨基酸残基的10-40％。
9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第三N末端结构域多肽选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。
10.根据权利要求1所述的融合蛋白，还包含分别将所述第一结构域连接至所述第二结构域和/或将所述第二结构域连接至所述第三N末端结构域的第一接头氨基酸序列和/或第二接头氨基酸序列，其中所述第一接头氨基酸序列和所述第二接头氨基酸序列彼此相同或不同。
11.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白与活性成分和/或显像剂连接。
12.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述人铁蛋白的重链变体具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:18。
13.一种纳米颗粒，包含根据权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白的多个单体。
14.根据权利要求13所述的纳米颗粒，包含所述融合蛋白的24个单体。
15.根据权利要求13所述的纳米颗粒，其中选自多柔比星、米托蒽醌、匹杉琼、Genz644282、紫杉醇、奥利斯他汀、喜树碱、吉西他滨和铂基的活性成分连接至或封装在所述纳米颗粒中。
16.一种药物组合物，包含根据权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白或根据权利要求13至15中任一项所述的纳米颗粒，与至少一种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂联合。
17.根据权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求13至15中任一项所述的纳米颗粒或根据权利要求16所述的药物组合物在制备用于治疗和/或诊断肿瘤的药物中的用途。
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