JPWO2008047947A1 - シスプラチン投与効果判定方法及びシスプラチン投与効果判定キット - Google Patents
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Abstract
シスプラチン投与による治療効果の有無を優れた確度及び特異度で判定する。診断対象者から採取した生体由来試料における、PDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子、PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子、PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子、NRG1(neuregulin 1)遺伝子及びLUM(Lumican)遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するステップaと、測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップbとを含むシスプラチン投与効果判定方法。
Description
本発明は、抗癌剤として使用されているシスプラチンの投与効果を判断する方法及びシスプラチン投与効果判定キットに関する。
シスプラチン(cisplatin、“CDDP”と略称される)は、全ての種類の癌において抗癌剤・化学療法の中心的な薬剤である。シスプラチン投与に起因する副作用は、ほぼ100%近くの患者に出現するが、臨床的効果は必ずしも良好とは言えない。シスプラチンの投与効果は、症例によってばらつきがあり、一部の患者に対しては全く奏効しないことが知られている。このため、多くの患者が非常に重篤な副作用に苦しんだにも拘わらず、治療効果が得られないまま癌が進行して予後不良となることがしばしばある。
したがって、シスプラチンによる治療効果が投与前に判定できるとすれば、患者にとって非常に大きな福音となる。また、シスプラチン投与に耐性を示す患者群に特異的に発現亢進する遺伝子(薬剤耐性遺伝子)及びシスプラチン投与に感受性を示す患者群に特異的に発現亢進する遺伝子(薬剤感受性遺伝子)を同定することにより、薬剤耐性を克服した新たな効果的な抗癌剤治療法を開発することができる。
しかしながら、現在までシスプラチン耐性に関連する遺伝子が幾つか発表(Bordowら、1994(非特許文献1);Gottesmanら、1996(非特許文献2);Loeら、1996(非特許文献3);Jinら、1998(非特許文献4);Perezら、1998(非特許文献5);Hinoshitaら、2000(非特許文献6))されているものの、実際の臨床でシスプラチン投与効果を判定できるような遺伝子は無いのが現状である。
Bordow SB,Haber M,Madafiglio J,Cheung B,Marshall GM,Norris MD.Cancer Res.Oct 1;54(19):5036−5040.1994 Gottesman MM,Pastan I,Ambudkar SV.Curr Opin Genet Dev.Oct;6(5):610−617.1996 Loe D.W.,Deeley R.G.,Cole S.P.Eur.J.Cancer,32A:945−957,1996. Jin S,Scotto KW.Mol Cell Biol.Jul;18(7):4377−4384.1998 Perez RP.Eur J Cancer.Sep;34(10):1535−1542.1998 Hinoshita E,Uchiumi T,Taguchi K,Kinukawa N,Tsuneyoshi M,Maehara Y,Sugimachi K,Kuwano M.Clin Cancer Res.Jun;6(6):2401−2407.2000
したがって、シスプラチンによる治療効果が投与前に判定できるとすれば、患者にとって非常に大きな福音となる。また、シスプラチン投与に耐性を示す患者群に特異的に発現亢進する遺伝子(薬剤耐性遺伝子)及びシスプラチン投与に感受性を示す患者群に特異的に発現亢進する遺伝子(薬剤感受性遺伝子)を同定することにより、薬剤耐性を克服した新たな効果的な抗癌剤治療法を開発することができる。
しかしながら、現在までシスプラチン耐性に関連する遺伝子が幾つか発表(Bordowら、1994(非特許文献1);Gottesmanら、1996(非特許文献2);Loeら、1996(非特許文献3);Jinら、1998(非特許文献4);Perezら、1998(非特許文献5);Hinoshitaら、2000(非特許文献6))されているものの、実際の臨床でシスプラチン投与効果を判定できるような遺伝子は無いのが現状である。
Bordow SB,Haber M,Madafiglio J,Cheung B,Marshall GM,Norris MD.Cancer Res.Oct 1;54(19):5036−5040.1994 Gottesman MM,Pastan I,Ambudkar SV.Curr Opin Genet Dev.Oct;6(5):610−617.1996 Loe D.W.,Deeley R.G.,Cole S.P.Eur.J.Cancer,32A:945−957,1996. Jin S,Scotto KW.Mol Cell Biol.Jul;18(7):4377−4384.1998 Perez RP.Eur J Cancer.Sep;34(10):1535−1542.1998 Hinoshita E,Uchiumi T,Taguchi K,Kinukawa N,Tsuneyoshi M,Maehara Y,Sugimachi K,Kuwano M.Clin Cancer Res.Jun;6(6):2401−2407.2000
そこで、本発明者らは、上述した実情に鑑み、シスプラチン投与による治療効果の有無を判定することができるシスプラチン投与効果判定方法及びシスプラチン投与効果判定キット提供することを目的としている。
上述した目的を達成するため、本発明者は、シスプラチンに対する非常に優れた耐性を示す細胞株を使用することでシスプラチン耐性或いは感受性を示す遺伝子群を特定し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
(1) 診断対象者から採取した生体由来試料における、PDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子、PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子、PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子、NRG1(neuregulin 1)遺伝子及びLUM(Lumican)遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するステップaと、測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップbとを含むシスプラチン投与効果判定方法。
(2) 前記ステップaでは、上記遺伝子のmRNA量を測定することを特徴とする(1)記載のシスプラチン投与効果判定方法。
(3) 前記ステップaでは、上記遺伝子の産物であるタンパク質量を測定することを特徴とする(1)記載のシスプラチン投与効果判定方法。
(4) 上記ステップaでは、後述する表1に示す遺伝子群のうち上記PDE3B遺伝子、上記遺伝子、上記PKD2遺伝子、上記NRG1遺伝子及び上記LUM遺伝子以外の少なくとも1以上の遺伝子の発現量を更に測定することを特徴とする(1)記載のシスプラチン投与効果判定方法。
(5) PDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子、PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子、PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子、NRG1(neuregulin 1)遺伝子及びLUM(Lumican)遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するための手段を含む、シスプラチン投与効果判定キット。
(6) 上記手段は、上記遺伝子のmRNA又は当該mRNAに由来するcDNAに対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることを特徴とする(5)記載のシスプラチン投与効果判定キット。
(7) 上記ポリヌクレオチドは、支持体に固定されたものであることを特徴とする(6)記載のシスプラチン投与効果判定キット。
(8) 上記手段は、上記遺伝子の産物であるタンパク質に対して特異的に結合する抗体であることを特徴とする(5)記載のシスプラチン投与効果判定キット。
(9) 後述する表1に示す遺伝子群のうち上記PDE3B遺伝子、上記遺伝子、上記PKD2遺伝子、上記NRG1遺伝子及び上記LUM遺伝子以外の少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するための手段を更に含むことを特徴とする(5)記載のシスプラチン投与効果判定キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006−286285号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
上述した目的を達成するため、本発明者は、シスプラチンに対する非常に優れた耐性を示す細胞株を使用することでシスプラチン耐性或いは感受性を示す遺伝子群を特定し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
(1) 診断対象者から採取した生体由来試料における、PDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子、PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子、PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子、NRG1(neuregulin 1)遺伝子及びLUM(Lumican)遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するステップaと、測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップbとを含むシスプラチン投与効果判定方法。
(2) 前記ステップaでは、上記遺伝子のmRNA量を測定することを特徴とする(1)記載のシスプラチン投与効果判定方法。
(3) 前記ステップaでは、上記遺伝子の産物であるタンパク質量を測定することを特徴とする(1)記載のシスプラチン投与効果判定方法。
(4) 上記ステップaでは、後述する表1に示す遺伝子群のうち上記PDE3B遺伝子、上記遺伝子、上記PKD2遺伝子、上記NRG1遺伝子及び上記LUM遺伝子以外の少なくとも1以上の遺伝子の発現量を更に測定することを特徴とする(1)記載のシスプラチン投与効果判定方法。
(5) PDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子、PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子、PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子、NRG1(neuregulin 1)遺伝子及びLUM(Lumican)遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するための手段を含む、シスプラチン投与効果判定キット。
(6) 上記手段は、上記遺伝子のmRNA又は当該mRNAに由来するcDNAに対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることを特徴とする(5)記載のシスプラチン投与効果判定キット。
(7) 上記ポリヌクレオチドは、支持体に固定されたものであることを特徴とする(6)記載のシスプラチン投与効果判定キット。
(8) 上記手段は、上記遺伝子の産物であるタンパク質に対して特異的に結合する抗体であることを特徴とする(5)記載のシスプラチン投与効果判定キット。
(9) 後述する表1に示す遺伝子群のうち上記PDE3B遺伝子、上記遺伝子、上記PKD2遺伝子、上記NRG1遺伝子及び上記LUM遺伝子以外の少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するための手段を更に含むことを特徴とする(5)記載のシスプラチン投与効果判定キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006−286285号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図1は、実施例で樹立した耐性株の代表例として、Sa−3株及びSa−3R株におけるMTTアッセイの結果を示す特性図である。
図2は、実施例で樹立した耐性株の代表例として、Sa−3株及びSa−3R株におけるABCトランスポーター(MDR1、MRP1及びMRP2)について発現をRT−PCRで測定した結果を示す特性図である。
図3は、実施例で樹立した耐性株及びその親株を用いたマイクロアレイ解析の結果として同定された耐性株において特異的に発現増強する遺伝子及び発現減弱する遺伝子の個数を示すベン図である。
図4は、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定された199個の遺伝子についてパスウェイ解析を行った結果として得られた4つのネットワークを示す特性図である。
図5は、実施例で特定した5つの遺伝子の代表例としてlumican遺伝子について行ったRT−PCRの結果を示す特性図(A)及びウエスタンブロッティングの結果を示す写真(B)である。
図6は、実施例で特定した5つの遺伝子の代表例としてlumican遺伝子について臨床検体の免疫組織学的染色法を施行した結果を示す写真である。
図7は、PDE3E遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図8は、lumican遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図9は、PDGFC遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図10は、PKD2遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図11は、NRG1遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図2は、実施例で樹立した耐性株の代表例として、Sa−3株及びSa−3R株におけるABCトランスポーター(MDR1、MRP1及びMRP2)について発現をRT−PCRで測定した結果を示す特性図である。
図3は、実施例で樹立した耐性株及びその親株を用いたマイクロアレイ解析の結果として同定された耐性株において特異的に発現増強する遺伝子及び発現減弱する遺伝子の個数を示すベン図である。
図4は、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定された199個の遺伝子についてパスウェイ解析を行った結果として得られた4つのネットワークを示す特性図である。
図5は、実施例で特定した5つの遺伝子の代表例としてlumican遺伝子について行ったRT−PCRの結果を示す特性図(A)及びウエスタンブロッティングの結果を示す写真(B)である。
図6は、実施例で特定した5つの遺伝子の代表例としてlumican遺伝子について臨床検体の免疫組織学的染色法を施行した結果を示す写真である。
図7は、PDE3E遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図8は、lumican遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図9は、PDGFC遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図10は、PKD2遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
図11は、NRG1遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果として示す特性図である。
以下、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法及び/又はシスプラチン投与効果判定キットを詳細に説明する。
本シスプラチン投与効果判定方法は、診断対象者から採取した生体由来試料における、以下の5個の遺伝子から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するステップaと、測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップbとを含んでいる。
PDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子(配列番号1)
PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子(配列番号3)
PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子(配列番号5)
NRG1(neuregulin 1)遺伝子(配列番号7)
LUM(Lumican)遺伝子(配列番号9)
PDE3B遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号2に示す。PDGFC遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号4に示す。PKD2遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号6に示す。NRG1遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号8に示す。LUM遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号10に示す。
なお、これらPDE3B遺伝子、PDGFC遺伝子、PKD2遺伝子、NRG1遺伝子及びLUM遺伝子は、詳細を後述する、シスプラチン耐性株及びシスプラチン感受性株を用いてマイクロアレイ解析や、臨床検体を用いた後ろ向き試験を行った結果として同定された遺伝子である。また、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においては、これらの遺伝子の発現量に加えて表1に挙げた遺伝子群から得らばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現量を測定し、上記5つの遺伝子の発現量に加えてこの遺伝子の発現量を判定に使用しても良い。
表1において「No.」の欄は各遺伝子に割り振った番号を示し、「Common」の欄は一般的な遺伝子の名称を示している。また、「Genbank」の欄はGenbankの提供するデータベースにおける当該遺伝子の登録番号であり、「Systematic」の欄は当該遺伝子の系統名を示し、「Map」の欄は当該遺伝子の染色体上の位置を示している。さらに、「Description」の欄は遺伝子に関する説明又は当該遺伝子の産物であるタンパク質に関する説明である。
なお、表1に挙げた遺伝子群は、詳細を後述する、シスプラチン耐性株及びシスプラチン感受性株を用いてマイクロアレイ解析を行った結果として同定された遺伝子から構成される。ここで、シスプラチン耐性株は、口腔扁平上皮癌由来細胞株又は中咽頭扁平上皮癌由来細胞株からシスプラチン耐性を指標として樹立された細胞株であって、シスプラチン投与により奏効しない患者の細胞株モデルとしての意味を有する。また、シスプラチン感受性株とは、シスプラチン耐性株の親株である口腔扁平上皮癌由来細胞株又は中咽頭扁平上皮癌由来細胞株それ自身を意味する。
すなわち、表1に挙げた遺伝子群は、シスプラチン耐性株において、特異的に発現増強した遺伝子と特異的に発現減弱した遺伝子とから構成されている。表1において、シスプラチン耐性株において特異的に発現増強した遺伝子はNo.1〜164であり、シスプラチン耐性株において特異的に発現減弱した遺伝子はNo.165〜199である。
また、表1に挙げた遺伝子群について、上記マイクロアレイ解析の結果を用いてIngenuity pathway analysisを行うことで統計的に意義あるネットワークを構築した結果として、表2に示す遺伝子群が特定される。
具体的に、表1に挙げた遺伝子群のうち51個の遺伝子群が4つのネットワークを形成するとともに、これら4つのネットワークが大きな一大ネットワークを形成している。
ここで、判定対象者としては、特に限定されず、各種癌に罹患した患者、各種癌を疑われた者及び健常者のいずれであっても良い。また、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法は、判定対象者の対して直接何らかの処置を施すものではなく、診断対象者から採取した生体由来試料を用いて実施する。
本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において生体由来試料とは、判定対象者における遺伝子発現解析が可能であれば特に限定されないが、例えば、組織、細胞、体液、尿及びその他生体試料由来の蛋白質抽出液を挙げることができる。ここで体液とは、血液、リンパ液、組織液(組織間液、細胞間液、間質液)、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液(髄液)、関節液(滑液)、眼房水(房水)、消化液、膵液、腸液、精液及び羊水を含む意味である。また、生体由来試料は、組織、細胞、体液、尿及びその他生体試料由来の蛋白質抽出液のいずれか一種でも複数種でもよい。
組織としては、癌罹患患者の治療目的で行われた手術の際に得られた組織の一部、癌を疑われた診断対象者から生検等によって採取された組織の一部、癌罹患患者で原発性か転移性かを鑑別する目的で生検等によって採取された組織の一部を含む意味である。
また、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において細胞としては、上記各組織から単離した細胞を使用することができる。また、体液としては、上記血液から分離した血漿又は血清、尿、リンパ液、脳脊髄液或いは腹水を使用することができる。本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においてその他の生体由来試料としては、喀痰などから単離した細胞又は蛋白質抽出液を用いることができる。
具体的に、判定対象者から採取した生体由来試料における、上述した遺伝子の発現を測定するには、例えば、測定対象の遺伝子に対するmRNA量を測定する又は測定対象の遺伝子の産物であるタンパク質量を測定すればよい。
測定対象の遺伝子に対するmRNA量を測定する方法としては、公知の遺伝子の発現の検出方法を用いることができる。例えば、測定対象の遺伝子のmRNA量を検出するために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、測定対象の遺伝子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いることができる。当該プローブを用いて測定対象の遺伝子のmRNA量を検出するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、プローブを作製する際に当該プローブに適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを判定対象者から採取した生体由来試料から単離したmRNA(又はmRNAから合成したcDNA)とハイブリダイズする。その後、ハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光強度を測定することにより、測定対象の遺伝子のmRNA量を検出することができる。なお、プローブとしては、ガラスビーズやガラス基板等の支持体に固定化して使用することもできる。すなわち、測定対象の遺伝子(複数でもよい)について作製したプローブを支持体上に固定化したマイクロアレイ又はDNAチップの形で用いることもできる。
なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、42℃で、1×SSC(0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム)、0.1%のSDS(Sodium dodecyl sulfate)を含む緩衝液による42℃での洗浄処理によってもハイブリダイズを維持することを意味する。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
一方、測定対象の遺伝子の産物であるタンパク質量を測定する方法としては、公知のタンパク質検出方法を用いることができる。具体的には、測定対象のタンパク質に対する抗体を使用した各種の方法を適用することができる。
なお、測定対象のタンパク質を抗原とし、当該抗原に結合する限り、前記抗体としては特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法(Kohler.G.and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73:3−46)等に準じて行うことができる。
ここで、モノクローナル抗体を作製する際には、上述した遺伝子の産物を抗原として使用することができ、また、上述した遺伝子の産物の断片を発現する細胞を抗原として使用することができる。なお、これらタンパク質若しくは当該タンパク質の断片は、例えば、Molecuar Cloning:A Laboratory Manual 第2版第1−3巻 Sambrook,J.ら著、Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989年に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得することができる。また、これらタンパク質若しくは当該タンパク質の断片を発現する細胞も、Molecuar Cloning:A Laboratory Manual 第2版第1−3巻 Sambrook,J.ら著、Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989年に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得することができる。
得られたモノクローナル抗体は、測定対象のタンパク質の定量用に、エンザイム−リンクイムノソルベントアッセイ(ELISA)、酵素イムノドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づいたアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノアッセイ法で検査試薬として用いることができる。また、モノクローナル抗体は標識化されることが好ましい。標識化を行う際、標識化合物としては例えば当分野で公知の酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、染色物質などを使用することができる。
ところで、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においては、測定対象の遺伝子として上述したPDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子、PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子、PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子、NRG1(neuregulin 1)遺伝子及びLUM(Lumican)遺伝子から選択するが、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法は、測定対象の遺伝子をこれら5つの遺伝子に限定するものではなく、表1に挙げる遺伝子群から選ばれる他の遺伝子を測定対象として追加してもよい。特に、測定対象の遺伝子としては、上述した5つの遺伝子に加えて、表2に挙げた遺伝子群から選ばれる他の遺伝子を測定対象とすることがより好ましい。
以上のようにして、診断対象者から採取した生体由来試料における、上述した遺伝子群から選ばれる測定対象の遺伝子の発現量を測定した後、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法では、当該発現量に基づいてシスプラチン投与による効果の有無又は効果の程度を判定する。
具体的には、上述したいずれかの方法により測定対象の遺伝子の発現量を測定した後、当該遺伝子の発現量を評価する。発現量の評価は、測定対象の遺伝子毎に基準値を設定し、この基準値との比較によって行っても良い。基準値としては、構成的に発現する遺伝子の発現量に対する相対値を設定することができる。また、測定対象の遺伝子の発現量は、今回行ったように免疫組織化学染色(IHC)スコアにて評価し、擬陽性と擬陰性を評価できる値を基準値として評価しても良い。
本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法及び判定キットによれば、非常に優れた確度及び/又は優れた特異度で判定対象者について、シスプラチン投与による効果の有無又は効果の程度を判断することができる。ここで、感度とは、シスプラチン投与に奏功する患者群における陽性率を意味する。特異度とは、シスプラチン投与に奏功しない患者群における陰性率を意味する。
特に、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において、測定対象の遺伝子の種類を増やすこと(例えば、6種類以上の遺伝子)によって、より優れた感度及び/又はより優れた特異度で診断することができる。
本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法によれば、抗癌剤・化学療法開始前の癌患者から採取した生体由来試料を用いた遺伝子発現解析(mRNAレベル或いはタンパク質レベル)により、シスプラチン投与による効果をより客観的、特異的に判定することができることから、投与効果を期待できない患者に対する過度の負担となるようなシスプラチンの投与を防止することができ、当該患者にとって有効な治療方針にとって有用な知見を提供することができる。
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明に係る技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
<耐性株の樹立>
先ず、本実施例ではシスプラチン耐性株を樹立した。具体的には、和歌山医科大学医学部歯科口腔外科講座から提供された口腔扁平上皮癌由来細胞株(H−1株及びSa−3株)に対して、シスプラチン(以下、CDDPと称する場合もある)濃度を0.1μg/mlの低濃度から段階的にCDDPを持続的に接触させることによって、シスプラチンに対して耐性を有する細胞株を樹立した。H−1株から樹立したシスプラチン耐性株をH−1R株と命名し、Sa−3株から樹立したシスプラチン耐性株をSa−3R株と命名した。
また、中咽頭扁平上皮癌由来細胞株(KB株)に対しても同様にCDDP処理を行い、シスプラチン耐性株を樹立した。KB株から樹立したシスプラチン耐性株をKBR株と命名した。
これらシスプラチン耐性株(H−1R株、Sa−3株及びKBR株)について、シスプラチンに対して感受性を示す各親株に対する相対的な耐性度を検討した。具体的には、各耐性株及び各親株をそれぞれ、CDDPで処理し(CDDPの濃度を0.05〜10μg/mlとした)、その後、MTTアッセイを行った。そして、各耐性株及び各親株について50%生存(死滅)濃度(IC50)を求めた。H−1株とH−1R株の相対的な耐性度は約10倍、Sa−3株とSa−3R株の相対的な耐性度は約7.5倍、KB株とKBR株の相対的な耐性度は8.6倍であった。これらの3種類の細胞株は凍結解凍を行っても、さらに、1月間CDDP無添加培養を行っても耐性は変わらなかった。
図1に代表例としてSa−3株及びSa−3R株におけるMTTアッセイの結果を示す。なお、他の耐性株とその親株においても、図1に示したプロファイルと同様なプロファイルを示した。
なお、耐性株のサイズは親株と比較して若干大きくなっているが、基本的な形態、増殖速度、およびコロニー形成能については、耐性株及び親株において大きな変化は認められず、ほぼ同様の性状を保っていた。
また、樹立した耐性株が遺伝子学的にもCDDP耐性を示すことを証明するため、薬剤耐性機構のうちABCトランスポーター遺伝子の発現状況をRT−PCR法によって解析した。ABCトランスポーター(ATP−binding cassette)は、細胞膜に存在し、薬物の輸送に関わっており、特に薬剤耐性との関連について多く報告されている。CDDP耐性と関連があるといわれるABCトランスポーター(MDR1、MRP1及びMRP2)について発現を検討した。具体的に、MDR1、MRP1及びMRP2の各RT−PCRに際しては、以下の表3に示すプライマーを用いた。なお、比較の対象としてGAPDHをRT−PCRによって検出した。
RT−PCRの結果、本例で樹立した各耐性株においては、3種類のABCトランスポーターで強発現が認められた。図2に代表例としてSa−3株及びSa−3R株におけるRT−PCRの結果を示す。この結果から、本例で樹立した各耐性株は遺伝子学的もCDDPに対する耐性を有する細胞株であることが明かとなった。なお、従前のCDDP耐性に関連する報告では、耐性株の耐性度は2倍程度であり、実験誤差範囲ともいえる程度の低耐性しか保有していない細胞株であった。本実施例で樹立した耐性株は、従前の細胞株と比較して高い薬剤耐性を有し、解析に非常に有用であると考えられた。
<マイクロアレイ解析>
次に、本実施例では、耐性株及びその親株を用いたマイクロアレイ解析によって、耐性株において特異的に発現増強している遺伝子及び耐性株において特異的に発現減弱している遺伝子を同定した。具体的にマイクロアレイ解析では、マイクロアレイとして54675種類のプローブが固定化されたAffymetrix U133 Plus2.0を使用した。また、マイクロアレイ解析には、解析ソフトウェアとしてGeneChip Operating Software 1.1(Affymetrix社製)及びGeneSpring6.1(Silicon Genetics社製)を使用した。
マイクロアレイ解析としては、先ず、耐性株Sa−3R株についてその親株Sa−3株と比較して1.5倍以上の発現が観察された遺伝子群、耐性株H−1R株についてその親株H−1株と比較して1.5倍以上の発現が観察された遺伝子群、及び耐性株KBR株についてその親株KB株比較して1.5倍以上の発現が観察された遺伝子群を特定した。そして、これら3つの群に共通する遺伝子群を、シスプラチン耐性株において特異的に発現増強している遺伝子群(164遺伝子)として同定した(図3参照)。
一方、耐性株Sa−3R株についてその親株Sa−3株と比較して1.5倍以下の発現が観察された遺伝子群、耐性株H−1R株についてその親株H−1株と比較して1.5倍以下の発現が観察された遺伝子群、及び耐性株KBR株についてその親株KB株比較して1.5倍以下の発現が観察された遺伝子群を特定した。そして、これら3つの群に共通する遺伝子群を、シスプラチン耐性株において特異的に発現減弱している遺伝子群(35遺伝子)として同定した(図3参照)。
これら合計199遺伝子は、癌細胞においてシスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定できたこととなる。
<パスウェイ解析>
次に、本実施例では、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定された199個の遺伝子についてパスウェイ解析を行い、199個の遺伝子で如何なるネットワークが形成されるかを検討した。具体的に、パスウェイ解析には、ソフトウェアとしてIngenuity Pathway Analysis(Ingenuity systems社製)を使用した。その結果、199個の遺伝子のうち50個の遺伝子が4つのネットワークを形成しており、これら4つのネットワークが更に大きな1つのネットワークを形成していることが判明した。これら4つのネットワークを構成する遺伝子群を表4にまとめた。
また、パスウェイ解析の結果として得られた4つのネットワークを図4に示す。表4及び図4に示したネットワークを構成する50個の遺伝子は、耐性株におけるCDDP耐性という表現型に強く関連する遺伝子であると結論づけた。
<後ろ向き試験>
次に、本実施例では、後ろ向き試験として臨床検体によって抗癌剤の奏功率を予測しえる候補遺伝子を、この50個の遺伝子から検索した。まず、RT−PCRによってmRNAの発現を確認することで、50遺伝子中で耐性株において発現している遺伝子のなかから5個の遺伝子(PDE3B、PDGFC、PKD2、NRG1及びLumican)を選出した。
PDE3Bに対する抗体として抗ヒトPDE3Bヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz社製)、PDGFCに対する抗体として抗ヒトPDGFCヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz社製)、PKD2に対する抗体として抗ヒトPKD2ウサギポリクローナル抗体(ABGENT社製)、NRG1に対する抗体として抗ヒトPKD2ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz社製)及びLumicanに対する抗体として抗ヒトLumicanヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz社製)を準備した。これらの遺伝子がタンパク・レベル質レベルで耐性株において発現増強していることを、準備した抗体を用いたウエスタンブロッティングにて確認した。
なお、上述した5個の遺伝子のうちlumican遺伝子について行ったRT−PCRの結果及びウエスタンブロッティングの結果を代表例として図5(A)及び(B)に示す。図5(A)及び(B)に示すように、lumican遺伝子は、親株と比較して耐性株において特異的に発現していることが判る。Lumican遺伝子を除く他の遺伝子についても同様な結果が得られた。
また、シスプラチン投与に結果、完全寛解した症例(CR症例:Complete Response症例)、部分寛解した症例(PR症例:Partial Response症例)及び不変の症例(NC症例:No Change症例)由来の臨床検体を用いて、免疫組織学的染色法により発現状態を調べた。免疫組織学的染色法は、ホルマリンで固定されたパラフィン包埋組織を厚さ4μmの切片にし、脱パラフィン処理と脱水処理した後、0.3%H2O2と30分間反応させて内因性ペルオキシダーゼを除去し、1.5%ブロッキング血清(Santa Cruz Biotechnology社製)で非特異的なタンパクとの反応を阻害した。その後、1:100倍希釈抗体Lin7Cモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology)を室温・湿潤状態で30分間反応させた。リン酸緩衝液で3回洗浄し、Envision reagent(Dako社製)と反応させた後、3,3−diaminobenzidinetetrahydrochloride(Dako社製)によって発色させ検出した。最終に、対比のためにヘマトキシリン染色を施した。
免疫組織学的染色法における染色性の評価にはIHCスコアを用いた。IHCスコアは、対物レンズ40倍で観察し、1視野の中の全細胞数のうち陽性細胞の百分率と染色性の強度(例えば3段階(弱、中及び強)に評価して、それぞれに1〜3の整数を割り当てる)とを掛け合わせた数の総和である。これを無作為に抽出した10視野で行い、その平均値としてIHCスコアを算出する。IHCスコアは、染色強度と染色範囲を示す優れたスコアとして、現在、一般的に用いられている染色度判定方法である。
lumican遺伝子について臨床検体の免疫組織学的染色法を施行した結果の代表例を図6に示した。シスプラチンに耐性である臨床検体症例において、lumicanタンパクの発現亢進が確認できた。
また、シスプラチン投与に対するNC症例を10症例、PR症例を22症例及びCR症例を16症例を用いてIHCスコアを求め、IHCスコアの分布を上述した5つの遺伝子毎に求めた。PDE3E遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図7に示し、lumican遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図8に示し、PDGFC遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図9に示し、PKD2遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図10に示し、NRG1遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図11に示した。
図7〜11に示すように、上記の5つの遺伝子全てについて、IHCスコアとシスプラチン投与の奏功評価とが相関していることが明かとなった。
さらに、上記の5個の遺伝子について、その発現の有無と治療効果判定を表5に纏めた。なお、表5において「+」は各遺伝子についてタンパク質レベルの発現が陽性であったことを示し、「−」は各遺伝子についてタンパク質レベルの発現が陰性であったことを示している。
表5からも判るように、シスプラチン投与の奏功結果と上述した5つの遺伝子の発現とが相関していることが明かとなった。
<結果のまとめ>
以上のように、先ず<マイクロアレイ解析>の結果から、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として信頼性の高い199個の遺伝子を同定することができたに絞り込めた。また、<パスウェイ解析>の結果から、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として更に信頼性の高い51個の遺伝子を絞り込めた。さらに、<後ろ向き試験>の結果から、51個の遺伝子に含まれる5個の遺伝子については、その発現量からシスプラチン投与の効果を判定できることが実証された。これらの結果から、各種癌に対するシスプラチンの投与効果を患者毎に高精度に判定することができる有用な手法を開発できたものと評価できる。
本シスプラチン投与効果判定方法は、診断対象者から採取した生体由来試料における、以下の5個の遺伝子から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するステップaと、測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップbとを含んでいる。
PDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子(配列番号1)
PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子(配列番号3)
PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子(配列番号5)
NRG1(neuregulin 1)遺伝子(配列番号7)
LUM(Lumican)遺伝子(配列番号9)
PDE3B遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号2に示す。PDGFC遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号4に示す。PKD2遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号6に示す。NRG1遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号8に示す。LUM遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号10に示す。
なお、これらPDE3B遺伝子、PDGFC遺伝子、PKD2遺伝子、NRG1遺伝子及びLUM遺伝子は、詳細を後述する、シスプラチン耐性株及びシスプラチン感受性株を用いてマイクロアレイ解析や、臨床検体を用いた後ろ向き試験を行った結果として同定された遺伝子である。また、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においては、これらの遺伝子の発現量に加えて表1に挙げた遺伝子群から得らばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現量を測定し、上記5つの遺伝子の発現量に加えてこの遺伝子の発現量を判定に使用しても良い。
なお、表1に挙げた遺伝子群は、詳細を後述する、シスプラチン耐性株及びシスプラチン感受性株を用いてマイクロアレイ解析を行った結果として同定された遺伝子から構成される。ここで、シスプラチン耐性株は、口腔扁平上皮癌由来細胞株又は中咽頭扁平上皮癌由来細胞株からシスプラチン耐性を指標として樹立された細胞株であって、シスプラチン投与により奏効しない患者の細胞株モデルとしての意味を有する。また、シスプラチン感受性株とは、シスプラチン耐性株の親株である口腔扁平上皮癌由来細胞株又は中咽頭扁平上皮癌由来細胞株それ自身を意味する。
すなわち、表1に挙げた遺伝子群は、シスプラチン耐性株において、特異的に発現増強した遺伝子と特異的に発現減弱した遺伝子とから構成されている。表1において、シスプラチン耐性株において特異的に発現増強した遺伝子はNo.1〜164であり、シスプラチン耐性株において特異的に発現減弱した遺伝子はNo.165〜199である。
また、表1に挙げた遺伝子群について、上記マイクロアレイ解析の結果を用いてIngenuity pathway analysisを行うことで統計的に意義あるネットワークを構築した結果として、表2に示す遺伝子群が特定される。
具体的に、表1に挙げた遺伝子群のうち51個の遺伝子群が4つのネットワークを形成するとともに、これら4つのネットワークが大きな一大ネットワークを形成している。
本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において生体由来試料とは、判定対象者における遺伝子発現解析が可能であれば特に限定されないが、例えば、組織、細胞、体液、尿及びその他生体試料由来の蛋白質抽出液を挙げることができる。ここで体液とは、血液、リンパ液、組織液(組織間液、細胞間液、間質液)、体腔液、漿膜腔液、胸水、腹水、心嚢液、脳脊髄液(髄液)、関節液(滑液)、眼房水(房水)、消化液、膵液、腸液、精液及び羊水を含む意味である。また、生体由来試料は、組織、細胞、体液、尿及びその他生体試料由来の蛋白質抽出液のいずれか一種でも複数種でもよい。
組織としては、癌罹患患者の治療目的で行われた手術の際に得られた組織の一部、癌を疑われた診断対象者から生検等によって採取された組織の一部、癌罹患患者で原発性か転移性かを鑑別する目的で生検等によって採取された組織の一部を含む意味である。
また、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において細胞としては、上記各組織から単離した細胞を使用することができる。また、体液としては、上記血液から分離した血漿又は血清、尿、リンパ液、脳脊髄液或いは腹水を使用することができる。本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においてその他の生体由来試料としては、喀痰などから単離した細胞又は蛋白質抽出液を用いることができる。
具体的に、判定対象者から採取した生体由来試料における、上述した遺伝子の発現を測定するには、例えば、測定対象の遺伝子に対するmRNA量を測定する又は測定対象の遺伝子の産物であるタンパク質量を測定すればよい。
測定対象の遺伝子に対するmRNA量を測定する方法としては、公知の遺伝子の発現の検出方法を用いることができる。例えば、測定対象の遺伝子のmRNA量を検出するために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、測定対象の遺伝子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いることができる。当該プローブを用いて測定対象の遺伝子のmRNA量を検出するには、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、プローブを作製する際に当該プローブに適宜蛍光標識等の標識を付与しておき、これを判定対象者から採取した生体由来試料から単離したmRNA(又はmRNAから合成したcDNA)とハイブリダイズする。その後、ハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光強度を測定することにより、測定対象の遺伝子のmRNA量を検出することができる。なお、プローブとしては、ガラスビーズやガラス基板等の支持体に固定化して使用することもできる。すなわち、測定対象の遺伝子(複数でもよい)について作製したプローブを支持体上に固定化したマイクロアレイ又はDNAチップの形で用いることもできる。
なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、42℃で、1×SSC(0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム)、0.1%のSDS(Sodium dodecyl sulfate)を含む緩衝液による42℃での洗浄処理によってもハイブリダイズを維持することを意味する。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
一方、測定対象の遺伝子の産物であるタンパク質量を測定する方法としては、公知のタンパク質検出方法を用いることができる。具体的には、測定対象のタンパク質に対する抗体を使用した各種の方法を適用することができる。
なお、測定対象のタンパク質を抗原とし、当該抗原に結合する限り、前記抗体としては特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をスクリーニングすることによって作製できる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法(Kohler.G.and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73:3−46)等に準じて行うことができる。
ここで、モノクローナル抗体を作製する際には、上述した遺伝子の産物を抗原として使用することができ、また、上述した遺伝子の産物の断片を発現する細胞を抗原として使用することができる。なお、これらタンパク質若しくは当該タンパク質の断片は、例えば、Molecuar Cloning:A Laboratory Manual 第2版第1−3巻 Sambrook,J.ら著、Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989年に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得することができる。また、これらタンパク質若しくは当該タンパク質の断片を発現する細胞も、Molecuar Cloning:A Laboratory Manual 第2版第1−3巻 Sambrook,J.ら著、Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989年に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得することができる。
得られたモノクローナル抗体は、測定対象のタンパク質の定量用に、エンザイム−リンクイムノソルベントアッセイ(ELISA)、酵素イムノドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づいたアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノアッセイ法で検査試薬として用いることができる。また、モノクローナル抗体は標識化されることが好ましい。標識化を行う際、標識化合物としては例えば当分野で公知の酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、染色物質などを使用することができる。
ところで、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法においては、測定対象の遺伝子として上述したPDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子、PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子、PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子、NRG1(neuregulin 1)遺伝子及びLUM(Lumican)遺伝子から選択するが、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法は、測定対象の遺伝子をこれら5つの遺伝子に限定するものではなく、表1に挙げる遺伝子群から選ばれる他の遺伝子を測定対象として追加してもよい。特に、測定対象の遺伝子としては、上述した5つの遺伝子に加えて、表2に挙げた遺伝子群から選ばれる他の遺伝子を測定対象とすることがより好ましい。
以上のようにして、診断対象者から採取した生体由来試料における、上述した遺伝子群から選ばれる測定対象の遺伝子の発現量を測定した後、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法では、当該発現量に基づいてシスプラチン投与による効果の有無又は効果の程度を判定する。
具体的には、上述したいずれかの方法により測定対象の遺伝子の発現量を測定した後、当該遺伝子の発現量を評価する。発現量の評価は、測定対象の遺伝子毎に基準値を設定し、この基準値との比較によって行っても良い。基準値としては、構成的に発現する遺伝子の発現量に対する相対値を設定することができる。また、測定対象の遺伝子の発現量は、今回行ったように免疫組織化学染色(IHC)スコアにて評価し、擬陽性と擬陰性を評価できる値を基準値として評価しても良い。
本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法及び判定キットによれば、非常に優れた確度及び/又は優れた特異度で判定対象者について、シスプラチン投与による効果の有無又は効果の程度を判断することができる。ここで、感度とは、シスプラチン投与に奏功する患者群における陽性率を意味する。特異度とは、シスプラチン投与に奏功しない患者群における陰性率を意味する。
特に、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法において、測定対象の遺伝子の種類を増やすこと(例えば、6種類以上の遺伝子)によって、より優れた感度及び/又はより優れた特異度で診断することができる。
本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法によれば、抗癌剤・化学療法開始前の癌患者から採取した生体由来試料を用いた遺伝子発現解析(mRNAレベル或いはタンパク質レベル)により、シスプラチン投与による効果をより客観的、特異的に判定することができることから、投与効果を期待できない患者に対する過度の負担となるようなシスプラチンの投与を防止することができ、当該患者にとって有効な治療方針にとって有用な知見を提供することができる。
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明に係る技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
<耐性株の樹立>
先ず、本実施例ではシスプラチン耐性株を樹立した。具体的には、和歌山医科大学医学部歯科口腔外科講座から提供された口腔扁平上皮癌由来細胞株(H−1株及びSa−3株)に対して、シスプラチン(以下、CDDPと称する場合もある)濃度を0.1μg/mlの低濃度から段階的にCDDPを持続的に接触させることによって、シスプラチンに対して耐性を有する細胞株を樹立した。H−1株から樹立したシスプラチン耐性株をH−1R株と命名し、Sa−3株から樹立したシスプラチン耐性株をSa−3R株と命名した。
また、中咽頭扁平上皮癌由来細胞株(KB株)に対しても同様にCDDP処理を行い、シスプラチン耐性株を樹立した。KB株から樹立したシスプラチン耐性株をKBR株と命名した。
これらシスプラチン耐性株(H−1R株、Sa−3株及びKBR株)について、シスプラチンに対して感受性を示す各親株に対する相対的な耐性度を検討した。具体的には、各耐性株及び各親株をそれぞれ、CDDPで処理し(CDDPの濃度を0.05〜10μg/mlとした)、その後、MTTアッセイを行った。そして、各耐性株及び各親株について50%生存(死滅)濃度(IC50)を求めた。H−1株とH−1R株の相対的な耐性度は約10倍、Sa−3株とSa−3R株の相対的な耐性度は約7.5倍、KB株とKBR株の相対的な耐性度は8.6倍であった。これらの3種類の細胞株は凍結解凍を行っても、さらに、1月間CDDP無添加培養を行っても耐性は変わらなかった。
図1に代表例としてSa−3株及びSa−3R株におけるMTTアッセイの結果を示す。なお、他の耐性株とその親株においても、図1に示したプロファイルと同様なプロファイルを示した。
なお、耐性株のサイズは親株と比較して若干大きくなっているが、基本的な形態、増殖速度、およびコロニー形成能については、耐性株及び親株において大きな変化は認められず、ほぼ同様の性状を保っていた。
また、樹立した耐性株が遺伝子学的にもCDDP耐性を示すことを証明するため、薬剤耐性機構のうちABCトランスポーター遺伝子の発現状況をRT−PCR法によって解析した。ABCトランスポーター(ATP−binding cassette)は、細胞膜に存在し、薬物の輸送に関わっており、特に薬剤耐性との関連について多く報告されている。CDDP耐性と関連があるといわれるABCトランスポーター(MDR1、MRP1及びMRP2)について発現を検討した。具体的に、MDR1、MRP1及びMRP2の各RT−PCRに際しては、以下の表3に示すプライマーを用いた。なお、比較の対象としてGAPDHをRT−PCRによって検出した。
<マイクロアレイ解析>
次に、本実施例では、耐性株及びその親株を用いたマイクロアレイ解析によって、耐性株において特異的に発現増強している遺伝子及び耐性株において特異的に発現減弱している遺伝子を同定した。具体的にマイクロアレイ解析では、マイクロアレイとして54675種類のプローブが固定化されたAffymetrix U133 Plus2.0を使用した。また、マイクロアレイ解析には、解析ソフトウェアとしてGeneChip Operating Software 1.1(Affymetrix社製)及びGeneSpring6.1(Silicon Genetics社製)を使用した。
マイクロアレイ解析としては、先ず、耐性株Sa−3R株についてその親株Sa−3株と比較して1.5倍以上の発現が観察された遺伝子群、耐性株H−1R株についてその親株H−1株と比較して1.5倍以上の発現が観察された遺伝子群、及び耐性株KBR株についてその親株KB株比較して1.5倍以上の発現が観察された遺伝子群を特定した。そして、これら3つの群に共通する遺伝子群を、シスプラチン耐性株において特異的に発現増強している遺伝子群(164遺伝子)として同定した(図3参照)。
一方、耐性株Sa−3R株についてその親株Sa−3株と比較して1.5倍以下の発現が観察された遺伝子群、耐性株H−1R株についてその親株H−1株と比較して1.5倍以下の発現が観察された遺伝子群、及び耐性株KBR株についてその親株KB株比較して1.5倍以下の発現が観察された遺伝子群を特定した。そして、これら3つの群に共通する遺伝子群を、シスプラチン耐性株において特異的に発現減弱している遺伝子群(35遺伝子)として同定した(図3参照)。
これら合計199遺伝子は、癌細胞においてシスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定できたこととなる。
<パスウェイ解析>
次に、本実施例では、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として同定された199個の遺伝子についてパスウェイ解析を行い、199個の遺伝子で如何なるネットワークが形成されるかを検討した。具体的に、パスウェイ解析には、ソフトウェアとしてIngenuity Pathway Analysis(Ingenuity systems社製)を使用した。その結果、199個の遺伝子のうち50個の遺伝子が4つのネットワークを形成しており、これら4つのネットワークが更に大きな1つのネットワークを形成していることが判明した。これら4つのネットワークを構成する遺伝子群を表4にまとめた。
<後ろ向き試験>
次に、本実施例では、後ろ向き試験として臨床検体によって抗癌剤の奏功率を予測しえる候補遺伝子を、この50個の遺伝子から検索した。まず、RT−PCRによってmRNAの発現を確認することで、50遺伝子中で耐性株において発現している遺伝子のなかから5個の遺伝子(PDE3B、PDGFC、PKD2、NRG1及びLumican)を選出した。
PDE3Bに対する抗体として抗ヒトPDE3Bヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz社製)、PDGFCに対する抗体として抗ヒトPDGFCヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz社製)、PKD2に対する抗体として抗ヒトPKD2ウサギポリクローナル抗体(ABGENT社製)、NRG1に対する抗体として抗ヒトPKD2ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz社製)及びLumicanに対する抗体として抗ヒトLumicanヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz社製)を準備した。これらの遺伝子がタンパク・レベル質レベルで耐性株において発現増強していることを、準備した抗体を用いたウエスタンブロッティングにて確認した。
なお、上述した5個の遺伝子のうちlumican遺伝子について行ったRT−PCRの結果及びウエスタンブロッティングの結果を代表例として図5(A)及び(B)に示す。図5(A)及び(B)に示すように、lumican遺伝子は、親株と比較して耐性株において特異的に発現していることが判る。Lumican遺伝子を除く他の遺伝子についても同様な結果が得られた。
また、シスプラチン投与に結果、完全寛解した症例(CR症例:Complete Response症例)、部分寛解した症例(PR症例:Partial Response症例)及び不変の症例(NC症例:No Change症例)由来の臨床検体を用いて、免疫組織学的染色法により発現状態を調べた。免疫組織学的染色法は、ホルマリンで固定されたパラフィン包埋組織を厚さ4μmの切片にし、脱パラフィン処理と脱水処理した後、0.3%H2O2と30分間反応させて内因性ペルオキシダーゼを除去し、1.5%ブロッキング血清(Santa Cruz Biotechnology社製)で非特異的なタンパクとの反応を阻害した。その後、1:100倍希釈抗体Lin7Cモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology)を室温・湿潤状態で30分間反応させた。リン酸緩衝液で3回洗浄し、Envision reagent(Dako社製)と反応させた後、3,3−diaminobenzidinetetrahydrochloride(Dako社製)によって発色させ検出した。最終に、対比のためにヘマトキシリン染色を施した。
免疫組織学的染色法における染色性の評価にはIHCスコアを用いた。IHCスコアは、対物レンズ40倍で観察し、1視野の中の全細胞数のうち陽性細胞の百分率と染色性の強度(例えば3段階(弱、中及び強)に評価して、それぞれに1〜3の整数を割り当てる)とを掛け合わせた数の総和である。これを無作為に抽出した10視野で行い、その平均値としてIHCスコアを算出する。IHCスコアは、染色強度と染色範囲を示す優れたスコアとして、現在、一般的に用いられている染色度判定方法である。
lumican遺伝子について臨床検体の免疫組織学的染色法を施行した結果の代表例を図6に示した。シスプラチンに耐性である臨床検体症例において、lumicanタンパクの発現亢進が確認できた。
また、シスプラチン投与に対するNC症例を10症例、PR症例を22症例及びCR症例を16症例を用いてIHCスコアを求め、IHCスコアの分布を上述した5つの遺伝子毎に求めた。PDE3E遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図7に示し、lumican遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図8に示し、PDGFC遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図9に示し、PKD2遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図10に示し、NRG1遺伝子についてIHCスコアの分布を求めた結果を図11に示した。
図7〜11に示すように、上記の5つの遺伝子全てについて、IHCスコアとシスプラチン投与の奏功評価とが相関していることが明かとなった。
さらに、上記の5個の遺伝子について、その発現の有無と治療効果判定を表5に纏めた。なお、表5において「+」は各遺伝子についてタンパク質レベルの発現が陽性であったことを示し、「−」は各遺伝子についてタンパク質レベルの発現が陰性であったことを示している。
<結果のまとめ>
以上のように、先ず<マイクロアレイ解析>の結果から、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として信頼性の高い199個の遺伝子を同定することができたに絞り込めた。また、<パスウェイ解析>の結果から、シスプラチン耐性に関連する遺伝子として更に信頼性の高い51個の遺伝子を絞り込めた。さらに、<後ろ向き試験>の結果から、51個の遺伝子に含まれる5個の遺伝子については、その発現量からシスプラチン投与の効果を判定できることが実証された。これらの結果から、各種癌に対するシスプラチンの投与効果を患者毎に高精度に判定することができる有用な手法を開発できたものと評価できる。
本発明によれば、シスプラチンの投与による奏効の有無を非常に優れた確度で判定することができる。したがって、本発明に係るシスプラチン投与効果判定方法及びシスプラチン投与効果判定キットは、対象となる患者に対してシスプラチン投与を含む治療を適用するか否かの判定を行うことができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
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Claims (9)
- 診断対象者から採取した生体由来試料における、PDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子、PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子、PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子、NRG1(neuregulin 1)遺伝子及びLUM(Lumican)遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するステップaと、
測定の結果として得られた遺伝子の発現量に基づいてシスプラチンの投与効果を判定するステップbと、
を含むシスプラチン投与効果判定方法。 - 前記ステップaでは、上記遺伝子のmRNA量を測定することを特徴とする請求項1記載のシスプラチン投与効果判定方法。
- 前記ステップaでは、上記遺伝子の産物であるタンパク質量を測定することを特徴とする請求項1記載のシスプラチン投与効果判定方法。
- 上記ステップaでは、表1に示す遺伝子群のうち上記PDE3B遺伝子、上記PDGFC遺伝子、上記PKD2遺伝子、上記NRG1遺伝子及び上記LUM遺伝子以外の少なくとも1以上の遺伝子の発現量を更に測定することを特徴とする請求項1記載のシスプラチン投与効果判定方法。
- PDE3B(phosphodiesterase 3B)遺伝子、PDGFC(platelet derived growth factor C)遺伝子、PKD2(Polycystic kidney disease−2 gene)遺伝子、NRG1(neuregulin 1)遺伝子及びLUM(Lumican)遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するための手段を含む、シスプラチン投与効果判定キット。
- 上記手段は、上記遺伝子のmRNA又は当該mRNAに由来するcDNAに対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項5記載のシスプラチン投与効果判定キット。
- 上記ポリヌクレオチドは、支持体に固定されたものであることを特徴とする請求項6記載のシスプラチン投与効果判定キット。
- 上記手段は、上記遺伝子の産物であるタンパク質に対して特異的に結合する抗体であることを特徴とする請求項5記載のシスプラチン投与効果判定キット。
- 表2に示す遺伝子群のうち上記PDE3B遺伝子、上記PDGFC遺伝子、上記PKD2遺伝子、上記NRG1遺伝子及び上記LUM遺伝子以外の少なくとも1以上の遺伝子の発現を測定するための手段を更に含むことを特徴とする請求項5記載のシスプラチン投与効果判定キット。
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