CN116897162A - 铁蛋白重链亚基突变体及其应用 - Google Patents

铁蛋白重链亚基突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及铁蛋白重链亚基突变体及其应用。更具体地，本发明涉及铁蛋白重链亚基突变体多肽、包含所述多肽的融合蛋白、包含所述多肽的笼状蛋白，以及它们作为药物载体的应用。

Description

铁蛋白重链亚基突变体及其应用 技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明涉及铁蛋白重链亚基突变体及其应用。更具体地，本发明涉及铁蛋白重链亚基突变体多肽、包含所述多肽的融合蛋白、包含所述多肽的笼状蛋白，以及它们作为药物载体的应用。
发明背景
铁蛋白(Ferritin)是一种大约450kDa的大蛋白，由24个亚基自组装成球形笼状结构，其内部和外部尺寸分别为大约8和大约12nm，笼状结构容纳包含多达4500个铁原子的铁核。真核生物铁蛋白包含重链(H；21kDa)和轻链(L；19kDa)。H链负责Fe(II)氧化成Fe(III)并包括催化性铁氧化酶位点，而L链在铁成核中发挥作用。H和L链共同组装成24聚体的杂聚体铁蛋白，其中H链与L链的比例根据组织特异性分布而不同。
由于铁蛋白具有可包裹药物的笼状结构、显著的稳定性、较小且均一的尺寸，本领域已经尝试将铁蛋白用作药物载体以递送药物。铁蛋白的药物递送方式可以是将药物，如小分子药物阿霉素装载在笼状空腔内，例如可见H-ferritin–nanocaged doxorubicin nanoparticles specifically target and kill tumors with a single-dose injection，Minmin Liang et.al,PNAS,vol 111(41),2014,14900-5.另外，铁蛋白因具有与受体TfR1结合的活性，其能够靶向多个高表达TfR1的肿瘤组织，并能穿越血脑屏障。如WO2015180325A1描述了仅由H链自组装成的铁蛋白(H-铁蛋白)，由于其能够与受体TfR1结合而靶向肿瘤细胞。WO2018153372A1则教导了H-铁蛋白可用作能够穿越血脑屏障的纳米药物载体。
另一种铁蛋白的药物递送方式是可将功能性分子偶联在铁蛋白外表面，该方式与包载于铁蛋白内腔的内包方式相比，可载带的药物分子类型更多，且不受铁蛋白内部空间的限制，也无需考虑到达靶部位笼内药物释放方式等问题，因此该载药方式具备更广阔的应用前景。
目前文献报道的铁蛋白外表面偶联功能性分子的方法可以通过生物学方式，如通过重组表达的方式(参考US20140234961A1)，或通过化学方式，例如Antibody–drug conjugates:targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin，Elisabetta Falvo et.al,Nanoscale,2013,5,12278-12285.重组表达的方法工艺确定，产 物明确。但其步骤多、且受生物体影响大、周期长、成本高。每设计一个铁蛋白融合表达药物，均需要经历基因序列设计、蛋白表达纯化、杂质控制的全流程，这难以满足高通量筛选、确定铁蛋白偶联药物的需要，不利于铁蛋白药物的成药开发。且该方式难以同时向铁蛋白表面偶联多种不同的功能分子，其使用场景和领域有一定的限制。相比而言，用化学方法将药物分子偶联到铁蛋白外表面则更方便灵活，可通过各种化学反应高通量、快速的将各种功能分子偶联在铁蛋白表面，并可同时偶联多种功能分子。
化学偶联法的关键在于提供优化的，适用于化学偶联场景的铁蛋白变体。因为虽然野生型铁蛋白与其它载体蛋白相比，其已然具有良好的pH和温度稳定性，且易于用原核表达的方式方便的大规模制备，但其在化学反应条件中仍无法避免的出现易聚合、易生成杂质、偶联效率低(键合率低)、偶联产物不稳定等问题。而目前对于适用于化学偶联场景的铁蛋白突变体的研究和开发甚少，本领域对此有迫切的需求。
附图简述
图1.示出铁蛋白H亚基突变体的蛋白表达结果。
图2.示出铁蛋白H亚基突变体样品的透射电镜结果。
图3.示出Mut-HFn-212、Mut-HFn-241、Mut-HFn-242和Mut-HFn-243的SEC图谱。
图4.示出偶联小分子药物SN38后的突变体的TEM结果。
图5.示出Mut-HFn-241和Mut-HFn-243偶联小分子药物SN38的RP-HPLC图谱。
图6.示出Mut-HFn-212、Mut-HFn-233、Mut-HFn-241、Mut-HFn-242和Mut-HFn-243的SN38偶联产物的SEC结果。
图7.示出偶联小分子药物CL2A-CM后的突变体的TEM结果。
图8.示出Mut-HFn-212、Mut-HFn-233、Mut-HFn-241、Mut-HFn-242、Mut-HFn-243的CM偶联产物的SEC结果。
图9.示出Mut-HFn-212、Mut-HFn-203、Mut-HFn-233、Mut-HFn-241、Mut-HFn-242和Mut-HFn-243的SN38偶联产物与TfR-1结合亲和力的测定结果。
图10.示出Mut-HFn-241和Mut-HFn-243偶联小分子药物SN38后对MDA-MB-231的细胞杀伤作用。
图11.示出Mut-HFn-241和Mut-HFn-243偶联小分子药物SN38后对HT-29的细胞杀伤作用。
发明内容
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
“铁蛋白”是指由蛋白外壳和铁内核两部分构成的储铁结构。天然情况下，铁蛋白的蛋白外壳是通常由24个亚基自组装形成的笼状蛋白结构(外径12nm，内径8nm)，而铁内核的主要成分为水铁矿。不含铁内核的铁蛋白的蛋白外壳也称为“去铁蛋白”。本文所述“铁蛋白”包括真核生物铁蛋白和原核生物铁蛋白，优选真核生物铁蛋白，更优选哺乳动物铁蛋白，例如人铁蛋白。真核生物铁蛋白通常包括重链H亚基和轻链L亚基。在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有H和L亚基的比例有所不同。然而，通过重组方式，也可以获得仅由H亚基组装成的“H铁蛋白(HFn)”或仅由L亚基组装成的“L铁蛋白(LFn)”。
本发明所述铁蛋白H亚基包括但不限于哺乳动物铁蛋白H亚基，例如人铁蛋白H亚基或马铁蛋白H亚基，优选人铁蛋白H亚基。示例性的野生型人铁蛋白H亚基包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
“笼状蛋白”，也称作“纳米笼”，是指由多个能够自组装的多肽(亚基)形成的具有内部中央空腔的三维蛋白结构，即笼状结构。组装成笼状蛋白的多肽(亚基)数目没有特别限制，只要其能够形成所述笼状结构。笼状蛋白可以具有对称结构，也可以具有非对称结构，取决于其亚基组成。典型的笼状蛋白包含铁蛋白/去铁蛋白。
“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸是相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸的聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
如本文所用，“多核苷酸”是指多个核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本发明的多核苷酸的序列可以针对不同的宿主细胞(如大肠杆菌)进行密码子优化，从而改善多肽的表达。进行密码子优化的方法是本领域已知的。
“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质 或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列。相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子。
两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的“序列相同性”指的是所述序列之间的相同的氨基酸或核苷酸的百分比。评估多肽或多核苷酸序列之间的序列相同性水平的方法是本领域已知的。序列相同性可以使用已知的各种序列分析软件评估。例如，序列相同性可以通过EMBL-EBI的在线比对工具来评估(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)。两个序列之间的序列相同性可以使用Needleman-Wunsch算法，使用默认参数来评估。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。通常，在表达构建体中，感兴趣的核苷酸序列与调控序列可操作地连接。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关感兴趣的序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控序列与目的核苷酸序列连接，使得目的核苷酸序列的转录被所述调控序列控制和调节。用于将调控序列可操作地连接于目的核苷酸序列的技术为本领域已知的。
如本文所用，“药物活性成分”或“活性药物成分”或“API(Active pharmaceutical ingredient)”指的是药物中具有药理活性或能够直接影响机体功能的物质。通常而言，“药物活性成分”并不包含药物载体或赋形剂。
本文使用的“药学上可接受的赋形剂”是指在配制药物产品中所用的没有药理活性且无毒的任意成分，包括但不限于崩解剂、粘合剂、填充剂、缓冲剂、张力剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂或润滑剂。
如本文所用，“有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病的症状所必需的量。
二、铁蛋白重链(H)亚基的突变体多肽
为了改善铁蛋白重链亚基作为药物载体性质，发明人之前已经获得铁氧中心和/或半胱氨酸位点突变的改良的突变体(PCT/CN2020/101312)。
作为药物载体，铁蛋白可以通过其表面上的巯基(SH)化学偶联至功能性分子(抗体、示踪分子、小分子肽)，从而获得铁蛋白-功能性分子缀合物。在之前工作的基础上，本发明人进一步对铁蛋白H亚基进行了改造，从而提供更灵活的偶联位点，降低副反应和提高偶联产物的均一性，并减少铁蛋白聚集，提高铁蛋白的可溶性。出乎意料的是，本发明的铁蛋白H亚基突变体还具有显著提高的化学偶联反应效率(键合率)。
因此，在一个方面，本发明提供一种铁蛋白重链(H)亚基突变体多肽，其相对于野生型铁蛋白H亚基，包含在对应于SEQ ID NO:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸取代。
不受任何理论限制，据认为在对应于SEQ ID NO:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸被亲水性更高的氨基酸取代将会增加铁蛋白的亲水性，减少其聚集。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸被亲水性更高的氨基酸例如带羧基侧链的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述带羧基侧链的氨基酸包括谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)或组氨酸(H)。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，也称作N98D取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代，也称作K108E取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被组氨酸(H)取代，也称作R156H取代。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，且在对应于SEQ ID NO:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，在对应于SEQ ID NO:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代，且在对应于SEQ ID NO:1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被组氨酸(H)取代。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的第27位、第61位、第62位和/或第65位的位置处的氨基酸取代。不受任何理论限制，根据之前的研究结果，据认为在 对应于SEQ ID NO:1的第27位、第61位、第62位和/或第65位的位置处的氨基酸取代可以降低所形成的铁蛋白的储铁能力，从而使得所述铁蛋白在用作药物载体时具有更高的安全性。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第27位的位置处的谷氨酸(E)被取代为苯丙氨酸(F)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第61位的位置处的谷氨酸(E)被取代为色氨酸(W)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(E)被取代为赖氨酸(K)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(H)被取代为甘氨酸(G)。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(E)被取代为赖氨酸(K)，且在对应于SEQ ID NO:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(H)被取代为甘氨酸(G)。
野生型人铁蛋白H亚基上有3个巯基，分别位于第2-3段α螺旋之间的Loop区(野生型人铁蛋白H亚基第90位半胱氨酸的巯基)，第3段α螺旋上(野生型人铁蛋白H亚基第102位半胱氨酸的巯基)，第4段α螺旋近三重对称轴区(野生型人铁蛋白H亚基第130位半胱氨酸的巯基)。然而，在缀合过程中，若存在多个反应位点，则无法控制缀合的具体位置、以及功能性分子与HFn的反应比例。
因此，在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽包含减少的半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第90、102和130位的位置处的半胱氨酸的至少一个被取代。在一些实施方案中，所述半胱氨酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、甘氨酸，优选被丝氨酸或被野生型铁蛋白轻链(L)亚基多肽相应位置处的氨基酸取代。示例性的野生型铁蛋白轻链(L)亚基多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第90位的位置处包含半胱氨酸，和
在对应于SEQ ID NO:1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代，
任选地，在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第102位的位置处包含半胱氨酸，和
在对应于SEQ ID NO:1的第90位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或谷氨酸取代，
任选地，在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
此外，还可以通过仅在铁蛋白H亚基的loop区(对应于SEQ ID NO:1的第79-91位氨基酸)包含一个半胱氨酸，同时去除其它表面巯基，也可以使得每个铁蛋白亚基仅保留一个供化学缀合的位点。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在loop区中包含一个半胱氨酸，在对应于SEQ ID NO:1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，以及任选地，在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代。在一些实施方案中，除了loop区中的一个半胱氨酸和任选的在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸，所述突变体多肽不包含另外的半胱氨酸。在一些优选实施方案中，所述突变体多肽在loop区外不包含半胱氨酸。
在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第90和102的位置处的半胱氨酸被取代，任选地，在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代；且所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第90、102和130位的位置处的半胱氨酸被取代；且所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第79位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被半胱氨酸(C)取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第80位的位置处的氨基酸例如异亮氨酸(I)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第81位的位置处的氨基酸例如苯丙氨酸(F)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第82位的位置处的氨基酸例如亮氨酸(L)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第83位的位置处的氨基酸例如谷氨酰胺(Q)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第84位的位置处的氨基酸例如天冬氨酸(D)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第85位的位置处的氨基酸例如异亮氨酸(I)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第86位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被半胱氨酸取代。在一些 实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第87位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第88位的位置处的氨基酸例如脯氨酸(P)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第89位的位置处的氨基酸例如天冬氨酸(D)被半胱氨酸取代。在一些实施方案中，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第91位的位置处的氨基酸例如天冬氨酸(D)被半胱氨酸取代。
在一些具体实施方案中，所述突变体多肽包含SEQ ID NO:5-8中任一所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述突变体多肽能够组装成笼状蛋白和/或能够在组装成笼状蛋白后赋予所述笼状蛋白特异性结合TfR1受体的能力。
三、多核苷酸、表达构建体、宿主细胞和铁蛋白H亚基突变体多肽制备方法
在另一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其包含编码本发明的重组铁蛋白H亚基多肽的核苷酸序列。
在一些实施方式中，本发明的多核苷酸包含例如选自SEQ ID NO:14-16之一的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种表达构建体，其包含与表达调控序列可操作地连接的本发明的多核苷酸。
用于本发明的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞DNA中并和宿主细胞DNA一起复制的载体。可商购获得许多适于本发明的载体。在一个具体实施方案中，本发明的表达构建体衍生自Novagen公司的pET22b。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸或以本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽。
可用于表达本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。在优选的实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属细胞，优选是大肠杆菌。在本发明的一个具体实施方案中，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株细胞。
可以通过许多已熟知的技术之一将本发明的重组表达构建体导入宿主细胞，这样的技术包括但不限于：热激转化，电穿孔，DEAE-葡聚糖转染，显微注射，脂质体接介导的转染，磷酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击， 病毒转化及类似技术。
在另一方面，本发明提供了一种产生本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽的方法，包括：
a)在允许多肽表达的条件下培养本发明的宿主细胞；
b)从得自步骤a)的培养物获得由所述宿主细胞表达的多肽；及
c)任选进一步纯化得自步骤b)的多肽。
然而，本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽也可以通过化学合成的方法获得。
四、多肽缀合物
在另一方面，本发明提供一种多肽缀合物，其包含本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽和通过所述铁蛋白H亚基突变体多肽的巯基与其缀合的功能性部分。
在一些实施方案中，所述功能性部分选自治疗性分子、可检测分子或靶向性分子。
所述治疗性分子包括但不限于小分子药物、治疗性多肽、治疗性抗体等。示例性的治疗性小分子包括但不限于毒素、免疫调节剂、拮抗剂、细胞凋亡诱导剂、激素、放射性药物、抗血管生成剂、siRNA、细胞因子、趋化因子、前药、化疗药物等。在一些具体实施方案中，所述治疗性分子是7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)。SN38的结构如下式所示：
在一些实施方案中，所述治疗性分子是喜树碱类毒素吉咪替康(CM)。CM的结构如下式所示：
所述可检测分子包括但不限于荧光分子、发光化学物质、酶、放射性同位素、标签等。
所述靶向性分子包括但不限于靶向性抗体、特异性受体配体等。例如，所述靶向性分子可以是特异性靶向肿瘤抗原的抗体。
在一些实施方案中，所述功能性部分通过接头与所述铁蛋白H亚基突变体多肽缀合。
在一些实施方案中，所述多肽缀合物能够组装成笼状蛋白和/或能够在组装成笼状蛋白后赋予所述笼状蛋白特异性结合TfR1受体的能力。
在一些实施方案中，所述多肽缀合物是分离的多肽缀合物，例如，其没有组装成笼状蛋白。在一些实施方案中，所述多肽缀合物包含于笼状蛋白中。
五、笼状蛋白
由于保留了野生型铁蛋白H亚基的自组装能力和/或受体结合能力，本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽在合适的介质中可以独自组装成笼状蛋白(即H铁蛋白/去铁蛋白)，也可以与铁蛋白L亚基或其他铁蛋白H亚基或其它自组装多肽形成笼状蛋白，并且能够赋予所述笼状蛋白特异性靶向能力。
因此，在另一方面，本发明提供一种笼状蛋白，其包含至少一个本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽和/或本发明的多肽缀合物。
示例性的所述笼状蛋白可以包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、或48个本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽和/或本发明的多肽缀合物。在一些优选实施方案中，所述笼状蛋白包含24个本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽和/或本发明的多肽缀合物。
在一些实施方案中，所述笼状蛋白仅包含本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽和/或本发明的多肽缀合物，例如，仅包含本发明的多肽缀合物。例如，在一些优选实施方案中，所述笼状蛋白由24个本发明的多肽缀合物组装形成。
在一些实施方案中，所述笼状蛋白包含多个本发明的多肽缀合物，所述多个本发明的多肽缀合物包含相同的或不同的功能性部分。
在一些实施方案中，所述笼状蛋白还包含铁蛋白L亚基。在一些实施方案中，所述笼状蛋白包含至少一个本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽和至少一个铁蛋白L亚基，优选地，所述铁蛋白H亚基突变体多肽与铁蛋白L亚基的比例范围例如可以是1:23-23:1。
在一些实施方案中，所述笼状蛋白不包含铁蛋白L亚基。
六、缀合方法
本领域已知多种将功能性分子通过巯基与蛋白质缀合的方法，这些都可以应用于本发明。本领域技术人员可以根据具体的功能性分子以及所选的接头确定合适的缀合方法。示例性的方法可以参考Moon,S.J.,et al.,Antibody conjugates of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin(SN-38)for targeted cancer chemotherapy.J Med Chem,2008.51(21):p.6916-26。
在一方面，本发明提供一种制备本发明的笼状蛋白的方法，所述笼状蛋白包含至少一个本发明的多肽缀合物，所述方法包括：
a)使功能性分子缀合至解聚的本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽，和
b)使缀合有所述功能性分子的铁蛋白H亚基突变体多肽重组装成笼状蛋白。
在一些实施方案中，所述功能性分子通过接头缀合至解聚的本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽。
在一些实施方案中，所述功能性分子是SN38。在一些实施方案中，其中步骤a)包括使下式所示化合物(带有接头的SN38)与解聚的本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽接触，
在一些实施方案中，所述功能性分子是CM。在一些实施方案中，其中步骤a)包括使下式所示化合物(带有接头的CM)与解聚的本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽接触，
在一方面，本发明提供一种制备本发明的笼状蛋白的方法，所述笼状蛋白包含至少一个本发明的多肽缀合物，所述方法包括：
a)提供包含至少一个本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽的笼状蛋白，和
b)使功能性分子缀合至所述笼状蛋白中的本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽。
在一些实施方案中，所述功能性分子通过接头缀合至所述笼状蛋白中的本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽。
在一些实施方案中，所述功能性分子是SN38。在一些实施方案中，其中步骤b)包括使下式所示化合物(带有接头的SN38)与所述笼状蛋白接触。
在一些实施方案中，所述功能性分子是CM。在一些实施方案中，其中步骤b)包括使下式所示化合物(带有接头的CM)与所述笼状蛋白接触
七、笼状蛋白-API复合物
在另一方面，本发明提供一种笼状蛋白-API复合物，其中所述笼状蛋白-API复合物包含本发明的笼状蛋白，以及装载在所述笼状蛋白内部的药物活性成分(API)。
在一些实施方案中，所述复合物中的笼状蛋白包含本发明的多肽缀合物，所述缀合物包含本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽和治疗性分子。缀合有治疗性分子的本发明的笼状蛋白可以以两种不同的方式同时递送不同的治疗有效成分。
在一些实施方案中，所述复合物中的笼状蛋白包含本发明的多肽缀合物，所述缀合物包含本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽和可检测分子。缀合有可检测分子的本发明的笼状蛋白可以用于监测(例如实时监测)药物的递送。
在一些实施方案中，所述复合物中的笼状蛋白包含本发明的多肽缀合物，所述缀合物包含本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽和靶向性分子。缀合有靶向性分子的本发明的笼状蛋白可以在体内靶向另外的治疗性靶标。
装载在所述笼状蛋白内部的所述药物活性成分(API)并没有特别限制，只要其适合于装载于本发明的所述笼状蛋白中，例如，所述API不会破坏笼状蛋白的笼状结构和/或其大小适合于被所述笼状结构容纳。所述API的实例包括但不限于烷基化剂、铂类、抗代谢类、肿瘤抗生素类药物、天然提取物、激素类、放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂、麻醉剂。
八、药物组合物及其应用
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽、本发明的多肽缀合物、本发明的笼状蛋白和/或本发明的笼状蛋白-API复合物，以及药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽或本发明的多肽缀合物，以及任选的有效量的API，其中所述铁蛋白H亚基突变体多肽、本发明的多肽缀合物以未组装成笼状蛋白的形式提供。所述铁蛋白H亚基突变体多肽或多肽缀合物，可以在体外或在递送至体内后，在适合条件下，自组装为笼状蛋白或笼状蛋白-API复合物。
在一些实施方案中，在本发明的多肽缀合物包含治疗性分子的情况下，包含本发明的多肽缀合物的药物组合物可以不包含额外的API。
本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、笼状蛋白-API复合物和/或药物组合物可以用于治疗和/或预防的疾病取决于其所 包含的治疗性分子或API。并且，由于本发明的笼状蛋白具有肿瘤靶向能力和血脑屏障穿透能力，特别适合于治疗肿瘤或脑部疾病。此外，如果本发明的多肽缀合物包含靶向性分子，则取决于该靶向性分子的靶标，本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、笼状蛋白-API复合物和/或药物组合物也可以用于其它疾病。
脑部疾病的实例包括但不限于，例如脑瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中、癫痫、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症。所述肿瘤的实例包括但不限于，例如结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌以及各种造血系统癌如Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌、白血病。
在另一方面，本发明提供本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、笼状蛋白-API复合物和/或药物组合物在制备药物中的用途。在一些实施方案中，所述药物例如用于治疗肿瘤或脑部疾病。
在另一方面，本发明提供一种在对象中治疗和/或预防疾病的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、笼状蛋白-API复合物和/或药物组合物。所述疾病如上文所定义，优选是肿瘤或脑部疾病。
本发明的多肽、本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽、多肽缀合物、笼状蛋白、笼状蛋白-API复合物和/或药物组合物可通过本领域普通技术人员已知的任何适当方法进行施用(参见例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，”第21版，2005)。药物组合物例如可通过静脉内、肌肉内、腹腔内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜腔内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用。
九、制备笼状蛋白-API复合物的方法
在另一方面，本发明提供一种制备本发明的笼状蛋白-API复合物的方法，所述方法包括使本发明的铁蛋白H亚基突变体多肽、本发明的多肽缀合物和/或本发明的笼状蛋白与API接触，由此获得笼状蛋白-API复合物。
在一些实施方案中，所述方法包括：
a)使解聚的本发明的笼状蛋白与API接触；和
b)重组装所述笼状蛋白，由此获得笼状蛋白-API复合物。
如本发明所用，“解聚”指的是在一定条件下，笼状蛋白的紧密闭合球状结构被打开，使其全部亚基或部分亚基相互分离的过程，所述条件例如是蛋白变性条件，例如含高浓度脲的缓冲溶液。
如本发明所用，“重组装”指的是通过改变条件例如更换成生理学相容条件，使解聚的笼状蛋白，即分离的亚基重新自组装成笼状蛋白的过程。 在笼状蛋白的重组装过程中，API将会被包裹在其内部，从而形成笼状蛋白-API复合物。所述生理学相容条件例如是生理缓冲溶液。
在一些实施方案中，所述方法在步骤a)之前还包括使本发明的笼状蛋白解聚的步骤。在一些实施方案中，其中通过在高浓度(例如至少6M，优选8M)的脲存在下使本发明的笼状蛋白解聚。在一些实施方案中，其中通过逐步降低脲浓度(例如梯度透析)来重组装所述笼状蛋白。
在一些实施方案中，所述方法包括：
a)在非解聚条件下，使本发明的笼状蛋白与API接触，由此允许API结合至所述笼状蛋白和/或装载至所述笼状蛋白的内部中央空腔，
b)获得笼状蛋白-API复合物。
在一些实施方式中，所述非解聚条件包括使所述笼状蛋白和API置于生理可接受的缓冲液中。合适的生理可接受的缓冲液包括但不限于PBS溶液、生理盐水、纯水、HEPES缓冲液等。
在一些实施方案中，API通过被动扩散穿梭至所述笼状蛋白的内部中央空腔。通过使所述笼状蛋白和API至于生理可接受的缓冲液中，API可以在笼状蛋白不解聚的情况下通过扩散的方式进入笼状蛋白的内部内腔中。
实施例
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
实施例1、构建具有提高键合率和水溶性的人H-铁蛋白
1.1铁蛋白H亚基突变的设计
根据人铁蛋白H亚基的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1；参见PDB:3AJO_A)设计H亚基突变体的氨基酸序列，对H亚基中可能涉及铁装载的位点进行了突变，涉及第62位的谷氨酸(E62)和第65位的组氨酸(H65)的铁氧中心位点。同时为增加铁蛋白的亲水性，减少聚集，将第108位的带氨基侧链的赖氨酸(K108)用带羧基侧链的氨基酸取代；将第98位的天冬酰胺(N98)用带羧基侧链的氨基酸取代；和/或将第156位的带氨基侧链的精氨酸(R156)用带羧基侧链的氨基酸取代。所有的氨基酸位置均参考SEQ ID NO:1。同时，为增加铁蛋白偶联药物的均一性，将H亚基的三个活性巯基位点中的两个(第90位和第130位)突变成为其它氨基酸，仅保留第102位的半胱氨酸作为偶联位点。
突变体的具体设计见表1。所得亚基突变体分别命名为Mut-HFn-240 (SEQ ID NO:5)、Mut-HFn-241(SEQ ID NO:6)、Mut-HFn-242(SEQ ID NO:7)和Mut-HFn-243(SEQ ID NO:8)。
此外，将突变体Mut-HFn-212(SEQ ID NO:2)、Mut-HFn-233(SEQ ID NO:3)和Mut-HFn-203(SEQ ID NO:4)作为对照，该突变体未进行亲水性位点和铁装载相关位点的改良，仅保留了1个Cys作为化学偶联位点，将其它两个在外表面的Cys进行突变(C102S和C130S)。
表1、HFn突变体的设计
1.2 H-铁蛋白的制备和纯化
获得突变的氨基酸序列后，针对大肠杆菌对其编码序列进行了密码子优化。野生型铁蛋白以及5个突变体的密码子优化的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：9-16。野生型HFn、Mut-HFn-212、Mut-HFn-233、Mut-HFn-242的构建方法为：选择大肠杆菌表达外源蛋白的常用载体pET-30a(+)，卡那霉素抗性(Kan+)，选择Nde I和Hind III酶切位点嵌入目的基因。经酶切图谱和基因测序确证表达载体构建成功。
Mut-HFn-240、Mut-HFn-241、Mut-HFn-242的构建方法为：选择大肠杆菌表达外源蛋白的常用载体pET-28a(+)，卡那霉素抗性(Kan+)，选择Nco I和Xho I酶切位点嵌入目的基因。经酶切图谱和基因测序确证表达载体构建成功。
上述表达载体构建成功后，选择E.coli BL21(DE3)作为宿主菌，将含有目的基因的重组质粒转化至宿主菌感受态细胞中，通过含卡那霉素的抗性平板筛选阳性克隆，确定重组菌株。
重组菌株接种于1L LB培养基/2L摇瓶，37℃低速摇瓶培养至OD600 1.0左右，加入0.5mM IPTG，诱导表达3～4h后离心收菌泥。每30ml菌液 离心收集的菌泥加入25mL 20mM Tris-HCl缓冲液重悬均匀，于高压均质机1000bar破碎0.5～2min，裂解液于5000r/min离心30min，取上清送检SDS-PAGE，上样量为10μl(样品:Loading buffer＝1:1)。各蛋白的表达结果如图1所示。所有蛋白均表达在上清液中。
蛋白纯化方法包括以下步骤：上述高压均质破碎的菌体裂解液，经离心(1500rpm，10min)去除大肠杆菌菌体碎片；上清液72℃加热15分钟；沉淀杂蛋白，离心去除沉淀；上清液在排阻色谱Superdex 200pg柱上分离纯化；SDS-PAGE电泳鉴定纯度；BCA测定蛋白浓度。所有样品纯度均达到96％以上。
实施例2、铁蛋白H亚基突变体的表征
2.1.突变体HFn TEM结果
制样方法：铁蛋白样品(20μL，0.1mg/mL)在普通碳支持膜上1min，然后用2％的醋酸双氧铀清洗两遍，最后用2％的醋酸双氧铀染色一分钟。FEI Tecnai Spirit(120kV)3)电镜观察条件：使用透射电子显微镜(FEI Tecnai Spirit(120kV))观察，观察条件：HT100Kv。透射电镜结果(图2)表明，突变的H亚基多肽与野生型H亚基多肽均可形成均匀、规则的笼状蛋白结构，直径在大约12-19nm之间。
2.2突变体HFn的SEC结果
分别取1ml蛋白浓度为1mg/ml的蛋白样品，置于干净的1.5ml EP管中，取10微升样品在高效液相层析系统(Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ)通过凝胶过滤层析柱(Agilent Advance Bio SEC 300A 2.7um 7.8*300nm，色谱柱编号：ARD-007流速：0.5ml/min)SEC分析铁蛋白单体和聚体峰，流动相：50mM Tris buffer，pH7.2。检测波长：280nm柱温：25℃
SEC的结果如表2所示，图3则详细展示了Mut-HFn-212、Mut-HFn-241、Mut-HFn-242和Mut-HFn-243的SEC图谱。相同制备条件下，Mut-HFn-212的粒径稍大，且容易发生聚集。
表2
样品 粒径(nm)
Mut-HFn-212 19.23
Mut-HFn-233 20.31
Mut-HFn-203 20.98
Mut-HFn-240 14.73
Mut-HFn-241 16.97
Mut-HFn-242 16.89
Mut-HFn-243 17.076
实施例3、突变人H-铁蛋白与药物的偶联
3.1与Mal-PEG2-VC-PABC-SN-38的偶联
3.1.1偶联方法
将与接头连接的喜树碱类毒素SN-38(Mal-PEG2-VC-PABC-SN-38)作为偶联对象，与实施例1获得的突变体进行化学偶联反应。
Mal-PEG2-VC-PABC-SN-38由上海睿智化学合成制备，其结构如下：
偶联步骤：将实施例1制备的Mut-HFn-212、Mut-HFn-233、Mut-HFn-203、Mut-HFn-241、Mut-HFn-242、和Mut-HFn-243使用脱盐柱换液至5mM EDTA、75mM PB pH 8.0中。Mal-PEG2-VC-PABC-SN-38用DMF溶解。铁蛋白蛋白溶液在37℃时使用漩涡振荡器混合的同时加入DMF，然后加入上述DMF溶解的Mal-PEG2-VC-PABC-SN-38，置于37℃静置反应20min。样品在10000g条件下离心2.0min，然后使用AKTA脱盐换液于10mM Tris-HCl pH 7.0的溶液中。将脱盐后的样品浓缩后配制成蛋白浓度为20、30、40mg/mL。
3.1.2偶联产物检测
3.1.2.1 TEM形态检测
偶联小分子药物后的突变体HFn的TEM样品制备方法同实施例1，TEM结果如图4所示，各突变体偶联后仍呈笼状结构，直径为12-19nm。
3.1.2.1 RP-HPLC检测法
将3.1.1制备的偶联产物用RP-HPLC(Agilent，1260Infinity II)液相色谱柱(ACQUITY C18 1.7μm 2.1×100mm)进行分析，检测280nm、363nm波长，梯度洗脱，流动相采用：A相：0.1％TFA/水；B相：乙腈，柱温20℃，流速0.4Ml/min，进样量2ul。
梯度洗脱条件为：
时间(min) 流速(ml/min) M.P.A(％) M.P.B(％)
0 0.4 62.0 38.0
7.0 0.4 55.0 45.0
SN-38在363nm和280nm处均有吸收，以363nm为主，而铁蛋白则在280nm处有吸收峰。结果表明，所有突变体在SN-38小分子(363nm处)和铁蛋白(280nm处)出峰时间重叠，表明SN-38偶联到了铁蛋白突变体上。图5分别显示了Mut-HFn-241和Mut-HFn-243的RP-HPLC具体图谱。
同时，根据SN-38和铁蛋白在特征吸收波段的吸收峰面积，结合进样时原液浓度，计算各突变铁蛋白的载药量(键合率)。另外，偶联后的载药量、和内毒素的结果如表3所示。
其中载药量＝偶联上SN-38的HF亚基的量/总HFn亚基量*100％。
表3：HFn突变体SN-38偶联产物各参数
结果表明，突变体显示出良好的载药特性，且Mut-HFn-241、242和243比Mut-HFn-212、Mut-HFn-233、Mut-HFn-203的载药量(键合率)更高。且Mut-HFn-212、Mut-HFn-233、Mut-HFn-203易沉淀，Mut-HFn-241、242和243则更稳定，不容易发生沉淀。与对照212突变体相比，本发明的突变体与SN-38的键合率明显增加，达到15-16个/铁蛋白分子，而233键合率仅为5个/铁蛋白分子。高达15的键合率远超出ADC药物与抗体比率(DAR) 最大为8的药物负载能力，使得本发明的铁蛋白偶联药物的有效剂量更低，具备超越ADC的巨大潜力。
3.1.2.2 SEC检测法
3.1.1节制备的Mut-HFn-212、Mut-HFn-233、Mut-HFn-241、Mut-HFn-242和Mut-HFn-243偶联产物采用SEC(TSK gel G4000SWxl 7.8×300mm，8μm)检测波长280nm、363nm，柱温30℃，等度洗脱，流动相为：0.1M PB&0.2M NaCl&5％IPA，pH7.0。流速0.4Ml/min，进样量30ul。
SEC结果如图6所示，铁蛋白和小分子药物在同一位置出现峰表明两者形成了偶联产物。Mut-HFn-241、Mut-HFn-242和Mut-HFn-243与Mut-HFn-212和Mut-HFn-233相比，其生成的聚集体要少(聚集体峰小或者无)。
3.2与CM的偶联
3.2.1偶联方法
将与接头连接的喜树碱类毒素吉咪替康(CM)作为偶联对象，与实施例1获得的Mut-HFn-212、Mut-HFn-233、Mut-HFn-241、Mut-HFn-242、Mut-HFn-243进行化学偶联反应。偶联步骤同3.1.1。
CL2A-CM由苏州联宁生物科技有限公司合成制备，其结构如下：
3.2.2偶联产物检测
3.2.2.1 TEM形态检测
3.2.1节制备的偶联小分子药物后的突变体HFn的TEM样品制备方法同实施例1，TEM结果如图7所示，各突变体偶联后仍呈笼状结构，直径为12-19nm。
3.1.2.2 SEC检测法
3.2.2节制备的Mut-HFn-212、Mut-HFn-233、Mut-HFn-241、Mut-HFn-243偶联产物采用SEC(TSK gel G4000SWxl 7.8×300mm，8μm)检测，方法同3.1.2.2。
SEC结果如图8所示，结果表明CM也可成功的偶联到铁蛋白突变体上。Mut-HFn-241、Mut-HFn-243与Mut-HFn-212和Mut-HFn-233相比，其聚集体较少，偶联产物较均一。
上述样品的载药量(键合率)参见下表4：
表4：HFn突变体CM偶联产物键合率
实施例4 TfR-1亲和力实验
实验方法：
1、样品：实施例3制备的SN-38偶联产物。
2、稀释与包被：将各铁蛋白样品用包被液(碳酸缓冲液，pH9.0)稀释至0.04μg/mL，混匀后加入到酶标板中，100μL/孔，每个样品三个复孔，覆上封板膜4℃过夜。
3、封闭：酶标板用1×PBST和1×PBS各洗3次。加入封闭液(5％脱脂奶粉)300μL/孔，37℃孵育2h。
4、将人源TfR-1用蛋白稳定剂(购自湖州英创生物科技有限公司，PR-SS-002)稀释至1μg/mL(1:200)，100μL/孔，覆上封板膜，37℃孵育2h。
5、酶标板用1×PBST和1×PBS各洗3次。抗-TFR1抗体(人源)(购买自北京义翘神州科技有限公司：11020-MM02)用蛋白稳定剂稀释至0.1μg/mL(1:1000)，100μL/孔，覆上封板膜，37℃孵育1.5h。
6、酶标板用1×PBST和1×PBS各洗3次。将抗鼠IgG用偶联稳定剂稀释1：5000，100μL/孔，覆上封板膜，37℃孵育30min。
7、酶标板用1×PBST和1×PBS各洗3次。避光加入TMB一步显 色液，100μL/孔，室温下避光摇床上混匀孵育30min，立即用酶标仪测定OD 652nm。用Graphpad 6.0软件分析原始数据，做曲线图，纵坐标为吸收652nm值，横坐标为H铁蛋白(HFn)样品包被浓度。
偶联产物的亲和力结果如图9所示。结果表明，Mut-HFn-241/242/243和233的偶联产物的结合亲和力均高于Mut-HFn-212、Mut-HFn-203偶联产物，其中Mut-HFn-241/242/243偶联产物的亲和力更强。
实施例5 偶联药物药效实验
1.MDA-MB-231细胞模型
利用实施例3制备的SN-38与Mut-HFn-241、Mut-HFn-243的偶联产物在人三阴性乳腺癌MDA-MB-231(ATCC:CRM-HTB-26 TM)的BALB/c裸鼠皮下移植瘤肿瘤模型中进行药效学实验，以研究本发明的偶联药物在癌症治疗上的应用。
筛选合格的荷瘤BALB/c裸鼠24只，随机分为4组，每组6只，分别给予无菌注射用水、市售盐酸伊立替康注射液(CPT-11，60mg/kg)、Mut-HFn-241-SN38(2.5mg/kg)和Mut-HFn-243-SN38(2.5mg/kg)。尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药四周。第一次接种瘤块当天为第0天，第16天测定肿瘤体积，以后每周进行2次肿瘤体积的测量。
实验结果见图10。结果表明，Mut-HFn-241-SN38和Mut-HFn-243-SN38显示出在人结肠癌HT-29的BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型中具有显著的抑瘤效果，与高剂量的市售盐酸伊立康注射液(60mg/kg)相当。
2.HT-29细胞模型
将实施例3制备的SN-38与Mut-HFn-241、Mut-HFn-243的偶联产物在人结肠癌HT-29(ATCC:HTB 3B TM)的BALB/c裸鼠皮下移植瘤肿瘤模型中进行药效学实验，以研究本发明的组合物在癌症治疗中的应用。
筛选合格的荷瘤BALB/c裸鼠24只，随机分为4组，每组6只，分别给予无菌注射用水、市售盐酸伊立替康注射液(60mg/kg)、Mut-HFn-241-SN38和Mut-HFn-243-SN38(30mg/kg)。尾静脉注射给药，每周给药一次，连续给药四周。第一次接种瘤块当天为第0天，第13天测定肿瘤体积，以后每周进行2次肿瘤体积的测量。
实验结果见图11。本发明的Mut-HFn-241-SN-38和 Mut-HFn-243-SN-38显示出在人结肠癌HT-29的BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型中具有显著的抑瘤效果，与高剂量的市售盐酸伊立康注射液(60mg/kg)相当。
序列表
SEQ ID NO:1野生型H亚基氨基酸序列
SEQ ID NO:2 Mut-HFn-212氨基酸序列(C102S；C130S；)
SEQ ID NO:3 Mut-HFn-233氨基酸序列K86C C90E C102A C130A
SEQ ID NO:4 Mut-HFn-203氨基酸序列I80C C90S C102S C130S
SEQ ID NO:5 Mut-HFn-240(K108E；C90E；C130A；E62K；H65G)：
SEQ ID NO:6 Mut-HFn-241(K108E；N98D；C90E；C130A；E62K；H65G)：
SEQ ID NO:7 Mut-HFn-242(K108E；N98D；R156H；C90E；C130A；E62K；H65G)：
SEQ ID NO:8 Mut-HFn-243(K108E；N98D；R156H；C102A；C130A；E62K；H65G)
SEQ ID NO:9野生型H亚基核苷酸序列
SEQ ID NO:10 Mut-HFn-212的核苷酸序列
SEQ ID NO:11 Mut-HFn-233的核苷酸序列
SEQ ID NO:12 Mut-HFn-203的核苷酸序列
SEQ ID NO:13 Mut-HFn-240的核苷酸序列
SEQ ID NO:14 Mut-HFn-241的核苷酸序列
SEQ ID NO:15 Mut-HFn-242的核苷酸序列
SEQ ID NO:16 Mut-HFn-243的核苷酸序列
SEQ ID NO:17野生型铁蛋白轻链(L)亚基

Claims (38)

  1. 一种铁蛋白重链(H)亚基突变体多肽，其相对于野生型铁蛋白H亚基，包含在对应于SEQ ID NO:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸取代。
  2. 权利要求1的突变体多肽，相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位、第108位、和/或第156位的位置处的氨基酸被亲水性更高的氨基酸例如带羧基侧链的氨基酸取代。
  3. 权利要求1的突变体多肽，其中所述带羧基侧链的氨基酸选自谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)或组氨酸(H)。
  4. 权利要求1-3中任一项的突变体多肽，其中所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代。
  5. 权利要求1-3中任一项的突变体多肽，其中所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代。
  6. 权利要求1-3中任一项的突变体多肽，其中所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被组氨酸(H)取代。
  7. 权利要求1-3中任一项的突变体多肽，其中所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，且在对应于SEQ ID NO:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代。
  8. 权利要求1-3中任一项的突变体多肽，其中所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置处的氨基酸例如天冬酰胺(N)被天冬氨酸(D)取代，在对应于SEQ ID NO:1的第108位的位置处的氨基酸例如赖氨酸(K)被谷氨酸(E)取代，且在对应于SEQ ID NO:1的第156位的位置处的氨基酸例如精氨酸(R)被组氨酸(H)取代。
  9. 权利要求1-8中任一项的突变体多肽，其中相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的第62位和/或第65位的位置处的氨基酸取代。
  10. 权利要求9的突变体多肽，其中所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(E)被取代为赖氨酸(K)。
  11. 权利要求9的突变体多肽，其中所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(H)被取代为甘氨酸(G)。
  12. 权利要求9的突变体多肽，其中所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第62位的位置处的氨基酸例如谷氨酸(E)被取代为赖氨酸(K)，且在对应于SEQ ID NO:1的第65位的位置处的氨基酸例如组氨酸(H)被取代为甘氨酸(G)。
  13. 权利要求1-12中任一项的突变体多肽，其中相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽包含减少的半胱氨酸。
  14. 权利要求13的突变体多肽，其中所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第90、102和130位的位置处的半胱氨酸的至少一个被取代。
  15. 权利要求14的突变体多肽，其中所述半胱氨酸被选自以下的氨基酸取代：丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、甘氨酸，优选被丝氨酸或被野生型铁蛋白轻链(L)亚基多肽相应位置处的氨基酸取代。
  16. 权利要求14的突变体多肽，其中相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第90位的位置处包含半胱氨酸，和
    在对应于SEQ ID NO:1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代，
    任选地，在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
  17. 权利要求14的突变体多肽，其中相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第102位的位置处包含半胱氨酸，和
    在对应于SEQ ID NO:1的第90位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或谷氨酸取代，
    任选地，在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代，优选被丝氨酸或丙氨酸取代。
  18. 权利要求13的突变体多肽，其中相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在loop区中包含一个半胱氨酸，在对应于SEQ ID NO:1的第102位的位置处的半胱氨酸被取代，以及任选地，在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸被取代。
  19. 权利要求18的突变体多肽，其中除了loop区中的一个半胱氨酸和任选的在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸，所述突变体多肽不包含另外的半胱氨酸。
  20. 权利要求18的突变体多肽，其中所述突变体多肽在loop区外不包含半胱氨酸。
  21. 权利要求18的突变体多肽，其中相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第90和102的位置处的半胱氨酸被取代，任选地，在对应于SEQ ID NO:1的第130位的位置处的半胱氨酸被 取代；且所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。
  22. 权利要求18的突变体多肽，其中相对于野生型铁蛋白H亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第90、102和130位的位置处的半胱氨酸被取代；且所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89和91位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。
  23. 权利要求1的突变体多肽，其中所述突变体多肽包含选自SEQ ID NO:5-8之一的氨基酸序列。
  24. 权利要求1-23中任一项的突变体多肽，其中所述突变体多肽能够组装成笼状蛋白和/或能够在组装成笼状蛋白后赋予所述笼状蛋白特异性结合TfR1受体的能力。
  25. 一种多肽缀合物，其包含权利要求1-24中任一项的铁蛋白H亚基突变体多肽，和通过所述铁蛋白H亚基突变体多肽的巯基与其缀合的功能性部分。
  26. 权利要求25的多肽缀合物，其中所述功能性部分选自治疗性分子、可检测分子或靶向性分子。
  27. 权利要求26的多肽缀合物，所述治疗性分子选自小分子药物、治疗性多肽和治疗性抗体，例如，所述治疗性分子是SN38或CM。
  28. 权利要求26的多肽缀合物，所述可检测分子选自荧光分子、发光化学物质、酶、同位素、标签。
  29. 权利要求26的多肽缀合物，所述靶向性分子是靶向性抗体。
  30. 权利要求25-29中任一项的多肽缀合物，所述功能性部分通过接头与所述铁蛋白H亚基突变体多肽缀合。
  31. 权利要求25-30中任一项的多肽缀合物，所述多肽缀合物能够组装成笼状蛋白和/或能够在组装成笼状蛋白后赋予所述笼状蛋白特异性结合TfR1受体的能力。
  32. 一种笼状蛋白，其包含至少一个权利要求1-24中任一项的铁蛋白H亚基突变体多肽铁蛋白H亚基突变体多肽和/或至少一个权利要求25-31中任一项的多肽缀合物。
  33. 权利要求32的笼状蛋白，其包含24个所述铁蛋白H亚基突变体多肽和/或所述多肽缀合物。
  34. 权利要求32的笼状蛋白，其由24个所述多肽缀合物组装形成。
  35. 权利要求32的笼状蛋白，所述笼状蛋白包含多个所述多肽缀合物，所述多个多肽缀合物包含相同的或不同的功能性部分。
  36. 一种笼状蛋白-API复合物，其中所述笼状蛋白-API复合物包含权 利要求32-35中任一项的笼状蛋白，以及装载在所述笼状蛋白内部的药物活性成分(API)。
  37. 一种药物组合物，其包含权利要求1-24中任一项的铁蛋白H亚基突变体多肽、权利要求25-31中任一项的多肽缀合物、权利要求32-35中任一项的笼状蛋白和/或权利要求36的笼状蛋白-API复合物，以及药学上可接受的赋形剂。
  38. 权利要求1-24中任一项的铁蛋白H亚基突变体多肽、权利要求25-31中任一项的多肽缀合物、权利要求32-35中任一项的笼状蛋白/权利要求36的笼状蛋白-API复合物和/或权利要求36的药物组合物在制备药物中的用途。
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