JP7297745B2 - ヒトフェリチンおよびプロテアーゼ切断可能ペプチドに基づく融合タンパク質ならびに化学療法用担体としてのそれらの使用 - Google Patents

ヒトフェリチンおよびプロテアーゼ切断可能ペプチドに基づく融合タンパク質ならびに化学療法用担体としてのそれらの使用 Download PDF

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Description

本発明は、融合タンパク質、該融合タンパク質の複数のモノマーから構成されるナノ粒子、該融合タンパク質をコードする核酸、ならびにそれらの診断用途および治療用途に関する。本発明は、融合タンパク質、該融合タンパク質の複数のモノマーにより構成されるナノ粒子、およびそれらの使用に関する。タンパク質のＮ末端に少なくとも１つのメタロプロテイナーゼ切断配列と、タンパク質－薬物安定性を増大させるマスキングポリマーとして作用する修飾されたＰＡＳポリペプチドとを含む、ヒトフェリチンの重鎖に基づく融合タンパク質、ならびに該融合タンパク質の複数のモノマーから構成されるナノ粒子、該融合タンパク質をコードする核酸、およびそれらの診断用途および治療用途を記載する。
疾患領域での治療剤の選択的放出は、現在の治療、特に抗癌治療を改善するための最も重要な課題の１つである。この文脈では、治療剤の担体（ナノベクター）としてのナノ粒子の使用は、投与部位と最終標的との間に存在し得る生物学的障壁を回避可能にし、より具体的には、正常組織ではなく疾患領域に選択的な方法で薬物を蓄積することを潜在的に可能にする。基本的な前提条件として、ナノベクターは大量の薬物に効果的に結合することができなければならない。
標的化された薬物放出のための公知の担体の中で、フェリチン（Ｆｔ）に基づくナノ粒子は、生体適合性、生物学的障壁を越える能力、機能化の多様性、および特定の種類の薬物と結合する能力という並外れた特徴のため、ますます興味深いものになっている。Ｆｔは、２４個のサブユニットからなる非常に対称性の高い多量体タンパク質構造体であり、この２４個のサブユニットは、鉄を貯蔵するために生理学的に使用される空洞を取り囲む、本質的に球形の殻を有する分子構造体に集合する。外径は１２ｎｍ、内径は８ｎｍである。このような殻状の分子構造体を、以下「ナノ粒子」または「ＨＦｔナノ粒子」と呼ぶ。ヒトフェリチン（ＨＦｔ）の重鎖に基づくナノ粒子は、特にインビボでのヒトへの用途に関して、他の薬物放出系と比較して多くの利点を示す。実際、ＨＦｔ分子は生物学的障壁（２０ｎｍの小径）を越えるように設計されており、生理的条件下では低濃度（約２０μｇ／Ｌ）であるが細胞内および血液中の両方に存在する。
ＨＦｔ分子は天然の要素であるため、強力な非自己（外来性）抗体および／またはＴ細胞免疫応答を惹起しにくい。さらに、ＨＦｔはそれ自体が効果的かつ選択的に腫瘍細胞に結合することができる数少ない天然ナノ粒子の１つである。実際、標的癌治療にとって最も魅力的な分子の１つであるトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）を使用することにより、ＨＦｔが内在化されることが示されている。ＴｆＲ１は実際、多くの種類の癌の表面で正常にアップレギュレートされ（正常細胞の最大１００倍）、効率的に内在化される。４７４を超える臨床組織試料では、ＨＦｔは、ヒトフェリチンの軽鎖（ＬＦｔ）ではなく、ＴｆＲ１によって内在化され、非腫瘍組織と比較して多くの種類の腫瘍（すなわち、肝癌、肺癌、膵癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、肉腫および胸腺癌）を特異的に認識することが証明され、感度９８％、特異性９５％であった（Ｆａｎ Ｋ，Ｃａｏ Ｃ，Ｐａｎ Ｙ，Ｌｕ Ｄ，Ｙａｎｇ Ｄ，Ｆｅｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｒｒｉｔｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２；７：４５９－６４）。ただし、天然のＨＦｔはいくつかの欠点を示す。第一に、例えばドキソルビシン（幅広い抗腫瘍スペクトルを有する抗腫瘍薬の１つ）などの特定の種類の薬物に結合することができる収率は低く、これにより、天然のＨＦｔの可能な用途および臨床開発が制限される可能性がある。第二に、天然のＨＦｔは、全身経路を介して注入された場合、約２～３時間と非常に短い血漿半減期を示す。最後に、その天然のフェロキシダーゼ活性は、ヒト骨芽細胞の発達および成熟を阻害し、石灰化の減少、骨減少症および骨粗鬆症をもたらす可能性がある（Ｚａｒｊｏｕ Ａ，Ｊｅｎｅｙ Ｖ，Ａｒｏｓｉｏ Ｐ，Ｐｏｌｉ Ｍ，Ｚａｖａｃｚｋｉ Ｅ，Ｂａｌｌａ Ｇ，Ｂａｌｌａ Ｊ．Ｆｅｒｒｉｔｉｎ ｆｅｒｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ：ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．２０１０，２５：１６４－７２）。このため、部位特異的変異により得られ、阻害作用を示さない、フェロキシダーゼ活性を欠くＨＦｔ変異体（以下ｖＨＦｔと呼ぶ）を使用することが望ましい。
近年、天然のＨＦｔのインビボ半減期、およびＨＦｔ‐薬物複合体の安定性の両方を増大させるために、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳと名付けられ、薬物送達に適した新規のＨＦｔベースの構築物が国際公開第２０１６０５１３４０号パンフレットに開示された。この構築物では、各ＨＦｔサブユニットのＮ末端は、ｉ）ＰＡＳポリペプチド配列、すなわち、プロリン（Ｐ）残基、アラニン（Ａ）残基およびセリン（Ｓ）残基に富む配列、ならびにｉｉ）各ＨＦｔサブユニットと外側のＰＡＳポリペプチドとの間に挿入された腫瘍プロテアーゼ（ＭＭＰ）によるタンパク質分解切断に応答する腫瘍選択的配列（ＭＰ）に遺伝的に融合されている。ＰＡＳシールド（ＰＡＳ ｓｈｉｅｌｄ）は、薬物カプセル化プロセス中、好ましくは薬物ドキソルビシンについて、タンパク質の安定性を増大させ、タンパク質－薬物複合体の安定性を増大させることを目的とするものであった。ＰＡＳの存在は、タンパク質表面をマスキングし、したがって、その血漿半減期を延長することもできる。ＭＰ配列は、得られたマスクされていないＨＦｔが癌細胞内で過剰発現されたＴｆＲ１と自由に相互作用し、このＴｆＲ１によって内在化されることができるように、腫瘍微小環境（すなわち、この配列に特異的なＭＭＰ）に存在する刺激によって、ＰＡＳシールドを選択的に除去することを可能にする。ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ構築物は、ｉ）野生型ＨＦｔの３倍のドキソルビシン（ＤＯＸ）を内部空洞にカプセル化し、ｉｉ）比較的安定な複合体（すなわち、薬物漏出はごくわずかであった）を形成し、ｉｉｉ）比較的高いインビボ循環時間を有することを証明した。重要なことに、ＤＯＸを搭載したＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ（ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ－ＤＯＸ）は、ヒト膵癌モデルではインビボで優れた治療効果を示し、動物の総生存率を有意に増加させた。これは、ＨＦｔに関して、ＤＯＸカプセル化、タンパク質‐薬物複合体安定性および血漿中循環時間が増大するＰＡＳシールドに起因した。しかし、治療剤の担体（ナノベクター）として改善されたナノ粒子を提供する必要性が依然として存在する。
本発明者らは、驚くべきことに、ＰＡＳドメインに対してグルタマートまたはアスパルタートから選択される少なくとも１つの負に帯電した残基を挿入すると、本開示の例および図面に報告された実験データから明らかに示されるように、融合タンパク質ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳの特性が劇的に改善することを発見した。特に、本発明者らは、ＰＡＳドメインに対してグルタマートなどの負に帯電した残基を挿入した新しい構築物（ＨＦ－ＭＰ－ＰＡＳＥ）が、薬物のカプセル化のための反応の終了時に回収されたタンパク質の量に関して、天然のＨＦｔ、およびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳの両タンパク質よりも優れていることを予期せず発見した。さらに、新しい構築物ＨＦ－ＭＰ－ＰＡＳＥは、天然のＨＦｔ、およびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳと比較して、細胞の核での薬物の蓄積が高く、血清中での安定性が高く、腫瘍への蓄積が高いことを示した。
したがって、本発明の第１の目的は、少なくとも３つのドメインを含む融合タンパク質であって、
（ａ）第１のドメインは、天然のヒトフェリチンの重鎖または天然のヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）第２のドメインは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）第３のＮ末端ドメインは、プロリン、セリン、アラニン、およびグルタマートまたはアスパルタートから選択される少なくとも１つの負に帯電した残基から本質的になるか、またはそれらからなる、少なくとも２０アミノ酸残基のポリペプチドのアミノ酸配列からなる、融合タンパク質である。
本発明はまた、本発明の化合物を含む組成物、および治療用途における特定の使用を提供する。この目的および他の目的は、添付の請求項１に定義されている融合タンパク質によって達成される。他の独立請求項および従属請求項は、本発明のさらなる態様および特定の実施形態に関し、本願明細書の不可欠な部分を形成する。
本発明者らは、フェリチン空洞内の薬物結合を改善および促進するために、タンパク質表面からシステイン残基を除去し、タンパク質空洞に追加のシステイン残基を導入することを決定した。このようにして、チオール反応性モチーフを含むあらゆる分子、例えば、薬物、リンカー、フルオロフォアなどを非常に効果的に内部空洞に結合することができた（例および図を参照）。
したがって、本発明のさらなる目的は、天然のヒトフェリチンの重鎖のムテインであり、該ムテインは、タンパク質表面にシステインの残基がなく、タンパク質の内部空洞に少なくとも１つのシステインがある。
さらに、本発明者らは、フェリチン空洞内の正の薬物の結合を改善および促進するために、タンパク質表面からシステイン残基を除去し、タンパク質空洞にグルタマートまたはアスパルタートから選択される追加の負に帯電した残基を導入することを決定した。このようにして、正に帯電したモチーフを含む分子、例えば、薬物、リンカー、フルオロフォアなどを非常に効果的に内部空洞に結合することができた（例および図を参照）。
したがって、本発明のさらなる目的は、天然のヒトフェリチンの重鎖のムテインであり、該ムテインは、タンパク質表面にシステインの残基がなく、タンパク質の内部空洞に少なくとも１つの追加のグルタマート残基またはアスパルタート残基がある。
本発明のさらなる目的は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つによる融合タンパク質またはナノ粒子をコードする単離された核酸である。
本発明のさらなる目的は、該核酸を含むベクター、および該核酸または該ベクターを含む宿主細胞である。
本発明のさらなる特徴および利点は、添付の図面を参照して、限定としてではなく、例示の目的でのみ提供される以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
ＨＦｔベースのナノ粒子の製造の略図であり、ここで、２４個のモノマーの各々のＮ末端は、切断可能なペプチド配列に、ならびにプロリン、アラニン、セリンおよびグルタマート（ＰＡＳＥ）から本質的になる配列に遺伝的に結合している。 ネイティブアガロースゲル電気泳動バンド移動プロファイルを示す。レーンＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ（１５μｇ）；レーン２、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ（１５μｇ）。 薬物ミトキサントロン（ＭＩＴ）またはピクサントロン（ＰＩＸ）を含有するＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥの合成の略図である。明確にするために、２４個の修飾されたＨＦｔ Ｎ末端のうちの４個のみが示されている。 新規ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥタンパク質および文献からの他のデータと比較した、以前のＨＦｔ構築物（ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ）がミトキサントロンまたはピクサントロンをカプセル化する能力を示す。タンパク質回収率と、結合した薬物分子の数とに関して相対収率が示されている。この特許の構築物の主題は、天然のＨＦｔまたは修飾されたＨＦｔ（ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ）の両方と比較して、タンパク質回収に関して驚くほどかつ予想外に優れた収率を有することが分かる。 ＨＦｔベースの構築物のゲル濾過溶出プロファイル（ＳＥＣ）および粒径分布（ＤＬＳ）を示す。（Ａ）ＭＩＴ添加ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ（黒）構築物およびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ（赤）構築物のＳＥＣ分析。それぞれ２８０ｎｍ（実線）および６１０ｎｍ（点線）での、同時のタンパク質およびＭＩＴの寄与後に取得された溶出プロファイル。（Ｂ）同じ構築物のＤＬＳプロファイル。 ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴ複合体からの薬物放出を示す。ＭＩＴ添加ナノ担体をＰＢＳ中４℃および３７℃で保存し、所定の時間にＳＥＣによってそれらのミトキサントロン含有量についてアッセイした。ミトキサントロン漏出の割合は、２８０ｎｍおよび６１０ｎｍで同時に収集した溶出プロファイルを比較することによって評価した。 ３時間のインキュベーション後のＳＷ４８０（上部パネル）およびＳＷ６２０（下部パネル）大腸癌細胞株内のＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴ（２０μＭ ＭＩＴ濃度）の局在化を示す。左パネル：ラミンＡ／Ｃ染色（核膜マーカー、緑）；中央パネル：ＭＩＴ（青）；右パネル：組合せ。白いバーは１０μｍの長さを示す。 ３時間のインキュベーション後のＳＷ４８０（パネルＡ、ＣおよびＥ）およびＳＷ６２０（パネルＢ、ＤおよびＦ）大腸癌細胞株内のＭＩＴ（パネルＡ、Ｂ）、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ－ＭＩＴ（パネルＣ、Ｄ）およびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴ（パネルＥ、Ｆ）の局在化を示す。いずれの実験でもＭＩＴ濃度は２０μＭである。白いバーは２０μｍの長さを示す。 ヒト細胞株ＰａＣａ－４４、Ｃａｐａｎ－１およびＭｉａＰａＣａ２（膵癌）、ＨＴ１０８０（線維肉腫）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳癌）ならびにＳＷ４８０およびＳＷ６２０（結腸直腸癌）に対するＭＩＴおよびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴの殺傷効果を示す。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３） ドキソルビシン含有化合物に対する生体内分布実験の結果を示す。裸の薬物ドキソルビシン、またはフェリチンベースの化合物、すなわち、天然のＨＦｔ、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳおよびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ内にカプセル化されたドキソルビシンのヒト膵腫瘍（異種移植片）を担持するマウスに静脈内注射した２４時間後に、ドキソルビシンの血漿中濃度を計算した。 ＨＦｔベースのナノ粒子の製造の略図であり、ここで、以前に示されたＮ末端修飾（ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ）に加えて、天然のシステイン残基はセリン残基により置換され、非天然のシステイン残基またはグルタマート残基（赤い球形内）は内部空洞に含まれる（ＨＦｔ－Ｃｙｓ－ＭＰ－ＰＡＳＥまたはＨＦｔ－Ｇｌｕ－ＭＰ－ＰＡＳＥ）。 システインのチオール基に応答する薬物（例えばマレイミド）または正のモチーフを含有する薬物を含有するＨＦｔ－Ｃｙｓ－ＭＰ－ＰＡＳＥまたはＨＦｔ－Ｇｌｕ－ＭＰ－ＰＡＳＥの合成の略図である。明確にするために、２４個の修飾されたＨＦｔ Ｎ末端のうちの４個のみが示されている。タンパク質の内部空洞内の非天然のシステイン残基は赤で示されている。 新規ＨＦｔ－Ｃｙｓ２－ＭＰ－ＰＡＳＥタンパク質（モノマー１つ当たり４つの非天然のシステイン、２４量体当たり９６を含有）による、ドキソルビシンの６－マレイミドカプロイルヒドラゾン誘導体（ＤＯＸ－ＥＭＣＨ）、もしくはマレイミド－プロピオン酸とＧｅｎｚ－６４４２８２との組合せをカプセル化する能力、またはＨＦｔ－Ｇｌｕ－ＭＰ－ＰＡＳＥ（モノマー１つ当たり４つの非天然のグルタマート、２４量体当たり９６を含有）による、天然のミトキサントロンもしくはＧｅｎｚ－６４４２８２をカプセル化する能力を示す。タンパク質回収率と、コンジュゲートした薬物分子の数とに関して相対収率が示されている。
本発明の主題である融合タンパク質は、少なくとも３つのドメインを含む。
第１のドメインは、ヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列を含む。そのようなアミノ酸配列は、少なくとも９０％の配列同一性を有する天然の配列である。ヒトフェリチンの重鎖は１８３アミノ酸（配列番号１）の長さを有するため、少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体は、天然の配列と比較して最大１９のアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ヒトフェリチンの重鎖は、タンパク質表面からシステイン残基が除去され、少なくとも１つのシステインまたは負の（アスパルタートまたはグルタマート）残基がタンパク質の内部空洞に挿入され、好ましくは２つ、３つまたは４つのシステインまたはアスパルタートもしくはグルタマートがタンパク質の内部空洞に挿入されたムテインである。タンパク質表面からの天然のシステイン残基は、チオール反応基のない残基によって置換され、好ましくはシステインはセリンによって置換される。本明細書では、ヒトフェリチンのタンパク質表面は、溶媒に曝露された任意の残基として定義される。本明細書では、ヒトフェリチンの内部空洞は、溶媒に曝露されていない任意の残基として定義される。
例えば、一実施形態では、システインは、リジン７１、リジン１４３および／またはグリシン１８２の代わりに挿入される。
好ましい一実施形態では、ヒトフェリチンの重鎖は、代替の変異体を表す、天然のシステイン残基を欠き、内部空洞に３つの非天然のシステイン残基を含むＨＦｔ変異体（ＨＦｔ－Ｃｙｓ１）のアミノ酸配列（配列番号２）である。ＨＦｔ－Ｃｙｓ１のアミノ酸配列は、６つのアミノ酸置換、すなわち、システイン９０の代わりにセリン、システイン１０２の代わりにセリン、システイン１３０の代わりにセリン、リジン７１の代わりにシステイン、リジン１４３の代わりにシステインおよびグリシン１８２の代わりにシステインによって特徴付けられる。
好ましい一実施形態では、ヒトフェリチンの重鎖は、代替の変異体（ＨＦｔ－Ｃｙｓ２）を表す、天然のシステイン残基を欠き、内部空洞に４つの非天然のシステイン残基を含む。このもう１つの変異体のアミノ酸配列は、７つのアミノ酸置換、すなわち、システイン９０の代わりにセリン、システイン１０２の代わりにセリン、システイン１３０の代わりにセリン、リジン５３の代わりにシステイン、リジン７１の代わりにシステイン、スレオニン１３５の代わりにシステインおよびリジン１４３の代わりにシステインによって特徴付けられる。
好ましい一実施形態では、ヒトフェリチンの重鎖は、代替の変異体（ＨＦｔ－Ｇｌｕ）を表す、天然のシステイン残基を欠き、内部空洞に４つの非天然のグルタマート残基を含む。このもう１つの変異体のアミノ酸配列は、７つのアミノ酸置換、すなわち、システイン９０の代わりにセリン、システイン１０２の代わりにセリン、システイン１３０の代わりにセリン、リジン５３の代わりにグルタマート、リジン７１の代わりにグルタマート、スレオニン１３５の代わりにグルタマートおよびリジン１４３の代わりにグルタマートによって特徴付けられる。
本明細書に開示されるヒトフェリチンのムテイン／変異体はいずれも、本発明の目的である。ヒトフェリチンの重鎖の、本明細書に開示される実施形態はいずれも、本発明による融合タンパク質内の第１のドメインとして使用され得る。
天然のＨＦｔのアミノ酸配列は以下の通りである（最初のメチオニンはコード領域の開始であり、タンパク質の後のプロセシングで除去することができると考えられる）：
Figure 0007297745000001
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質ＨＦｔは、外表面上の天然のシステイン残基を欠き、内部空洞に３つの非天然のシステイン残基を含むＨＦｔ変異体（ＨＦｔ Ｃｙｓ１）を含む。一実施形態では、変異体ＨＦｔ Ｃｙｓ１のアミノ酸配列は以下の通りである：
Figure 0007297745000002
変異体ＨＦｔ Ｃｙｓ２のアミノ酸配列は以下の通りである：
Figure 0007297745000003
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質ＨＦｔは、外表面上の天然のシステイン残基を欠き、内部空洞に４つの非天然のグルタマート残基を含むＨＦｔ変異体（ＨＦｔ Ｇｌｕ）を含む。一実施形態では、変異体ＨＦｔ Ｇｌｕのアミノ酸配列は以下の通りである：
Figure 0007297745000004
本発明の融合タンパク質の第２のドメインは、少なくとも１つのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位、特にＭＭＰ ２、ＭＭＰ ３、ＭＭＰ ７またはＭＭＰ ９のアミノ酸配列を含む。非限定的な例として、以下にいくつかのペプチドを列挙し、これらのペプチドはコラーゲン鎖の切断配列を模倣し、ＭＭＰ ２およびＭＭＰ ９によって特に効果的に切断される：
Figure 0007297745000005
目的の酵素の切断部位を含むアミノ酸配列は、例えば以下に示すような配列などでは、切断部位が数回繰り返されるように構築することもできる。
Figure 0007297745000006
前述のアミノ酸配列はいずれも、本発明による融合タンパク質およびナノ粒子の製造の代表的な例であるが、これらに限定されるものではない。
Ｎ末端に連結された、本発明の融合タンパク質の第３のドメインは、プロリン、セリン、アラニン、およびグルタマートまたはアスパルタートなどの少なくとも１つの負のアミノ酸（簡潔にするために「ＰＡＳＥ」と呼ばれる）に富み、特にタンパク質タンパク質凝集を促進し得る薬物を用いて薬物カプセル化プロセス中のタンパク質の安定性を増大させ、負のアミノ酸（ＰＡＳ）を欠くポリペプチドと比較してタンパク質薬物複合体の安定性を増大させるという目的を有する、ポリペプチドのアミノ酸配列から本質的になるか、それらからなる。
ポリペプチドＰＡＳＥは、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒ、ならびに負に帯電した非構造化ポリマーを形成する少なくとも１つ以上のＧｌｕおよび／またはＡｓｐに富むアミノ酸配列から本質的になり、その長さは好ましくは８０アミノ酸残基未満であり、さらに好ましくは２０～８０アミノ酸残基から構成され、さらになお好ましくは３０～７０アミノ酸残基から構成される。好ましい実施形態では、前述のポリペプチドＰＡＳＥのプロリン残基は、ポリペプチドＰＡＳＥの総アミノ酸残基の１０～４０％に達する。
一実施形態によれば、ＰＡＳＥドメインは、１つ、２つ、３つまたは４つのグルタマートおよび／またはアスパルタートを含む。好ましい一実施形態では、ＰＡＳＥドメインは、ＰＡＳドメインの１５、１６、１７、１８、１９または２０残基内に１つ以下のグルタマートまたはアスパルタートを含む。
本発明の範囲内での使用に特に適しており、したがって好ましいＰＡＳＥポリペプチドの例は以下の通りである：
Figure 0007297745000007
本明細書に開示されているＰＡＳＥドメインはいずれも、本発明の目的である。
本明細書では、「ポリペプチドはＰｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒに富むアミノ酸配列から本質的になる」という用語を用いて、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒ残基の１～５％が、ポリペプチドの安定なランダムコイルコンフォメーションを変化させない他のアミノ酸、例えばグリシンなどによって置換されている、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒからなる安定なランダムコイルコンフォメーションを形成するポリペプチドを定義する。上記のように、本発明の生合成ランダムコイルポリペプチド（またはランダムコイルポリペプチドセグメント）は、プロリン残基およびアラニン残基、ならびにグルタマートまたはアスパルタートの少なくとも１つの残基のみからなり、安定なランダムコイルコンフォメーションを形成する。本明細書で使用される用語「ランダムコイル」は、一般に、アミノ酸ポリマー／アミノ酸配列／ポリペプチドを含むポリマー分子の任意のコンフォメーションに関し、該ポリマー構造を形成する個々のモノマー要素は、隣接するモノマー要素に向かって本質的にランダムに配向されるが、該隣接するモノマー要素に依然として化学的に結合されている。特に、「ランダムコイルコンフォメーション」を採用する／有する／形成するポリペプチド、アミノ酸配列またはアミノ酸ポリマーは、定義された二次構造および三次構造を実質的に欠いている。ポリペプチドランダムコイルの性質およびそれらの実験的同定方法は当業者に知られており、科学文献に記載されている（Ｃａｎｔｏｒ（１９８０）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｍｉｔｈ（１９９６）Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ １：Ｒ９５ Ｒ１０６）。
安定化およびマスキングＰＡＳＥポリペプチドは、前述のように、１つ以上のメタロプロテイナーゼ切断部位を含む短いペプチド配列を介してＨＦｔの表面に付加され、本発明の融合タンパク質に置換可能なマスキングを提供する。実際、ＰＡＳＥポリペプチドは、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって標的組織で選択的に除去することができる。ＭＭＰ ２およびＭＭＰ ９は、腫瘍微小環境で過剰発現し、血管新生、浸潤および腫瘍転移に関与する重要なメタロプロテイナーゼであることが示された。
本発明のさらなる目的はまた、ＰＡＳＥまたはＰＡＳドメインおよびＭＭＰ切断可能ドメインがＮ末端の代わりにＨＦｔタンパク質のＣ末端に連結されている融合タンパク質である。一実施形態によれば、融合タンパク質は、配列番号１６または配列番号１７を有する。
Figure 0007297745000008
Figure 0007297745000009
本発明の範囲内のフェリチンの多量体表面上のＰＡＳＥポリペプチドの使用は、先行技術を超えるいくつかの利点を提供する。タンパク質薬物複合体の形成中にさらに高い収率と単分散材料とを得るために、ＰＡＳ配列にグルタマート（Ｅ）残基またはアスパルタート（Ｄ）残基を付加することによって以前に報告されたＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳを遺伝的に再操作し、ＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳＥと名付けた新しい構築物を得た。この修飾の結果、フェリチンに基づくタンパク質は、天然のＨＦｔまたは修飾されたＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳ対応物よりも可溶性かつ単分散の様式でタンパク質凝集（例えば、ミトキサントロンおよびピクサントロン）を促進することができる薬物と複合体を形成することができた。
ドキソルビシンとは異なる（例えば、ミトキサントロンおよびピクサントロン）タンパク質薬物複合体カプセル化収率の安定性のこの改善は、遺伝子融合技術、および組換えタンパク質の生産技術の両方を使用して、ヒトフェリチン（ＨＦｔ）の重鎖に基づくナノ粒子を構築した本発明者によって、驚くべきことにかつ予想外に達成された。特に、例に関連するセクションに詳細に記載されるように、１つの単一核酸配列（例えばＤＮＡ）内で、図１に記載の３つの配列、すなわち、ｉ）ＨＦｔ、ｉｉ）ＭＭＰ ２／９によって切断可能な短いペプチド配列（ＭＰ）、ｉｉｉ）Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＡｌａおよびＧｌｕ（ＰＡＳＥ）に富み、好ましくは２０～８０残基から構成される長さを有する非構造化ポリペプチド配列をコードする遺伝子構築物を作製した。配列ｉｉ）およびｉｉｉ）は、その可逆的マスキングのためにＨＦｔのＮ末端に結合される。
すでに上述したように、本発明者らによって得られたＨＦｔ融合タンパク質は、治療薬（化学化合物、モノクローナル抗体、ペプチドなど）を担持することができるＨＦｔナノ粒子を自発的に形成する（図２）。
一実施形態では、１つ以上、好ましくは５つの治療用分子および／または診断用分子が、ＨＦｔナノ粒子の内部空洞内にカプセル化されるか、ＨＦｔナノ粒子の表面に共有結合されるか、ＨＦｔの内部空洞に共有結合される。ＰＡＳＥポリペプチドの存在により、未修飾タンパク質（ＨＦｔ）またはＰＡＳ修飾タンパク質（ＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳ）と比較して、結合した薬物の量と、タンパク質薬物複合体自体の均一性とが大幅に増大した。得られた材料の均一性は、沈殿、クラスタリング、および治療用分子を担持する最終生成物の欠失などの負の効果の欠如を示すため、製薬分野では非常に望ましい特性である。
治療用分子は、例えば、医薬活性成分である。本明細書で使用される場合、「医薬活性成分」またはさらに単純に「活性成分」という表現は、任意の医薬活性分子（化学化合物、モノクローナル抗体、ペプチドなど）、例えば癌治療に使用することができる分子を指す。本発明に使用するのに好ましい活性成分は、例えば、限定するものではないが、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ピクサントロン、Ｇｅｎｚ ６４４２８２、パクリタキセル、オーリスタチン、カンプトテシン、ゲムシタビンおよび白金系活性成分である。上記の活性成分の前駆体を使用してもよい。
治療用途では、標的化担体系として作用する本発明のＨＦｔナノ粒子は、任意の好適な投与経路、例えば、経口、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、坐剤として、病巣内、鼻腔内もしくは皮下、髄腔内、リンパ管内、微小液滴の吸入を介して、または徐放装置、例えば浸透圧ポンプの埋め込みによって、対象または患者に投与することができる。本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む哺乳動物などの動物に関する。
本明細書で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、特定の疾患、病変、状態もしくは症状の治療での成功もしくは改善の証拠、または特定の状況では症状もしくは状態の発症の予防を指す。
治療用途では、本発明のＨＦｔナノ粒子は、治療上有効な用量の医薬活性成分の投与に使用される。「治療上有効な用量」とは、そのためにそれが投与される治療効果をもたらす用量を意味することを意図している。正確な用量は、治療の目的、対象、治療される疾患などを含むいくつかの因子に依存し、それ自体公知の方法を使用することにより、当業者によって容易に決定され得る。（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１ ３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照）。
本発明のＨＦｔナノ粒子は、例えば、ナノ粒子の空洞内に活性成分を隔離することによって、またはナノ粒子表面に活性成分を共有結合させることによって、医薬成分の投与を必要とする任意の疾患を治療するために使用され得る。ナノ粒子はまた、ナノ粒子の空洞内にイメージング剤を隔離することによって、またはナノ粒子表面にイメージング剤を共有結合させることによって、診断、さらに具体的には疾患の画像化のために使用することもできる。
本発明のＨＦｔナノ粒子は、任意の疾患、好ましくは癌を含む過剰増殖性の疾患、例えば、癌腫、神経膠腫、中皮腫、黒色腫、肉腫、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、バーキットリンパ腫、頭頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、膵癌、肝胆道癌、膀胱癌、小腸癌、直腸癌、腎癌、胆嚢癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｘ ｃａｎｃｅｒ）、膣癌、子宮癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵内分泌癌、カルチノイド腫瘍、骨癌、皮膚癌、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（他の種類の癌については、ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．２００８ Ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）の治療のために対象に投与することができる。
一実施形態によれば、ＨＦｔナノ粒子は、例えば内部空洞に挿入された１つ以上のシステインを使用して、チオール反応性モチーフを含むあらゆる分子、例えば、薬物、リンカー、フルオロフォアなどに結合される。好ましい一実施形態によれば、ＨＦｔナノ粒子は、内部空洞に挿入された１つ以上のシステインを使用して、ドキソルビシンの６マレイミドカプロイルヒドラゾン誘導体（ＤＯＸ ＥＭＣＨ）、またはリンカーマレイミドプロピオン酸および薬物Ｇｅｎｚ ６４４２８２をカプセル化する。
以下の例は、例示の目的で提供され、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものではない。
例
例１
ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ融合タンパク質の発現ベクターの構築
タンパク質凝集を減少させ、安定性を増大させる試みとして、各ＨＦｔサブユニットに融合したＰＡＳ配列を形成する外側シールドに、負に帯電した残基を導入することを決定した。実際に、以前に得られたＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ構築物の分析から、４０残基のＰＡＳ配列内に２つのグルタマート残基を導入すると、２４量体内のサブユニットアセンブリに影響を与えることなく、異なる２４量体アセンブリ間の凝集を防止するのに十分な静電反発力が引き起こされることが示唆された。構築物の表面上の負電荷をできるだけ分散させるために、グルタミン酸残基を２０残基の距離に配置した。
３つの異なる配列、すなわち、ＨＦｔ（配列番号１）、ＭＰ（配列番号５）およびＰＡＳＥ（配列番号１０）を１つの単一配列に組み合わせることによって、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ遺伝子を得た。この構築物は、ＰＡＳ配列内の２つのアミノ酸置換、すなわち、アラニン１３の代わりのグルタマートおよびアラニン３３の代わりのグルタマートについてのみ、以前に開示されたＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ構築物（以前はＨＦｔ ＭＭＰ ＰＡＳ ４０と名付けられた；国際公開第２０１６０５１３４０号）とは異なる。これら２つの構築物を使用して、この新規特許に開示されているあらゆる比較実験を行った。
ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（ドイツ）を使用して、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ遺伝子を含むｐＥＴ １１ａ発現ベクターを合成した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での高レベルの発現のためのコドン最適化を考慮して遺伝子合成を行った。
組換えタンパク質技術を用いて融合タンパク質ＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳＥを得、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ（約１５０ｍｇ／Ｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞培養物）と同様に、高収率で細胞可溶性画分から精製した。ネイティブの条件下でアガロースゲル電気泳動を行うことによって、タンパク質表面に挿入された負に帯電したグルタマート残基（タンパク質１つ当たり４８）のタンパク質移動度に及ぼす影響を評価した（図１）。変性剤ＳＤＳ ＰＡＧＥとは異なり、ネイティブ電気泳動では、タンパク質移動度は、タンパク質の電荷および分子量の両方に依存する。後者がＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳおよびＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳＥでは同等であると仮定すると、観察されたタンパク質移動度の差は、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ構築物内の付加的な負電荷に起因しなければならない（図２）。
例２
化学療法薬を担持するＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳおよびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥの調製
本発明者は、化学療法剤として、薬物ミトキサントロン（ＭＩＴ）またはピクサントロン（ＰＩＸ）が使用された例を報告した。Ｆａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１７（２）：５１４ ２２に開示されているプロトコルに従って、ｐＨの関数としてタンパク質アンカップリングカップリング（ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）プロセスを利用することによって、融合タンパク質のタンパク質空洞内にこれらの薬物をカプセル化した。分解／再組立て手順を図３に示す。
例３
薬物ミトキサントロンおよびピクサントロンのカプセル化収率の試験
ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥでのＭＩＴまたはＰＩＸカプセル化の効率と、天然のＨＦｔの効率、およびＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳでの効率とを比較した（図４）。行った実験ではいずれも、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥは、反応の終了時に回収されたタンパク質の量に関して、天然のＨＦｔ、およびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳの両タンパク質よりも優れている。これは、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥの方が安定であり、タンパク質薬物複合体の形成中に溶液から凝集／沈殿しないことを示している。
例４
タンパク質ミトキサントロン複合体の均一性および安定性の試験
ＭＩＴを添加したＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ複合体は、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ対応物よりも可溶性かつ単分散性であり、溶液中に高分子量種を示さなかった（図５）。動的光散乱（ＤＬＳ）実験により、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴ試料は、本発明者らが以前に報告したＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ－ＤＯＸ（薬物としてドキソルビシンを含有する）とほぼ同じサイズを有し、平均直径は１７．０±１．１ｎｍであることが示された（図５Ｂ）。これらの結果は、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴにグルタマート残基を挿入すると、驚くべきことに、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ対応物に比べてはるかに高いタンパク質可溶性および均一性がもたらされ、溶液中でのＭＩＴ媒介タンパク質間相互作用が防がれる可能性が高いことを示している。さらに、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥと比較してＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳに観察された２４量体当たりのＭＩＴ分子の数がわずかに多い（５５．０対４９．０）のは、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ構築物の表面にＭＩＴ分子が存在し、これによりタンパク質タンパク質凝集が促進され得るためと考えることができる。
溶液を４℃または３７℃のＰＢＳ中で２カ月保存し、サイズクロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析によって７日ごとにＭＩＴ含有量を評価することによって、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴ複合体の安定性を試験した。ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴは優れた安定性を示し、４℃で２カ月保存した後に１０％未満のＭＩＴが放出され（図６）、混濁または沈殿の兆候はなかった。
例５
ＨＦｔベースのナノ担体の細胞内在化および局在化の試験
ＭＩＴを含有するＨＦｔベースの構築物が細胞表面結合および／または内在化を受けるかどうかを決定するために、それらを大腸癌細胞ＳＷ４８０およびＳＷ６２０と３７℃で１時間または３時間インキュベートし、共焦点顕微鏡によってＭＩＴ関連の蛍光を可視化した。
図７は、ＳＷ４８０（上部パネル）およびＳＷ６２０（下部パネル）細胞株内のＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳＥ ＭＩＴの局在化を示す。核膜マーカーラミンＡ／Ｃ（緑）による染色によって示されるように、３時間のインキュベーション後、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴは両細胞株の核に大量に蓄積する。特に、ＭＩＴは、結腸癌細胞および乳癌細胞に関して以前に提案されたように、サイズ、位置および形状に基づいて核小体であると想定される核内構造に局在する。
遊離ＭＩＴ、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ－ＭＩＴまたはＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ ＭＩＴを用いて処理した細胞間の比較を図８に示す。いずれの場合もＭＩＴは細胞核内に局在するが、遊離ＭＩＴおよびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ－ＭＩＴの場合、薬物は細胞質にも部分的に存在する。全体として、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴを用いて処理した細胞は、核内にＭＩＴの最も高い蓄積を示した。
例６
インビトロでのＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳＥ ＭＩＴの抗増殖効果
ＭＩＴを添加したＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥがインビトロで癌細胞を殺傷する能力を評価するために、様々な起源の広範囲のヒト癌細胞、すなわち、線維肉腫ＨＴ１０８０癌細胞；トリプルネガティブ乳癌ＭＤＡ ＭＢ ２３１癌細胞；膵癌ＰａＣａ４４、Ｃａｐａｎ１およびＭｉａＰａＣａ２癌細胞；結腸直腸癌ＳＷ４８０およびＳＷ６２０癌細胞に対してＸＴＴ生存率アッセイを行った。
ＭＩＴが、ＨＦｔ ＭＰ ＰＡＳＥ構築物にカプセル化された後、その薬理活性を維持しただけでなく、ＭＩＴを添加したナノ担体は、試験されたあらゆる細胞株で裸のＭＩＴと同様のＩＣ５０値を示し、場合によってはさらに低いＩＣ５０値を示した（図９を参照）。これは、裸の薬物は細胞内に自由に拡散することができるが、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ構築物は、律速受容体（ｒａｔｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が媒介する取り込みを受けることによってのみＭＩＴを送達することができるという点で注目に値する。さらに、新しいナノ系ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＭＩＴは、膵臓細胞株に対して、現在使用されている薬物ゲムシタビンの約１０倍の殺傷効果を示した（すなわち、Ｐａｃａ４４細胞、Ｃａｐａｎ１細胞およびＭｉａＰａＣａ２細胞それぞれについて、０．４３対６．７５μＭ、０．１０対２．８μＭおよび０．０７対１．１５μＭ）。
例７
マウスを対象としたドキソルビシン含有化合物の生体内分布実験
腫瘍および臓器の薬物蓄積に関してＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥがＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳに匹敵するかどうかを比較するために、薬物を用いて両融合タンパク質をカプセル化した。両融合タンパク質が、ミトキサントロン薬物とは対照的に、ドキソルビシン（ＤＯＸ）をカプセル化する点で類似した能力を有するため、薬物としてドキソルビシン（ＤＯＸ）を選択した。裸の薬物Ｄｏｘ、またはフェリチンベースの化合物、すなわち、天然のＨＦｔ、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳおよびＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ内にカプセル化されたドキソルビシンのヒト膵腫瘍（異種移植片）を担持するマウスに静脈内注射した２４時間後に、Ｄｏｘの血漿中濃度を計算した。図１０は、ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥの方が、血清中での安定性が高く、腫瘍への蓄積も高いことを示している。
例８
ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－ＣｙｓまたはＧｌｕ融合タンパク質のための発現ベクターの構築
フェリチン空洞内の薬物結合を改善および促進する試みとして、タンパク質表面からシステイン残基を除去し、タンパク質空洞に追加のシステイン残基またはグルタマート残基を導入することを決定した。このようにして、チオール反応性モチーフまたは正に帯電したモチーフを含むあらゆる分子、例えば、薬物、リンカー、フルオロフォアなどを非常に効果的な方法で内部空洞に結合することが可能である。図１１および図１２は、ＨＦｔベースのナノ粒子の製造および合成の略図であり、ここで、以前に示されたＮ末端修飾（ＨＦｔ－ＭＰ－ＰＡＳ）に加えて、天然のシステイン残基はセリン残基により置換され、非天然のシステイン残基またはグルタマート残基（赤い球形内）は内部空洞に含まれる（ＨＦｔ－Ｃｙｓ－ＭＰ－ＰＡＳＥまたはＨＦｔ Ｇｌｕ ＭＰ ＰＡＳＥ）。図１３は、新規ＨＦｔ－Ｃｙｓ２－ＭＰ－ＰＡＳＥタンパク質（モノマー１つ当たり４つの非天然のシステイン、２４量体当たり９６を含有）がドキソルビシンの６マレイミドカプロイルヒドラゾン誘導体（ＤＯＸ ＥＭＣＨ）をカプセル化する能力を示す。同じ図に、ＨＦｔ－Ｃｙｓ－ＭＰ－ＰＡＳＥがリンカーマレイミドプロピオン酸および薬物Ｇｅｎｚ ６４４２８２をカプセル化する能力も示されている。同じ図に、ＨＦｔ－Ｇｌｕ－ＭＰ－ＰＡＳＥが遊離薬物ミトキサントロンまたはＧｅｎｚ６４４２８２をカプセル化する能力も示されている。１つの修正を含むが、Ｆａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１７（２）：５１４ ２２に開示されているプロトコルに従って、ｐＨの関数としてタンパク質アンカップリングカップリングプロセスを利用することによって、融合タンパク質のタンパク質空洞内にこれらの薬物をいずれもカプセル化した。マレイミド含有分子を使用する反応では、低ｐＨ値による分子損傷の可能性を回避するために、ｐＨ酸工程の後にこれらをｐＨ６．５～７．５で加えた。また、リンカーマレイミドプロピオン酸および薬物Ｇｅｎｚ６４４２８２を使用する反応では、前者を薬物の前にリンカー／チオール比１．２：１で加えた。
タンパク質回収率と、コンジュゲートした薬物分子の数とに関して相対収率が示されている。
例９
インビトロでのＨＦｔ－Ｇｌｕ－ＭＰ－ＰＡＳＥ Ｇｅｎｚ ６４４２８２の抗増殖効果
増殖を試験するために、ヒト肉腫（ＨＴ１０８０およびＡ２０４）細胞、ヒト乳癌（ＭＤＡ ＭＢ ２３１）細胞、ヒト黒色腫（Ｃｏｌｏ３８）細胞およびヒト膵癌（ＰａＣａ４４およびＭｉａＰａＣａ２）細胞を、３７℃で２００μｌの完全培地中に約５×１０３／ウェルで９６ウェル１５プレート上に播種した。翌日、ウェルに、Ｇｅｎｚ６４４２８２では様々な濃度で、Ｇｅｎｚ６４４２８２またはＨＦｔ Ｇｌｕ ＭＰ ＰＡＳＥ Ｇｅｎｚ６４４２８２を３連で投与し、細胞を７２時間培養した。培養の最後の４時間の間、３（４，５ジメチルチオゾール２イル）２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の還元によって細胞生存率を評価した。合計１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを各ウェルに加え、試料を３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、ホルマザン結晶を１００μＬのジメチルスルホキシドに溶解させた。５５０ｎｍで吸光度を測定した。
培養癌細胞に対するＨＦｔ Ｇｌｕ ＭＰ ＰＡＳＥ Ｇｅｎｚ６４４２８２の抗増殖効果を図１４に示す。結果は、ＨＦｔ Ｇｌｕ ＭＰ ＰＡＳＥ Ｇｅｎｚ６４４２８２が濃度依存的に、インビトロで増殖した癌細胞を効果的に阻害し、ＩＣ５０値が裸の薬物と同じかそれよりも低いことを示している。これらの結果は、潜在的な治療用途に照らして非常に重要である。同じ結果が、構築物ＨＦｔ－Ｃｙｓ－ＭＰ－ＰＡＳＥ Ｇｅｎｚ６４４２８２を使用しても得られた。
インビボでのＨＦｔ Ｇｌｕ ＭＰ ＰＡＳＥ Ｇｅｎｚ ６４４２８２の抗増殖効果
５週齢の雌のＣＤ１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、レッコ、イタリア）に、２００μｌのＲＰＭＩ １６４０培地＋１％ＢＳＡに再懸濁した４ｘ１０６ＰａＣａ－４４細胞を皮下注射（すなわち、右側腹部）した。腫瘍が約１００ｍｍ３の体積に達した際に、マウスを６匹の群に無作為化し、２００μＬの生理食塩水、Ｇｅｎｚ－６４４２８２（１．９ｍｇ／Ｋｇ）またはＨＦｔ－Ｇｌｕ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－Ｇｅｎｚ（０．９５または１．９ｍｇ／Ｋｇ）を静注した。３週間にわたり、マウスに週２回注射した。デジタルキャリパーを用いて腫瘍体積を週２回測定し、マウスの体重をモニターした。マウスの腫瘍が１５００ｍｍ３以上の体積に達した際に、動物を殺処分した。図１５に、最後の治療から約２週間後の腫瘍成長曲線を報告する。この図では、ＨＦｔ－Ｇｌｕ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－Ｇｅｎｚが癌の進行を劇的に低下させる能力が明らかであり、１００％の完全な腫瘍応答が観察される。図１６は、動物の総生存率を示している。ＨＦｔ－Ｇｌｕ－ＭＰ－ＰＡＳＥ－Ｇｅｎｚを用いて処置された全動物は疾患がなく、治療開始から１００日後に生存し、試験された化合物の大きな効果が示された。
配列表１ ＜２２３＞１ 天然のＨＦｔのアミノ酸配列
配列表２ ＜２２３＞２ ＨＦＴ変異体
配列表３ ＜２２３＞配列番号３
配列表４ ＜２２３＞配列番号４
配列表５ ＜２２３＞配列番号５
配列表６ ＜２２３＞配列番号６
配列表７ ＜２２３＞配列番号７
配列表８ ＜２２３＞配列番号８
配列表９ ＜２２３＞配列番号９
配列表１０ ＜２２３＞配列番号１０
配列表１１ ＜２２３＞配列番号１１
配列表１２ ＜２２３＞配列番号１２
配列表１３ ＜２２３＞配列番号１３
配列表１４ ＜２２３＞配列番号１４
配列表１５ ＜２２３＞配列番号１５
配列表１６ ＜２２３＞配列番号１６
配列表１７ ＜２２３＞配列番号１７
配列表１８ ＜２２３＞ＨＦｔ Ｇｌｕ配列番号１８

Claims (21)

  1. 少なくとも第１のドメイン、第２のドメイン、および第３のＮ末端ドメインを含む融合タンパク質であって、
    （ａ）前記第１のドメインが、天然のヒトフェリチンの重鎖または前記天然のヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含み、
    （ｂ）前記第２のドメインが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位のアミノ酸配列を含み、
    （ｃ）前記第３のＮ末端ドメインが、プロリン、セリンおよびアラニン、ならびに１つ、２つ、３つまたは４つグルタマートまたはアスパルタートからなり、１５～２０残基内に１つより多くのグルタマートまたはアスパルタートを含まない、少なくとも２０アミノ酸残基のポリペプチドのアミノ酸配列からなり、安定なランダムコイルコンフォメーションを形成する、融合タンパク質。
  2. 前記第３のＮ末端ドメインが、８０アミノ酸残基未満の長さを有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記第３のＮ末端ドメインが、４０～７５アミノ酸残基の長さを有する、請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記第３のＮ末端ドメインが、２０残基内に１つより多くのグルタマートまたはアスパルタートを含まない、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記第３のＮ末端ドメインのプロリン残基が、その総アミノ酸残基の１０～４０％に達する、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記第３のＮ末端ドメインが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４から選択されるポリペプチドからなる、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記第１のドメインが、配列番号１の天然のヒトフェリチンの重鎖のアミノ酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  8. 前記第１のドメインが、タンパク質表面上にシステイン残基がなく、前記融合タンパク質の内部空洞内に少なくとも１つのシステインもしくはアスパルタートもしくはグルタマートを有する、天然ヒトフェリチンの重鎖の変異体を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記天然ヒトフェリチンの重鎖の変異体が、前記融合タンパク質の内部空洞内に２つ、３つもしくは４つのシステインもしくはアスパルタートもしくはグルタマートを有する、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 前記天然ヒトフェリチンの重鎖の変異体が、前記融合タンパク質表面上にシステイン残基を有しない、請求項８または９に記載の融合タンパク質。
  11. 前記天然ヒトフェリチンの重鎖の変異体が、配列番号２、配列番号１５または配列番号１８のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の融合タンパク質。
  12. 前記天然ヒトフェリチンの重鎖の変異体が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の融合タンパク質。
  13. 前記第２のドメインが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７およびＭＭＰ９からなる群から選択されるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位のアミノ酸配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. 前記マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位の前記アミノ酸配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８からなる群から選択される、請求項１３に記載の融合タンパク質。
  15. 前記第１のドメインを前記第２のドメインに、および／または前記第２のドメインを前記第３のＮ末端ドメインにそれぞれ連結する第１および／または第２のリンカーアミノ酸配列を含み、前記第１および前記第２のリンカーアミノ酸配列が互いに同じであるか異なる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  16. 活性成分および／またはイメージング剤に連結している、請求項１から１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質の複数のモノマーを含むナノ粒子。
  18. ドキソルビシン、ミトキサントロン、ピクサントロン、Ｇｅｎｚ６４４２８２、パクリタキセル、オーリスタチン、カンプトテシン、ゲムシタビンおよび白金系から選択される活性成分が、前記ナノ粒子に連結されているか、または前記ナノ粒子内にカプセル化されている、請求項１７に記載のナノ粒子。
  19. 少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と組み合わせて、請求項１から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項１７または１８に記載のナノ粒子を含む医薬組成物。
  20. 薬剤として使用するための、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 腫瘍の治療的処置および／または診断に使用するための、請求項２０に記載の医薬組成物。
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