CN111316103A - 用于预测或诊断肝疾病的组合物及利用其的肝疾病预测或诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预测或诊断肝疾病的组合物及利用其的肝疾病预测或诊断方法，更详细地，涉及用于预测或诊断非酒精性脂肪肝中的肝纤维化的标记物及利用其来进行预测或诊断的方法，若利用本发明的用于预测或诊断肝疾病的组合物，则可确认与非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化呈正相关的生长分化因子15蛋白的数值，因此可以将其有效地用于预测及诊断非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化。

Description

用于预测或诊断肝疾病的组合物及利用其的肝疾病预测或诊 断方法
技术领域
本发明是由大韩民国教育部主持，任务号为2016934590，上述项目的研究机构为韩国研究基金会，研究项目名称为“科学和工程方面的个人基础研究支持”，研究项目名称为“非酒精性脂肪肝”。合作开发新的生物标志物以预测疾病患者组织学肝纤维化进展的中间研究”，牵头组织是首尔博拉麦医院，研究期间为2016.11.01～2017.10.31。
此外，本发明是在大韩民国厚生省的支持下，通过第1465023825号任务完成的，上述任务的研究管理机构为韩国卫生产业振兴院，研究项目名称为“疾病克服技术开发”，研究项目名称为“大韩民国”。根据非酒精性脂肪肝转化人群的组织病理学分析血清代谢产物”，主要研究机构为首尔博拉麦医院，研究期间为
Figure GDA0002464834430000011
本专利申请要求于2017年8月21日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2017-0105714的优先权，并且该专利申请的公开内容通过引用合并于此。
本发明涉及用于预测或诊断肝疾病的组合物及利用其的肝疾病预测或诊断方法，更详细地，涉及用于预测或诊断非酒精性脂肪肝中的肝纤维化的标记物及利用其的预测或诊断方法。
背景技术
生长分化因子15(growth differentiation factor 15；GDF15)广泛分布在哺乳动物组织中，已知在炎症、癌症和心血管疾病中起着多方面的作用。最近，在与肝硬化和慢性乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染的感染有关的肝细胞癌患者中血清生长分化因子15数值已显示增加。尽管尚不清楚肝疾病中的生长分化因子15的流行病学作用，但是已发现生长分化因子15不仅刺激转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1；TGF-β1)的表达，而且直接激活在肝纤维化/致癌途径中起到重要作用的SMAD信号系统。
最近，报告了肌肉减少症是非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis；NASH)及非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver disease；NAFLD)的独立危险因素。由于生长分化因子15表达在肌肉消耗条件下增加，因此预期血清生长分化因子15数值可通过调节肌肉量来影响非酒精性脂肪肝疾病的组织学严重程度。
因此，独立于已知的代谢性风险因素，有必要调查生长分化因子15是否增加经活检鉴定的患非酒精性脂肪肝疾病的患者中非酒精性脂肪肝炎发生风险及进行性纤维化(Advanced fibrosis)、肝细胞暴露于高浓度的生长分化因子15是否对肝纤维化产生影响，从而确定非酒精性脂肪肝疾病的发生和发展中生长分化因子15的致病性作用。
发明内容
本发明人致力于研究开发用于预测或诊断非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化的标记物及利用其的预测或诊断方法。
其结果，阐明生长分化因子15蛋白的数值与肝纤维化呈正相关，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供包含用于测定编码生长分化因子15蛋白的核酸序列的表达或生长分化因子15蛋白的活性的制剂的用于预测或诊断肝疾病的组合物。
本发明的再一目的在于，提供预测或诊断肝疾病的方法，包括用于测定试样中编码生长分化因子15蛋白的核酸序列的表达程度或生长分化因子15蛋白的浓度的测定步骤。
本发明的另一目的在于，提供预防、治疗或改善肝疾病的候选物质筛选方法，包括：对生长分化因子15蛋白处理被检测试样的步骤；以及筛选抑制上述生长分化因子15蛋白的活性的被检测试样的步骤。
本发明的还有一目的在于，提供预防、治疗或改善肝疾病的候选物质筛选方法的方法，包括：对生长分化因子15蛋白表达细胞处理被检测试样的步骤；以及从上述细胞筛选抑制生长分化因子15蛋白的表达的被检测试样的步骤。
本发明涉及用于预测或诊断肝疾病的组合物及利用其的肝疾病预测或诊断方法，更详细地，包括用于预测或诊断非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化的标记物。下面，进一步详细说明本发明。
本发明的一实施方式为用于预测或诊断肝疾病的组合物，包含用于测定编码生长分化因子15蛋白的核酸序列的表达或生长分化因子15蛋白的活性的制剂。
上述肝疾病可以为肝纤维化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变或肝癌，例如，可以为肝纤维化，但并不限定于此。
上述肝纤维化可以为非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化，但并不限定于此。
上述生长分化因子15蛋白可包含序列1的氨基酸序列，例如，可以由序列1的氨基酸序列组成。
上述制剂可以为与生长分化因子15蛋白或其片段特异性结合的抗体，但并不限定于此。
上述制剂还可包含与抗体特异性结合检测体，上述抗体与上述生长分化因子15蛋白或其片段特异性结合。
上述检测体可以为用着色酶、荧光物质、放射性同位素或胶体等标记的共轭物(conjugate)；或者与抗体特异性结合的第二抗体，上述抗体与上述生长分化因子15蛋白或其片段特异性结合，但并不限定于此。
上述生长分化因子15蛋白可来源于从检体分离的生物学试样。
上述生物学试样可获自血液或活检组织，但并不限定于此。
本发明的再一实施方式为预测或诊断肝疾病的方法，包括测定试样中编码生长分化因子15蛋白的核酸序列的表达程度或生长分化因子15蛋白的浓度的测定步骤。
上述肝疾病可以为肝纤维化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变或肝癌，例如，可以为肝纤维化，但并不限定于此。
上述肝纤维化可以为非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化，但并不限定于此。
上述生长分化因子15蛋白可包含序列1的氨基酸序列，例如，可以由序列1的氨基酸序列组成。
上述生长分化因子15蛋白可来源于从检体分离的生物学试样。
上述生物学试样可获自血液或活检组织，但并不限定于此。
上述测定步骤可通过利用选自由酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)、比色法(colorimetric method)、电化学法(electrochemical method)、荧光法(fluorimetric method)、发光法(luminometry)、粒子计数法(particle counting method)、视觉评价法(visual assessment)、闪烁计数法(scintillation counting method)及组织免疫染色法组成的组中的一种方法来执行，例如，可利用酶联免疫吸附法来执行，但并不限定于此。
在上述测定步骤中，可用于测定生长分化因子15蛋白的浓度是否为1.52ng/mL以上。
在本发明的一实施例中，将血清生长分化因子15数值的测定值分为4个组(quartiles；Q)。将生长分化因子15的数值最高的组设为Q4，这意味着生长分化因子15蛋白的浓度为1.52ng/mL以上，在此情况下，重度纤维化的发病率为41.7％。
因此，在生长分化因子15数值对应于Q4的情况下，可视为与进行性纤维化有关，因此，利用测定生长分化因子15蛋白的浓度是否为1.52ng/mL以上的方法，从而可将生长分化因子15用作预测或诊断非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化的标记物。
本发明的另一实施方式为预防、治疗或改善肝疾病的候选物质筛选方法，包括：处理步骤，对生长分化因子15蛋白处理被检测试样；以及分析步骤，筛选抑制上述生长分化因子15蛋白的活性的被检测试样。
上述肝疾病可以为肝纤维化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变或肝癌，例如，可以为肝纤维化，但并不限定于此。
上述肝纤维化可以为非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化，但并不限定于此。
上述被检测试样可获自血液或活检组织，但并不限定于此。
为了测定生长分化因子15蛋白的活性，上述分析步骤可通过利用选自由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫荧光法、酶联免疫法(ELISA)、质量分析及蛋白芯片组成的组中的方法来执行，但并不限定于此。
上述生长分化因子15蛋白可包含序列1的氨基酸序列，例如，可以由序列1的氨基酸序列组成。
本发明的还有一实施方式为预防、治疗或改善肝疾病的候选物质筛选方法，包括：处理步骤，对生长分化因子15蛋白表达细胞处理被检测试样；以及分析步骤，从上述细胞筛选抑制生长分化因子15蛋白的表达的被检测试样。
上述肝疾病可以为肝纤维化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变或肝癌，例如，可以为肝纤维化，但并不限定于此。
上述肝纤维化可以为非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化，但并不限定于此。
上述被检测试样可获自血液或活检组织，但并不限定于此。
为了测定生长分化因子15蛋白的表达，上述分析步骤可通过利用蛋白质印迹(Western blotting)、酶联免疫化学检测法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫组织化学染色法(immunohistochemical staining)、免疫沉淀(immunoprecipitation)及免疫荧光法(immunofluorescence)组成的组中的方法来执行，但并不限定于此。
上述生长分化因子15蛋白可包含序列1的氨基酸序列，例如，可以由序列1的氨基酸序列组成。
本发明涉及用于预测或诊断肝疾病的组合物及利用其的肝疾病预测或诊断方法，可通过上述组合物来确定与非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化呈正相关的生长分化因子15蛋白的数值，因此可以将其有效地用于预测及诊断非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化。
附图说明
图1a为示出根据非酒精性脂肪肝疾病的组织学严重程度生长分化因子15数值显著增加的曲线图。
图1b为示出根据脂肪症等级的平均生长分化因子15数值的曲线图。
图1c为示出根据球样变性(ballooning)等级的平均生长分化因子15数值的曲线图。
图1d为示出根据肝小叶炎症等级的平均生长分化因子15数值的曲线图。
图1e为示出根据纤维化阶段的平均生长分化因子15数值的曲线图。
图1f为示出根据严重程度区分纤维化阶段的平均生长分化因子15数值的曲线图。
图2a为示出用马松三色(Masson's trichrome)染色对应于纤维化阶段F0的肝组织的照片。
图2b为示出用抗-生长分化因子15抗体染色对应于纤维化阶段F0的肝组织的照片。
图2c为示出用马松三色染色对应于纤维化阶段F1的肝组织的照片。
图2d为示出用抗-生长分化因子15抗体染色对应于纤维化阶段F1的肝组织的照片。
图2e为示出用马松三色染色对应于纤维化阶段F2的肝组织的照片。
图2f为示出用抗-生长分化因子15抗体染色对应于纤维化阶段F2的肝组织的照片。
图2g为示出用马松三色染色对应于纤维化阶段F3的肝组织的照片。
图2h为示出用抗-生长分化因子15抗体染色对应于纤维化阶段F3的肝组织的照片。
图3a为示出生长分化因子15数值与肝硬化程度之间的相关关系的曲线图。
图3b为示出根据血清生长分化因子15数值和糖尿病状态确认的进行性纤维化(Advanced fibrosis)的曲线图。
图4a为示出对作为人肝星状细胞(Human Hepatic Stellate Cell；HSCs)的LX-2细胞的提取物处理重组人生长分化因子15(Recombinant human GDF15；rhGDF15)后，随时间变化的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin；α-SMA)的免疫印迹照片。
图4b为示出对LX-2细胞处理人生长分化因子15后随时间变化的α-平滑肌肌动蛋白的免疫荧光照片。
图4c为示出对LX-2细胞处理人生长分化因子15后随时间变化的α-平滑肌肌动蛋白的免疫印迹照片。
图4d为示出对肝细胞的提取物处理人生长分化因子15后随时间变化的α-平滑肌肌动蛋白的免疫印迹照片。
图5a为示出棕榈酸处理3小时后，肝细胞、人肝星状细胞细胞及库普弗细胞中生长分化因子15信使核糖核酸(mRNA)的表达量的曲线图。
图5b为示出棕榈酸处理6小时后，肝细胞、人肝星状细胞细胞及库普弗细胞中生长分化因子15信使核糖核酸的表达量的曲线图。
具体实施方式
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明的范围不应解释为受这些实施例的限制。
实验例1：选择受试人员
以是否存在肝脂肪变性的放射学记录为基准选择对象。
对象的资格标准如下：
(i)18岁以上；
(ii)超声波扫描(肝/肾中产生回声及后方衰减增加)中产生明亮的回声的肝；以及
(iii)未知原因导致6个月内丙氨酸转氨酶(Alanine Transaminase，ALT)数值超出标准值。
适用以下排除标准：
(i)乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染；
(ii)自身免疫性肝炎；
(iii)药物引起的肝损伤或脂肪变性；
(iv)威尔森氏症或血色素沉着症；
(v)过量饮酒(男性>30g/天，女性>20g/天)；以及
(vi)恶性肿瘤诊断。
实验组包括非酒精性脂肪肝炎或怀疑有纤维化的肝活检患者。
并且，基于肝组织的肝活检以及用于移植供体肝的初步评估中收集的血清或放射线结果，将对照组设定为包括用于确认怀疑为肝腺瘤或局部结节性增生但没有肝脂肪变性的迹象的实体肝癌而收集的血清。
实验例2：测定方法
体重指数(Body mass index，BMI，≥25kg/m2)被用作根据世界卫生组织亚太地区标准判断肥胖的标准。代谢综合征是由修订后的国家胆固醇教育计划成人治疗小组III标准(National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III criteria)定义。使用胰岛素抵抗的稳态模型评估(homeostasis model assessment of insulinresistance，HOMA-IR)对快速活检静脉血样本进行12小时(过夜)的稳态模型评估来评估胰岛素抵抗。肌肉减少症(Sarcopenia)通过质体重以阑尾骨骼肌(appendicular skeletalmuscle；ASM)的质量的值来评估(ASM/weight，ASM％)。骨骼肌质量不足(Low skeletalmuscle mass；LSMM)根据美国国立卫生研究院肌肉减少症项目(National Institutes ofHealth Sarcopenia Project)指南被定义为骨骼肌质量(ASM)除以BMI的值(ASM/BMI)。生长分化因子15数值使用商业上可利用的酶联免疫吸附分析试剂盒(enzyme-linkedimmunosorbent assay kit；ELISA；R&D Systems，Minneapolis，MN)测定。上述生长分化因子15的氨基酸序列信息如下述表1所示。
表1
Figure GDA0002464834430000081
为了测定肝硬度，进行用于预测进行性纤维化(Advanced fibrosis)的瞬时弹性测试(transient elastography；TE)。计算纤维化指数(NAFLD fibrosis score；NFS)、纤维化-4(Fibrosis-4；Fib4)标准及天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase；AST)、血小板比指数(AST to Platelet Ratio Index；APRI)，在预测及诊断进行性纤维化方面比较了这些关于生长分化因子15的指数。
实验例3：肝组织学评估
根据5％以上的巨型大疱性脂肪变性的存在与否诊断非酒精性脂肪肝疾病。非酒精性脂肪肝炎是基于由大细胞组成的组织学肝损伤的整体模式诊断。根据这些标准确认了纤维化。仅在F3以上的阶段才诊断为进行性纤维化。
实验例4：生长分化因子15存在下的肝细胞培养
在100ng/mL的生长分化因子15及10ng/mL的TGF-β存在下培养的LX-2细胞(人肝星状细胞；Human Hepatic Stellate Cell，KAIST)及直接从小鼠的肝分离的原代肝细胞(primary hepatocytes cells)的3×105细胞/6孔(well)中加入100ng/mL的重组人生长分化因子15(Recombinant human GDF15；rhGDF15；R&D Systems；957-GD-025)。通过免疫印迹、免疫组织化学染色及免疫荧光染色确认纤维化标记物的数值，如α平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin；α-SMA)及胶原蛋白1(Collagen 1)。
实验例5：确认有棕榈酸处理引起的生长分化因子15信使核糖核酸的表达量变化
分离原代肝细胞，并分化为肝细胞、人肝星状细胞(LX-2)、库普弗(Kupffer)细胞及肝血管内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells；LSECs)。库普弗细胞为存在于肝中的巨噬细胞，已知在炎症发作中起重要作用。
为了区分库普弗细胞和肝血管内皮细胞，通过使用MiniMACSTM分离系统(韩国首尔美天旎生物科技(Miltenyi Biotec，Seoul，Korea))来进行磁激活细胞筛选(magnetic-activated cell sorting；MACS)。肝血管内皮细胞的纯度通过使用抗-PE抗体(纯度90％以上)的荧光激活细胞分选方法进行评估。将原代细胞在1.5mL对无血清(serum-free)培养基中培养4小时，并分别处理5(w/w)％的牛血清白蛋白(bovine serum albumin；BSA对照组)、200uM的棕榈酸/5(w/w)％的牛血清白蛋白溶液及500uM的棕榈酸/5(w/w)％的牛血清白蛋白溶液。经3小时及6小时后，收集细胞并进一步分析。通过进行逆转录聚合酶链反应(Reverse-transcription polymerase chain reaction；RT-PCR)及实时聚合酶链反应(real-time PCR)来评估处理棕榈酸后的生长分化因子15信使核糖核酸的表达。
实验例6：统计分析
组间差异通过使用独立t-检验、曼-惠特尼U(Mann-Whitney U)检验、方差分析(analysis of variance；ANOVA)或对连续变量的克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)检验及对分类变量的卡方(chi-square)检验来评估。斯皮尔曼(Spearman)的相关分析以评估生长分化因子15数值与组织学参数之间的关系。
使用修改年龄、性别、胰岛素抵抗(homeostasis model assessment of insulinresistance，HOMA-IR)的常规线性模型比较根据非酒精性脂肪肝炎或进行性纤维化状态变化的生长分化因子15数值。为了调查非酒精性脂肪肝炎或纤维化的独立预测因子，生成了调整了协变量(covariates)的二元逻辑回归模型(binary logistic regression model)。显著性定义为P<0.05。所有统计分析均使用IBM SPSS统计版本20.0(IBM Inc.，Armonk，NY)来进行。
结果例1：根据非酒精性脂肪肝疾病的组织学谱的临床特征
如表2所示，调查150名的非酒精性脂肪肝疾病患者和40名对照组。通过活检将非酒精性脂肪肝疾病患者被分为72名(男性为65.3％)非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfatty liver；NAFL)和78名(男性为44.9％)非酒精性脂肪肝炎。
表2
Figure GDA0002464834430000101
Figure GDA0002464834430000111
Figure GDA0002464834430000121
从上述表2中可以确认，发现了非酒精性脂肪肝疾病的严重程度与体重指数、腰围、相关条件(糖尿病、高血压及黄斑症)、丙氨酸转氨酶(Alanine Transaminase；ALT)及天冬氨酸转氨酶(Aspartate Transaminase；AST)数值、胰岛素抵抗(HOMA-IR)的正相关性(1BMI≥25kg/m2，2根据美国国立研究院肌肉减少症项目(National Institutes of HealthSarcopenia Project)指南的男性<0.789及女性<0.512以上的ASM/BMI、3连续变量的独立t检验或曼-惠特尼分析检验；分类变量的卡方检验)。
从表3中可以确认，非酒精性脂肪肝疾病患者(n＝150)中进行性纤维化患者的年龄较大，并且女性更多，与未确认到进行性纤维化的非酒精性脂肪肝疾病患者相比，血清白蛋白数值和血小板数值显著低。
表3
Figure GDA0002464834430000122
Figure GDA0002464834430000131
进行性纤维化与糖尿病、高血压、高胰岛素抵抗、低ASM/BMI(P：0.003，0.001，<0.001，0.008)的条件显著相关，但与腰围或体重指数无显著相关关系(1BMI≥25kg/m2、2根据美国国立卫生院肌肉减少症项目(National Institutes of Health SarcopeniaProject)的男性<0.789及女性<0.512以上的ASM/BMI，3连续变量的方差分析或克鲁斯卡尔-沃利斯检验；分类变量的卡方检验)。
结果例2：生长分化因子15数值与进行性纤维化的关系
根据上述表2，生长分化因子15数值根据非酒精性脂肪肝疾病的组织学严重程度显著增加。从图1a中可以确认，非酒精性脂肪肝炎患者的生长分化因子15数值显著高于对照组(没有非酒精性脂肪肝疾病)或非酒精性脂肪肝患者。与此相反，从图1b中可以确认，生长分化因子15数值与脂肪症等级之间没有关联(P＝0.202)。从图1c及图1d中可以确认，血清生长分化因子15数值根据球样变性(ballooning)(Spearman's ρ，0.200；P＝0.006)及肝小叶炎症的严重程度(Spearman's ρ，0.271；P<0.001)显著增加。从图1e中可以确认，纤维化程度与血清生长分化因子15数值显著相关(Spearman's ρ，0.337；P<0.001)。从图1f中可以确认，与作为不对应进行性纤维化的对象的F0至F2相比，作为对应进行性纤维化的对象的F3及F4的生长分化因子15数值显著高(P<0.001)。
结果可以确认，血清生长分化因子15数值与非酒精性脂肪肝疾病的组织学严重程度之间具有级联关系，并且可以确认与肝小叶炎症、球样变性及纤维化的严重程度呈正相关。
从图2中可以确认，根据免疫组织化学分析确认，与图2b、图2d及图2f所示的未确认到进行性纤维化的对象的情况相比，在具有图2h所示的进行性纤维化的对象的肝中的生长分化因子15表达程度显著高。
由于生长分化因子15数值与进行性纤维化(≥F3)独立相关，因此调查了生长分化因子15数值与由纤维化的严重程度的严重程度示出肝硬度的TE数值之间的相关性是否成立。
从图3a中可以确认，生长分化因子15数值与肝硬度之间存在显著的正相关性(Spearman's ρ，0.525；P<0.001)。
然后，将生长分化因子15数值分为4组(quartiles；Q)；Q1和Q4分别是最低组和最高组。重度纤维化的发病率在Q1、Q2、Q3及Q4中分别为2.2％、8.2％、8.5％及41.7％(P<0.001)。生长分化因子15的最高组(Q4；生长分化因子15数值≥1.52ng/mL)与进行性纤维化相关(未调整比值比[OR]，10.56；95％可置信区间[CI]，4.35-25.60；P<0.001)。
结果例3：确认非酒精性脂肪肝疾病中作为纤维化的决定性因子的生长分化因子15
随后，调查了仅在非酒精性脂肪肝疾病患者中通过生长分化因子15数值来预测纤维化进行的风险是否有限。
如表4所示，多变量模型1调整了年龄、性别及体重指数，多变量模型2除多变量模型1中包含的因素外还调整了吸烟、高血压及糖尿病，多变量模型3除多变量模型2中包含的因素外还调整了天冬氨酸转氨酶、血小板及白蛋白，多变量模型4除多变量模型3中包含的因素外还调整了胰岛素抵抗的稳态模型评估，多变量模型5除多变量模型4中包含的因素外还调整了骨骼肌质量不足。
表4
Figure GDA0002464834430000151
Q4的生长分化因子15数值显示出在根据年龄、性别、体重指数、吸烟状态调整的多变量模型(Multivariate model)分析中保持显著状态的进行性纤维化、高血压、糖尿病、天冬氨酸转氨酶数值、血小板数值、白蛋白数值。对胰岛素抵抗及骨骼肌质量不足的进一步调整对生长分化因子15数值与进行性纤维化之间的关联性具有统计学上显著性。相比之下，Q4的生长分化因子15数值与非酒精性脂肪肝疾病对象中非酒精性脂肪肝炎的发病风险没有关联性。但是，可以确认即使在调整骨骼肌质量不足及胰岛素抵抗后，生长分化因子15仍可作为非酒精性脂肪肝疾病的进行性纤维化的独立性决定因子来发挥作用。
结果例4：有无糖尿病与进行性纤维化患病率之间的相关关系
调查了无论有无糖尿病，生长分化因子15是否均可对进行性纤维化产生决定性影响。
从图3b中可以确认，将生长分化因子15数值分为4组进行分层分析结果显示，进行性纤维化的严重程度存在其他差异。尤其，在患有糖尿病的对象中，进行性纤维化的发病率对应Q4的生长分化因子15数值的情况下为54.2％，在对应Q1至Q3的生长分化因子15数值的情况下仅为12.1％。尤其，在生长分化因子15数值对应Q4的情况下非糖尿病患者中对应重度纤维化的患病率也为31.3％，这表明，与具有对应Q1至Q3的生长分化因子15数值的非糖尿病患者的风险度相比，纤维化进行分限度高6倍以上(OR，6.72，95％CI，1.50～30.13)。与有无糖尿病无关，在非酒精性脂肪肝疾病组中，与生长分化因子15数值相关的进行性纤维化患病率为29.8％(17/57)、10.8％(10/93)(P＝0.003，卡方检验)。
结果例5：生长分化因子15处理诱导LX-2细胞中的纤维化
从图4a中可以确认，人生长分化因子15处理使现有纤维化标记物如LX-2细胞中的α-平滑肌肌动蛋白及胶原蛋白1(Collagen 1)的表达增加，但并不影响细胞凋亡。
从图4b中可以确认，与免疫印迹(immunoblotting)一样，通过免疫荧光(immunoluorescence)染色法确认结果显示，在用生长分化因子15处理12小时的情况下，如白色箭头部分所示，α-平滑肌肌动蛋白表达量高。从图4c中可以确认，验证生长分化因子15通过增加人肝细胞中SMAD2及SMAD3的磷酸化来诱导纤维化。从图4d中可以确认，生长分化因子15的处理通过上调原代肝细胞中SMAD2及SMAD3的磷酸化来诱导纤维化。
在用生长分化因子15处理后12小时之内α-平滑肌肌动蛋白数值增加，SMAD磷酸化在3小时内很快被诱导。在用生长分化因子15处理后，发现随着已知在肝细胞活化及纤维化中起到重要作用的SMAD2和SMAD3的磷酸化增加，生长分化因子15激活人肝细胞并诱导纤维化。对肝细胞的生长分化因子15的剂型刺激效果在12小时后显著减少，这表明生长分化因子15可能参与了对肝损伤或炎症的初始反应。
结果例6：根据棕榈酸处理的生长分化因子15信使核糖核酸的表达增加
调查了生长分化因子15是否与骨骼肌质量不足无关地对进行性纤维化起到决定性作用。对肝细胞以时间及剂量依赖性地处理已知诱导后，评估生长分化因子15信使核糖核酸表达。
从图5a中可以确认，用棕榈酸处理3小时后，在肝细胞中没有变化，而在人肝星状细胞中，用200uM的棕榈酸处理时，生长分化因子15信使核糖核酸表达水平略有上升，但不显著。然而，在库普弗细胞中，用500uM的棕榈酸处理时，生长分化因子15信使核糖核酸表达水平显著增加约2倍(P＝0.004)。
从图5b中可以确认，用棕榈酸处理6小时后，肝细胞和人肝星状细胞中的生长分化因子15信使核糖核酸表达数值没有显著变化。在用200uM的棕榈酸处理时库普弗细胞中的生长分化因子15信使核糖核酸表达量增加2.5倍(P＝0.009)，用500uM的棕榈酸处理时增加1.5倍(P＝0.032)。
结果确认，用棕榈酸处理时可增加库普弗细胞中生长分化因子15信使核糖核酸表达量，这表明生长分化因子15的表达量与肌肉量之间呈负相关。
产业上的可利用性
本发明涉及用于预测或诊断肝疾病的组合物及利用其的肝疾病预测或诊断方法，更详细地，涉及用于预测或诊断非酒精性脂肪肝中的肝纤维化的标记物及利用其的预测或诊断方法。
序列表
<110> Industry-University Cooperation Foundation Chungbuk University
<120> 用于预测或诊断肝疾病的组合物及利用其的肝疾病预测或诊断方法
<130> PP180035
<150> KR 17/105,714
<151> 2017-08-21
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人GDF15
<400> 1
Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys
1 5 10 15
Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala
20 25 30
Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly
35 40 45
Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys
50 55 60
Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr
85 90 95
Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His
100 105 110
Cys Ile

Claims (21)

1.用于预测或诊断肝疾病的组合物，所述组合物包含用于测定编码生长分化因子15蛋白的核酸序列的表达或生长分化因子15蛋白的活性的制剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肝疾病选自：肝纤维化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变及肝癌。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述肝纤维化为非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生长分化因子15蛋白包含序列1的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述制剂为能够与生长分化因子15蛋白或其片段特异性结合的抗体。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生长分化因子15蛋白来源于从检体分离的生物学试样。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述生物学试样获自血液或活检组织。
8.用于预测或诊断肝疾病的方法，所述方法包括对试样中编码生长分化因子15蛋白的核酸序列的表达程度或生长分化因子15蛋白的浓度进行测定的测定步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述肝疾病选自：肝纤维化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变及肝癌。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肝纤维化为非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述生长分化因子15蛋白包含序列1的氨基酸序列。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述生长分化因子15蛋白来源于从检体分离的生物学试样。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物学试样获自血液或活检组织。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述测定步骤通过利用选自下列的一种方法来执行：酶联免疫吸附法、比色法、电化学法、荧光法、发光法、粒子计数法、视觉评价法、闪烁计数法及组织免疫染色法。
15.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在上述测定步骤中，测定生长分化因子15蛋白的浓度是否为1.52ng/mL以上。
16.预防、治疗或改善肝疾病的候选物质筛选方法，所述方法包括：
处理步骤，对生长分化因子15蛋白处理被检测试样；以及
分析步骤，筛选抑制上述生长分化因子15蛋白的活性的被检测试样。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肝疾病选自：肝纤维化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变及肝癌。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肝纤维化为非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化。
19.预防、治疗或改善肝疾病的候选物质筛选方法，所述方法包括：
处理步骤，对生长分化因子15蛋白表达细胞处理被检测试样；以及
分析步骤，从上述细胞筛选抑制生长分化因子15蛋白的表达的被检测试样。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述肝疾病选自：肝纤维化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬变及肝癌。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述肝纤维化为非酒精性脂肪肝疾病中的肝纤维化。
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