CN111317825A - 规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体及其制备方法，该无机硅药物载体包括规则折叠的无机硅骨架；该无机硅药物载体具有超小的粒径、超大的孔道和大的比表面积。制备方法包括在含有表面活性剂和氢氧化钠的水溶液上层加入含有正硅酸四乙酯的环己烷，制得规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒；进而于酸性乙醇溶液中去掉表面活性剂得到最终产品。本发明合成方法简单，克服了制备多层无机硅纳米颗粒步骤繁杂的缺点；本发明的无机硅具有超小尺寸和超大孔道的特点，在药物递送、药物缓释方面具有巨大的应用潜力。

Description

规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体、其制备 方法及其应用
技术领域
本发明属于医用材料领域，具体涉及一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，多级结构硅纳米颗粒的合成快速发展。相较于单级结构硅，多级结构硅具有特殊的多级结构，可以提供更多的小室环境，更多的活性表面和更多的储存空间。因此，多级结构硅在能量存储，环境治理，酶工程和药物载体方面具有重要的应用潜力。更重要的是，多级结构硅纳米颗粒具有同时装载两种或者更多的药物的潜力，从而实现药物的联合治疗或者序贯治疗。另外，由于球状物体具有更低表面能，低密度和高比表面积，球状多级结构硅纳米颗粒正在成为药物载体研究的热点。但是，制造多级结构硅纳米球步骤复杂，成本高昂。另外，大分子药物如siRNA和单克隆抗体在肿瘤治疗及免疫疾病治疗方面取得了显著的疗效，而大分子药物载体可以增强药物疗效并降低药物毒副作用。
目前，多种多级结构硅纳米球已经被制备出来。例如，在经典的
Figure BDA0002402860400000011
硅合成方法中加入对苯二酚，福尔马林和正硅酸乙酯合成花粉样的球状纳米颗粒，经过高温钙化处理去除甲醛，获得的具有粗糙表面的硅纳米颗粒，其可以载运溶菌酶侵入细菌内部实现杀菌的目的(H.Song,Y.A.Nor,M.H.Yu,Y.N.Yang,J.Zhang,H.W.Zhang,C.Xu,N.Mitter,C.Z.Yu.Journal of the American Chemical Society:2016,138,20)。另外，在柔性模板法合成的基础上，引入油相，降低正硅酸乙酯水解速率，形成特殊的水-油-表面活性剂胶束，从而合成具有3D树状结构的多级硅纳米颗粒(D.Shen,J.Yang,X.Li,L.Zhou,R.Zhang,W.Li,L.Chen,R.Wang,F.Zhang,D.Zhao.Nano Lett:2014,14,923)。在此基础上，进一步降低水相中的表面活性剂浓度，可以制备具有病毒状结构的球状硅纳米颗粒，从而进一步增强其进入细胞的能力(W.Wang,P.Wang,X.Tang,A.A.Elzatahry,S.Wang,D.Al-Dahyan,M.Zhao,C.Yao,C.T.Hung,X.Zhu,T.Zhao,X.Li,F.Zhang,D.Zhao.ACS Cent Sci:2017,3,839)。张铁锐等人将高沸点油溶性有机物加入到分散有机纳米材料的低沸点溶剂中形成油相，将油相与含有活性剂的水相混合后乳化，然后蒸发去掉低沸点溶剂，在得到高沸点油性有机物和纳米材料混合的的微纳米球上覆盖二氧化硅层，通过后处理去掉高沸点有机物后，得到空心的无机硅纳米颗粒(专利申请号：201810417513.0)。虽然这些已有的多级结构硅纳米球呈现出各自的特点和用途，但是制备步骤复杂，而且这些纳米颗粒通常具有超过100nm的直径，不利于其通过网状内皮系统，具有较短的血液循环时间，不利于它们在靶点的聚集；部分多级结构硅纳米颗粒粒径小于50nm，但是他们的孔径较小，不利于大分子药物的装载。
因此，探寻一种制备方法简单，具有较小粒径和大孔道的多层级硅纳米球对于解决大分子药物装载难题具有重要意义。
发明内容
发明目的：为了突破目前多级结构硅纳米球制备过程复杂，制备具有大孔道超小尺寸的多级结构硅纳米球，实现对大分子药物的载运，本发明提供了一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒。本发明还提供一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的制备方法和应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明含有一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体，包括无机硅骨架，无机硅骨架为片层硅规则折叠的球形结构；无机硅骨架含有超大孔道。
其中，所述超大孔道有序，呈互通状，孔道孔径为9nm～14nm；规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅粒径为36～45nm,比表面积为300～800m2/g，其孔道规则有序，孔径为9nm～14nm。
具体来说，无机硅骨架具有片层规则折叠的球形结构，具有超小的尺寸，具有超大的孔道，其超大的孔道可以用于载运大分子药物(如siRNA)和化疗药物，用于肿瘤的治疗。
本发明所述的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵溶于含氢氧化钠的水溶液中，在40～60℃、600～1200rpm条件搅拌1～4h，直至生成透明溶液；所述十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0.01～0.09M,氢氧化钠浓度为0.5～1.5mM.
(2)在静置的条件下向步骤(1)中透明溶液中缓慢加入含有正硅酸四乙酯的环己烷溶液，正硅酸四乙酯和环己烷溶液的比例为0.5:10～2:10mL/mL，所述转速为逐渐从0rpm增加到200～300rpm。
(3)将步骤(2)所得的产物离心得到固体沉淀、乙醇洗涤，转移至含有100～500μL浓盐酸的300～600mL的无水乙醇溶液中，在50～60℃条件下反应3～12h去除表面活性剂，由此得到产物为规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒；
(4)将步骤(3)中得到的产物离心收集固体沉淀，无水乙醇洗涤后，溶于5％葡萄糖溶液中备用，用于载运大分子药物。
步骤(3)所述浓盐酸为市售37％以上的盐酸溶液。
本发明所述的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体在载运大分子药物和化疗药物中的应用。
作为优选，所述的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体在载运大分子药物和化疗药物抑制乳腺癌耐药细胞生长的应用。
具体的，本发明为一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的制备方法包括：将表面活性剂溶于含有氢氧化钠的水中，在加热搅拌，表面活性剂完全溶解的情况下，暂停溶液搅拌。在静置条件下加入正硅酸四乙酯和环己烷混合物，从静置开始逐渐调高转速。在搅拌的作用下，硅源从环己烷中逐渐转移到乙醇和水的混合液中，水解产生羟基，与表面活性剂亲水端产生静电作用结合在表面活性剂的表面，形成水/表面活性剂/硅源/环己烷胶束，硅源在表面活性剂外逐步缩聚生长，同时在搅拌形成的剪切力的作用下不断折叠，最终形成了规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒。通过在高温的酸性无水乙醇溶液中去除表面活性剂，产生大孔孔道。通过静电相互作用，将DOX装载于孔道中，同时在DOX表面覆盖低分子量的聚醚酰亚胺和P糖蛋白的siRNA，其可以有效抑制耐药乳腺癌的生长。
本发明制备的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅具有超小的球状尺寸和均一的粒径；无机硅球表面具有规则超大的孔道和大的比表面积；该无机硅纳米颗粒具有载运大分子药物，突破网状内皮细胞屏障作用；该产品的制备方法简单易行，经济高效，克服了现有多级结构硅制备复杂的缺点，在大分子药物载运方面具有巨大的应用潜力。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明在采用的硅源中，加入了油相环己烷，通过减慢硅源进入水相的速度，从而减缓硅源在水相的水解速度，形成了特殊结构的水/表面活性剂/硅源/环己烷胶束，从而形成了超小尺寸和大孔道的无机硅纳米颗粒；
2、本发明规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅具有超小尺寸、良好的分散性；具有高的比表面积，超大和短距孔道，有利于其载运大分子并释放到外界环境中；
3、本发明首先将十六烷基三甲基溴化铵溶于氢氧化钠水溶液中，继而在本溶液中加入正硅酸四已酯，在60℃的水浴中，短时间内(10h)完成多级结构无机硅纳米颗粒的合成，通过无水乙醇除去表面活性剂模板，得到规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒。依靠静电相互作用载运药物，合成方法简单，无需高温高压和有毒试剂。
4、本发明制备的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒可以有效减少其被网状内皮系统细胞吞噬，其超大孔径可以载运大分子药物和化疗药物，实现对耐药肿瘤细胞的序贯治疗。
5、本发明的方法还具有对设备要求低、经济高效，易于掌握、无污染等特点。
附图说明
图1为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的透射电子显微镜照片；
图2为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体低放大倍数扫描电子显微镜照片；
图3为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体高放大倍数扫描电子显微镜照片；
图4为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体高放大倍数扫描电子显微镜照片和模拟卡通图片；
图5为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体傅立叶变换红外光谱图
图6为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体核磁共振波谱图；
图7为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的氮气吸附脱附及孔径分布图；
图8为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体装载siRNA琼脂糖凝胶电泳图；
图9为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体在不同pH值条件下的siRNA释放图；
图10为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体装载DOX后在不同pH条件下药物释放图；
图11为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体装载siRNA和DOX后能够有效降低MCF-7耐药细胞株中P糖蛋白的表达；
图12为本发明制得的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体装载siRNA和DOX后可以有效杀伤MCF-7耐药细胞；
图13为本发明在不同条件下制备的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体透射电子显微镜图；
图14为本发明在不同条件下制备的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体透射电子显微镜图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
以下实施例中的所应用的原料和试剂均市售可得。
实施例1
(1)将表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵溶于含氢氧化钠的水溶液中，在60℃、1200rpm搅拌反应2h，生成透明溶液；表面活性剂0.8g，氢氧化钠水溶液，浓度12.5mM，氢氧化钠水溶液40mL。
(2)在溶液静置的条件下，向步骤(1)中的透明溶液中加入正硅酸四已酯(2mL)和环己烷(18mL)的混合物，然后逐渐增加转速至300rpm，持续反应10h。
(3)将步骤(2)所得的产物离心、取固体沉淀，转移至500mL无水乙醇溶液中，在60℃条件下加热12h去除表面活性剂，得到规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒。
实施例2
实施例2与实施例1制备方法相同，不同之处在于，步骤(1)表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵0.4g溶于含氢氧化钠的水溶液中，在60℃、1200rpm搅拌反应2h，生成透明溶液，制备出孔道形状相近的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒，如图13所示，由于表面活性记得的减少，其粒径在～45nm，。
实施例3
实施例3与实施例1制备方法相同，不同之处在于，步骤(1)表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵1.2g溶于含氢氧化钠的水溶液中，在60℃、1200rpm搅拌反应2h，生成透明溶液。
步骤(2)中，转速逐渐加速到200rpm，制备出孔道形状相近的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒，如图14所示，转速的降低导致其粒径增加到～50nm。
以上实施例中所得无机硅纳米颗粒包括规则折叠的无机硅骨架和规则超大的孔道，无机硅骨架为片层规则折叠的球形结构，所述超大孔道有序，呈互通状，孔道孔径为9nm～14nm；规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅粒径为36～45nm,比表面积为300～800m2/g，其孔道规则有序，孔径为9nm～14nm。
对上述实施例1的步骤(3)中制备的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒进行鉴定，包括透射电镜，扫描电镜，傅立叶变换红外光谱图以及29Si高分辨魔角核磁共振谱图。这些结果表明上述步骤(3)中制备的产物为一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒。同时，利用Brunauer-Emmett-Teller(BET)法对此无机硅纳米颗粒的孔容、孔径分布以及氮气吸附脱附曲线进行了测定。根据以上结果确定，本发明制备的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒的特征为：无机硅纳米颗粒的粒径为36～45nm(图1，图2，图3和图4)；无机硅纳米颗粒表面带有具有规则的互通孔道，其孔道宽度为9～14nm(图4)，可用于载运大分子和其它药物用于肿瘤的成像和治疗；傅立叶变换红外光谱图表明该无机硅纳米颗粒在1091cm-1具有典型的Si-O非对称伸缩震动带，在951cm-1有典型的Si-O对称伸缩震动带，在464cm-1具有典型的Si-O-Si弯曲震动(图5)；29Si高分辨魔角核磁共振图谱表明该无机硅纳米颗在-100～-109nm上具有典型的无机硅波谱Q3((HO)Si(OSi≡)3)和Q4(Si(OSi≡)4)(图6)；BET法测得该无机硅的孔径为9.8～13.3nm，这与扫描电镜测得的孔径值基本一致，通过氮气吸附脱附曲线得出其比表面积为748m2/g(图7)。
实施例1中所制备的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒可以有效载运大分子药物siRNA和化疗药物，杀死耐药乳腺癌细胞。
将实施例1中的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒装载大分子和化疗药物及其释放测试：
取20mg实施例1的步骤(3)中制备的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒重悬于60mL水中，加入10mg DOX，待其充分溶解后，避光置于摇床上。室温震荡12小时后，离心收集沉淀，用超纯水洗涤5次，直到离心后上清变为无色。利用紫外吸收光度仪在490nm处对收集到的上清液的吸光度进行测量，计算得到该无机硅纳米颗粒对DOX的装载量达到了120mg/g。装载有DOX的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒被命名为SNs-DOX。取上述20mg SNs-DOX溶于40mL超纯水中，将悬液逐滴加入5mL 0.004g/mL的聚醚酰亚胺的水溶液中，常温下低速搅拌反应5h，离心收集固体物质，超纯水洗涤3次后，重悬于超纯水中备用。按照siRNA与SNs-DOX重量比1:5，1:10，1:15，1:20，1:30，1:40和1:60将两者混合，室温下抚育10min。上述样品与琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液混合后加入1.5％琼脂糖凝胶样品孔中，在100V电压下，电泳5min，最后在UV下观察siRNA在琼脂糖凝胶上的分布情况，结果表明，1μg SNs-DOX可以载运0.03μg P糖蛋白的siRNA。SNs同时载运DOX和siRNA的纳米颗粒命名为SNs-DOX-siRNA(图8)。
将SNs-DOX-siRNA溶于不同pH值的磷酸缓冲液中，进行siRNA和DOX的释放试验。试验结果表明在37℃pH 7.4磷酸缓冲液中经过30min的孵育，SNs-DOX-siRNA并没有释放siRNA，但在pH 6.0和6.5的磷酸缓冲液，siRNA得到了充分释放(图9)。同样，SNs-DOX-siRNA在37℃pH 6.0的磷酸缓冲液中抚育48h，其装载的DOX释放率达到了69.32％，但是在pH 7.4的磷酸缓冲液中，其DOX释放率只有33.14％(图10)。SNs-DOX-siRNA这种酸性条件下释放药物的特点，可以有效降低其在配制SNs-DOX-siRNA时释放药物，同时保证了它只有在被细胞摄取以后，在细胞内溶菌酶的酸性条件下充分释放药物。
实施例1中所载运的P糖蛋白的siRNA序列为：5’GGAAAAGAAACCAACUGUCdTdT3’。
本实施例1制备的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒装载P糖蛋白的siRNA和DOX杀死耐药乳腺癌细胞：
MCF-7乳腺癌耐药细胞培养于含有10％胎牛血清和L-谷氨酸的Dulbecco′sModified Eagle Medium(DMEM)中，待其细胞密度长至70％，胰酶消化收集细胞，分别铺于6孔板和96孔板中，在37℃细胞培养箱中培养24h。在上述铺满细胞的孔中分别加入SNs，DOX，SNs-DOX-PEI和SNs-DOX-PEI-siRNA。在6孔板中，DOX的药物浓度定为2.79μmol，SNs-DOX-PEI和SNs-DOX-PEI-siRNA浓度根据SNs药物装载量(120mg/g)定为13.5μg/mL,SNs浓度定为10.53μg/mL。在96孔板中，DOX药物浓度定为0.36，0.55，0.82，1.24，1.86，2.79，4.19，6.29和9.43μmol，其它药物浓度如上所述，根据SNs药物装载量(120mg/g)计算得到。加入药物后，细胞继续培养48h。提取6孔板细胞中的全蛋白进行免疫组化检测，实验结果表明，P糖蛋白在SNs-DOX-PEI-siRNA处理组显著下降，而其它处理组与对照组没有明显区别，这表明规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒(SNs)能够载运大分子siRNA进入耐药乳腺癌细胞中并发挥抑制特定蛋白表达的功能，这为化疗药物发挥作用奠定了基础(图11)；对于96孔板细胞，每孔加入10μL MTS试剂，抚育1～2h后利用紫外吸收光谱仪测定其在490nm处吸光度，计算细胞活力。实验结果表明在最高处理浓度下SNs-DOX-PEI-siRNA组的细胞活力仅为35％,SNs-DOX-PEI组的细胞活力达到了75％，而DOX组，SNs组的细胞活力都超过了90％(图12)。
上述实验结果表明SNs-DOX-PEI-siRNA能够同时载运大分子siRNA和化疗药物DOX进入肿瘤细胞中，抑制P糖蛋白的表达，从而使DOX不被P糖蛋白排除胞外，进入肿瘤细胞核，诱导细胞凋亡，最终实现药物的联合治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体，其特征在于：该无机硅纳米颗粒包括规则折叠的无机硅骨架和规则超大的孔道，所述无机硅骨架为片层规则折叠的球形结构，其粒径尺寸为36～45nm，比表面积为300～800m2/g；其孔道规则有序，孔径为9nm～14nm。
2.一种权利要求1所述的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的制备方法，其特征在于：其制备方法包括如下步骤：
(1)将表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵溶于含氢氧化钠的水溶液中，在一定温度下搅拌反应，直至生成透明溶液；
(2)在静置的条件下向步骤(1)透明溶液中缓慢加入含有正硅酸四乙酯的环己烷溶液，逐渐增加转速继续反应；
(3)将步骤(2)所得的产物离心得到固体沉淀、乙醇洗涤，转移至酸性无水乙醇溶液中，加热去除表面活性剂，由此得到产物为规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵0.4～1.2g溶于含12.5mM氢氧化钠的水溶液中，使得十六烷基三甲基溴化铵的浓度为0.01～0.09M。
4.根据权利要求2所述的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中在60℃、1200rpm条件下搅拌反应直至生成透明溶液。
5.根据权利要求2所述规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述正硅酸四乙酯和环己烷溶液的比例为(0.5～2):10mL/mL，所述转速为逐渐增加至200～300rpm。
6.根据权利要求2所述规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(3)所得的产物离心得到固体沉淀、乙醇洗涤，转移300～600mL无水乙醇溶液中，在60℃条件下加热3～12h去除表面活性剂。
7.根据权利要求2所述规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述浓盐酸为市售37％以上的盐酸溶液。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述的规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体，其特征在于：药物载体在载运大分子药物的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的一种规则折叠的超小尺寸大孔道无机硅大分子药物载体通过静电吸附的方法依次装载盐酸阿霉素(DOX)和大分子药物p-多糖蛋白的siRNA，能够有效杀死耐DOX乳腺癌细胞。
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