ES2923152T3 - Proteínas de fusión basadas en ferritina humana y péptidos escindibles por proteasas y su uso como vehículos quimioterapéuticos - Google Patents

Proteínas de fusión basadas en ferritina humana y péptidos escindibles por proteasas y su uso como vehículos quimioterapéuticos Download PDF

Info

Publication number
ES2923152T3
ES2923152T3 ES18797162T ES18797162T ES2923152T3 ES 2923152 T3 ES2923152 T3 ES 2923152T3 ES 18797162 T ES18797162 T ES 18797162T ES 18797162 T ES18797162 T ES 18797162T ES 2923152 T3 ES2923152 T3 ES 2923152T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
hft
seq
amino acid
pase
fusion protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18797162T
Other languages
English (en)
Inventor
Aldo Braca
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Thena Biotech Srl
Original Assignee
Thena Biotech Srl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Thena Biotech Srl filed Critical Thena Biotech Srl
Application granted granted Critical
Publication of ES2923152T3 publication Critical patent/ES2923152T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Una proteína de fusión, una nanopartícula compuesta por una pluralidad de monómeros de dicha proteína de fusión y usos de la misma. Se describe una proteína de fusión basada en la cadena pesada de la ferritina humana, que incluye en el extremo N de la proteína al menos una secuencia de escisión de metaloproteinasa y un polipéptido PAS modificado que actúa como un polímero enmascarador que aumenta la estabilidad del fármaco de la proteína. , así como una nanopartícula compuesta por múltiples monómeros de dicha proteína de fusión, un ácido nucleico que codifica para dicha proteína de fusión, y aplicaciones diagnósticas y terapéuticas de la misma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión basadas en ferritina humana y péptidos escindibles por proteasas y su uso como vehículos quimioterapéuticos
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a una proteína de fusión, nanopartículas compuestas por una pluralidad de monómeros de dicha proteína de fusión, ácidos nucleicos que codifican dicha proteína de fusión y aplicaciones diagnósticas y terapéuticas de los mismos.
Se describe una proteína de fusión basada en la cadena pesada de la ferritina humana, que incluye en el extremo N de la proteína, al menos una secuencia de escisión de metaloproteinasa y un polipéptido PAS modificado que actúa como un polímero de enmascaramiento que aumenta la estabilidad proteína-fármaco, así como una nanopartícula compuesta por múltiples monómeros de dicha proteína de fusión, un ácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión y aplicaciones diagnósticas y terapéuticas de los mismos.
Estado de la técnica
La liberación selectiva de agentes terapéuticos en áreas enfermas representa uno de los desafíos más importantes para mejorar las terapias actuales, especialmente en la terapia contra el cáncer. En este contexto, el uso de nanopartículas como vehículos (nanovectores) de agentes terapéuticos permite potencialmente tanto sortear las barreras biológicas que pueden estar presentes entre el sitio de administración y la diana final como, más específicamente, acumular el fármaco de forma selectiva en el área enferma en lugar de en los tejidos normales. Como un prerrequisito fundamental, el nanovector debe ser capaz de unir grandes cantidades del fármaco de forma eficaz. Entre los vehículos conocidos para la liberación dirigida de fármacos, las nanopartículas basadas en ferritinas (Ft) son cada vez más interesantes gracias a sus extraordinarias características de biocompatibilidad, capacidad de cruzar barreras biológicas, versatilidad de funcionalización y capacidad de unión a determinados tipos de fármacos. Las Ft son estructuras de proteínas multiméricas altamente simétricas que consisten en 24 subunidades que se ensamblan en una estructura molecular con una cubierta esencialmente esférica, que encierra una cavidad que se usa fisiológicamente para almacenar hierro. El diámetro exterior y el diámetro interior son 12 y 8 nm, respectivamente. Dicha estructura molecular en forma de cubierta se designará en lo sucesivo en el presente documento "nanopartícula" o "nanopartícula HFt". Las nanopartículas basadas en la cadena pesada de la ferritina humana (HFt) muestran una serie de ventajas frente a otros sistemas de liberación de fármacos, especialmente en relación con las aplicaciones humanas in vivo. De hecho, las moléculas de HFt están diseñadas para atravesar las barreras biológicas (20 nm de diámetro menor) y están presentes tanto dentro de las células como en la sangre en condiciones fisiológicas, aunque a bajas concentraciones (aproximadamente 20 pg/l).
Al ser elementos naturales, es menos probable que provoquen una fuerte respuesta inmunitaria de anticuerpos no propios (extraños) y/o células T. Adicionalmente, HFt es una de las pocas nanopartículas naturales que es capaz por sí sola de unirse a las células tumorales de forma eficaz y selectiva. De hecho, mediante el uso de una de las moléculas más atractivas para la terapia dirigida contra el cáncer, receptor de transferrina 1 (TfR1), se ha demostrado que HFt se internaliza. De hecho, TfR1 está regulado positivamente en la superficie de muchos tipos de cáncer (hasta 100 veces más que en las células normales) y se internaliza de manera eficiente. En más de 474 muestras clínicas de tejido, HFt, pero no la cadena ligera de la ferritina humana (LFt), se demostró que se internaliza por TfR1 y que reconoce específicamente muchos tipos de tumores (es decir, cánceres de hígado, pulmón, páncreas, colon, cuello uterino, ovario, próstata, mama, sarcoma y timo) en comparación con tejidos no tumorales, con una sensibilidad del 98 % y una especificidad del 95 % (Fan K, Cao C, Pan Y, Lu D, Yang D, Feng J, et al. Magnetoferritin nanoparticles for targeting and visualizing tumour tissues. Nat Nanotechnol. 2012;7:459-64). Sin embargo, HFt nativa exhibe algunas desventajas. En primer lugar, los rendimientos con los que es capaz de unirse a ciertos tipos de fármacos, tales como, por ejemplo, doxorrubicina (uno de los fármacos antineoplásicos de amplio espectro antitumoral) son bajos y esto puede restringir su posible uso y desarrollo clínico. En segundo lugar, la HFt nativa tiene una semivida en plasma muy corta, aproximadamente 2-3 horas, cuando se inyecta a través de la vía sistémica. Por último, su actividad natural de ferroxidasa podría inhibir el desarrollo y la maduración de los osteoblastos humanos y provocar una mineralización disminuida, osteopenia y osteoporosis (Zarjou A, Jeney V, Arosio P, Poli M, Zavaczki E, Balla G, Balla J. Ferritin ferroxidase activity: a potent inhibitor of osteogenesis. J Bone Miner Res. 2010,25:164-72). Por esta razón, es recomendable usar una variante de HFt que carezca de la actividad ferroxidasa, obtenida por mutación específica del sitio (en lo sucesivo en el presente documento designada vHFt), que no da inhibición.
Recientemente, para aumentar tanto la semivida in vivo de HFt nativa y la estabilidad de los complejos HFt-fármaco, una novedosa construcción basada en HFt, llamada HFt-MP-PAS, adecuada para la administración de fármacos se desveló en el documento WO2016051340 A1. En esta construcción el extremo N de cada subunidad HFt se fusiona genéticamente para: i) una secuencia polipeptídica PAS, es decir, una secuencia rica en restos de prolina (P), alanina (A) y serina (S); y ii) una secuencia selectiva de tumores (MP) que responde a la escisión proteolítica por proteasas tumorales (MMP), insertada entre cada subunidad HFt y el polipéptido pAs externo. El escudo PAS tenía como objetivo aumentar la estabilidad de la proteína durante el proceso de encapsulación del fármaco, preferentemente para el fármaco doxorrubicina, y de aumentar la estabilidad del complejo proteína-fármaco. La presencia de PAS también es capaz de enmascarar la superficie de la proteína y, por lo tanto, prolongar su semivida en plasma. La secuencia MP permite que el escudo PAS se retire selectivamente mediante estímulos presentes en el microambiente del tumor (es decir, MMP específicas para esta secuencia) de modo que la HFt desenmascarada resultante pueda interactuar libremente con TfR1 sobreexpresado en células cancerosas e internalizarla. La construcción HFt-MP-PAS demostró i) encapsular en la cavidad interna tres veces más doxorrubicina (DOX) que la HFt de tipo silvestre, ii) formar complejos más estables (es decir, la fuga del fármaco fue insignificante) y iii) poseer mayor tiempo de circulación in vivo. De manera importante, HFt-MP-PAS cargado con DOX (HFt-MP-PAS-DOX) mostró una excelente eficacia terapéutica en un modelo de cáncer de páncreas humano in vivo, aumentando significativamente la supervivencia general de los animales. Se atribuyó al escudo PAS el aumento de la encapsulación DOX, la estabilidad del complejo proteínafármaco y el tiempo de circulación en plasma con respecto a HFt. Sin embargo, todavía existe la necesidad de proporcionar nanopartículas mejoradas como vehículos (nanovectores) de agentes terapéuticos.
Sumario de la invención
Los inventores descubrieron sorprendentemente que la inserción de al menos un resto cargado negativamente seleccionado de glutamato o aspartato en el dominio PAS mejora drásticamente las propiedades de la proteína de fusión HFt-MP-PAS como se muestra claramente a partir de los datos experimentales informados en los ejemplos y dibujos de la presente divulgación. En particular, los inventores descubrieron inesperadamente que la nueva construcción con la inserción de un resto cargado negativamente tal como el glutamato en el dominio PAS (HF-MP-PASE) supera tanto a la HFt nativa como a las proteínas HFt-MP-PAS en términos de cantidad de proteína recuperado al final de las reacciones de encapsulación del fármaco. Por otra parte, la nueva construcción HF-MP-PASE mostró una mayor acumulación del fármaco en los núcleos de las células, una mayor estabilidad en suero y una mayor acumulación tumoral en comparación con la HFt nativa y el HFt-MP-PAS. En consecuencia, un primer objeto de la presente invención es una proteína de fusión, que comprende al menos tres dominios, en donde:
(a) un primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la ferritina humana nativa, o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la ferritina humana nativa;
(b) un segundo dominio comprende la secuencia de aminoácidos de un sitio de escisión de metaloproteinasa de matriz (MMP); y
(c) un tercer dominio N-terminal consiste en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de al menos 20 restos de aminoácidos y que consiste esencialmente o consiste en prolina, serina, alanina y al menos un resto cargado negativamente seleccionado de glutamato o aspartato.
La presente invención proporciona también composiciones que comprenden los compuestos de la invención así como para usos específicos en aplicaciones terapéuticas. Este y otros objetos se logran a través de la proteína de fusión como se define en la reivindicación 1 adjunta. Las otras reivindicaciones independientes y las reivindicaciones dependientes se refieren a aspectos adicionales y realizaciones específicas de la invención, que forman parte integrante de la memoria descriptiva.
Los inventores, para mejorar y facilitar la unión del fármaco dentro de la cavidad de ferritina, decidieron retirar los restos de cisteína de la superficie de la proteína e introducir restos de cisteína adicionales en la cavidad de la proteína. De esta manera, fue posible unir a la cavidad interna cada molécula que contenía un motivo reactivo con tiol, por ejemplo, fármacos, enlazadores, fluoróforos, etc., de una manera muy eficaz (véanse los ejemplos y figuras).
En consecuencia, se desvela además en el presente documento una muteína de la ferritina humana nativa pesada en donde dicha muteína no tiene restos de cisteína en la superficie de la proteína y tiene al menos una cisteína en la cavidad interna de la proteína.
Además, los inventores, para mejorar y facilitar la unión de fármacos positivos dentro de la cavidad de ferritina, decidieron retirar los restos de cisteína de la superficie de la proteína e introducir restos cargados negativamente adicionales seleccionados de glutamato o aspartato, en la cavidad de la proteína. De esta manera, fue posible unir a la cavidad interna moléculas que contenían motivos cargados positivamente, por ejemplo, fármacos, enlazadores, fluoróforos, etc., de una manera muy eficaz (véanse los ejemplos y figuras).
En consecuencia, se desvela además en el presente documento una muteína de la ferritina humana nativa pesada en donde dicha muteína no tiene restos de cisteína en la superficie de la proteína y tiene al menos un resto de glutamato o de aspartato adicional en la cavidad interna de la proteína.
Se desvela además en el presente documento un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión o una nanopartícula de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento.
Se desvela además en el presente documento un vector que comprende dichos ácidos nucleicos y una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico o dicho vector.
Las características y ventajas adicionales de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que se proporciona solo con fines ilustrativos y no a modo de limitación, con referencia a los dibujos adjuntos, en donde:
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación esquemática de la fabricación de nanopartículas basadas en HFt, en donde el extremo N de cada uno de los 24 monómeros está unido genéticamente a secuencias peptídicas escindibles y a secuencias que consisten esencialmente en prolina, alanina, serina y glutamato (PASE).
La Figura 2 muestra los perfiles de migración de bandas de electroforesis en gel de agarosa nativa. Carril HFt-MP-PAS (15 |jg); Carril 2, HFt-MP-PASE (15 jg )
La Figura 3 es una representación esquemática de la síntesis de HFt-MP-PASE que contiene el fármaco mitoxantrona (MIT) o pixantrona (PIX). Para fines de claridad, solo se muestran 4 de los 24 extremos N de HFt modificados.
La Figura 4 muestra la capacidad de encapsular mitoxantrona o pixantrona por la construcción de HFt anterior (HFt-MP-PAS) en comparación con la de la novedosa proteína HFt-MP-PASE y con otros datos de la bibliografía. Los rendimientos relativos se indican en términos de % de recuperación de proteína y número de moléculas de fármaco unidas. Puede verse que la construcción objeto de esta patente sorprendente e inesperadamente tiene rendimientos superiores en términos de recuperación de proteínas en comparación tanto con la HFt nativa como con la HFt modificada (HFt-MP-PAS).
La Figura 5 muestra los perfiles de elución de filtración en gel (SEC) y la distribución del tamaño de partículas (DLS) de las construcciones basadas en HFt. (A) Análisis SEC de construcciones HFt-MP-PAS (negra) y HFt-MP-PASE (roja) cargadas con MIT. Perfiles de elución obtenidos siguiendo contribuciones simultáneas de proteína y MIT a 280 nm (sólido) y 610 nm (punteado), respectivamente. (B) Perfiles DLS de las mismas construcciones. La Figura 6 muestra la liberación de fármacos de los complejos HFt-MP-PASE-MIT. Los nanovehículos cargados con MIT se almacenaron a 4 °C y 37 °C en PBS y se analizó su contenido de mitoxantrona mediante SEC en momentos determinados. El porcentaje de pérdida de mitoxantrona se evaluó comparando los perfiles de elución recogidos simultáneamente a 280 nm y 610 nm.
La Figura 7 muestra la localización de HFt-MP-PASE-MIT (concentración de MIT 20 jM ) en líneas celulares de cáncer de colon SW480 (panel superior) y SW620 (panel inferior) después de 3 h de incubación. Paneles izquierdos: Tinción Lamin A/C (marcador de membrana nuclear, verde); paneles centrales: MIT (azul); paneles derechos: fusionar. La barra blanca indica una longitud de 10 jm .
La Figura 8 muestra la localización de MIT (paneles A, B), HFt-MP-PAS-MIT (paneles C, D) y HFt-MP-PASE-MIT (paneles E, F) en líneas celulares de cáncer de colon SW480 (paneles A, C y E) y SW620 (paneles B, D y F) después de 3 h de incubación. La concentración de MIT es de 20 jM en todos los experimentos. La barra blanca indica una longitud de 20 jm .
La Figura 9 muestra la eficacia de destrucción de MIT y HFt-MP-PASE-MIT frente a las líneas celulares humanas PaCa-44, Capan-1 y MiaPaCa2 (carcinoma pancreático), HT1080 (fibrosarcoma), MDA-MB-231 (cáncer de mama) y SW480 y SW620 (cáncer colorrectal). Media ± S.E.M. (n =3)
La Figura 10 muestra los resultados de los experimentos de biodistribución de compuestos que contienen doxorrubicina. Las concentraciones en plasma de doxorrubicina se calcularon 24 horas después de las inyecciones intravenosas en ratones que tenían un tumor pancreático humano (xenoinjertos) del fármaco puro doxorrubicina o de doxorrubicina encapsulada en los compuestos basados en ferritina: HFt nativa, HFt-MP-PAS y HFt-MP-PASE. La Figura 11 es una representación esquemática de la fabricación de nanopartículas basadas en HFt, en donde además de las modificaciones del extremo N mostradas anteriormente (HFt-MP-PAS), los restos de cisteína nativos se sustituyen con restos de serina y los restos de cisteína o glutamato no nativos (en esferas rojas) se incluyen en la cavidad interna (HFt-Cys-MP-PASE o HFt-Glu-MP-PASE).
La Figura 12 es una representación esquemática de la síntesis de HFt-Cys-MP-PASE o HFt-Glu-MP-PASE que contiene un fármaco reactivo con el grupo tiol de las cisteínas (por ejemplo, maleimida) o un fármaco que contiene un motivo positivo. Para fines de claridad, solo se muestran 4 de los 24 extremos N de HFt modificados. Los restos de cisteína no nativos en la cavidad interna de la proteína se muestran en rojo.
La Figura 13 muestra la capacidad de encapsular un derivado de 6-maleimidocaproil hidrazona de doxorrubicina (DOX-EMCH) o la combinación de ácido maleimido-propiónico y Genz-644282 por la nueva proteína HFt-Cys2-MP-PASE (que contiene 4 cisteínas no nativas por monómero, 96 por 24 unidades monoméricas) o la capacidad de encapsular mitoxantrona nativa o Genz-644282 por HFt-Glu-MP-PASE (que contiene 4 glutamatos no nativos por monómero, 96 por 24 unidades monoméricas). Los rendimientos relativos se indican en términos de % de recuperación de proteína y número de moléculas de fármaco conjugadas.
Descripción detallada de la invención
La proteína de fusión que es la materia objeto de la presente invención comprende al menos tres dominios.
El primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la ferritina humana. Dicha secuencia de aminoácidos es la secuencia nativa que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia. Dado que la cadena pesada de la ferritina humana tiene una longitud de 183 aminoácidos (SEQ ID NO: 1), una variante que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia contiene hasta 19 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa.
En una realización, la cadena pesada de la ferritina humana es una muteína en la que se retiran los restos de cisteína de la superficie de la proteína y se inserta al menos un resto de cisteína o negativo (aspartato o glutamato) en la cavidad interna de la proteína, preferentemente dos, tres o cuatro cisteínas o aspartato o glutamato se insertan en la cavidad interna de la proteína. Los restos de cisteína nativos de la superficie de la proteína se reemplazan por un resto sin un grupo reactivo tiol, preferentemente, la cisteína se reemplazará por una serina. La superficie proteica de la ferritina humana se define en el presente documento como cualquier resto expuesto al disolvente. La superficie proteica de la ferritina humana se define en el presente documento como cualquier resto no expuesto al disolvente. Por ejemplo, en una realización la cisteína se inserta en lugar de la Lisina 71, de la Lisina 143 y/o de la Glicina 182. En una realización preferida la cadena pesada de la ferritina humana es la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 de la variante HFt (HFt-Cys1) que carece de los restos de cisteína nativos y que contiene tres restos de cisteína no nativos en la cavidad interna, que representan una variante alternativa. La secuencia de aminoácidos de HFt-Cys1 se caracteriza por seis sustituciones de aminoácidos: Serina en lugar de Cisteína 90, Serina en lugar de Cisteína 102, Serina en lugar de Cisteína 130, Cisteína en lugar de Lisina 71, Cisteína en lugar de Lisina 143 y Cisteína en lugar de Glicina 182.
En una realización preferida, la cadena pesada de la ferritina humana carece de los restos de cisteína nativos y contiene cuatro restos de cisteína no nativos en la cavidad interna, que representan una variante alternativa (HFt-Cys2). La secuencia de aminoácidos de esta variante adicional se caracteriza por siete sustituciones de aminoácidos: Serina en lugar de Cisteína 90, Serina en lugar de Cisteína 102, Serina en lugar de Cisteína 130, Cisteína en lugar de Lisina 53, Cisteína en lugar de Lisina 71, Cisteína en lugar de Treonina 135 y Cisteína en lugar de Lisina 143.
En una realización preferida, la cadena pesada de la ferritina humana carece de los restos de cisteína nativos y contiene cuatro restos de glutamatos no nativos en la cavidad interna, que representan una variante alternativa (HFt-Glu). La secuencia de aminoácidos de esta variante adicional se caracteriza por siete sustituciones de aminoácidos: Serina en lugar de Cisteína 90, Serina en lugar de Cisteína 102, Serina en lugar de Cisteína 130, Glutamato en lugar de Lisina 53, Glutamato en lugar de Lisina 71, Glutamato en lugar de Treonina 135 y Glutamato en lugar de Lisina 143.
Todas las realizaciones desveladas en el presente documento de la cadena pesada de la ferritina humana pueden usarse como primer dominio en la proteína de fusión de acuerdo con la invención.
La secuencia de aminoácidos de la HFt nativa es (considerando que la primera Metionina es el comienzo de la región codificante y podría retirarse en el procesamiento posterior de la proteína):
(SEQ ID NO 1)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAATNRQTNLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALK-
NF AK YFLHQ SHEEREHAEKLMKLQN QRGGRIFLQDIKKPDCDD WES GLNAME-
C ALHLEKNVN Q SLLELHKL ATDKNDPHLCDFIETHYLNEQ V-KA1KELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES
En algunas realizaciones, la proteína de fusión HFt de la invención comprende una variante de HFt (HFt Cys1) que carece de los restos de cisteína nativos en la superficie externa y que contiene tres restos de cisteínas no nativos en la cavidad interna. En una realización, la secuencia de aminoácidos de la variante HFt Cys1 es:
(SEQ ID NO 2)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALK-
NF AKYFLEIQ SEtEEREEtAEKLMCLQNQRGGRIFLQDIK-
KPDSDDWESGLNAMESALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLSDFIETHYL-
NEQ V C AIKELGDH VTNLRKMGAPE S GL AE YLFDKHTLGD SDNEC
La secuencia de aminoácidos de la variante HFt Cys2 es:
(SEQ ID NO 15)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALK-
NF AC YFLHQ SHEEREHAEKLMCLQNQRGGRIFLQDIK-
KPDSDDWES GLN AME S ALHLEKN VN Q S LLELHKL ATDKNDPHL S D -
FIECHYLNEQVCAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES
En algunas realizaciones, la proteína de fusión HFt de la invención comprende una variante de HFt (HFt Glu) que carece de los restos de cisteína nativos en la superficie externa y que contiene cuatro restos de glutamatos no nativos en la cavidad interna. En una realización, la secuencia de aminoácidos de la variante HFt Glu es:
(SEQ ID NO: 18)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALK-
NF AEYFLHQ SHEEREHAEKLMELQN QRGGRIFLQDIK-
KPDSDDWESGLNAMESALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLSDFIEE-
HYLTsEQ VE AIKELGDHVTNLRKMGAPE S GL AEYLFDKHTLGD SDNE S
El segundo dominio de la proteína de fusión de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de al menos un sitio de escisión de metaloproteinasa de matriz (MMP), particularmente MMP 2, MMP 3, MMP 7 o MMP 9. Como un ejemplo no limitante, en lo sucesivo en el presente documento se listan algunos péptidos, que simulan la secuencia de escisión de la cadena de colágeno y se escinden de forma especialmente eficaz por MMP 2 y MMP 9:
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln (SEQ ID NO: 3)
Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln (SEQ ID NO: 4)
Pro Leu Gly Leu Ala Gly (SEQ ID NO: 5)
Pro Val Gly Leu Ile Gly (SEQ ID NO: 6)
Cys Gly Leu Asp Asp (SEQ ID NO: 7)
Las secuencias de aminoácidos que contienen el sitio de corte para la enzima deseada también pueden construirse de tal manera que el sitio de escisión se repita varias veces, tal como, por ejemplo, en la secuencia que se muestra a continuación:
Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln (SEQ ID NO: 8).
Todas las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente son ejemplos representativos, pero no limitantes, de fabricación de las proteínas de fusión y las nanopartículas de acuerdo con la presente invención.
El tercer dominio de la proteína de fusión de la invención, enlazado al extremo N, consiste esencialmente o consiste en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que es rico en prolina, serina, alanina y al menos un aminoácido negativo tales como glutamato o aspartato (denominado "PASE" en aras de la brevedad), con el objetivo de aumentar la estabilidad de la proteína durante el proceso de encapsulación del fármaco, especialmente con fármacos que pueden promover la agregación de proteína proteína, y de aumentar la estabilidad del complejo proteína-fármaco en comparación con el polipéptido que carece de los aminoácidos negativos (PAS).
El polipéptido PASE consiste esencialmente en secuencias de aminoácidos ricas en Pro, Ala y Ser, y al menos uno o más Glu y/o Asp que forman un polímero no estructurado cargado negativamente, cuya longitud es preferentemente menor de 80 restos de aminoácidos, más preferentemente comprendida entre 20 y 80 restos de aminoácidos, aún más preferentemente comprendida entre 30 y 70 restos de aminoácidos. En una realización preferida, los restos de prolina del polipéptido PASE mencionado anteriormente ascienden al 10-40 % del total de restos de aminoácidos del polipéptido PASE.
De acuerdo con una realización, el dominio PASE comprenderá uno, dos, tres o cuatro de glutamato y/o aspartato. En una realización preferida, el dominio PASE comprende no más de un glutamato o aspartato dentro de 15, 16, 17, 18, 19 o 20 restos del dominio PAS.
Los ejemplos de polipéptidos PASE particularmente adecuados para su uso dentro del alcance de la presente invención y, por lo tanto, preferidos, son los siguientes:
ASPAAPAPASPAAPAPSAPAEASPAAPAPASPAAPAPSAPAE (SEQ ID NO: 9);
ASPAAPAPASPAEPAPSAPAASPAAPAPASPAEPAPSAPA (SEQ ID NO: 10);
A SP A APAPA SP A AP APS APAEASP A AP APASPA AP APS APAEASP A AP APAS­
PA AP APS APAE ASPA APAPAS (SEQ ID NO: 11);
ASPAAPAPASPAAPAPSAPADASPAAPAPASPAAPAPSAPAD (SEQ ID NO: 12);
ASPAAPAPASPADPAPSAPAASPAAPAPASPADPAPSAPA (SEQ ID NO: 13);
A SP A APAPA SP A AP APS AP ADASPA APAPA SP A APAPSAPAD ASPA AP APAS­
PA AP APS APAD ASPA APAPAS (SEQ ID NO: 14);
Con la expresión "el polipéptido consiste esencialmente en secuencias de aminoácidos ricas en Pro, Ala y Ser" en la presente descripción se define un polipéptido que forma una conformación de espiral aleatoria estable que consiste en Pro, Ala y Ser en donde del 1 al 5 % de Pro, Los restos de Ala y Ser se reemplazan por otros aminoácidos, tales como, por ejemplo, glicina, que no alteran la conformación de espiral aleatoria estable del polipéptido. Como se ha mencionado anteriormente, los polipéptidos de espiral aleatoria biosintéticos (o segmentos polipeptídicos de espiral aleatoria) de esta invención que consisten únicamente en restos de prolina y alanina y al menos un resto de glutamato o aspartato y forman una conformación de espiral aleatoria estable. La expresión "espiral aleatoria" como se usa en este documento se refiere generalmente a cualquier conformación de una molécula polimérica, incluyendo polímeros de aminoácidos/secuencias de aminoácidos/polipéptidos, en la cual los elementos monoméricos individuales que forman dicha estructura polimérica están orientados esencialmente al azar hacia los elementos monoméricos adyacentes mientras siguen estando unidos químicamente a dichos elementos monoméricos adyacentes. En particular, un polipéptido, secuencia de aminoácidos o polímero de aminoácidos que adopta/tiene/forma una "conformación de espiral aleatoria" carece sustancialmente de una estructura secundaria y terciaria definida. La naturaleza de las espirales aleatorias polipeptídicas y sus métodos de identificación experimental son conocidos por el experto en la materia y se han descrito en la literatura científica (Cantor (1980) Biophysical Chemistry, 2a ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York; Creighton (1993) Proteins-Structures and Molecular Properties, 2a ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York; Smith (1996) Fold Des 1:R95 R106). El polipéptido PASE estabilizador y enmascarador se añade a la superficie de HFt a través de una secuencia peptídica corta que, como se mencionó anteriormente, contiene uno o más sitios de escisión de metaloproteinasas, de tal manera que proporcione a la proteína de fusión de la invención un enmascaramiento desplazable. De hecho, el polipéptido PASE puede retirarse selectivamente en los tejidos diana mediante metaloproteinasas de matriz extracelular (Mm P). Se demostró que MMP 2 y MMP 9 son metaloproteinasas clave que se sobreexpresan en el microambiente tumoral y están implicadas en la angiogénesis, invasión y metástasis tumoral.
También es otro objeto de la invención una proteína de fusión en donde el dominio PASE o PAS y los dominios escindibles de MMP están enlazados al extremo C de la proteína HFt en lugar del extremo N. De acuerdo con una realización, la proteína de fusión tiene la SEQ ID NO: 16 o la SEQ ID NO: 17.
PAS MP HFt (SEQ ID NO:16)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALK-
NF AK YFLHQ SHEEREH AEKLMKLQN QRGGRIFLQDIKKPDCDD WES GLNAME-
C ALHLEKNVN Q SLLELHKL ATDKNDPHLCDFIETHYLNEQ V -
KAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNESPLGLAGASPAAPA-
P ASP AAP AP S AP AASP AAP AP ASP AAP AP S AP A
PASE MP HFt (SEQ ID NO:17)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALK-
NFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAME-
C ALHLEKNVN Q SLLELHKL ATDKNDPHLCDFIETHYLNEQV -
KAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNESPLGLAGASPAAPA-
P ASP AEP APS AP AASP AAP AP ASP AEP APS APA
El uso de polipéptidos PASE en la superficie multimérica de ferritina dentro del alcance de la presente invención ofrece varias ventajas sobre la técnica anterior. Para obtener mayores rendimientos y materiales monodispersos durante la formación del complejo proteína-fármaco, los presentes inventores rediseñaron genéticamente la HFt MP PAS informada anteriormente añadiendo restos de glutamato (E) o aspartato (D) en la secuencia de PAS y obtuvieron una nueva construcción, llamada HFt MP PASE. Gracias a esta modificación, las proteínas basadas en ferritina podrían formar complejos con fármacos que pueden promover la agregación de proteínas (por ejemplo, mitoxantrona y pixantrona) de una manera más soluble y monodispersa que la HFt nativa o la contraparte de HFt Mp PAS modificada.
Esta mejora de la estabilidad de la encapsulación del complejo proteína-fármaco produce rendimientos diferentes a los de la doxorrubicina (por ejemplo, mitoxantrona y pixantrona), han sido sorprendente e inesperadamente logrados por el presente inventor, quien construyó nanopartículas basadas en la cadena pesada de la ferritina humana (HFt), usando tanto la tecnología de fusión de genes como la tecnología de producción de proteínas recombinantes. En particular, como se describirá en detalle en la sección relacionada con los ejemplos, se fabricaron construcciones genéticas, que, en una sola secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN), codifican las tres secuencias establecidas en la Figura 1: i) HFt; ii) secuencias peptídicas cortas (MP) escindibles por MMP 2/9; iii) secuencias polipeptídicas no estructuradas ricas en Pro, Ser, Ala y Glu (PASE) preferentemente con una longitud comprendida entre 20 y 80 restos. Las secuencias ii) y iii) están unidas al extremo N de HFt para un enmascaramiento reversible de las mismas.
Como ya se ha indicado anteriormente, las proteínas de fusión de HFt obtenidas por los presentes inventores forman espontáneamente nanopartículas de HFt capaces de transportar productos terapéuticos (compuestos químicos, anticuerpos monoclonales, péptidos, etc.) (Figura 2).
En una realización una o más, preferentemente 5, moléculas terapéuticas y/o de diagnóstico se encapsulan en la cavidad interna de la nanopartícula de HFt o se unen covalentemente a la superficie de la nanopartícula de HFt o se unen covalentemente en la cavidad interna de la HFt. La cantidad de fármaco unido y la homogeneidad del propio complejo de proteína y fármaco aumentan considerablemente en comparación con la proteína no modificada (HFt) o con la modificada con PAS (HFt MP PAS) gracias a la presencia de los polipéptidos PASE. La homogeneidad del material obtenido es una propiedad muy deseable en el campo farmacéutico, ya que indica la ausencia de efectos negativos, tales como precipitación, agrupamiento y pérdida del producto final que lleva la molécula terapéutica.
Una molécula terapéutica es, por ejemplo, un principio activo farmacéutico. Como se usa en el presente documento, la expresión "principio activo farmacéutico" o más sencillamente "principio activo" se refiere a cualquier molécula farmacéuticamente activa (compuesto químico, anticuerpo monoclonal, péptido, etc.), por ejemplo, una molécula que puede usarse para el tratamiento del cáncer. Los principios activos preferidos para su uso en la presente invención son, por ejemplo, sin limitación, doxorrubicina, mitoxantrona, pixantrona, Genz 644282, paclitaxel, auristatinas, camptotecinas, principios activos basados en gemcitabina y platino. También puede usarse un precursor de los principios activos enumerados anteriormente.
En aplicaciones terapéuticas, las nanopartículas de HFt de la presente invención, que actúan como sistemas vehículo dirigidos, pueden administrarse a un sujeto o paciente a través de cualquier vía de administración adecuada, por ejemplo, por vía oral, por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía intramuscular, como un supositorio, por vía intralesional, por vía intranasal o por vía subcutánea, por vía intratecal, por vía intralinfática, a través de la inhalación de microgotas o mediante el implante de un dispositivo de liberación lenta, por ejemplo, una bomba osmótica. Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a los animales, tales como mamíferos, incluyendo seres humanos, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones y similares.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar" o "tratamiento" se refiere a la evidencia de éxito o mejora en el tratamiento de una determinada enfermedad, lesión, afección o síntoma o, en determinadas circunstancias, la prevención de la aparición de un síntoma o afección.
En aplicaciones terapéuticas, las nanopartículas de HFt de la invención se usan para la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de un principio activo farmacéutico. Se pretende que "dosis terapéuticamente eficaz" signifique una dosis que produce el efecto terapéutico para el que se administra. La dosis exacta dependerá de numerosos factores, incluyendo el objetivo del tratamiento, el sujeto, de la enfermedad que se vaya a tratar, etc. y puede determinarse fácilmente por un experto en la materia mediante el uso de metodologías conocidas en sí mismas (véanse, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1 3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
Las nanopartículas de HFt de la invención pueden usarse para el tratamiento de cualquier enfermedad que requiera la administración de un principio farmacéutico, por ejemplo, secuestrando el principio activo dentro de la cavidad de la nanopartícula o uniéndolo covalentemente a la superficie de la nanopartícula. Las nanopartículas también pueden usarse para el diagnóstico, más particularmente para la formación de imágenes de enfermedades, secuestrando un agente de formación de imágenes dentro de la cavidad de la nanopartícula o uniéndolo covalentemente a la superficie de la nanopartícula.
La nanopartícula de HFt de la presente invención puede administrarse a un sujeto para el tratamiento de cualquier enfermedad, preferentemente una enfermedad hiperproliferativa, incluyendo cáncer, por ejemplo: carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, sarcomas, linternas, leucemias, adenocarcinomas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, glioblastoma, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, linfoma de Burkitt, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer hepatobiliar, cáncer de vejiga, cáncer de intestino delgado, cáncer rectal, cáncer de riñón, cáncer de vesícula biliar, cáncer de pene, cáncer de uretra, cáncer testicular, cáncer de cuello del útero, cáncer vaginal, cáncer uterino, cáncer de tiroides, cáncer paratiroideo, cáncer suprarrenal, cáncer de páncreas endocrino, tumor carcinoide, cáncer de huesos, cáncer de piel, retinoblastomas, mieloma múltiple, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (véase CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V. T. et al. Edición de 2008) para otros tipos de cáncer).
De acuerdo con una realización, las nanopartículas de HFt se unen a cada molécula que contiene un motivo reactivo con tiol, por ejemplo, fármacos, enlazadores, fluoróforos, etc. usando, por ejemplo, una o más cisteínas insertadas en la cavidad interna. De acuerdo con una realización preferida, la nanopartícula de HFt encapsula un derivado de 6 maleimidocaproil hidrazona de doxorrubicina (DOX EMCH) o el enlazador ácido maleimido propiónico y el fármaco Genz 644282 usando una o más cisteínas insertadas en la cavidad interna.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no como una limitación del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Construcción de vectores de expresión para proteínas de fusión HFt-MP-PASE
Como un intento de reducir la agregación de proteínas y aumentar la estabilidad, se decidió introducir restos cargados negativamente en el escudo exterior formando una secuencia PAS fusionada a cada subunidad HFt. De hecho, el análisis de la construcción HFt-MP-PAS previamente obtenida sugirió que la introducción de dos restos de glutamato en una secuencia PAS de 40 restos provocaría suficiente repulsión electrostática para evitar la agregación entre diferentes ensamblajes 24 méricos, sin afectar el ensamblaje de subunidades dentro de las 24 unidades monoméricas. Para distribuir las cargas negativas en la superficie de la construcción tanto como sea posible, los restos de ácido glutámico se colocaron a una distancia de 20 restos.
El gen HFt-MP-PASE se logró combinando tres secuencias diferentes en una sola secuencia: HFt (SEQ ID NO: 1), MP (SEQ ID NO: 5) y PASE (SEQ ID NO: 10). Esta construcción difiere de la construcción HFt-MP-PAS desvelada anteriormente (denominada anteriormente HFt MMP PAS40; documento WO2016051340) solo para dos sustituciones de aminoácidos en la secuencia PAS: Glutamato en lugar de Alanina 13 y Glutamato en lugar de Alanina 33. Todos los experimentos comparativos descritos en esta novedosa patente se realizaron usando estas dos construcciones.
El vector de expresión pET 11a que contiene el gen HFt-MP-PASE se sintetizó usando GENEART AG (Germania). La síntesis de genes se llevó a cabo teniendo en cuenta la optimización de codones para altos niveles de expresión en Escherichia coli.
Se obtuvo la proteína de fusión HFt MP PASE a través de tecnología de proteína recombinante y se purificó a partir de la fracción soluble celular con alto rendimiento, similar a HFt-MP-PAS (aproximadamente 150 mg por litro de cultivo celular de E. coli). El efecto sobre la movilidad de la proteína de los restos de glutamato cargados negativamente (48 por proteína) insertados en la superficie de la proteína se evaluó realizando electroforesis en gel de agarosa en condiciones nativas (Figura 1). En variación con la SDS PAGE desnaturalizante, en la electroforesis nativa la movilidad de las proteínas depende tanto de la carga de la proteína como de la masa molecular. Suponiendo que este último sea comparable para HFt MP PAS y HFt MP PASE, la diferencia observada en la movilidad de la proteína debe atribuirse a las cargas negativas adicionales en la construcción HFt-MP-PASE (Figura 2).
Ejemplo 2
Preparación de HFt-MP-PAS y HFt-MP-PASE que llevan fármacos quimioterapéuticos
Como agentes quimioterapéuticos, el inventor informó de un ejemplo en el cual se usaron los fármacos mitoxantrona (MIT) o pixantrona (PIX). Estos fármacos se encapsularon dentro de la cavidad proteica de las proteínas de fusión aprovechando el proceso de desacoplamiento acoplamiento de proteínas en función del pH de acuerdo con el protocolo descrito en Falvo et al., 2016, Biomacromolecules. 17(2):514 22. El procedimiento de ensamblaje/reensamblaje se muestra en la Figura 3.
Ejemplo 3
Prueba de los rendimientos de encapsulación de los fármacos mitoxantrona y pixantrona
La eficiencia de la encapsulación MIT o PIX en HFt-MP-PASE se comparó con la de la HFt nativa y en la HFt MP PAS (Figura 4). En todos los experimentos realizados, HFt-MP-PASE supera a las proteínas HFt nativa y HFt-MP-PAS en términos de la cantidad de proteína recuperada al final de las reacciones. Esto indica que HFt-MP-PASE es más estable y no se agrega/precipita fuera de la solución durante la formación del complejo proteína-fármaco.
Ejemplo 4
Prueba de homogeneidad y estabilidad del complejo proteico mitoxantrona
El complejo HFt-MP-PASE cargado con MIT era más soluble y monodisperso que las contrapartes HFt-MP-PAS, sin mostrar especies de mayor peso molecular en solución (Figura 5). Los experimentos de dispersión de luz dinámica (DLS) indicaron que las muestras de HFt-MP-PASE-MIT tienen aproximadamente el mismo tamaño que nuestro HFt-MP-PAS-DOX informado anteriormente (que contiene doxorrubicina como fármaco), con un diámetro medio de 17,0 ± 1,1 nm (Figura 5B). Estos resultados indican que la inserción de los restos de glutamato en HFt-MP-PASE-MIT sorprendentemente conduce a una solubilidad y homogeneidad de la proteína mucho más alta en comparación con la contraparte de HFt-MP-PAS, probablemente previniendo las interacciones de proteínas mediadas por MIT en solución. Además, el número ligeramente mayor de moléculas MIT por 24 unidades monoméricas observado para HFt-MP-PAS en comparación con HFt-MP-PASE (55,0 frente a 49,0) probablemente se puede atribuir a la presencia de moléculas MIT en la superficie de la construcción anterior que pueden promover agregación de proteínas proteicas.
La estabilidad de los complejos HFt-MP-PASE-MIT se probó almacenando las soluciones durante 2 meses en PBS a 4 °C o 37 °C y evaluando su contenido de MIT mediante análisis de cromatografía de tamaño (SEC) cada 7 días. HFt-MP-PASE-MIT mostró una excelente estabilidad, con menos del 10 % de MIT liberada después de 2 meses de almacenamiento a 4 °C (Figura 6) y sin signos de turbidez o precipitación.
Ejemplo 5
Pruebas de internalización celular y localización de nanovehículos basados en HFt
Para determinar si las construcciones basadas en HFt que contienen MIT se someten a la unión y/o internalización de la superficie celular, se incubaron con células de cáncer de colon SW480 y SW620 a 37 °C durante 1 o 3 h y se visualizó la fluorescencia asociada a MIT mediante microscopía confocal. La Figura 7 muestra la localización de HFt MP PASE MIT en las líneas celulares SW480 (panel superior) y SW620 (panel inferior). Después de incubaciones de 3 horas, HFt-MP-PASE-MIT se acumula masivamente en los núcleos de ambas líneas celulares, como se muestra mediante la tinción con el marcador de membrana nuclear Lamin A/C (en verde). En particular, MIT se localiza en estructuras intranucleares que se supone que son nucléolos en función del tamaño, posición y forma, como se propuso previamente para el carcinoma de colon y las células de cáncer de mama.
Una comparación entre células tratadas con MIT libre, HFt-MP-PAS-MIT o HFt-MP-PASE MIT se muestra en la Figura 8. En todos los casos, la MIT se localiza dentro de los núcleos celulares, pero en el caso de MIT libre y HFt-MP-PAS-MIT, el fármaco también está parcialmente presente en el citoplasma. En general, las células tratadas con HFt-MP-PASE-MIT mostraron la mayor acumulación de MIT en los núcleos.
Ejemplo 6
Efectos antiproliferativos de HFt MP PASE MIT in vitro
Para evaluar la capacidad de HFt-MP-PASE cargado con MIT para destruir células cancerosas in vitro, los presentes inventores han realizado ensayos de viabilidad XTT en una amplia gama de células cancerosas humanas de diferente origen: células de fibrosarcoma HT1080; cáncer mama triple negativo MDA MB 231; pancreático PaCa 44, Capan 1 y MiaPaCa2; colorrectal SW480 y SW620.
No solo MIT conservó su actividad farmacológica después de la encapsulación en construcciones HFt MP PASE, sino que el nanovehículo cargado con MIT mostró valores de CI50 similares a los de la MIT desnuda en todas las líneas celulares probadas, e incluso inferiores en algunos casos (véase la Figura 9). Esto es notable porque los fármacos desnudos pueden difundirse libremente en las células, mientras que las construcciones HFt-MP-PASE solo pueden administrar MIT al someterse a una captación mediada por un receptor limitante de la velocidad. Por otra parte, el nuevo nanosistema HFt-MP-PASE-MIT mostró, en las líneas celulares pancreáticas, una eficacia de destrucción aproximadamente diez veces superior a la del fármaco Gemcitabina utilizado actualmente (es decir, 0,43 frente a 6,75 pM, 0,10 frente a 2,8 pM y 0,07 frente a 1,15 pM, para células Paca44, Capan 1 y MiaPaCa2 respectivamente).
Ejemplo 7
Experimentos de biodistribución de compuestos que contienen doxorrubicina en ratones
Para comparar cómo HFt-MP-PASE se compara con HFt-MP-PAS en términos de acumulación de fármacos en tumores y órganos, ambas proteínas de fusión se encapsularon con un fármaco. Como fármaco se eligió la doxorrubicina (DOX) ya que ambas proteínas de fusión tienen una capacidad similar para encapsularla, en contraste con el fármaco mitoxantrona. Las concentraciones en plasma de Dox se calcularon 24 horas después de las inyecciones intravenosas en ratones que tenían un tumor pancreático humano (xenoinjertos) del fármaco desnudo Dox o de doxorrubicina encapsulada en los compuestos basados en ferritina: HFt nativa, HFt-MP-PAS y HFt-MP-PASE. La Figura 10 muestra que HFt-MP-PASE tiene la mayor estabilidad en el suero y también la mayor acumulación de tumores.
Ejemplo 8
Construcción de vectores de expresión para proteínas de fusión HFt-MP-PASE-Cys o Glu
Como un intento de mejorar y facilitar la unión del fármaco dentro de la cavidad de ferritina, se decidió retirar los restos de cisteína de la superficie de la proteína e introducir restos de cisteína o glutamato adicionales en la cavidad de la proteína. De esta manera, sería posible unir a la cavidad interna cada molécula que contenga un tiol reactivo o un motivo cargado positivamente, por ejemplo, fármacos, enlazadores, fluoróforos, etc. Las Figuras 11 y 12 son representaciones esquemáticas de la fabricación y síntesis de nanopartículas basadas en HFt, en donde además de las modificaciones del extremo N mostradas anteriormente (HFt-MP-PAS), los restos de cisteína nativos se sustituyen con restos de serina y los restos de cisteína o glutamato no nativos (en esferas rojas) se incluyen en la cavidad interna (HFt-Cys-MP-PASE o HFt-Glu MP PASE). La Figura 13 muestra la capacidad de encapsular un derivado de 6 maleimidocaproil hidrazona de doxorrubicina (DOX EMCH) mediante la nueva proteína HFt-Cys2-MP-PASE (que contiene 4 cisteínas no nativas por monómero, 96 por 24 unidades monoméricas). En la misma figura se muestra también la capacidad de la HFt-Cys-MP-PASE para encapsular el enlazador ácido maleimido propiónico y el fármaco Genz 644282. En la misma figura se muestra también la capacidad de la HFt-Glu-MP-PASE para encapsular los fármacos libres mitoxantrona o Genz 644282. Todos estos fármacos se encapsularon dentro de la cavidad proteica de las proteínas de fusión aprovechando el proceso de desacoplamiento acoplamiento de proteínas en función del pH de acuerdo con el protocolo descrito en Falvo et al., 2016, Biomacromolecules. 17(2):51422, con una modificación. En las reacciones que usan moléculas que contienen maleimida, estos se añadieron a pH 6,57,5 después de la etapa de pH ácido para evitar posibles daños en las moléculas debido a los bajos valores de pH. Además, en la reacción usando el enlazador ácido propiónico maleimido y el fármaco Genz 644282, el primero se añadió antes que el fármaco en una relación enlazador/tiol de 1,2:1.
Los rendimientos relativos se indican en términos de % de recuperación de proteína y número de moléculas de fármaco conjugadas.
Ejemplo 9
Efectos antiproliferativos de HFt-Glu-MP-PASE Genz 644282 in vitro
Para probar la proliferación, se sembraron células de sarcoma humano (HT 1080 y A204), cáncer de mama humano (MDA MB 231), melanoma humano (Colo38) y cáncer de páncreas humano (PaCa44 y MiaPaCa2) en 15 placas de 96 pocillos a aproximadamente 5 x 103/pocillo en 200 pl de medio completo a 37 °C. El día siguiente, los pocillos recibieron Genz 644282 o HFt Glu MP PASE Genz 644282, por triplicado, a diferentes concentraciones en Genz 644282 y las células se cultivaron durante 72 horas. Durante las últimas 4 horas en cultivo, la viabilidad celular se evaluó mediante la reducción de bromuro de 3 (4,5 dimetiltiozol 2 il) 2,5 difeniltetrazolio (MTT). Se añadió un total de 1 mg/ml de MTT en cada pocillo y las muestras se incubaron durante 30 min a 37 °C. Después del lavado, los cristales de formazán se disolvieron en 100 pl de dimetilsulfóxido. Se midió la absorbancia a 550 nm.
Los efectos antiproliferativos de HFt Glu MP PASE Genz 644282 para las células cancerosas cultivadas se muestran en la Figura 14. Los resultados indican que HFt Glu MP PASE Genz 644282 inhibe eficazmente las células cancerosas cultivadas in vitro en forma dependiente de la concentración, con valores de CI50 idénticos o incluso más bajos en comparación con el fármaco desnudo. Estos resultados son de gran importancia a la luz de las posibles aplicaciones terapéuticas. También se han obtenido los mismos resultados usando la construcción HFt-Cys-MP-PASE Genz 644282.
Efectos antiproliferativos de HFt-Glu-MP-PASE Genz 644282 in vivo
Ratones desnudos CD1 hembra de cinco semanas de edad (Charles River Laboratories, Lecco, Italia) se inyectaron por vía subcutánea (es decir, flanco derecho) con 4x106 células PaCa-44 resuspendidas en 200 pl de medio RPMI 1640 más BSA al 1 %. Cuando los tumores habían alcanzado un volumen de aproximadamente 100 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos de seis animales y se inyectaron i.v. con 200 pl de solución salina fisiológica, Genz-644282 (1,9 mg/kg) o HFt-Glu-MP-PASE-Genz (0,95 o 1,9 mg/kg). Los ratones se inyectaron dos veces por semana durante tres semanas; el volumen del tumor se midió dos veces por semana con un calibrador digital y se controló el peso del ratón. Cuando el tumor de los ratones había alcanzado un volumen >1500 mm3, se sacrificaron los animales. En la

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de fusión que comprende al menos tres dominios, en donde:
(a) un primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la ferritina humana nativa o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la ferritina humana nativa;
(b) un segundo dominio comprende la secuencia de aminoácidos de un sitio de escisión de metaloproteinasa de matriz (MMP); y
(c) un tercer dominio N terminal consiste en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de al menos 20 restos de aminoácidos y que consiste esencialmente o consiste en prolina, serina y alanina y al menos un resto cargado negativamente seleccionado de glutamato o aspartato (PASE), en donde dicho tercer dominio N terminal consiste solamente en restos de prolina, serina y alanina y al menos un resto de glutamato o aspartato y forma una conformación de espiral aleatoria estable o en donde dicho dominio N-terminal es un polipéptido que consiste esencialmente en secuencias de aminoácidos ricas en Pro, Ala y Ser y al menos un resto de glutamato o aspartato y forma una espiral aleatoria estable, en donde el polipéptido consiste esencialmente en se define como un polipéptido que forma una conformación de espiral aleatoria estable que consiste en Pro, Ala y Ser en donde del 1 al 5 % de los restos de Pro, Ala y Ser se reemplazan por otros aminoácidos.
2. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho tercer dominio N terminal (PASE) tiene una longitud de menos de 80 restos de aminoácidos, preferentemente comprendida entre 20 y 80 restos de aminoácidos, más preferentemente comprendida entre 40 y 75 restos de aminoácidos.
3. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de ferritina humana nativa de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de aminoácidos de la variante de cadena pesada de ferritina humana de SEQ ID NO: 2 o una variante de la ferritina humana pesada sin restos de cisteína en la superficie de la proteína y con al menos una cisteína o aspartato o glutamato en la cavidad interna de la proteína, preferentemente con dos, tres o cuatro cisteínas o aspartato o glutamato en la cavidad interna.
4. La proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el segundo dominio comprende la secuencia de aminoácidos de un sitio de escisión de metaloproteinasa de matriz (MMP) seleccionado del grupo que consiste en MMP 2, MMP 3, MMP 7 y MMP 9, en particular en donde la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión de la metaloproteinasa de matriz (MMP) se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.
5. La proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho tercer dominio N terminal (PASE) comprende no más de un glutamato o aspartato dentro de 15 a 20 restos del dominio PASE, preferentemente no más de un glutamato o aspartato dentro de los 20 restos del dominio PASE.
6. La proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los restos de prolina de dicho polipéptido del tercer dominio N terminal (PASE) ascienden al 10-40 % del total de restos de aminoácidos del mismo.
7. La proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho polipéptido del tercer dominio N terminal (PASE) se selecciona de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14.
8. La proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una primera y/o segunda secuencia o secuencias de aminoácidos enlazadores que unen respectivamente el primer dominio al segundo dominio y/o el segundo dominio al tercer dominio, en donde la primera y la segunda secuencia de aminoácidos son iguales o diferentes entre sí.
9. La proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que está enlazada a un principio activo y/o agente de formación de imágenes.
10. La proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la cadena pesada de la variante de ferritina humana tiene SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 15 o SEQ ID NO 18.
11. Una nanopartícula que comprende una pluralidad de monómeros de una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, preferentemente 24 monómeros.
12. Una nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 11, en donde un principio activo seleccionado de doxorrubicina, mitoxantrona, pixantrona, Genz 644282, paclitaxel, auristatinas, camptotecinas, gemcitabina y basado en platino está enlazado o encapsulado en dicha nanopartícula.
13. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, una nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en combinación con al menos un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
14. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso como un medicamento, en particular para su uso en el tratamiento terapéutico y/o diagnóstico de un tumor.
ES18797162T 2017-11-06 2018-11-05 Proteínas de fusión basadas en ferritina humana y péptidos escindibles por proteasas y su uso como vehículos quimioterapéuticos Active ES2923152T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT201700116184 2017-11-06
PCT/IB2018/058655 WO2019087155A1 (en) 2017-11-06 2018-11-05 Fusion-proteins based on human ferritin and protease-cleavable peptides and their use as chemotherapeutics carriers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2923152T3 true ES2923152T3 (es) 2022-09-23

Family

ID=61581399

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18797162T Active ES2923152T3 (es) 2017-11-06 2018-11-05 Proteínas de fusión basadas en ferritina humana y péptidos escindibles por proteasas y su uso como vehículos quimioterapéuticos

Country Status (11)

Country Link
US (1) US11987604B2 (es)
EP (1) EP3707261B1 (es)
JP (1) JP7297745B2 (es)
CN (1) CN111328346B (es)
CA (1) CA3082076A1 (es)
DK (1) DK3707261T3 (es)
EA (1) EA202090897A1 (es)
ES (1) ES2923152T3 (es)
PL (1) PL3707261T3 (es)
PT (1) PT3707261T (es)
WO (1) WO2019087155A1 (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2741782B1 (en) * 2011-08-12 2020-05-06 Ascendis Pharma A/S Protein carrier-linked prodrugs
CA3082076A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Thena Biotech S.r.l. Fusion-proteins based on human ferritin and protease-cleavable peptides and their use as chemotherapeutics carriers
WO2021008454A1 (zh) * 2019-07-12 2021-01-21 昆山新蕴达生物科技有限公司 基于铁蛋白重链亚基的药物载体
WO2022179536A1 (zh) * 2021-02-25 2022-09-01 昆山新蕴达生物科技有限公司 铁蛋白重链亚基突变体及其应用
CN115137839A (zh) * 2021-03-30 2022-10-04 南京纳么美科技有限公司 靶向-共装载亲/疏水药物的铁蛋白笼纳米载体及其应用
CN113476588B (zh) * 2021-07-06 2022-11-22 武汉大学 靶向乳腺癌的多功能纳米颗粒、其制备方法及其应用
CN114230671B (zh) * 2021-11-18 2023-12-01 中国科学院武汉病毒研究所 寨卡病毒重组蛋白疫苗及其制备方法
CN116410333A (zh) * 2021-12-31 2023-07-11 四川大学 一类促凋亡铁蛋白纳米粒和应用
CN114292834B (zh) * 2022-03-09 2022-05-31 天津辅元生物医药科技有限公司 一种融合蛋白酶及其制备方法、其在提取i型胶原蛋白中的应用以及该i型胶原蛋白的用途
CN115181733B (zh) * 2022-05-26 2023-11-21 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 相对定量分析猪铁蛋白重链fth1的肽段组合物及应用
CN114886873B (zh) * 2022-06-15 2023-03-24 南京林业大学 一种负载sn-38的铁蛋白纳米粒及其制备方法和应用
WO2024110757A1 (en) * 2022-11-24 2024-05-30 King's College London Control of nanocage self-assembly

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7550263B2 (en) * 2003-09-05 2009-06-23 Gtc Biotherapeutics, Inc. Method for the production of fusion proteins in transgenic mammal milk
NZ580670A (en) * 2007-06-21 2011-09-30 Univ Muenchen Tech Biological active proteins having increased in vivo and/or vitro stability
KR20150043505A (ko) 2012-09-07 2015-04-22 사노피 대사 증후군의 치료용 융합 단백질
RU2714155C2 (ru) 2014-09-30 2020-02-12 Тена Байотек С.Р.Л. Слитый белок, наночастица, состоящая из множества мономеров указанного слитого белка, и их применение
CA3082076A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Thena Biotech S.r.l. Fusion-proteins based on human ferritin and protease-cleavable peptides and their use as chemotherapeutics carriers

Also Published As

Publication number Publication date
EP3707261A1 (en) 2020-09-16
DK3707261T3 (da) 2022-07-11
CA3082076A1 (en) 2019-05-09
PT3707261T (pt) 2022-07-13
JP7297745B2 (ja) 2023-06-26
CN111328346A (zh) 2020-06-23
US20210403515A1 (en) 2021-12-30
US11987604B2 (en) 2024-05-21
WO2019087155A1 (en) 2019-05-09
JP2021509104A (ja) 2021-03-18
EP3707261B1 (en) 2022-05-04
CN111328346B (zh) 2023-06-23
PL3707261T3 (pl) 2022-09-12
EA202090897A1 (ru) 2020-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2923152T3 (es) Proteínas de fusión basadas en ferritina humana y péptidos escindibles por proteasas y su uso como vehículos quimioterapéuticos
He et al. Ferritin drug carrier (FDC) for tumor targeting therapy
Zhao et al. Amphiphilic self-assembly peptides: Rational strategies to design and delivery for drugs in biomedical applications
ES2665218T3 (es) Una proteína de fusión, una nanopartícula compuesta por una pluralidad de monómeros de dicha proteína de fusión y usos de la misma
US20140294967A1 (en) Stable nanocomposition comprising paclitaxel, process for the preparation thereof, its use and pharmaceutical compositions containing it
AU2018342909B2 (en) Castration resistant prostate cancer
ES2507508T3 (es) Terapia anticancerígena enzimática
Pooja et al. Dendrimer-drug conjugates: Synthesis strategies, stability and application in anticancer drug delivery
US9326950B2 (en) Self-assembling nanoparticles composed of transmembrane peptides and their application for specific intra-tumor delivery of anti-cancer drugs
KR102436012B1 (ko) 항암제 프로드러그 컨쥬게이트의 새로운 용도
PT1295611E (pt) Preparações para transferência de oligonucleótidos
Zhao et al. A robust protein-peptide co-assembling nanoformulation (PePCAN) platform with significant cell-entry characteristics for targeted cancer therapy
US7368431B2 (en) Polypeptide, the conjugate thereof with doxorubicine and a pharmaceutical composition based thereon
EA044061B1 (ru) Новые слитые белки на основе ферритина человека и расщепляемых протеазой пептидов и их применение в качестве носителей химотерапевтических средств
WO2023043291A1 (ko) 신규 단백질 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
Yang et al. Peptide-Based Bioconjugates and Therapeutics for Targeted Anticancer Therapy. Pharmaceutics 2022, 14, 1378
Klippstein et al. Engineered nanoparticles for improved vasoactive intestinal peptide (VIP) biomedical applications
Heydarian Drug Nanocarriers as a Potential Therapeutic Strategy in Glioblastoma Multiforme
WO2024043836A1 (en) Gastrointestinal tract stabilized protein delivery using disulfide tes system
TW202018080A (zh) Rna奈米結構，其製備方法和用途