CN111304179A - 利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法，所述方法，包括如下步骤：(一)LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆；所涉及的引物包括：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8；(二)LcE3W251L/F309L菊酯降解酶的表达；(三)分离和纯化表达的LcE3W251L/F309L菊酯降解酶。本发明批量生产具有极高生物活性的羧酸脂酶突变体，从而通过该生物活性物质，有效水解土壤和水质中的菊酯类农药成分，净化生态环境，维护动植物和谐共处的稳态。

Description

利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法

技术领域

本发明涉及一种农药降解酶的制备方法，具体涉及菊酯类农药降解酶(LcE3W251L/F309L)的方法。

背景技术

有机磷农药常被用作杀虫剂喷洒在果树、蔬菜上，是有机氯农药的取代物，其药效高，品种多，防治范围广，成本低，为增加生产、防治传播疾病做出了巨大贡献。但有机磷农药是一种神经毒物，对生物体内的胆碱酯酶有抑制作用，抑制胆碱酯酶使其失去分解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱堆积，引起神经功能紊乱，从而导致肌体的损害。在人们生活质量不断提高的同时，有机磷农药在果蔬上残留对人体健康的影响和引起的相关安全隐患问题逐渐引起人们的关注。

目前，有机磷农药污染降解方法主要有超声波、吸附、洗涤和电离辐射等物理方法；水解、氧化分解和光化学降解等化学方法；微生物、降解酶和工程菌等生物方法。其中生物降解方法是利用生物作用将农药分解为小分子无毒或低毒化合物，最终降解为水。与物理和化学降解技术相比，具有更加高效、彻底、无二次污染等优势。

有研究报道，双翅目昆虫铜绿蝇(Luciliacuprina,Lc)是一类抗有机磷酸脂类农药的昆虫。此类昆虫中编码羧酸脂酶LcE3的基因因为天然携带了两种不同的突变，导致了他们对有机磷农药的抗性。其中一种突变为羧酸脂酶LcE3第137位氨基酸甘氨酸突变为天冬氨酸，标记为LcE3G137D，另一种突变为LcE3第251位氨基酸色氨酸突变为亮氨酸，标记为LcE3W251L。其中，LcE3G137D突变体能够对二嗪农杀虫剂产生抗性，其突变发生在LcE3酶活性位点的氧离子洞结构中，虽然阻断了羧酸脂酶的活性，但能够获得有机磷水解酶活性，提高脱磷酸化的速率。另一个LcE3W251L突变体能够对马拉松杀虫剂产生抗性，其突变发生在LcE3催化结构附近的酰基口袋结构中，能够在增强马拉硫磷羧酸脂酶的活性的同时，获得有机磷水解酶活性。同时，从黑腹果蝇(Drosophila melanogaster,Dm)中分离出来的羧酸脂酶DmEST23是LcE3的直系同源类似物，其相应位点的突变体亦能起到水解有机磷农药的功能。

于是，从昆虫自身携带的抵抗有机磷农药的天然突变体出发，研究者开发出了一系列人工诱导的E3和EST23的突变体，从中筛选出一批极有效的有机磷水解酶和拟除虫菊酯水解酶，包括：LcE3W251L，LcE3F309L，LcE3W251L/F309L，DmEST23W251L。其中，LcE3W251L突变体对反式拟除虫菊酯杀虫剂的水解活性比野生型提高了十倍，水解顺式拟除虫菊酯杀虫剂的活性提高了130倍以上。而LcE3F309L突变体比LcE3W251L突变体具有更强的水解反式拟除虫菊酯杀虫剂的活性。LcE3W251L/F309L同时携带了两个突变，能够极高效地水解绝大部分的顺式异构的杀虫剂。

但是，以上述昆虫为来源，提取相应的水解酶存在诸多问题，极大的限制了其产业化发展和应用。首先，上述果蝇及其突变体培育周期长，培育成本高，想要实现大规模的产业化生产，投入成本高昂；其次，上述突变体产生水解酶的相应基因在多代培育后易突变，使得水解酶活性大大降低，进一步增加了量产难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明首先涉及一组野生型LcE3的基因序列SEQ ID NO:1，和经大肠杆菌密码子优化的LcE3的基因序列SEQ ID NO:2；

本发明还涉及一组用于扩增野生型LcE3基因序列的引物基因序列，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

本发明还涉及一组用于在野生型LcE3序列中引入W251L突变的引物基因序列，SEQID NO:5和SEQ ID NO:6；

本发明还涉及一组用于在LcE3W251L突变体序列中引入F309L突变的引物基因序列，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

本发明所述的利用基因工程制备农药降解酶方法，包括如下步骤：

(一)LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆：

菊酯类农药降解酶标记为菊酯类农药降解酶(LcE3W251L/F309L)；

LcE3W251L/F309L突变体，是野生型LcE3的第251位氨基酸编码序列由TGG突变为CTG，第309位氨基酸编码序列由TTC突变为CTG。

所以采取的策略是先针对野生型LcE3的DNA做密码子优化，之后对编辑251位和309位氨基酸的DNA序列做突变，具体通过下述步骤实现：

(1)根据NCBI数据库中的数据，搜索获得野生型LcE3的基因,其DNA序列如SEQ IDNO:1所示，具体为(具体序列见附页)，并通过OPTIMIZER数据库对野生型LcE3的基因进行大肠杆菌密码自由化，优化后的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；

通过商业化化学合成方法，合成大肠杆菌密码子优化后的LcE3的基因片段；

(2)以上述经优化的野生型LcE3的片段为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列为引物，扩增野生型LcE3基因；

SEQ ID NO:3 F-LcE3-NdeI-primer:5’

-tacatATGAACTTCAACGTTTCTCT-3’

SEQ ID NO:4 R-LcE3-XhoI-primer:5’

-tgctcgagGAACAGGTCACGGTGTTTTT-3’；

回收PCR产物，并利用内切酶对回收产物以及所选质粒载体，在上述插入位点进行双酶切，酶切反应需在合适的体系和条件下进行；

所述的内切酶选自Thermo Scientific公司的快切酶，Fast digest XhoI(FD0583)和Fast digest XhoI(FD0694)，所述的质粒载体选自默克公司；

酶切反应的体系和工艺条件如下：

(3)使用经筛选出的连接酶，将上述PCR产物片段连接到所述的载体中；

所述的连接酶选自Thermo Scientific公司的T4 DNA连接酶(EL0014)；

(4)摇菌验证目的基因已准确插入载体,且在PCR过程中未引入突变，最终完成野生型LcE3的表达质粒的克隆；

(5)定点突变W251L位点:以步骤(4)获得的野生型LcE3质粒为模板，以SEQ ID NO:5所示的基因序列和SEQ ID NO:6所示的基因序列为引物，进行定点突变，并扩增突变序列；

SEQ ID NO:5F-LcE3W251L:5’-TGCCCGctgGCGAACACCCAGTGCCAGCA-3’

SEQ ID NO:6R-LcE3W251L:5’

-GTTCGCcagCGGGCAGATCGCGTTACCAG-3’

(6)采用制备野生型LcE3质粒类似的步骤，获得LcE3W251L质粒；

(7)在LcE3W251L质粒的基础上，以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物，利用所述引物，继续突变F309L位点，最终获得菊酯类农药降解酶LcE3W251L/F309L双突变质粒，也可称为菊酯类农药降解酶LcE3W251L/F309L突变质粒；

SEQ ID NO:7 F-LcE3F309L:5’

-GTTATGctgCCGTTCGGTCCGACCGTTGA-3’

SEQ ID NO:8 R-LcE3F309L:5’

-GAACGGcagCATAACTTTGTTGGTACGTT-3’

上述的适用于大肠杆菌的原核表达载体有很多，以pET系列和pGEX系列最为常用，基于简化目标蛋白纯化过程，调整蛋白可溶性，屏蔽毒性蛋白等要求，表达载体优选pGEX-6p，pET28-SMT3a，pET-26b(+)中的一种，更优选pET28-SMT3a，pET-26b(+)中的一种，最优选pET-26b(+)。

上述的PCR扩增程序反应物中的模板DNA优选质粒DNA、gDNA和cDNA中的一种，更优选质粒DNA和gDNA，最优选质粒DNA，含量应在0.1-1ng/50ul。

上述的PCR扩增程序反应物中的DNA聚合酶优选Taq DNA聚合酶、pfx DNA聚合酶和Phusion DNA聚合酶中的一种，更优选pfx DNA聚合酶和Phusion DNA聚合酶，最优选Phusion DNA聚合酶。

上述的PCR扩增程序反应物中的引物浓度优选0.1-1uM，更优选0.2-0.6uM，最优选0.4-0.5uM。

上述的PCR扩增反应的退火温度优选50-70℃，更优选55-70℃，最优选55-65℃；扩增反应的循环数最优选35次。

上述的PCR产物和载体的第一内切酶位点为NdeI，第二内切酶位点最优选Xhol；

(二)LcE3W251L/F309L菊酯降解酶的表达，包括如下步骤：

(1)将突变型表达质粒,通过以下步骤转化至BL21-codonplus RIL大肠杆菌细胞中，挑选卡那霉素抗性的单克隆在LB培养基中进行培养,培养方法如下：

1)从-80冰箱中取出一只BL21-codonplus RIL感受态细胞，约50ul；放置于冰上，待其溶解；

2)取10ng携带目的基因的pET质粒至融化的RIL感受态细胞中，混匀并冰上放置30分钟；

3)调节水浴锅温度至42度，将含有质粒和感受态的混合物的EP管42度热激处理90秒，处理完立刻放置于冰上静置5分钟；

4)向热激后的EP管中加入1000ul无抗LB培养基，放置于37度摇床180rpm培养1-2小时；

5)取100ul培养好的细菌均匀涂至50ug/ml浓度的卡那霉素的LB平板上，37度烘箱培养过夜，次日挑取单克隆。

(2)通过下列步骤添加IPTG诱导蛋白表达；

6)取培养过夜的菌液10ml转入1L含有相应抗性的培养基，；

7)37℃培养至OD约为0.6；

8)降温至18℃加IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)至终浓度0.5mM；

9)18℃诱导表达18小时，此过程中蛋白已经表达。

(3)通过离心重悬收集菌体，并在-80℃下存储备用；

(三)分离和纯化表达的LcE3W251L/F309L菊酯降解酶，包括如下步骤：

(1)收集目标蛋白,通过超声破碎暴露蛋白,将培养好的菌液放入离心机中，5000r/min离心10min，弃去上清，收集菌体，离心后的菌体沉淀悬浮于25mL结合缓冲液中，加入适量蛋白抑制剂，冰浴放置。超声破碎，每个循环26次，超声6s，间隔5s，根据破碎效果共2～4个循环，破碎后的菌体4℃18000rpm转速，离心30分钟，收集上清液保持在4℃；

(2)初步沉淀分离。选择适当的盐溶液或有机溶剂沉淀所得降解酶蛋白，经离心后收集沉底，并重新溶解于缓冲溶液中，可初步分离蛋白和其他杂质；

(3)层析纯化,通过多步层析进一步提纯，最终得到目标产品蛋白；

上述初步沉淀分离步骤中,沉淀剂优选硫酸铵、聚乙二醇、低温丙酮中的一种，更优选丙酮和硫酸铵，最优选硫酸铵；当时用硫酸铵为沉淀剂时，硫酸铵溶液的浓度优选10％-50％的饱和度，更优选20％-40％饱和度，最优选25％-35％饱和度。

上述层析纯化步骤中，层析方法优选亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析中的一种或几种连用，更优选镍柱亲和层析、DEAE FF阴离子交换层析和Sephadex凝胶过滤层析，最优选先利用镍柱亲和层析后再经DEAE FF阴离子交换最后经Sephadex G-60过滤。

经上述步骤之后得到的菊酯降解酶,经测定纯度在95％以上，可经进一步的稀释和复配后，制成制剂或用于喷洒或清洗菊酯类农药残留超标的农产品。

本发明的有益效果是：

本发明通过将昆虫源的能够高效水解拟除虫菊酯的羧酸脂酶LcE3W251L/F309L相应的突变体整合表达至生物工程菌大肠杆菌中的方法，并通过优化表达和纯化参数，批量生产具有极高生物活性的羧酸脂酶突变体，从而通过该生物活性物质，有效水解土壤和水质中的菊酯类农药成分，净化生态环境，维护动植物和谐共处的稳态。

附图说明

图1为突变质粒构建原理图。

具体实施方式

参见图1，构建有机磷农药降解酶LcE3野生型及其突变体基因的表达质粒，并对载体质粒进行回收纯化，包括如下步骤：

经酶切后的野生型LcE3基因通过连接酶在Ndel和Xhol位点接入pET-26b(+)载体后，再通过引物序列SEQ ID NO:5/6引入突变W251L后再通过引物序列SEQ ID NO:7/8引入F309L突变，最终构建出pET-26b(+)-LcE3W251L/F309L双突变质粒。

实施例1

1、野生型LcE3表达质粒的构建：

从NCBI中查询到野生型LcE3的序列，并通过OPTIMIZER进行大肠杆菌密码子优化并通过化学合成获得优化后的LcE3野生型序列SEQ ID NO:2。之后通过扩增引物，以优化后的LcE3野生型序列为模板，使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HFBuffer(Thermo Fisher,F531L)进行扩增，总体系20ul，组成如下：

扩增后回收扩增产物。上述扩增引物序列如下：

SEQ ID NO:3 F-LcE3-NdeI:5’-tacatATGAACTTCAACGTTTCTCT-3’

SEQ ID NO:4 R-LcE3-XhoI:5’-tgctcgagGAACAGGTCACGGTGTTTTT-3’

2、野生型有机磷农药降解酶LcE3基因和载体质粒DNA片段的体外连接

使用T4 DNA连接酶(Thermo Scientific)将LcE3基因的PCR的片段连接至pET-26b(+)载体中，摩尔比例为3:1。连接反应如下:170ng酶切后的基因片段，100ng酶切后的载体片段，1ul T4 DNA连接酶，1ul T4 DNA连接缓冲液，加水补至10ul体系。22℃反应10分钟。等待后续转化至大肠杆菌感受态细胞中。

3、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

在10ml试管中加入5ml LB液体培养基，挑取一个大肠杆菌DH5α单菌落至其中，混合均匀，在37℃摇床中以180转/分钟的速度培养过夜。次日，在250ml三角瓶中将500ul过夜培养的细菌加入到50ml的LB液体培养基中，比例为1:100。相同条件下培养2-3小时，至OD600为0.4-0.6之间，将50ml菌液倒入50ml离心管中，冰上放置30分钟。以4000转/分钟，4℃离心收集菌体沉淀。用25ml冰冷的灭菌的0.1M CaCl₂溶液处理沉淀，混合均匀置于冰上处理30分钟。再以4000转/分钟，4℃离心收集菌体沉淀。重复0.1M CaCl₂溶液处理两次后，最终的菌体沉淀以2ml冰冷的灭菌的含有15％甘油的0.1M CaCl₂溶液重悬，以100ul分装至预冷的EP管中，即可使用。其余感受态冻存至-80℃超低温冰箱保存。

4、大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化

取出一支含有100ul的DH5α感受态细胞的EP管，放置于冰上。向其中加入5ul的连接产物，混合均匀，放置于冰上静置30分钟。后取出置于42℃水浴锅中，准确计时热激90秒，取出，将EP管静置于冰上5分钟。随后，加入1ml无抗LB液体培养基，混合均匀，37℃摇床培养2小时，速度为180转/分钟。结束后以3000转/分钟的速度离心5分钟，丢弃上清，将沉淀以100ul LB液体培养基重悬，均匀涂于含有50ug/ml的卡那霉素的LB固体培养基上，静置20分钟后，倒置于37℃培养箱中，培养16小时过夜，形成菌落。

5、目的质粒的筛选和鉴定：

选取含有质粒pET-26b(+)-LcE3的重组菌落，使用质粒抽提试剂盒PureLink^TMQuick Plasmid Miniprep Kit(Invitrogen)进行质粒小抽提取。提取后的质粒用NdeI和XhoI进行双酶切验证插入基因大小是否正确。验证无误后，送质粒样品进行Sanger测序，经过测序无误的质粒可用于后续突变质粒的克隆。

6、有机磷农药降解酶双突变体LcE3W251L/F309L基因的设计和制备：

6.1根据目标片段和载体基因的特点，双突变体合成的引物序列如SEQ ID NO:5/6，7/8，所示:

SEQ ID NO:5 F-LcE3W251L:5’-TGCCCGctgGCGAACACCCAGTGCCAGCA-3’

SEQ ID NO:6 R-LcE3W251L:5’-GTTCGCcagCGGGCAGATCGCGTTACCAG-3’

SEQ ID NO:7 F-LcE3F309L:5’-GTTATGctgCCGTTCGGTCCGACCGTTGA-3’

SEQ ID NO:8 R-LcE3F309L:5’-GAACGGcagCATAACTTTGTTGGTACGTT-3’LcE3W251L/F309L双突变体的第251位氨基酸编码序列由TGG突变为CTG，第309位氨基酸编码序列由TTC突变为CTG。

6.2定点突变W251L位点:使用PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with HFBuffer(Thermo Fisher)进行PCR扩增，以制备好的野生型LcE3质粒为模板进行定点突变，总体系50ul，组成配比如下：

按照以上配比添加各类成分后，以如下参数设置PCR仪：步骤1(最初变性)：循环为1，温度98℃，时间30秒；步骤2(扩增)：循环为35，温度为98℃，10秒，变性；60℃20秒退火；72℃15秒/kb延伸；步骤3(延伸和补全)：循环为1，温度72℃，7分钟；步骤4(暂时存放)：循环为1，温度4℃长时间保存。

6.3DpnI消化：PCR反应后，取5ul的反应产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR产物的大小是否正确。随后，直接在PCR反应体系中加入1ulDpnI酶，混合均匀37℃处理1小时。DpnI消化完毕后可直接用于转化，或保存于-20℃备用。

6.4转化，挑选克隆及鉴定：在100ul感受态细胞中，加入5-10ul的经过DpnI消化后的突变产物。参照所使用感受态细菌的操作方法进行转化，在涂板前通过离心浓缩细菌沉淀，全部涂于含有50ug/ml的卡那霉素的LB固体平板上进行过夜培养。对于得到的克隆，先提取少量质粒进行NdeI和XhoI的酶切鉴定，确认插入基因大小是否正确，随后利用Sanger测序进一步比对突变基因是否发生。最终得到pET-26b(+)-LcE3W251L质粒，进行下一步工作。

6.5继续定点突变F309L位点:使用PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix withHF Buffer(Thermo Fisher)进行PCR扩增，以制备好的单突变体pET-26b(+)-LcE3W251L质粒为模板进行定点突变，总体系50ul，组成配比如下：

按照以上配比添加各类成分后，以如下参数设置PCR仪：步骤1(最初变性)：循环为1，温度98℃，时间30秒；步骤2(扩增)：循环为35，温度为98℃，10秒，变性；60℃20秒退火；72℃15秒/kb延伸；步骤3(延伸和补全)：循环为1，温度72℃，7分钟；步骤4(暂时存放)：循环为1，温度4℃长时间保存。

6.6DpnI消化：PCR反应后，取5ul的反应产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR产物的大小是否正确。随后，直接在PCR反应体系中加入1ulDpnI酶，混合均匀37℃处理1小时。DpnI消化完毕后可直接用于转化，或保存于-20℃备用。

6.7转化，挑选克隆及鉴定：在100ul感受态细胞中，加入5-10ul的经过DpnI消化后的突变产物。参照所使用感受态细菌的操作方法进行转化，在涂板前通过离心浓缩细菌沉淀，全部涂于含有50ug/ml的卡那霉素的LB固体平板上进行过夜培养。对于得到的克隆，先提取少量质粒进行NdeI和XhoI的酶切鉴定，确认插入基因大小是否正确，随后利用Sanger测序进一步比对突变基因是否发生。最终得到pET-26b(+)-LcE3W251L/F309L双突变质粒，进行下一步工作。

7、在基因工程菌大肠杆菌中进行目的蛋白质的表达

7.1双突变表达载体转化至大肠杆菌表达株细胞

将野生型表达质粒以及突变型表达质粒分别转化至BL21-codonplus RIL大肠杆菌细胞中，挑选卡那霉素抗性的单克隆在LB培养基中进行培养，37℃，220rpm转速培养过夜。

7.2诱导目的蛋白表达

取培养过夜的菌液10ml转入1L含有相应抗性的培养基，37℃培养至OD约为0.6，降温至18℃加IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)至终浓度0.5mM，18℃诱导表达18小时，此过程中蛋白已经表达。

4℃下6000rpm离心10分钟收集菌体，用PBS缓冲液(KH2PO4 0.27g/L，Na2HPO41.42g/L，NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，pH7.4)重悬菌体，4℃下4000rpm离心15分钟去上清，此时菌体可在-80℃冻存备用。

8、纯化和分离大肠杆菌中表达的降解酶蛋白

8.1超声破碎大肠杆菌

通过超声破碎暴露蛋白。将培养好的菌液放入离心机中，5000r/min离心10min，弃去上清，收集菌体，离心后的菌体沉淀悬浮于25mL结合缓冲液中。将悬浮菌液装在50mL玻璃烧杯中，加入适量蛋白抑制剂，冰浴放置。超声破碎，每个循环26次，超声6s，间隔5s，根据破碎效果共2～4个循环，破碎后的菌体4℃18000rpm转速，离心30分钟，上清液保持在4℃。随后进行蛋白纯化。

8.2进行Ni柱亲和层析

纯化过程首先进行Ni柱亲和层析。由于连入pET-26b(+)载体的克隆片段，酶蛋白表达后带有6个组氨酸构成的6xHis标签蛋白，其可以特异性地结合Ni柱。使用Buffer 1(500mMNaCl，20mMTris pH8.0，25mM imidazole)缓冲液平衡Ni柱三个体积后，破菌上清过Ni柱，待蛋白全部过柱后Buffer 1缓冲液冲洗至流穿液用Bradford检测不再显色，大约50ml，Ni柱连接AKTA纯化系统，Buffer 1，Buffer 2(500mMNaCl，20mMTris pH8.0，500mMimidazole)梯度洗脱，收集紫外280nm信号下的洗脱峰。随后进行酶切透析，根据洗脱获得目的蛋白的体积，截取大小匹配的透析袋，在透析缓冲液(500mMNaCl，20mMTris pH8.0)中透析除去咪唑，4℃磁力搅拌至酶切透析完全。

8.3进行离子交换层析

经过亲和层析纯化的酶蛋白，可以通过离子柱进一步除去杂蛋白。将蛋白溶液的NaCl浓度稀释至100mM以降低蛋白溶液的离子强度，易于蛋白结合到柱子上。根据氨基酸序列预测的蛋白所带静电荷决定所用离子交换柱类型。在缓冲液中带正电荷的蛋白可以结合阳离子交换S柱，带负电荷的蛋白可以结合阴离子交换Q柱。Buffer A(20mMTris pH8.0，100mMNaCl，1mMβ-me)平衡三个柱体积后，稀释好的蛋白溶液过柱，Bradford检测目的蛋白是否结合到柱子上。蛋白挂柱时，将柱子连接到AKTA纯化系统，Buffer A，Buffer B(20mMTris pH8.0，1M NaCl，1mM β-me)梯度洗脱，收集洗脱峰。蛋白不挂柱时，收集流穿液。

8.4进行凝胶过滤层析

目的酶蛋白经过亲和层析，离子交换层析等步骤后，再经过凝胶过滤层析进一步纯化，同时根据出峰情况检测蛋白均一性及溶液状态下的聚集情况。凝胶层析柱的选择Sephadex G-60，过柱前将酶蛋白溶液浓缩至所用样品环体积。收集蛋白洗脱峰，SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)检验蛋白纯度，符合纯度要求的目标酶蛋白浓缩至较高浓度，可直接用于后续实验或保存于-80℃备用。

8.5测定目的蛋白浓度和大小

将获得的蛋白进行蛋白浓度测序。根据氨基酸序列计算出目的蛋白在紫外280nm的吸光系数，利用紫外分光光度仪检测蛋白在280nm的吸收值，计算出蛋白浓度。通过聚丙烯酰胺电泳检测所得蛋白大小和目标酶蛋白一致。

实施例2

取上述制得的降解酶1ml，加水稀释至1000ml，加入5ml吐温-80，并用柠檬酸/柠檬酸钠调节pH至8.0，后加入500ppm的氯氰菊酯乳浊液100ml，经2小时后测定氯氰菊酯降解率为93％。

实施例3

取上述制得的降解酶1ml，加水稀释至1000ml，加入5ml吐温-80，并用柠檬酸/柠檬酸钠调节pH至8.0，利用此溶液浸泡经事先喷洒过200ppm高效氯氟氰菊酯的黄瓜1小时后，黄瓜上无法检出高效氯氟氰菊酯残留，同时测定浸泡后溶液中残留高效氯氟氰菊酯的量仅为喷洒总量的3.5％。

序列表

<110> 上海鲜锐生物科技有限公司

<120> 利用基因工程制备农药降解酶的引物和方法

<130> 2018.12.05

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1710

<212> DNA

<213> 双翅目铜绿蝇(Lucilia cuprina)

<400> 1

atgaacttca acgtttctct gatggaaaaa ctgaaatgga aaatcaaatg catcgaaaac 60

aaattcctga actaccgtct gaccaccaac gaaaccgttg ttgcggaaac cgaatacggt 120

aaagttaaag gtgttaaacg tctgaccgtt tacgacgact cttactactc tttcgaaggt 180

atcccgtacg cgcagccgcc ggttggtgaa ctgcgtttca aagcgccgca gcgtccgacc 240

ccgtgggacg gtgttcgtga ctgctgcaac cacaaagaca aatctgttca ggttgacttc 300

atcaccggta aagtttgcgg ttctgaagac tgcctgtacc tgtctgttta caccaacaac 360

ctgaacccgg aaaccaaacg tccggttctg gtttacatcc acggtggtga cttcatcatc 420

ggtgaaaacc accgtgacat gtacggtccg gactacttca tcaaaaaaga cgttgttctg 480

atcaacatcc agtaccgtct gggtgcgctg ggtttcctgt ctctgaactc tgaagacctg 540

aacgttccgg gtaacgcggg tctgaaagac caggttatgg cgctgcgttg gatcaaaaac 600

aactgcgcga acttcggtgg taacccggac aacatcaccg ttttcggtga atctgcgggt 660

gcggcgtcta cccactacat gatgctgacc gaacagaccc gtggtctgtt ccaccgtggt 720

atcctgatgt ctggtaacgc gatctgcccg tgggcgaaca cccagtgcca gcaccgtgcg 780

ttcaccctgg cgaaactggt tggttacaaa ggtgaagaca acgacaaaga cgttctggaa 840

ttcctgctga aagcgaaacc gcaggacctg atcaaactgg aagaaaaagt tctgaccctg 900

gaagaacgta ccaacaaagt tatgttcccg ttcggtccga ccgttgaacc gtaccagacc 960

gcggactgcg ttctgccgaa acacccgcgt gaaatggtta aacacgcgtg gggtaactct 1020

atcccgacca tgatgggtaa cacctcttac gaaggtctgt tcttcacctc tttcctgaaa 1080

cagatgccga tgctggttaa agaactggaa acctgcgtta acttcgttcc gtctgaactg 1140

gcggacgcgg aacgtaccgc gccggaaacc ctggaaatgg gtgcgaaaat caaaaaagcg 1200

cacgttaccg gtgaaacccc gaccgcggac aacttcatgg acctgtgctc tcacatctac 1260

ttctggttcc cgatgcaccg tctgctgcag ctgcgtttca accacacctc tggtaccccg 1320

gtttacctgt accgtttcga cttcgactct gaagacctga tcaacccgta ccgtatcatg 1380

cgttctggtc gtggtgttaa aggtgtttct cacgcggacg aactgaccta cttcttctgg 1440

aaccagctgg cgaaacgtat gccgaaagaa tctcgtgaat acaaaaccat cgaacgtatg 1500

accggtatct ggatccagtt cgcgaccacc ggtaacccgt actctaacga aatcgaaggt 1560

atggaaaacg tttcttggga cccgatcaaa aaatctgacg aagtttacaa atgcctgaac 1620

atctctgacg aactgaaaat gatcgacgtt ccggaaatgg acaaaatcaa acagtgggaa 1680

tctatgttcg aaaaacaccg tgacctgttc 1710

<210> 2

<211> 1710

<212> DNA

<213> 人工合成(Lucilia cuprina)

<400> 2

atgaacttca acgtttctct gatggaaaaa ctgaaatgga aaatcaaatg catcgaaaac 60

aaattcctga actaccgtct gaccaccaac gaaaccgttg ttgcggaaac cgaatacggt 120

aaagttaaag gtgttaaacg tctgaccgtt tacgacgact cttactactc tttcgaaggt 180

atcccgtacg cgcagccgcc ggttggtgaa ctgcgtttca aagcgccgca gcgtccgacc 240

ccgtgggacg gtgttcgtga ctgctgcaac cacaaagaca aatctgttca ggttgacttc 300

atcaccggta aagtttgcgg ttctgaagac tgcctgtacc tgtctgttta caccaacaac 360

ctgaacccgg aaaccaaacg tccggttctg gtttacatcc acggtggtga cttcatcatc 420

ggtgaaaacc accgtgacat gtacggtccg gactacttca tcaaaaaaga cgttgttctg 480

atcaacatcc agtaccgtct gggtgcgctg ggtttcctgt ctctgaactc tgaagacctg 540

aacgttccgg gtaacgcggg tctgaaagac caggttatgg cgctgcgttg gatcaaaaac 600

aactgcgcga acttcggtgg taacccggac aacatcaccg ttttcggtga atctgcgggt 660

gcggcgtcta cccactacat gatgctgacc gaacagaccc gtggtctgtt ccaccgtggt 720

atcctgatgt ctggtaacgc gatctgcccg ctggcgaaca cccagtgcca gcaccgtgcg 780

ttcaccctgg cgaaactggt tggttacaaa ggtgaagaca acgacaaaga cgttctggaa 840

ttcctgctga aagcgaaacc gcaggacctg atcaaactgg aagaaaaagt tctgaccctg 900

gaagaacgta ccaacaaagt tatgttcccg ttcggtccga ccgttgaacc gtaccagacc 960

gcggactgcg ttctgccgaa acacccgcgt gaaatggtta aacacgcgtg gggtaactct 1020

atcccgacca tgatgggtaa cacctcttac gaaggtctgt tcttcacctc tttcctgaaa 1080

cagatgccga tgctggttaa agaactggaa acctgcgtta acttcgttcc gtctgaactg 1140

gcggacgcgg aacgtaccgc gccggaaacc ctggaaatgg gtgcgaaaat caaaaaagcg 1200

cacgttaccg gtgaaacccc gaccgcggac aacttcatgg acctgtgctc tcacatctac 1260

ttctggttcc cgatgcaccg tctgctgcag ctgcgtttca accacacctc tggtaccccg 1320

gtttacctgt accgtttcga cttcgactct gaagacctga tcaacccgta ccgtatcatg 1380

cgttctggtc gtggtgttaa aggtgtttct cacgcggacg aactgaccta cttcttctgg 1440

aaccagctgg cgaaacgtat gccgaaagaa tctcgtgaat acaaaaccat cgaacgtatg 1500

accggtatct ggatccagtt cgcgaccacc ggtaacccgt actctaacga aatcgaaggt 1560

atggaaaacg tttcttggga cccgatcaaa aaatctgacg aagtttacaa atgcctgaac 1620

atctctgacg aactgaaaat gatcgacgtt ccggaaatgg acaaaatcaa acagtgggaa 1680

tctatgttcg aaaaacaccg tgacctgttc 1710

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(/)

<400> 3

tacatatgaa cttcaacgtt tctct 25

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成(/)

<400> 4

tgctcgagga acaggtcacg gtgttttt 28

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成(/)

<400> 5

tgcccgctgg cgaacaccca gtgccagca 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成(/)

<400> 6

gttcgccagc gggcagatcg cgttaccag 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成(/)

<400> 7

gttatgctgc cgttcggtcc gaccgttga 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成(/)

<400> 8

gaacggcagc ataactttgt tggtacgtt 29

Claims (10)

1.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：

一组用于扩增野生型LcE3基因序列的引物基因序列，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

2.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：一组用于在野生型LcE3序列中引入W251L突变的引物基因序列，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

3.利用基因工程制备农药降解酶的引物，其特征在于，包括：一组用于在LcE3W251L突变体序列中引入F309L突变的引物基因序列，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

4.利用基因工程制备农药降解酶方法，其特征在于，包括如下步骤：

(一)LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆；

所涉及的引物包括：

一组用于扩增野生型LcE3基因序列的引物基因序列，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

一组用于在野生型LcE3序列中引入W251L突变的引物基因序列，SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6；

一组用于在LcE3W251L突变体序列中引入F309L突变的引物基因序列，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

(二)LcE3W251L/F309L菊酯降解酶的表达；

(三)分离和纯化表达的LcE3W251L/F309L菊酯降解酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的LcE3W251L/F309L的突变体表达质粒的克隆，包括如下步骤：

(1)合成大肠杆菌密码子优化后的LcE3的基因片段；

(2)以上述经优化的野生型LcE3的片段为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列为引物，扩增野生型LcE3基因；

SEQ ID NO:3 F-LcE3-NdeI-primer:5’

-tacatATGAACTTCAACGTTTCTCT-3’

SEQ ID NO:4 R-LcE3-XhoI-primer:5’

-tgctcgagGAACAGGTCACGGTGTTTTT-3’；

回收PCR产物，并利用内切酶对回收产物以及所选质粒载体，在上述插入位点进行双酶切；

(3)使用经筛选出的连接酶，将上述PCR产物片段连接到所述的载体中；

(4)摇菌验证目的基因已准确插入载体,且在PCR过程中未引入突变，最终完成野生型LcE3的表达质粒的克隆；

(5)定点突变W251L位点:以步骤(4)获得的野生型LcE3质粒为模板，以SEQ ID NO:5所示的基因序列和SEQ ID NO:6所示的基因序列为引物，进行定点突变，并扩增突变序列；

SEQ ID NO:5 F-LcE3W251L:5’

-TGCCCGctgGCGAACACCCAGTGCCAGCA-3’

SEQ ID NO:6 R-LcE3W251L:5’

-GTTCGCcagCGGGCAGATCGCGTTACCAG-3’

(6)采用制备野生型LcE3质粒类似的步骤，获得LcE3W251L质粒；

(7)在LcE3W251L质粒的基础上，以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物，利用所述引物，继续突变F309L位点，最终获得菊酯类农药降解酶LcE3W251L/F309L突变质粒；

SEQ ID NO:7 F-LcE3F309L:5’

-GTTATGctgCCGTTCGGTCCGACCGTTGA-3’

SEQ ID NO:8 R-LcE3F309L:5’

-GAACGGcagCATAACTTTGTTGGTACGTT-3’。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

适用于大肠杆菌的原核表达载体为pGEX-6p，pET28-SMT3a，pET-26b(+)中的一种，更优选pET28-SMT3a，pET-26b(+)中的一种；

PCR扩增程序反应物中的模板DNA选自质粒DNA、gDNA和cDNA中的一种；

PCR扩增程序反应物中的DNA聚合酶选自Taq DNA聚合酶、pfx DNA聚合酶和PhusionDNA聚合酶中的一种；

PCR产物和载体的第一内切酶位点为NdeI，第二内切酶位点为Xhol。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的(二)LcE3W251L/F309L菊酯降解酶的表达，包括如下步骤：

(1)将突变型表达质粒,转化至BL21-codonplus RIL大肠杆菌细胞中，挑选卡那霉素抗性的单克隆在LB培养基中进行培养；

(2)添加IPTG诱导蛋白表达；

(3)收集菌体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，添加IPTG诱导蛋白表达的方法，包括如下步骤；取培养过夜的菌液转入含有相应抗性的培养基，培养，降温，加IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)，诱导表达。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，(三)分离和纯化表达的LcE3W251L/F309L菊酯降解酶的方法，包括如下步骤：

(1)收集目标蛋白,破碎暴露蛋白,离心收集菌体，将菌体沉淀悬浮于缓冲液中，加入蛋白抑制剂，冰浴放置，破碎，收集上清液；

(2)加入沉淀剂，沉淀所得降解酶蛋白，收集沉淀，并重新溶解于缓冲溶液中；

(3)层析纯化最终得到目标产品蛋白。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的沉淀剂选自硫酸铵、聚乙二醇、丙酮中的一种，层析方法选自亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析中的一种或几种连用。

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