EA044061B1 - Новые слитые белки на основе ферритина человека и расщепляемых протеазой пептидов и их применение в качестве носителей химотерапевтических средств - Google Patents
Новые слитые белки на основе ферритина человека и расщепляемых протеазой пептидов и их применение в качестве носителей химотерапевтических средств Download PDFInfo
- Publication number
- EA044061B1 EA044061B1 EA202090897 EA044061B1 EA 044061 B1 EA044061 B1 EA 044061B1 EA 202090897 EA202090897 EA 202090897 EA 044061 B1 EA044061 B1 EA 044061B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- hft
- seq
- amino acid
- pase
- fusion protein
- Prior art date
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 44
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 29
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 title claims description 18
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 title claims description 18
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 title claims description 18
- 239000000969 carrier Substances 0.000 title description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 title 1
- HBTBNXFVJYRYGI-UHFFFAOYSA-M hexadecane-1-sulfinate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCS([O-])=O HBTBNXFVJYRYGI-UHFFFAOYSA-M 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 51
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 50
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 claims description 45
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims description 44
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 44
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 36
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 30
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 26
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 24
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 21
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 21
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 claims description 21
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 21
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 19
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 claims description 19
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 claims description 19
- BAORCAMWLWRZQG-UHFFFAOYSA-N genz 644282 Chemical compound COC1=C(OC)C=C2C(=O)N(CCNC)C3=C(C=C4C(OCO4)=C4)C4=NC=C3C2=C1 BAORCAMWLWRZQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 16
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 101001002987 Homo sapiens Ferritin heavy chain Proteins 0.000 claims description 14
- 102000054087 human FTH1 Human genes 0.000 claims description 14
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 12
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims description 12
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 11
- PEZPMAYDXJQYRV-UHFFFAOYSA-N pixantrone Chemical compound O=C1C2=CN=CC=C2C(=O)C2=C1C(NCCN)=CC=C2NCCN PEZPMAYDXJQYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960004403 pixantrone Drugs 0.000 claims description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 102000000424 Matrix Metalloproteinase 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 108010016165 Matrix Metalloproteinase 2 Proteins 0.000 claims description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical class N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 claims description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 claims description 3
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 claims description 3
- 150000002306 glutamic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- -1 linker amino acid Chemical group 0.000 claims description 3
- 102000004318 Matrilysin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000422 Matrix Metalloproteinase 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010016160 Matrix Metalloproteinase 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 61
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 58
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 5
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 5
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 4
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 4
- 102000002131 PAS domains Human genes 0.000 description 4
- 108050009469 PAS domains Proteins 0.000 description 4
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- HFPVRZWORNJRRC-UWVGGRQHSA-N Gly-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN HFPVRZWORNJRRC-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 3
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 108010075016 Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 101001003584 Homo sapiens Prelamin-A/C Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026531 Prelamin-A/C Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- YBMRDBCBODYGJE-UHFFFAOYSA-N germanium dioxide Chemical compound O=[Ge]=O YBMRDBCBODYGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- MDNSLPICAWKNAG-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)N1C(=O)C=CC1=O MDNSLPICAWKNAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100026802 72 kDa type IV collagenase Human genes 0.000 description 1
- 101710151806 72 kDa type IV collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010007275 Carcinoid tumour Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- LBOLGUYQEPZSKM-YUMQZZPRSA-N Cys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N LBOLGUYQEPZSKM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 206010073073 Hepatobiliary cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000952234 Homo sapiens Sphingolipid delta(4)-desaturase DES1 Proteins 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 208000029725 Metabolic bone disease Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010049088 Osteopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N Pro-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100037416 Sphingolipid delta(4)-desaturase DES1 Human genes 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UYKREHOKELZSPB-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 108010071673 magnetoferritin Proteins 0.000 description 1
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004942 nuclear accumulation Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108700042769 prolyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000036326 tumor accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046885 vaginal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013139 vaginal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Description
Область техники изобретения
Настоящее изобретение относится к слитому белку, к наночастицам, состоящим из множества мономеров указанного слитого белка, к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанный слитый белок, и к их диагностическим и терапевтическим применениям. Настоящее изобретение относится к слитому белку, к наночастице, состоящей из множества мономеров указанного слитого белка, и к их применению. Описан слитый белок на основе тяжелой цепи ферритина человека, который содержит на N-конце белка по меньшей мере одну последовательность расщепления металлопротеиназы и модифицированный полипептид PAS, действующий в качестве маскирующего полимера, который повышает стабильность комплекса белок-лекарственное средство, а также наночастица, состоящая из нескольких мономеров указанного слитого белка, нуклеиновая кислота, кодирующая указанный слитый белок, и их диагностические и терапевтические применения.
Уровень техники
Селективное высвобождение терапевтических средств в пораженных областях является одной из самых важных задач по улучшению современных способов лечения, особенно в противоопухолевой терапии. В данном контексте применение наночастиц в качестве носителей (нановекторов) терапевтических средств потенциально обеспечивает возможность как обойти биологические барьеры, которые могут присутствовать на пути от места введения до конечной цели, так и, в частности, обеспечить накопление лекарственного средства селективным образом в пораженной области, а не в нормальных тканях. Основополагающим предварительным условием служит способность нановектора связывать большие количества лекарственного средства эффективным образом.
Среди известных носителей для целевого высвобождения лекарственного средства наночастицы на основе ферритинов (ferritins (Fts)) привлекают все большее внимание благодаря их исключительным характеристикам биосовместимости, способности проникать сквозь биологические барьеры, универсальности функционализируемости и возможности связывать определенные виды лекарственных средств. Fts представляют собой высоко симметричные мультимерные белковые структуры, состоящие из 24 субъединиц, которые собираются в молекулярную структуру по существу со сферической оболочкой, окружающей полость, которая физиологически используется для хранения железа. Наружный диаметр и внутренний диаметр составляют 12 и 8 нм, соответственно. Такая молекулярная структура по типу оболочки обозначается далее как наночастица или HFt-наночастица. Наночастицы на основе тяжелой цепи ферритина человека (heavy chain of human ferritin, HFt) демонстрируют ряд преимуществ по сравнению с другими системами высвобождения лекарственных средств, особенно в связи с применениями in vivo у человека. Фактически, молекулы HFt предназначены для прохождения сквозь биологические барьеры (с диаметром отсечения (minor diameter) 20 нм), и в физиологических условиях они присутствуют как в клетках, так и в крови, хотя и в низких концентрациях (приблизительно 20 мкг/л).
Являясь природными элементами, они с меньшей вероятностью могут вызывать сильный неаутоиммунный (в ответ на внешние факторы) гуморальный и/или Т-клеточный иммунный ответ. Кроме того, HFt является одной из нескольких природных наночастиц, которая сама по себе способна связываться с опухолевыми клетками эффективным и селективным путем. Действительно, с использованием одной из самых привлекательных молекул для таргетной терапии злокачественных новообразований, рецептора трансферрина 1 (transferrin receptor 1 (TfR1)), было показано, что HFt интернализуется. TfR1 действительно представлен, из-за повышающей регуляции, в больших количествах на поверхности многих видов злокачественных опухолей (с превышением до 100 раз по сравнению с нормальными клетками) и эффективно интернализуется. Для более чем 474 образцов клинических тканей, была доказана интернализация HFt, но не легкой цепи ферритина человека (light chain of human ferritin (LFt)), посредством TfR1 и специфическое распознавание многих типов опухолей (т.е. злокачественных новообразований печени, легких, поджелудочной железы, толстой кишки, шейки матки, яичников, простаты, молочной железы, саркомы и тимуса) по сравнению с неопухолевыми тканями, с 98% чувствительностью и 95% специфичностью (Fan K, Сао C, Pan Y, Lu D, Yang D, Feng J, et al. Magnetoferritin nanoparticles for targeting and visualizing tumour tissues. Nat Nanotechnol. 2012;7:459-64). Однако, нативная HFt имеет несколько недостатков. Во-первых, выходы, с которыми она способна связываться с определенными типами лекарственных средств, такими как, например, доксорубицин (один из противоопухолевых препаратов с широким спектром противоопухолевой активности), являются низкими, и это может ограничить их возможное применение и клинические разработки. Во-вторых, нативная HFt при системном пути введения имеет очень короткий период полужизни в плазме, приблизительно от 2 до 3 ч. И, наконец, ее природная ферроксидазная активность может ингибировать развитие и созревание остеобластов человека и приводить к снижению минерализации, к остеопении и остеопорозу (Zarjou A, Jeney V, Arosio P, Poli M, Zavaczki E, Balla G, Balla J. Ferritin ferroxidase activity: a potent inhibitor of osteogenesis. J Bone Miner Res. 2010,25:164-72). По данной причине целесообразно использовать вариант HFt, лишенный ферроксидазной активности благодаря сайт-специфической мутации (в настоящем документе обозначена как vHFt), который не вызывает ингибирования.
Недавно, для того чтобы увеличить как период полужизни in vivo нативного HFt, так и стабильность комплексов HFt-лекарственное средство, в WO 2016051340 А1 была раскрыта новая конструкция
- 1 044061 на основе HFt, названная HFt-MP-PAS, подходящая для доставки лекарственного средства. В данной конструкции N-конец каждой субъединицы HFt генетически слит с: i) полипептидной последовательностью PAS, то есть последовательностью, богатой остатками пролина (Р), аланина (А) и серина (S); и ii) селективной к опухоли последовательностью (МР), реагирующей на протеолитическое расщепление опухолевыми протеазами (ММР), вставленной между каждой субъединицей HFt и расположенным снаружи полипептидом PAS. Целью защиты с помощью PAS было повышение стабильности белка во время процесса инкапсулирования лекарственного средства, предпочтительно для лекарственного средства доксорубицин, и повышение стабильности комплекса белок-лекарственное средство. Присутствие PAS также способно маскировать поверхность белка и, таким образом, удлинять период его полужизни в плазме. Последовательность МР позволяет избирательно удалять защиту PAS с помощью сигналов, присутствующих в микроокружении опухоли (т.е. ММР, специфичные для данной последовательности), так что полученная в результате демаскированная HFt может свободно взаимодействовать и интернализироваться посредством TfR1, сверхэкспрессируемого в злокачественных клетках. Конструкция HFt-MP-PAS доказала, что i) инкапсулирует во внутренней полости в три раза больше доксорубицина (DOX), чем HFt дикого типа, ii) образует более стабильные комплексы (т.е. утечка лекарственного средства была незначительной) и iii) обладает более высоким in vivo временем циркуляции. Важно, что DOX-нагруженная конструкция HFt-MP-PAS (HFt-MP-PAS-DOX) продемонстрировала превосходную терапевтическую эффективность в in vivo модели рака поджелудочной железы человека, значительно увеличивая общую выживаемость животных. Увеличение инкапсулирования DOX, стабильности комплекса белоклекарственное средство и времени циркуляции в плазме по отношению к HFt было приписано наличию PAS. Однако, все еще существует потребность в создании улучшенных наночастиц в качестве носителей (нановекторов) терапевтических средств.
Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что введение по меньшей мере одного отрицательно заряженного остатка, выбранного из глутамата или аспартата в домен PAS резко улучшает свойства слитого белка HFT-MP-PAS, как ясно видно из экспериментальных данных, представленные в примерах и чертежах настоящего раскрытия. В частности, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что новая конструкция со вставкой отрицательно заряженного остатка, такого как глутамат, в домен PAS (HF-MP-PASE) превосходит как нативный белок HFt, так и белок HFt-MP-PAS с точки зрения количества белка, полученного в конце реакций для капсулирования лекарственного препарата. Кроме того, новая конструкция HF-MP-PASE показывает более высокую степень накопления лекарственного препарата в ядрах клеток, более высокую стабильность в сыворотке крови и более высокую степень накопления в опухоли по сравнению с нативным HFt и HFt-MP-PAS.
Соответственно, первый объект настоящего изобретения представляет собой слитый белок, содержащий по меньшей мере три домена, где:
(a) первый домен содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи нативного ферритина человека или его варианта, имеющего по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи нативного ферритина человека;
(b) второй домен содержит аминокислотную последовательность сайта расщепления матриксной металлопротеиназы (ММР); и (c) третий N-концевой домен состоит из аминокислотной последовательности полипептида из по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, и который по существу состоит или состоит из пролина, серина, аланина и по меньшей мере одного отрицательно заряженного остатка, выбранного из глутамата или аспартата. Настоящее изобретение обеспечивает также композиции, содержащие соединения по настоящему изобретению, а также для конкретных применений в терапевтических применениях. Эта и другие цели достигаются благодаря слитому белку, как охарактеризовано в прилагаемой формуле изобретения в пункте 1. Другие независимые пункты и зависимые пункты формулы изобретения относятся к дополнительным аспектам и конкретным вариантам осуществления изобретения, которые являются неотъемлемой частью настоящего описания.
Для того, чтобы улучшить и облегчить связывание лекарственного средства внутри полости ферритина, авторы настоящего изобретения решили удалить остатки цистеина с поверхности белка и ввести дополнительные остатки цистеина в полость белка. Таким образом, стало возможным очень эффективно связывать с внутренней полостью каждую молекулу, содержащую тиолреактивный мотив, например, лекарства, линкеры, флуорофоры и тому подобное (см. примеры и фигуры).
Соответственно, еще один объект настоящего изобретения представляет собой мутеин тяжелой цепи нативного ферритина человека, где указанный мутеин не имеет каких-либо остатков цистеина на поверхности белка и имеет по меньшей мере один цистеин во внутренней полости белка.
Кроме того, для того, чтобы улучшить и облегчить связывание лекарственных средств, содержащих положительно заряженный мотив, авторы настоящего изобретения решили удалить остатки цистеина с поверхности белка и ввести дополнительный отрицательно заряженный остаток, выбранный из глутамата или аспартата, в полость белка. Таким образом, стало возможным очень эффективно связывать с внутренней полостью молекулы, содержащие положительно заряженный мотив, например, лекарства, линке- 2 044061 ры, флуорофоры и тому подобное (см. примеры и фигуры).
Соответственно, еще один объект настоящего изобретения представляет собой мутеин тяжелой цепи нативного ферритина человека, где указанный мутеин не имеет каких-либо остатков цистеина на поверхности белка и имеет по меньшей мере один дополнительный остаток глутамата или аспартата во внутренней полости белка.
Еще один объект настоящего изобретения представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок или наночастицу в соответствии с любым из раскрытых в данном документе вариантов осуществления.
Еще один объект настоящего изобретения представляет собой вектор, содержащий указанные нуклеиновые кислоты, и клетку-хозяин, содержащую указанную нуклеиновую кислоту или указанный вектор.
Дополнительные признаки и преимущества изобретения станут очевидными из следующего подробного описания, которое предоставлено только в иллюстративных целях, но не в качестве ограничения, со ссылкой на прилагаемые чертежи.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 схематически представлено получение наночастиц HFt, в которых N-конец каждого из 24 мономеров генетически связан с расщепляемыми пептидными последовательностями и с последовательностями, по существу состоящими из пролина, аланина, серина и глутамата (PASE).
На фиг. 2 показаны профили перемещения полос электрофореза в нативном агарозном геле. Дорожка HFt-MP-PAS (15 мкг); Дорожка 2, HFt-MP-PASE (15 мкг). На фиг. 3 схематически представлен синтез HFt-MP-PASE, содержащего лекарственное средство митоксантрон (MIT) или пиксантрон (PIX). Для ясности показаны только 4 из 24 модифицированных N-концов HFt.
На фиг. 4 показана способность инкапсулировать митоксантрон или пиксантрон у предыдущей конструкции HFt (HFt-MP-PAS) по сравнению с новым белком HFt-MP-PASE и другими данными из литературы. Величины относительного выхода указаны в виде % выхода белка и количества связанных молекул лекарственного средства. Можно видеть, что данная конструкция, являющаяся объектом данного патента, неожиданно и непредвиденно имеет превосходные выходы с точки зрения получения белка по сравнению как с нативным HFt, так и с модифицированным HFt (HFt-MP-PAS). На фиг. 5 показаны профили элюции эксклюзионной хроматографии (SEC) и распределение частиц по размерам (DLS) конструкций на основе HFt. (A) SEC-анализ конструкций HFt-MP-PAS (черный) и HFt-MP-PASE (красный), загруженных MIT. Профили элюции, полученные при одновременном отслеживании вкладов белка и MIT при 280 нм (сплошная линия) и 610 нм (пунктирная линия), соответственно. (В) DLS-профили тех же конструкций.
На фиг. 6 показано высвобождение лекарственного средства из комплексов HFt-MP-PASE-MIT. Наноносители, нагруженные MIT, хранили при 4 и 37°С в PBS и анализировали на содержание митоксантрона с помощью SEC в определенные моменты времени. Процент утечки митоксантрона оценивали путем сравнения собранных одновременно профилей элюции при 280 нм и 610 нм.
На фиг. 7 показана локализация HFt-MP-PASE-MIT (концентрация MIT 20 мкМ) в клеточных линиях рака толстой кишки SW480 (верхняя панель) и SW620 (нижняя панель) после 3-часовой инкубации. Левые панели: окрашивание ламином (Lamin) А/С (маркер ядерной мембраны, зеленый); центральные панели: MIT (синий); правые панели: наложение. Белая черта обозначает длину в 10 мкм.
На фиг. 8 показана локализация MIT (панели А, В), HFt-MP-PAS-MIT (панели С, D) и HFt-MP-PASE-MIT (панели Е, F) в клеточных линиях рака толстой кишки SW480 (панели А, С и Е) и SW620 (панели В, D и F) после 3 ч инкубации. Концентрация MIT составляет 20 мкМ во всех экспериментах. Белая черта обозначает длину 20 мкм. На фиг. 9 показана эффективность MIT и HFt-MP-PASE-MIT в уничтожении линий клеток человека РаСа-44, Capan-1 и MiaPaCa2 (рак поджелудочной железы), НТ1080 (фибросаркома), MDA-MB-231 (рак молочной железы) и SW480 и SW620 (колоректальный рак). Среднее ± SEM (n = 3)
На фиг. 10 показаны результаты экспериментов по биораспределению доксорубицин-содержащих соединений. Концентрации доксорубицина в плазме рассчитывали через 24 ч после внутривенных инъекций мышам, несущим опухоль поджелудочной железы человека (ксенотрансплантаты), некапсулированного лекарственного средства доксорубицина или доксорубицина, инкапсулированного в соединениях на основе ферритина: нативный HFt, HFt-MP-PAS и HFt-MP-PASE.
На фиг. 11 схематически представлено изготовление наночастиц на основе HFt, где помимо модификаций N-конца, показанных ранее (HFt-MP-PAS), остатки нативного цистеина замещены остатками серина и ненативные остатки цистеина или глутамата (в красных сферах) включены во внутреннюю полость (HFt-Cys-MP-PASE или HFt-Glu-MP-PASE).
На фиг. 12 схематически представлен синтез HFt-Cys-MP-PASE или HFt-Glu-MP-PASE, содержащего лекарственное средство, реакционноспособное по отношению к тиоловой группе цистеинов (например, малеимид), или лекарственное средство, содержащее положительный мотив. Для ясности показаны только 4 из 24 модифицированных N-концов HFt. Ненативные остатки цистеина во внутренней по- 3 044061 лости белка показаны красным цветом.
На фиг. 13 показана способность инкапсулировать производное доксорубицина 6-малеимидокапроилгидразон (DOX-EMCH) или комбинацию малеимидопропионовой кислоты и Genz-644282 новым белком HFt-Cys2-MP-PASE (содержащим 4 ненативных цистеина на мономер, 96 на 24 мера) или способность инкапсулировать нативный митоксантрон или Genz-644282 с помощью HFt-Glu-MP-PASE (содержащего 4 ненативных глутамата на мономер, 96 на 24 мера). Относительные выходы указаны в виде % выхода белка и числа конъюгированных молекул лекарственного средства.
Подробное описание изобретения
Слитый белок, который является объектом настоящего изобретения, содержит по меньшей мере три домена.
Первый домен содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи ферритина человека. Такая аминокислотная последовательность представляет собой нативную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности. Так как длина тяжелой цепи ферритина человека составляет 183 аминокислоты (SEQ ID NO:1), то вариант, имеющий по меньшей мере 90% идентичности последовательности, содержит до 19 аминокислотных замен по сравнению с нативной последовательностью.
В одном варианте осуществления тяжелая цепь ферритина человека представляет собой мутеин, в котором остатки цистеина с поверхности белка удалены и по меньшей мере один цистеин или отрицательно заряженный (аспартат или глутамат) остаток вставлен во внутреннюю полость белка, предпочтительно, два, три или четыре цистеина или аспартата, или глутамата вставляются во внутреннюю полость белка. Нативные цистеиновые остатки с поверхности белка заменены остатком без тиолреактивной группы, с предпочтительной заменой цистеина на серин. Белковая поверхность ферритина человека в данном описании определяется как любые остатки, доступные для растворителя. Внутренняя полость ферритина человека определяется в данном описании как любые остатки, не доступные для растворителя.
Например, в одном варианте осуществления цистеин вставлен вместо лизина 71, лизина 143 и/или глицина 182.
В одном предпочтительном варианте осуществления тяжелая цепь ферритина человека представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 варианта HFT (HFT-Cys1), лишенного нативных остатков цистеина и содержащего три ненативных остатка цистеина во внутренней полости, которые представляют альтернативный вариант. Аминокислотная последовательность HFt-Cys1 характеризуется шестью аминокислотными заменами: серин вместо цистеина 90, серин вместо цистеина 102, серин вместо цистеина 130, цистеин вместо лизина 71, цистеин вместо лизина 143 и цистеин вместо глицина 182.
В одном предпочтительном варианте осуществления тяжелая цепь ферритина человека лишена нативных остатков цистеина и содержит четыре ненативных остатка цистеина во внутренней полости, которые представляют альтернативный вариант (HFt-Cys2). Аминокислотная последовательность данного дополнительного варианта характеризуется семью аминокислотными заменами: серин вместо цистеина 90, серин вместо цистеина 102, серин вместо цистеина 130, цистеин вместо лизина 53, цистеин вместо лизина 71, цистеин вместо треонина 135 и цистеин вместо лизина 143. В одном предпочтительном варианте осуществления тяжелая цепь ферритина человека лишена нативных остатков цистеина и содержит четыре ненативных остатка глутамата во внутренней полости, которые представляют альтернативный вариант (HFt-Glu). Аминокислотная последовательность данного дополнительного варианта характеризуется семью аминокислотными заменами: серин вместо цистеина 90, серин вместо цистеина 102, серин вместо цистеина 130, глутамат вместо лизина 53, глутамат вместо лизина 71, глутамат вместо треонина 135 и глутамат вместо лизина 143. Все мутеины/варианты ферритина человека, раскрытые в данном документе, представляют собой объекты настоящего изобретения. Все раскрытые в данном документе варианты осуществления тяжелой цепи ферритина человека могут быть использованы в качестве первого домена в слитом белке по изобретению. Аминокислотная последовательность нативного HFt представляет собой (учитывая, что первый метионин является началом кодирующей области и может быть удален при дальнейшей обработке белка):
(SEQIDNO 1)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYF
LHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVN QSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEY LFDKHTLGDSDNES
В некоторых вариантах осуществления слитый белок HFt по изобретению содержит вариант HFt (HFt Cys1), лишенный нативных остатков цистеина и содержащий три ненативных остатка цистеина во внутренней полости. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность варианта HFT Cys1 представляет собой:
- 4 044061 (SEQ ID NO 2)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYF LHQSHEEREHAEKLMCLQNQRGGRIFLQDIKKPDSDDWESGLNAMESALHLEKNVN QSLLELHKLATDKNDPHLSDFIETHYLNEQVCAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEY LFDKHTLGDSDNEC
Аминокислотная последовательность варианта HFt Cys2 представляет собой:
(SEQ ID NO 15)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFACYF LHQSHEEREHAEKLMCLQNQRGGRIFLQDIKKPDSDDWESGLNAMESALHLEKNVN QSLLELHKLATDKNDPHLSDFIECHYLNEQVCAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEY LFDKHTLGDSDNES
В некоторых вариантах осуществления слитый белок HFt по изобретению содержит вариант HFt (HFt Glu), лишенный нативных остатков цистеина и содержащий четыре ненативных остатка глутамата во внутренней полости. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность вариант HFt Glu представляет собой:
(SEQID NO: 18)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAA1NRQ1NLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAEYF LHQSHEEREHAEKLMELQNQRGGRIFLQDIKKPDSDDWESGLNAMESALHLEKNVN QSLLELHKLATDKNDPHLSDFTEEHYLNEQVEATKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEY LFDKHTLGDSDNES
Второй домен слитого белка по изобретению содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере одного сайта расщепления матриксной металлопротеиназы (ММР), в частности, ММР 2, ММР 3, ММР 7 или ММР 9. В качестве неограничивающего примера, далее перечислены несколько пептидов, которые имитируют последовательность расщепления цепи коллагена и особенно эффективно расщепляются с помощью ММР 2 и ММР 9:
Gly Pro Leu Gly He Ala Gly Gin (SEQ ID NO: 3)
Gly Pro Gin Gly He Trp Gly Gin (SEQ ID NO: 4)
Pro Leu Gly Leu Ala Gly (SEQ ID NO: 5)
Pro Vai Gly Leu He Gly (SEQ ID NO: 6)
Cys Gly Leu Asp Asp (SEQ ID NO: 7)
Аминокислотные последовательности, которые содержат сайт расщепления для предполагаемого фермента, также могут быть сконструированы таким образом, что сайт расщепления повторяется несколько раз, как, например, в последовательности, как показано ниже:
Gly Pro Leu Gly He Ala Gly Gin Gly Pro Leu Gly He Ala Gly Gin (SEQ ID NO: 8).
Все ранее указанные аминокислотные последовательности являются характерными, но не ограничивающими примерами получения слитых белков и наночастиц согласно настоящему изобретению.
Третий домен слитого белка по изобретению, связанный с N-концом, по существу состоит или состоит из аминокислотной последовательности полипептида, которая богата пролином, серином, аланином и по меньшей мере одной отрицательно заряженной аминокислотой, такой как глутамат или аспартат (для краткости называемый PASE), для повышения стабильности белка в процессе инкапсулирования лекарственного средства, особенно с лекарственными средствами, которые могут стимулировать белковую агрегацию, и повышения стабильности комплекса белок-лекарственное средство по сравнению с полипептидом, в котором отсутствуют отрицательно заряженные аминокислоты (PAS).
Полипептид PASE по существу состоит из аминокислотных последовательностей, богатых Pro, Ala и Ser, и по меньшей мере одного или нескольких Glu и/или Asp, которые образуют отрицательно заряженный неструктурированный полимер, длина которого предпочтительно составляет менее 80 аминокислотных остатков, более предпочтительно содержит от 20 до 80 аминокислотных остатков, еще более предпочтительно содержит от 30 до 70 аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте осуществления пролиновые остатки вышеуказанного полипептида PASE составляют от 10 до 40% от общего количества аминокислотных остатков полипептида PASE.
Согласно одному варианту осуществления домен PASE будет содержать один, два, три или четыре глутамата и/или аспартата. В одном предпочтительном варианте осуществления домен PASE содержит не более одного глутамата или аспартата в пределах 15, 16, 17, 18, 19 или 20 остатков домена PAS.
Примеры полипептидов PASE, особенно подходящие для применения в рамках настоящего изобретения и поэтому являющиеся предпочтительными, представляют собой следующие:
- 5 044061
ASP AAP APASP AAP APSAP AEASP AAP APASP AAP APS APAE (SEQ ID NO: 9);
ASPAAPAPASPAEPAPSAPAASPAAPAPASPAEPAPSAPA (SEQ ID NO: 10);
ASP AAP APASP AAP APSAP AEASP AAP APASP AAP APSAP AEASPAAP APASP AAP APS
APAEASPAAPAPAS (SEQ ID NO: 11);
ASP AAP APASP AAP APSAP AD ASP AAP APASP AAP APSAP AD (SEQ ID NO: 12);
ASPAAPAPASPADPAPSAPAASPAAPAPASPADPAPSAPA (SEQ ID NO: 13);
ASP AAP APASP AAP APSAP ADASP AAP APASP AAP APSAP ADASP AAP APASP AAP APS
AP AD ASP AAPAPAS (SEQ ID NO: 14);
Все раскрытые здесь домены PASE являются объектами настоящего изобретения. Термином полипептид по существу состоит из аминокислотных последовательностей, богатых Pro, Ala и Ser в настоящем описании определяется полипептид, который образует стабильную конформацию случайного клубка и который состоит из Pro, Ala и Ser, где от 1 до 5% остатков Pro, Ala и Ser заменены другими аминокислотами, такими как, например, глицин, которые не изменяют стабильную конформацию случайного клубка полипептида. Как упомянуто выше, биосинтетические полипептиды в конформации случайного клубка (или полипептидные сегменты в конформации случайного клубка) по настоящему изобретению, состоящие исключительно из остатков пролина и аланина и по меньшей мере одного остатка глутамата или аспартата, образуют стабильную конформацию случайного клубка. Используемый в данном документе термин случайный клубок в целом относится к любой конформации полимерной молекулы, включая аминокислотные полимеры/аминокислотные последовательности/полипептиды, в которых отдельные мономерные элементы, образующие указанную полимерную структуру являются по существу случайным образом ориентированными по отношению к смежным мономерным элементам, в то же время все еще являясь химически связанными с указанными смежными мономерными элементами. Конкретно, полипептид, аминокислотная последовательность или аминокислотный полимер, принимающий/имеющий/образующий конформацию случайного клубка, по существу, не имеют определенной вторичной и третичной структуры. Природа полипептидных случайных клубков и способы их экспериментальной идентификации известны специалисту в данной области и описаны в научной литературе (Cantor (1980) Biophysical Chemistry, 2nd ed., W.H. Freeman and Company, New York; Creighton (1993) Proteins-Structures and Molecular Properties, 2nd ed., W.H. Freeman and Company, New York; Smith (1996) Fold Des 1:R95 R106).
Стабилизирующий и маскирующий полипептид PASE добавляется к поверхности HFt посредством короткой пептидной последовательности, которая, как ранее указывалось, содержит один или более сайтов расщепления металлопротеиназы, получая таким образом слитый белок по изобретению с замещаемой маскировкой. Действительно, полипептид PASE может быть селективно удален в тканях-мишенях посредством внеклеточных матриксных металлопротеиназ (ММР). Было показано, что ММР 2 и ММР 9 являются ключевыми металлопротеиназами, которые сверхэкспрессированы в опухолевом микроокружении и участвуют в ангиогенезе, инвазии и опухолевых метастазах.
Еще один объект настоящего изобретения представляет собой слитый белок, в котором домен PASE или PAS и ММР-расщепляемые домены связаны с С-концом белка HFt вместо N-конца. Согласно одному варианту осуществления слитый белок имеет SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 17.
PAS MP HFt (SEQ ID NO: 16)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYF LHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVN QSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEY LFDKHTLGDSDNESPLGLAGASP AAP APASP AAP APSAP AASP AAP APASP AAP APSA PA
PASE MP HFt (SEQ ID NO: 17)
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYF LHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVN QSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEY LFDKHTLGDSDNESPLGLAGASP AAP APASP AEP APSAP AASP AAP APASP AEP APSAP A
Применение полипептидов PASE на мультимерной поверхности ферритина в рамках настоящего изобретения дает несколько преимуществ по сравнению с известными из уровня техники. Для того, чтобы получить с более высоким выходом монодисперсные материалы во время образования комплекса белок-лекарственное средство, авторы изобретения генетически преобразовали HFt MP PAS, о котором сообщалось ранее, путем добавления остатков глутамата (Е) или аспартата (D) в последовательности PAS и получили новую конструкцию, названную HFt MP PASE. Благодаря данной модификации, белки на основе ферритина могут образовывать комплексы с лекарственными средствами, которые могут стимулировать агрегацию белка (например, митоксантрон и пиксантрон) более растворимым и монодис
- 6 044061 персным образом, чем нативная HFt или модифицированный аналог HFt MP PAS.
Данное улучшение стабильности инкапсулирования комплекса белок-лекарственное средство, которое отличается от доксорубицина (например, митоксантрон и пиксантрон), было удивительно и неожиданно получены авторами настоящего изобретения, которые сконструировали наночастицы на основе тяжелой цепи ферритина человека (HFt), используя как технологию слитых генов, так и технологию получения рекомбинантных белков. В частности, как будет подробно описано в разделе, относящемся к примерам, были сделаны генетические конструкции, которые, в одной последовательности нуклеиновой кислоты (например, ДНК), кодируют три последовательности, приведенные на фиг. 1: i) HFt; ii) короткие пептидные последовательности (МР), расщепляемые ММР-2/9; iii) неструктурированные полипептидные последовательности, богатые Pro, Ser, Ala и Glu (PASE), предпочтительно, с длиной, составляющей от 20 до 80 остатков. Последовательности ii) и iii) связаны с N-концом HFt для обратимой маскировки.
Как уже говорилось выше, слитые белки HFt, полученные авторами настоящего изобретения, спонтанно образуют наночастицы HFt, способные нести терапевтические молекулы (химические соединения, моноклональные антитела, пептиды и тому подобное) (фиг. 2).
В одном варианте осуществления одна или несколько, предпочтительно 5, терапевтических и/или диагностических молекул инкапсулированы во внутренней полости наночастицы HFt, или ковалентно связаны с поверхностью наночастицы HFt, или ковалентно связаны во внутренней полости HFt. Количество связанного лекарственного средства и гомогенность комплекса белок-лекарственное средство значительно увеличивались по сравнению с немодифицированным белком (HFt) или модифицированным PAS (HFt MP PAS) благодаря наличию полипептидов PASE. Гомогенность полученного материала является весьма желательным свойством в области фармацевтики, поскольку оно указывает на отсутствие негативных эффектов, таких как осаждение, кластеризация и потеря конечного продукта, несущего терапевтическую молекулу.
Терапевтическая молекула представляет собой, например, фармацевтически активный ингредиент. Как используется в настоящем описании, термин фармацевтический активный ингредиент или, проще, активный ингредиент относится к любой фармацевтически активной молекуле (химическое соединение, моноклональное антитело, пептид и тому подобное), например, к молекуле, которая может быть использована для лечения злокачественного новообразования. Предпочтительные активные ингредиенты для использования в настоящем изобретении представляют собой, например, но ими не ограничиваются, доксорубицин, митоксантрон, пиксантрон, Genz 644282, паклитаксел, ауристатины, камптотецины, гемцитабин и активные ингредиенты на основе платины. Также может быть использован предшественник активных ингредиентов, перечисленных выше.
При терапевтических применениях наночастицы HFt по настоящему изобретению, которые действуют как нацеленные системы носителей, могут быть введены индивиду или пациенту посредством любого подходящего пути введения, например перорально, парентерально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, в виде суппозиториев, внутриочагово, интраназально или подкожно, интратекально, интралимфатически, путем ингаляции микрокапель или путем имплантации устройства замедленного высвобождения, например осмотического насоса. Как используется в настоящем описании, термин индивид относится к животным, таким как млекопитающие, включая человека, коров, овец, коз, лошадей, собак, кошек, кроликов, крыс, мышей и тому подобное.
Как используется в настоящем описании, термин лечение относится к свидетельству успешного или улучшенного лечения определенного заболевания, поражения, состояния или симптома, или, при определенных обстоятельствах, к профилактике возникновения симптома или состояния.
При терапевтических применениях наночастицы HFt по изобретению используются для введения терапевтически эффективной дозы фармацевтически активного ингредиента. Терапевтически эффективная доза означает дозу, которая дает терапевтический эффект, для достижения которого ее вводят. Точная доза будет зависеть от ряда факторов, в том числе цели лечения, индивида, заболевания, на которое направлено лечение, и тому подобное, и может быть легко определена специалистом в данной области техники, используя известные per se методики (см, например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
Наночастицы HFt по изобретению могут быть использованы для лечения любого заболевания, которое требует введения фармацевтического ингредиента, например, путем изолирования активного ингредиента в полости наночастицы или путем его ковалентного связывания с поверхностью наночастиц. Наночастицы могут быть также использованы для диагностики, более конкретно, для визуализации заболеваний, путем изолирования активного ингредиента в полости наночастицы или путем его ковалентного связывания с поверхностью наночастиц.
Наночастицы HFt по изобретению могут быть введены индивиду для лечения любого заболевания, предпочтительно, гиперпролиферативного заболевания, включая злокачественное новообразование, например: карциномы, глиомы, мезотелиомы, меланомы, саркомы, лимфомы, лейкоз, аденокарциномы, рак молочной железы, рак яичников, рак шейки матки, глиобластома, лейкоз, лимфома, рак предстательной
- 7 044061 железы, лимфома Беркитта, рак головы и шеи, рак толстой кишки, колоректальный рак, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак пищевода, рак желудка, рак поджелудочной железы, гепатобилиарный рак, рак мочевого пузыря, мелкоклеточный рак кишечника, рак прямой кишки, рак почки, рак желчного пузыря, рак полового члена, рак уретры, рак яичка, рак шейки матки, рак влагалища, рак матки, рак щитовидной железы, паратиреоидный рак, рак надпочечников, эндокринный рак поджелудочной железы, карциноидная опухоль, рак кости, рак кожи, ретинобластомы, множественные меланомы, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома (см. CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V. Т. et al. 2008 Edition) для других видов злокачественного новообразования).
Согласно одному варианту осуществления наночастицы HFT являются связанными с каждой молекулой, содержащей тиолреактивный мотив, например, лекарственные средства, линкеры, флуорофоры и тому подобное с использованием, например, одного или нескольких цистеинов, вставленных во внутреннюю полость. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления наночастицы HFT инкапсулируют производное доксорубицина 6-малеимидокапроилгидразон (DOX ЕМСН) или линкер малеимидопропионовую кислоту и лекарственный препарат GENZ 644282, используя один или несколько цистеинов, вставленных во внутренней полости. Следующие примеры приведены в иллюстративных целях, но не в качестве ограничения объема настоящего изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.
Примеры
Пример 1.
Конструирование экспрессионных векторов для слитых белков HFt-MP-PASE.
В качестве попытки уменьшить агрегацию белка и повысить стабильность было решено ввести отрицательно заряженные остатки в образующую внешнюю поверхность последовательность PAS, слитую с каждой субъединицей HFt. Действительно, анализ полученной ранее конструкции HFt-MP-PAS дал основание предположить, что введение двух глутаматных остатков в последовательность PAS из 40 остатков может вызвать достаточное электростатическое отталкивание для предотвращения агрегации между сборками различных 24-меров, не влияя на субъединичную сборку внутри 24-мера. Чтобы максимально распределить отрицательные заряды на поверхности конструкции, остатки глутаминовой кислоты были размещены на расстоянии 20 остатков друг от друга.
Ген HFt-MP-PASE получали путем объединения трех различных последовательностей в одну последовательность: HFt (SEQ ID NO: 1), МР (SEQ ID NO: 5) и PASE (SEQ ID NO: 10). Данная конструкция отличается от ранее раскрытой конструкции HFt-MP-PAS (названной ранее HFt MMP PAS40; WO 2016051340) только двумя аминокислотными заменами в последовательности PAS: глутамат вместо аланина 13 и глутамат вместо аланина 33. Каждый из сравнительных экспериментов, описанных в данном новом патенте, был выполнен с использованием данных двух конструкций. Вектор экспрессии, рЕТ-Ha, содержащий ген HFt-MP-PASE, синтезировали, используя GENEART AG (Germania). Синтез гена проводили с учетом оптимизации кодонов для высоких уровней экспрессии в Escherichia coli.
Слитый белок HFt MP PASE получали с помощью рекомбинантной технологии белков и очищали из растворимой клеточной фракции, с высоким выходом, подобно HFt-MP-PAS (около 150 мг на литр из культуры клеток Е. coli). Влияние на подвижность белка отрицательно заряженных остатков глутамата (48 на белок), вставленных на поверхности белка, оценивали путем проведения электрофореза в агарозном геле в нативных условиях (фиг. 1). В отличие от денатурирующего SDS PAGE, в нативном электрофорезе подвижность белка зависит как от заряда белка, так и от молекулярной массы. Предполагая, что последняя сопоставима для HFt MP PAS и HFt MP PASE, наблюдаемая разница в подвижности белка должна быть приписана дополнительным отрицательным зарядам в конструкции HFt-MP-PASE (фиг. 2). Пример 2.
Получение HFt-MP-PAS и HFt-MP-PASE, несущих химиотерапевтические средства В качестве химиотерапевтических средств авторы настоящего изобретения привели пример, в котором использовали лекарственные средства митоксантрон (MIT) или пиксантрон (РГХ). Данные препараты были инкапсулированы внутрь белковой полости слитых белков, используя процесс рассоединения-соединения белка как функцию рН в соответствии с протоколом, раскрытым в Falvo et al., 2016, Biomacromolecules. 17(2):514 22. Процедура разборки/сборки показана на фиг. 3.
Пример 3.
Тестирование инкапсулирующих выходов лекарственного средства митоксантрон и пиксантрон.
Эффективность инкапсулировать MIT или PIX в HFt-MP-PASE сравнивали с таковой у нативного белка HFT и HFT MP PAS (фиг. 4). Во всех проведенных экспериментах HFt-MP-PASE превосходит как нативный белок HFt, так и белок HFt-MP-PAS по количеству белка, полученного в конце реакций. Это указывает на то, что HFt-MP-PASE является более стабильным и не агрегирует/не выпадает в осадок из раствора во время образования комплекса белок-лекарственное средство.
Пример 4.
Тестирование гомогенности и стабильности комплекса белок-митоксантрон.
Комплексы HFt-MP-PASE, нагруженные MIT, были более растворимыми и монодисперсными, чем HFt-MP-PAS-аналоги, так что высокомолекулярные частицы в растворе не обнаруживались (фиг. 5).
- 8 044061
Эксперименты по динамическому рассеянию света (DLS) показали, что образцы HFt-MP-PASE-MIT имеют приблизительно такой же размер, как ранее раскрытый авторами изобретения HFt-MP-PAS-DOX (содержащий доксорубицин как лекарственное средство), со средним диаметром 17,0±1,1 нм (фиг. 5В). Полученные результаты указывают на то, что вставка остатков глутамата в HFt-MP-PASE-MIT неожиданно приводит к более высокой растворимости и гомогенности белка по сравнению с HFt-MP-PASаналогом, вероятно, предотвращая MIT-опосредованные белок-белковые взаимодействия в растворе. В дополнение, несколько большее число молекул MIT на 24-мер, наблюдаемое для HFt-MP-PAS по сравнению с HFt-MP-PASE (55,0 против 49,0) может быть, вероятно, приписано присутствию молекул MIT на поверхностях первой конструкции, что может способствовать белок-белковой агрегации.
Стабильность комплексов HFt-MP-PASE-MIT тестировали путем хранения растворов в течение 2 месяцев в PBS при 4°С или 37°С и оценивая содержание MIT с помощью анализа эксклюзионной хроматографии (SEC) каждые 7 дней. HFt-MP-PASE-MIT продемонстрировал превосходную стабильность, менее 10% MIT высвобождалось после 2 месяцев хранения при 4°С (фиг. 6), и не имелось признаков помутнения или выпадения в осадок.
Пример 5.
Тестирование клеточной интернализации и локализации наноносителей на основе HFt.
Для того чтобы определить, подвергаются ли MIT-содержащие конструкции на основе HFt связыванию с клеточной поверхностью и/или интернализации, их инкубировали с опухолевыми клетками толстой кишки, SW480 и SW620, при 37°С в течение 1 или 3 ч и флуоресценцию, связанную с MIT, визуализировали с помощью конфокальной микроскопии.
На фиг. 7 показана локализация HFt МР PASE MIT в клеточных линиях SW480 (верхняя панель) и SW620 (нижняя панель). После 3 ч инкубирования HFt MP PASE MIT в больших количествах накапливается в ядрах обеих клеточных линий, как показано окрашиванием маркером ядерной мембраны ламином А/С (в зеленом цвете). В частности, MIT локализуется во внутриядерных структурах, предположительно являющихся ядрышками, на основе размера, положения и формы, как ранее предполагалось для клеток карциномы толстой кишки и злокачественных клеток молочной железы.
Сравнение между клетками, обработанными свободным MIT, HFt-MP-PAS-MIT или HFt-MP-PASE показано на фиг. 8. Во всех случаях MIT локализуется внутри клеточных ядер, но в случае свободного MIT и HFt-MP-PAS-MIT препарат частично присутствует также в цитоплазме. В целом, клетки, обработанные HFt-MP-PASE-MIT, показали высокую степень накопления MIT в ядрах.
Пример 6.
Анти-пролиферативные эффекты HFt MP PASE MIT in vitro.
Для оценки способности HFt-MP-PASE, нагруженного MIT, уничтожать злокачественные клетки in vitro авторы изобретения провели анализы жизнеспособности ХТТ на широком спектре злокачественных клеток человека различного происхождения:
фибросаркома НТ1080; тройной негативный MDA молочной железы MB 231;
панкреатические РаСа 44, Capan 1 и MiaPaCa2; колоректальные злокачественные клетки SW480 и SW620.
Не только MIT сохранил фармакологическую активность после инкапсулирования в конструкциях HFt MP PASE, но и MIT-нагруженные наноносители показали значения IC50, сходные со значениями для неинкапсулированного MIT во всех протестированных клеточных линиях, и даже меньше в некоторых случаях (см. фиг. 9). Данный факт замечателен тем, что неинкапсулированные лекарственные средства могут свободно диффундировать в клетки, в то время как конструкции HFt MP PASE могут только доставлять MIT путем скорость-лимитирующего опосредованного рецептором поглощения. Более того, новая наносистема HFt-MP-PASE-MIT показала, что на клеточных линиях поджелудочной железы эффективность уничтожения приблизительно в десять раз выше, чем у применяемого в настоящее время препарата гемцитабина (то есть 0,43 против 6,75 мкМ, 0,10 против 2,8 мкМ и 0,07 против 1,15 мкМ для клеток Раса44, Capan 1 и MiaPaCa2, соответственно).
Пример 7.
Эксперименты по биораспределению доксорубицин-содержащих соединений на мышах.
Для сравнения, как HFt-MP-PASE сравнивается с HFt-MP-PAS с точки зрения накопления лекарственного средства в опухолях и органах, оба слитых белка инкапсулировали с лекарственным средством. В качестве лекарственного средства был выбран доксорубицин (DOX), поскольку оба слитых белка обладают схожей способностью инкапсулировать его, в отличие от лекарственного средства митоксантрона. Концентрации доксорубицина в плазме рассчитывали через 24 ч после внутривенных инъекций у мышей, несущих человеческие опухоли поджелудочной железы (ксенотрансплантаты), неинкапсулированного лекарственного средства доксорубицин или доксорубицина, инкапсулированного в соединениях на основе ферритина: нативный HFT, HFt-MP-PAS и HFt-MP-PASE. На фиг. 10 показано, что HFt-MPPASE обладает более высокой стабильностью в сыворотке крови и также больше накапливается в опухоли.
- 9 044061
Пример 8.
Конструирование экспрессионных векторов для слитых белков HFt-MP-PASE-Cys или Glu.
В качестве попытки улучшить и облегчить связывание лекарственного средства внутри полости в ферритине, было решено удалить остатки цистеина с поверхности белка и ввести дополнительные цистеиновые или глутаматные остатки в белковую полость. Таким образом, было бы возможно связать с внутренней полостью каждую молекулу, содержащую тиолреактивный или положительно заряженный мотив, например, лекарства, линкеры, флуорофоры и тому подобное. На фиг. 11 и 12 схематично показано изготовление и синтез HFt на основе наночастиц, где в дополнение к N-концевым модификациям, показанным ранее (HFt-MP-PAS), нативные остатки цистеина замещены остатками серина, и ненативные остатки цистеина или глутамата (в красных сферах) включены во внутреннюю полость (HFt-Cys-MP-PASE или HFt Glu MP PASE). Фиг. 13 показывает способность инкапсулировать производное доксорубицина 6-малеимидокапроилгидразон с помощью нового белка HFt-Cys2-MP-PASE (содержащего 4 ненативных цистеина на мономер, 96 на 24-мер). На этой же фигуре показана способность HFt-Cys-MP-PASE инкапсулировать линкер малеимидопропионовую кислоту и лекарственное средство Genz 644282. На этой же фигуре показана способность HFt-Glu-MP-PASE инкапсулировать свободные лекарственные средства митоксантрон или Genz 644282. Все данные лекарственные средства были инкапсулированы в белковой полости слитых белков, используя процесс рассоединения-соединения белка как функцию рН в соответствии с протоколом, раскрытым в Falvo et al., 2016, Biomacromolecules. 17(2):514 22, с одной модификацией. В реакциях с использованием молекул, содержащих малеимид, их добавляли при рН от 6,5 до 7,5 после стадии кислого рН, чтобы избежать возможного повреждения молекулы из-за низких значений рН. Кроме того, в реакции с использованием линкера малеимидопропионовой кислоты и лекарственного средства Genz 644282, первый добавляли перед лекарственным средством при соотношении линкер/тиол 1,2:1.
Относительные выходы указаны в виде % выхода белка и числа конъюгированных молекул лекарственного средства.
Пример 9.
Анти-пролиферативные эффекты HFt-Glu-MP-PASE Genz 644282 in vitro Для тестирования пролиферации клетки саркомы человека (НТ 1080 и А204), рака молочной железы человека (MDA MB 231), меланомы человека (Colo38) и рака поджелудочной железы человека (РаСа44 и MiaPaCa2) высевали на 15 96-луночных планшетов в количестве, составляющем приблизительно 5х103/лунка, в 200 мкл полной среды при 37°С. На следующий день в лунки добавляли Genz 644282 или HFt Glu MP PASE Genz 644282, трехкратно, при различных концентрациях Genz 644282, и клетки культивировали в течение 72 ч. В течение последних 4 ч в культуре жизнеспособность клеток оценивали по восстановлению 3(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ). Всего в каждую лунку добавляли 1 мг/мл МТТ и образцы инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После промывания кристаллы формазана растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида. Поглощение измеряли при 550 нм.
Анти-пролиферативные эффекты HFt Glu MP PASE Genz 644282 на культивируемые злокачественные клетки показаны на фиг. 14. Полученные результаты свидетельствуют о том, что HFt Glu MP PASE Genz 644282 эффективно ингибирует злокачественные клетки, выращенные in vitro зависимым от концентрации образом, со значениями IC50, одинаковыми или ниже по сравнению с неинкапсулированным лекарственным средством. Данные результаты имеют большое значение в свете потенциальных терапевтических применений. Те же результаты были также получены, используя конструкцию HFt-Cys-MP-PASE Genz 644282. Анти-пролиферативные эффекты HFt-Glu-MP-PASE Genz 644282 in vivo Пятинедельным самкам голых (nude) мышей CD1 (Charles River Laboratories, Лекко, Италия) инъецировали подкожно (то есть в правый бок) 4х106 клеток РаСа-44, ресуспендированных в 200 мкл среды RPMI1640 плюс 1% BSA. После того как размеры опухоли достигали объем около 100 мм3, мышей рандомизировали в группы из шести животных и внутривенно вводили 200 мкл физиологического раствора, Genz-644282 (1,9 мг/кг) или HFt-Glu-MP-PASE-Genz (0,95 или 1,9 мг/кг). Мышам делали внутривенные инъекции два раза в неделю в течение трех недель; объем опухоли измеряли два раза в неделю с помощью цифрового штангенциркуля, и массу мышей контролировали. После того как размер опухоли мышей достиг объема >1500 мм3, животных умерщвляли. На фиг. 15 представлены кривые роста опухолей через приблизительно две недели после последнего лечения. На данной фигуре очевидна способность HFt-Glu-MP-PASE-Genz резко снижать прогрессирование злокачественного новообразования, при этом наблюдается 100% полного ответа опухоли. На фиг. 16 показано общее выживание животного. Все животные, которых лечили HFt-Glu-MP-PASE-Genz, были свободны от заболевания и выживали через 100 дней после начала терапии, что указывает на высокую эффективность тестируемого соединения.
-
Claims (15)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Слитый белок, содержащий по меньшей мере три домена, где:(а) первый домен содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи нативного ферритина человека или его варианта, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности тяжелой цепи нативного ферритина человека;(b) второй домен содержит аминокислотную последовательность сайта расщепления матриксной металлопротеиназы (ММР); и (c) третий N-концевой домен состоит из аминокислотной последовательности полипептида из по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, и который по существу состоит или состоит из пролина, серина, аланина и по меньшей мере одного отрицательно заряженного остатка, выбранного из глутамата или аспартата (PASE), причем указанный третий N-концевой домен (PASE) имеет длину, которая составляет менее 80 аминокислотных остатков, и причем указанный домен PASE содержит не более одного глутамата или аспартата в пределах от 15 до 20 остатков домена PASE.
- 2. Слитый белок по п.1, где указанный третий N-концевой домен (PASE) имеет длину от 20 до 80 аминокислотных остатков, предпочтительно от 40 до 75 аминокислотных остатков.
- 3. Слитый белок по п.1 или 2, в котором первый домен содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи нативного ферритина человека SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность варианта тяжелой цепи ферритина человека SEQ ID NO: 2 или варианта тяжелой цепи ферритина человека без каких-либо остатков цистеина на поверхности белка и с по меньшей мере одним цистеином или аспартатом, или глутаматом во внутренней полости белка, предпочтительно с двумя, тремя или четырьмя цистеинами или аспартатами, или глутаматами во внутренней полости.
- 4. Слитый белок по любому из пп.1-3, в котором второй домен содержит аминокислотную последовательность сайта расщепления матриксной металлопротеиназы (ММР), выбранной из группы, состоящей из ММР 2, ММР 3, ММР 7 и ММР 9, в частности, где аминокислотная последовательность сайта расщепления матриксной металлопротеиназы (ММР) выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8.
- 5. Слитый белок по п.4, в котором указанный третий N-концевой домен (PASE) содержит не более одного глутамата или аспартата в пределах 20 остатков домена PASE.
- 6. Слитый белок по любому из пп.1-5, в котором остатки пролина указанного третьего N-концевого домена (PASE) полипептида составляют от 10 до 40% от общего числа аминокислотных остатков.
- 7. Слитый белок по любому из пп.1-6, в котором указанный полипептид третьего N-концевого домена (PASE) выбран из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14.
- 8. Слитый белок по любому из пп.1-7, содержащий первую и/или вторую линкерную аминокислотную последовательность(и), соответственно связывающую первый домен со вторым доменом и/или второй домен с третьим доменом, где первая и вторая аминокислотные последовательности являются одинаковыми или отличными друг от друга.
- 9. Слитый белок по любому из пп.1-8, который связан с активным ингредиентом и/или визуализирующим средством.
- 10. Слитый белок по любому из пп.1-9, в котором тяжелая цепь варианта ферритина человека имеет SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 18.
- 11. Наночастица, содержащая мономеры слитого белка по любому из пп.1-10.
- 12. Наночастица по п.11, где указанные мономеры слитого белка по любому из пп.1-10 представляют собой 24 мономера.
- 13. Наночастица по любому из пп.11 или 12, где активный ингредиент, выбранный из доксорубицина, митоксантрона, пиксантрона, GENZ 644282, паклитаксела, ауристатинов, камптотецинов, гемцитабина и активных ингредиентов на основе платины, связан с указанной наночастицой или инкапсулирован в указанной наночастице.
- 14. Фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по любому из пп.1-10 в сочетании с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым наполнителем, носителем или разбавителем.
- 15. Применение фармацевтической композиции по п.14 для терапевтического лечения и/или диагностики опухоли.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102017000116184 | 2017-11-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA044061B1 true EA044061B1 (ru) | 2023-07-20 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111328346B (zh) | 基于人铁蛋白和蛋白酶可切割肽的融合蛋白及其作为化学治疗载体的用途 | |
| RU2695220C2 (ru) | Нацеленные конъюгаты и частицы и их составы | |
| US9644001B2 (en) | Cell-penetrating peptides | |
| US11981754B2 (en) | Biomimetic peptide and biodegradable delivery platform for the treatment of angiogenesis- and lymphangiogenesis-dependent diseases | |
| CN106922149B (zh) | 融合蛋白、由多个所述融合蛋白的单体组成的纳米颗粒及其用途 | |
| US11679160B2 (en) | Castration resistant prostate cancer | |
| US20140294967A1 (en) | Stable nanocomposition comprising paclitaxel, process for the preparation thereof, its use and pharmaceutical compositions containing it | |
| TW200902051A (en) | Enzymatic anticancer therapy | |
| KR101958964B1 (ko) | 항종양 및 항혈관생성 활성을 갖는 사이클릭 펩타이드 | |
| Xu et al. | Multifunctional building elements for the construction of peptide drug conjugates | |
| WO2022240081A1 (ko) | 엽산 접합 아미노클레이를 기반으로 하는 표적 선택적 나노복합체, 이의 제조 방법 및 이의 용도 | |
| JP2010509241A (ja) | 膜貫通ペプチドからなる自己凝集性ナノ粒子および抗癌剤の特異的腫瘍内送達のためのその利用 | |
| EA044061B1 (ru) | Новые слитые белки на основе ферритина человека и расщепляемых протеазой пептидов и их применение в качестве носителей химотерапевтических средств | |
| KR102274876B1 (ko) | 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 | |
| US7368431B2 (en) | Polypeptide, the conjugate thereof with doxorubicine and a pharmaceutical composition based thereon | |
| CN110452301A (zh) | 一种抗肿瘤融合蛋白及其编码多核苷酸和应用 | |
| AU2022346534A1 (en) | Novel protein and pharmaceutical composition comprising same for prevention or treatment of cancer | |
| CN117582520A (zh) | 铁蛋白-肿瘤免疫调节分子缀合物及其用途 | |
| KR20190123824A (ko) | 암 치료를 위한 Colicin D 단편의 용도 | |
| CN109415424A (zh) | 肽及其纳米颗粒制剂 |