CN1617932A - 疏水酯类杀虫剂和毒素的降解 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及降解疏水酯类杀虫剂和毒素的酶和方法。本发明尤其涉及利用昆虫酯酶或其突变体，在污染环境和园艺物品的生物除污中除去残留的酯类杀虫剂和毒素，如拟除虫菊酯残留。

Description

疏水酯类杀虫剂和毒素的降解
发明领域
本发明涉及降解疏水酯类杀虫剂和毒素的酶和方法。本发明尤其涉及在污染环境和园艺物品的拟除虫菊酯残留的生物除污中，如α-羧酸酯酶等昆虫酯酶及其突变体的应用。
发明背景
拟除虫菊酯构成了化学杀虫剂的一种主要类型。它们是天然除虫菊酯的合成类似物，产生于除虫菊属植物(Tanacetum cinerariifolium)的花卉中。将它们的结构改变生产出的化合物保留了天然产物内在的对脊椎动物的适度毒性，但是作为杀虫剂却更为稳定和有效。自它们被引入的三十年来，它们已经上升到全世界杀虫剂销售额的10-20％，且在可预见的将来，预计它们将继续占有牢固的市场份额。目前它们在很多国家广泛地用于农业的生产和加工体系，并已经导致了从棉花和园艺直到羊毛的不同商品范围的残留事件的发生。
拟除虫菊酯的残留不合乎需要地污染了环境和大量商品。它们不合乎需要是因为他们作为杀虫剂对于无脊椎动物的很宽的作用范围，以及它们对脊椎动物的显著毒性，虽然它们通常被认为是对哺乳动物最安全的杀虫剂之一。特殊的敏感区域包括被污染的土壤，被下游灌溉者使用或仅允许流出农田的再循环的灌溉废水和园艺输出品中超出允许水平的残留。家畜工业也存在杀虫剂污染商品的问题，这些污染由它们自己直接使用的杀虫剂或由它们依赖的农作物和饲料副产物带来。从食品加工厂、地毯染料浴和动物浸沾生产中产生的加工废物、也被杀虫剂残留污染，有时非常严重。从而需要用生物除污策略以消除或减少这些杀虫剂残留。
一种被提议的生物除污策略涉及使用能固定化或降解杀虫剂残留的酶。例如，这种酶可以在污染水流动的生物反应器中被使用，或在收获后经过灭虫的水果、蔬菜或动物产品的洗涤溶液中使用，以减少杀虫剂残留的水平和保留时间。降解杀虫剂残留的适当的酶包括来自细菌、脊椎动物和有机磷酸酯(OP)抗性昆虫的OP水解酶。水解酶需要快速降解杀虫剂残留。
在铜绿蝇(Lucilia cuprina)中的有机磷酸酯抗性由编码羧酸酯酶E3基因的两种不同的突变体导致。两种突变体酶的底物特异性不同，但是它们都可以使两种主要的OP亚型解毒。来自L.cuprina的E3基因由Newcomb等(1997)克隆成功，结合使用DNA测序、杆状病毒表达和体外诱变，这些工作者鉴别了两种抗性突变体。一种是在活性位点的氧离子空穴区域上137位残基的Gly被Asp取代(Newcomb等，1997)。另一种是在底物结合区域上251位残基Trp被Leu取代(Campbell等，1998)，这使得马拉硫磷羧酸酯酶活性增强并获得了OP水解酶活性。
需要能够用来生物除污的方法和酶，可应用在例如被疏水酯类杀虫剂或毒素污染的土壤、粮食和水样品。
发明概述
本发明目前发现昆虫酯酶及它们的突变体能够水解疏水酯类杀虫剂或毒素，如拟除虫菊酯。昆虫酯酶和它们的突变体显示了一定程度的手性特异性，其因突变体的不同而异。因此有可能提供一系列能够降解疏水酯类杀虫剂和毒素的昆虫酯酶或其突变体，它们能单独或共同起作用，作为有效的用作如拟除虫菊酯等疏水酯类杀虫剂和毒素的生物除污剂。
因此，第一方面，本发明提供了一种除去或减少样品中疏水酯类杀虫剂或毒素浓度的方法，该方法包括将昆虫酯酶或其突变体与样品接触。
在第一方面的优选实施方案中，昆虫酯酶是酶的多基因家族的羧基/胆碱酯酶中的一员。较优选地，昆虫酯酶是一种羧酸酯酶。更优选地，昆虫酯酶是在这一多基因家族中形成亚进化枝的α-羧酸酯酶簇中的一员(Oakeshott等，1999)。形成这一亚进化枝的酯酶至少包括能从昆虫双翅目，半翅目和膜翅目中分离出的α-羧酸酯酶。在这一亚进化枝中发现的特异性酶包括，但不限于，E3或EST23酯酶。然而，来源于其它昆虫种的E3和EST23同源酯酶也可用于本发明的方法。
优选地，α-羧酸酯酶可以从双翅目种中分离出来。因此，优选用于本发明的α-羧酸酯酶实例是E3酯酶(SEQ ID NO：1)，它获自Luciliacuprina，或EST23酯酶(SEQ ID NO：2)，它获自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)。
在更优选的实施方案中，突变体昆虫酯酶在活性位点的氧离子空穴、酰基结合口袋或阴离子位点区域或其任何组合处有突变。
在更优选的实施方案中，α-羧酸酯酶的突变体选自如下组成的组：E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。优选地，α-羧酸酯酶的突变体为E3W251L、E3F309L、E3W251L/F309L或EST23W251L。
在第-方面另一个优选的实施方案中，α-羧酸酯酶或其突变体的序列选自如下构成的组：
i)示于SEQ ID NO：1的序列，
ii)示于SEQ ID NO：2的序列，和
iii)能够水解疏水酯类杀虫剂或毒素的与i)或ii)有至少40％相同性的序列。更优选地，该多肽至少与i)或ii)具有至少50％的相同性，更优选为至少60％的相同性，更优选为至少70％的相同性，更优选为至少80％的相同性，更优选为至少90％的相同性，更优选为至少95％的相同性，甚至优选地至少97％的相同性。
正如普通技术人员所知，第一方面的方法可以用一种以上的昆虫酯酶或其突变体进行。特殊的情况是不同的昆虫酯酶或其突变体对于疏水酯类杀虫剂或毒素的不同立体异构体具有不同的水解活性。
疏水酯类杀虫剂或毒素可以是任何具有疏水性质、包含酯基并对活的生物体具有一定程度的毒性的分子。特别优选的疏水酯类杀虫剂或毒素是拟除虫菊酯。该拟除虫菊酯可以是I型拟除虫菊酯或II型拟除虫菊酯。优选地，该I型拟除虫菊酯选自如下构成的组：1S/1R反苄氯菊酯，1S/1R顺苄氯菊酯，顺NRDC157 1S和顺NRDC1567 1R。优选地，II类拟除虫菊酯是溴氰菊酯。
优选地，样品是土壤样品，水剂样品或生物样品。优选的生物样品包括从如种子、蔬菜或水果的植物中获得的物质，以及从如肉的动物中获得的物质。
优选地，该方法施用于包含液体的环境。
该样品可通过任何适当的手段与昆虫酯酶或其突变体接触。包括将昆虫酯酶或其突变体直接加入到样品中，带有或不带有载体或赋形剂等。该昆虫酯酶或其突变体也可以以宿主细胞的形式加入，典型地为微生物，如可以表达编码昆虫酯酶或其突变体的多核苷酸的细菌或真菌。
昆虫酯酶或其突变体也可以以固定到一个聚合的多孔载体上的聚合的海绵或泡沫而被提供，该泡沫或海绵含有昆虫酯酶或其突变体。
优选地，该多孔载体含有聚氨酯。
在一个优选的实施方案中，海绵或泡沫进一步包含埋置的或结合到多孔载体内或表面的碳。
设想本发明方法中表面活性剂的使用可以从任何如样品中的沉淀物中释放疏水酯类杀虫剂和/或毒素。从而增加了本发明方法的有效性。因此，在另一个优选的实施方案中，该方法包括在疏水酯类杀虫剂或毒素与昆虫酯酶接触时存在表面活性剂。更优选地，该表面活性剂是生物表面活性剂。
而且，通过将样品与产生昆虫酯酶或它们突变体的转基因植物接触，样品中的疏水酯类杀虫剂或毒素也可以被降解。
第二方面，本发明实质上提供了一种纯化的多肽，它是一种昆虫酯酶的突变体，其中一种或多种突变是位于选自包含氧离子空穴、酰基结合口袋和阴离子位点构成的一组酯酶的区域内，其中该昆虫酯酶突变体能水解疏水酯类杀虫剂或毒素，条件是该昆虫酯酶突变体不是E3W251L、E3W251S、E3W251G或E3G137D。
优选地，该昆虫酯酶是α-羧酸酯酶。
优选地，该多肽选自如下的组：
i)具有SEQ ID NO：1的突变体，和
ii)具有SEQ ID NO：2的突变体，
其中所述突变体与SEQ ID NO′s：1或2中的至少一种具有40％的相同性。更优选地，该突变体至少与SEQ ID NO′s：1或2中的至少一种具有80％的相同性。更优选地，该突变体与SEQ ID NO′s：1或2中的至少一种具有90％的相同性。
优选地，所述突变是点突变。
优选地，所述多肽选自如下构成的组：E3G137R、E3G137H、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L、EST23W251L。
第三方面，本发明提供了一种融合多肽，它包括第二方面的多肽与至少一种其它的多肽序列融合。
本发明第四方面提供了一种编码第二或第三方面的多肽的分离出的多核苷酸。
本发明的第五方面提供了一种复制和/或表达第四方面的多核苷酸所用的载体。
第六方面，本发明提供了一种用第五方面的载体转化或转染的宿主细胞。
第七方面，本发明提供了一种水解一种疏水酯类杀虫剂或毒素的组合物，该组合物含有基于第二或第三方面的多肽，以及一种或多种可接受的载体。
第八方面，本发明提供了一种生产和选择可水解疏水酯类杀虫剂或毒素的酶的方法，该方法包括：
(i))在昆虫酯酶或已经被突变的昆虫酯酶中引入一种或多种突变，，以及
(ii)确定突变的昆虫酯酶水解疏水酯类杀虫剂或毒素的能力。
优选地，一种或多种突变增强了水解能力和/或改变了酯酶的立体专一性。
这样的一种或多种突变可以通过多种本领域技术人员已知的技术被引入。这些技术包括，但不限于，定向诱变，无规突变诱变，或使用体外进化技术中的DNA改组技术，每种技术都在编码昆虫酯酶或已经突变的昆虫酯酶的多核苷酸上进行。
在第八方面优选的实施方案中，昆虫酯酶是α-羧酸酯酶。更优选地，该α-羧酸酯酶是E3或EST23酯酶。更优选地，该α-羧酸酯酶具有选自如下组的序列：
i)示于SEQ ID NO：1的序列，
ii)示于SEQ ID NO：2的序列，和
iii)与i)或ii)至少40％相同的序列。更优选地，该多肽与i)或ii)有至少50％的相同性，更优选至少60％的相同性，更优选至少70％的相同性，更优选至少80％的相同性，更优选至少90％的相同性，更优选至少95％的相同性，甚至更优选至少97％的相同性。
优选地，酯酶的一种或多种突变位于一个选自如下区域组成的组的区域，包含：氧离子空穴，酰基结合口袋和阴离子位点。
在更优选的实施方案中，已经突变的昆虫酯酶选自如下组成的组：E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
在第八方面更优选的实施方案中，突变是点突变。
第九方面，本发明提供了一种基于第八方面的方法所获得的酶。
在整个说明书中，词语“包括”被理解为意指包括一定的成分、完整物或步骤，或一组成分、完整物或步骤，但不是被排除在外的其它任何的成分、完整物或步骤，或其它组的成分、完整物或步骤。
本发明下文通过非限制性的实施例以及参考附图来描述。
附图简述：
图1：E3的氨基酸排序(SEQ ID NO：1)和电鳐(Torpedocalifornica)乙酰胆碱酯酶的氨基酸排序(SEQ ID NO：3)。活性位点周围的丝氨酸和Gly137、Trp251和Phe309残基的序列以粗体显示并加下划线。
图2：在酰化反应中LcE3羧酸酯酶活性位点的假定构型。
图3：在含有杆状病毒表达酯酶的细胞提取物中进行的滴定实验的代表性结果。
图4：1R/S顺反式苄氯菊酯，1R/S顺反式NRDC157和顺式溴氰菊酯的四种立体异构体的分子结构。
图5：用E3W251L水解顺式和反式苄氯菊酯(0.5μM)的情况。序列检索表：
SEQ ID NO：1-铜绿蝇(Lucilia cuprina)E3α-羧酸酯酶的氨基酸序列
SEQ ID NO：2-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)EST23α-羧酸酯酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3-电鳐(Torpedo californica)乙酰胆碱酯酶的部分氨基酸序列。
发明详述
通用技术
除非另外说明，本发明利用的重组DNA技术是标准操作方法，是本领域技术人员已知的。该技术的描述和说明可见于文献，如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook等，分子克隆实验指南，冷泉港实验室出版(1989)，T.A.，Brown(编辑)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，卷1和2，IRL出版(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning：A Practical Approach，卷1-4，IRL出版(1995和1996)，和F.M.Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience(1988，包括直到现在所有的更新资料)，所有的都引入并在此作为参考。
拟除虫菊酯
拟除虫菊酯是除虫菊杀虫剂的合成类似物。例如，拟除虫菊酯包括(每种情况的常用名与The Pesticide Manual(第12版)一致)：苄氯菊酯、腈二氯苯醚菊酯、溴氢菊酯、氯氰菊酯、α-氯氰菊酯、溴氰菊酯、醚菊酯、氯氟胺氰戊菊酯、杀灭菊酯、氟氯氰菊酯、氟酯菊酯、氟胺氰菊酯、乙氰菊酯、氯氟氰菊酯、七氟苯菊酯、氟氯菊酯、四氟菊酯、己体氟氰菊酯和氟溴醚菊酯。
I型拟除虫菊酯化合物(如苄氯菊酯)与II型拟除虫菊酯化合物的不同之处在于，II型化合物在苯氧基苄基部分的α-碳原子上具有氰基基团。II型拟除虫菊酯的一些实例为氯氰菊酯、溴氰菊酯和腈二氯苯醚菊酯。
能用本发明的方法水解的拟除虫菊酯杀虫剂的实例包括但不限于如下这些化合物：3-苯氧基苄基(1RS)-顺，反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸盐[苄氯菊酯]，α-氰基-3-苯氧基苄基-1-(4-乙氧苯基)-2，2-二氯环丙烷羧酸盐[乙氰菊酯]，(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基(RS)-2-(4-氯苯)-3-异戊酸盐[杀灭菊酯]，(S)-α-氰基-3-苯氧基苯基(S)-2-(4-氯苯)异戊酸盐[高氰戊菊酯]，α-氰基-3-苯氧基苄基(S)-2-(4-2氟甲氧苯基)异戊酸盐[氟氰戊菊酯]，α-氰基-3-苯氧基苄基2-(2-氯-4-三氟甲基苯氨)异戊酸盐[氟胺氰菊酯]，(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基2，2，3，3-四甲基环丙烷羧酸盐[甲氰菊酯]，3-苯氧基苄基(1R)-顺，反-菊酸盐[d-拟除虫菊酯]，(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基(1R)-顺，反-菊酸盐-[cyfenothrin]，(RS)3-烯丙基-2-甲基-4-环氧戊基-2-烯炔基(1RS)-顺，反-菊酸盐[丙烯除虫菊]，α-氰基-3-苯氧基苄基(1R)-顺，反-3-苯氧基苄基(1R)-顺，反-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸盐[氯氰菊酯]，(S)-α-氰基-3-苯氧基苄基(1R)-顺-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷羧酸盐[溴氰菊酯]，(S)-α氰基-3-苯氧基苄基(1R)-顺-2，2-二甲基-3-(1，2，2，2-溴乙基)环丙烷羧酸盐[氟胺氰菊酯]，3，4，5，6-四氢化亚氨甲基(1RS)-顺，反-菊酸盐[胺菊酯]，5-苯基-3-氟-3-呋喃甲基(1RS)-顺，反-菊酸盐[灭虫菊]，α-氰基-4-氟-3-苯氧基苄基(1R，反)-2，2-二甲基-3-(2，2-二氯乙烯基)环丙烷羧酸盐[氟氯氰菊酯]。
多肽
通过“基本上纯化”，我们认为多肽已经从在自然状态与它结合的大部分的脂类、核苷酸、其它多肽和其它污染分子中分离出来。
多肽的相同性百分比由GAP(Needleman和Wunsh，1970)分析(GCG程序)确定，其中参数gap creation penalty＝5，gap extensionpenalty＝0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。
此处使用的术语“它们的突变体”是指天然存在的昆虫酯酶的突变体，相比于它们起源的天然存在的昆虫酯酶，它们保留了至少一些对疏水酯类杀虫剂或毒素的水解活性。优选地，该突变体与它们起源的天然存在的昆虫酯酶相比，具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。
天然存在的昆虫酯酶的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、或通过体外合成所需多肽来准备。这种突变体包括，例如缺失、插入或代换该氨基酸序列中的残基。可以使用缺失、插入和代换的组合以得到最终的构建体，提供具有需要的特性最终的蛋白产品。
在设计的氨基酸序列突变体时，突变位点的位置和突变种类依赖于被修饰的特性。在尤为优选的实施方案中，自然界存在的昆虫酯酶经突变增强了它们水解疏水酯类杀虫剂或毒素尤其是拟除虫菊酯的能力。该突变位点可以单独或连续的被修饰，如通过(1)首先用保守氨基酸备品取代，然后根据得到的结果用更多基本的选择取代，(2)去掉靶残基，或(3)插入其它与指定位点相邻的其他残基。这些突变体的实例包括：E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
用于本发明的突变体也可以通过使用DNA改组技术(Patten等，1997)获得。DNA改组是一种循环重组和突变的方法，它通过随机断裂相关的基因库，随后通过无引物PCR将片段重新组装来完成。通常，DNA改组提供了一种建立多核苷酸文库的方法，在这种情况下可以从中选择或筛选出编码能够水解疏水酯类杀虫剂或毒素的酶的多核苷酸序列，同时可以对选定的酶的立体专一性进行筛选。
氨基酸序列缺失部分通常在约1至30个残基之间变动，更优选地在约1至10个残基之间，典型地在约1至5个邻接的残基之间。
取代突变体的多肽分子中至少有一个氨基酸残基被去除，而在该位置上插入一个不同的残基。最感兴趣的取代突变位点包括被鉴别为活性或结合位点的识别位点。其它感兴趣的位点是那些从不同菌株或菌种中获得的相同的特定残基。这些位置对于生物活性是重要的。这些位点，尤其是当该位点所在的序列中还存在至少三个其它相同保守位点时，都以相对保守的方式被取代。这种保守的取代在表1的标题“典型取代”下显示。
此外，如果需要，非天然的氨基酸或化学氨基酸类似物可作为取代物或附加物被引入到昆虫酯酶或其突变体中。这种氨基酸包括，但不限于，普通氨基酸的D型异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半光氨酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸，被标识的氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和通常的氨基酸类似物。
本发明涉及的方面还包括昆虫酯酶或其类似物，在它们合成期间或合成后进行了不同的修饰，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保护/封闭基团的衍生作用、蛋白水解的切割作用、连接到抗体分子或其它细胞配体上等。这些修饰可以用来增加本发明多肽的稳定性和/或生物活性。
表1
    初始残基     典型取代
    Ala(A)     val；leu；ile；gly
    Arg(R)     lys
    Asn(N)     gln；his
    Asp(D)     glu
    Cys(C)     ser
    Gln(Q)     asn；his
    Glu(E)     asp
    Gly(G)     pro；ala
    His(H)     asn；gln
    Ile(I)     leu；val；ala
    Leu(L)     ile；val；met；ala；phe
    Lys(K)     arg
    Met(M)     leu；phe
    Phe(F)     leu；val；ala
    Pro(P)     gly
    Ser(S)     thr
    Thr(T)     ser
    Trp(W)     tyr
    Tyr(Y)     trp；phe
    Val(V)     ile；leu；met；phe；ala
昆虫酯酶及它们的突变体可以以各种方式生产，包括生产和回收天然蛋白质，生产和回收重组蛋白质，以及化学合成蛋白质。在一个实施方案中，一种编码昆虫酯酶或它们突变体的分离多肽是通过在有效生产并回收多肽的条件下培养能表达该多肽的细胞来生产的。优选的培养细胞是本发明的重组细胞。有效的培养条件包括，但不限于允许蛋白生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧气条件。有效的培养基指适合培养一种可以产生本发明多肽的细胞的任何培养基。这种培养基典型地包括一种水性介质，其中含有可吸收的碳源、氮源和磷酸盐，以及适当盐、矿物质、金属和其它营养物质，如维生素。产生昆虫酯酶或它们突变体的细胞，可在传统的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定器和培养皿中培养。培养在适于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。这些培养条件是本领域普通技术人员可以确定的。
多核苷酸
术语“分离的多核苷酸”是指一种从与它的天然态联合或连接的多核苷酸序列中分离出的多核苷酸序列。而且，术语“多核苷酸”此处可以与术语“核酸分子”交替地使用。
多核苷酸相同性的百分数由GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)来确定，其中参数gap creation penalty＝5，gapextension penalty＝0.3。被分析的序列长度至少为45个氨基酸时，GAP分析就在被测试的两个序列的至少为45个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为150个氨基酸时，GAP分析就在被测试的两个序列的至少为150个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为300个氨基酸时，GAP分析就在被测试的两个序列的至少为300个氨基酸的区域进行测试。
重组载体
重组载体可用来表达本发明方法中使用的昆虫酯酶或其突变体。而且，本发明的另一个实施方案中包括将包含至少一种本发明的分离多核苷酸分子的重组载体，其插入到能输送多核苷酸分子到宿主细胞的任何载体中。这种载体含有异源的多核苷酸序列，它们是非天然发现的与编码昆虫酯酶或它们突变体的多核苷酸相邻的多核苷酸序列，它们优选来源于除了酯酶来源的菌种之外的菌种。这些载体可以是RNA或DNA，原核的或真核的，典型的载体是病毒或质粒。
一种重组载体的类型包括可以将编码昆虫酯酶或它们突变体的多核苷酸有效地连接到一种表达载体上。短语“有效地连接”是指将多核苷酸分子以一种方式插入到表达载体中，使得该分子在转化到宿主细胞后能够表达。此处使用的表达载体是DNA或RNA载体，它们能够转化宿主细胞并有效表达指定的多核苷酸分子。优选地，该表达载体也能在宿主细胞内复制。表达载体可以是原核的或真核的，并且典型的是病毒或质粒。本发明的表达载体包括作用(即直接基因表达)到本发明重组细胞的任何载体，包括细菌、真菌、体内寄生物、节肢动物、其它动物和植物细胞。本发明优选的表达载体可以直接在细菌、酵母、节肢动物和哺乳动物细胞中进行基因表达，更优选可以在此处公开的更多的细胞类型中进行基因表达。
本发明的表达载体含有调整序列，如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点和其它与重组细胞一致的调控序列，它们控制本发明多核苷酸分子的表达。特别地，包含编码昆虫酯酶或它们突变体的多核苷酸的表达载体包括转录控制序列。转录控制序列是控制起始、延伸和终止转录的序列。特别重要的转录控制序列是那些控制转录起始的序列，如启动子、增强子、操纵基因和阻抑物序列。适当的转录控制序列包括可以对本发明的至少一种重组细胞起作用的任何控制序列。各种这样的转录控制序列是本领域技术人员已知的。优选的转录控制序列包括那些对细菌、酵母、节肢动物和哺乳动物细胞起作用的序列，例如，但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、λ噬菌体、T7噬菌体、T7lac、T3噬菌体、SP6噬菌体、SP01噬菌体、金属硫蛋白、α-交配因子、Pichia醇氧化酶、α-病毒亚基因组启动子(如Sindbis病毒亚基因组启动子)、抗生素抗性基因、杆状病毒、玉米穗虫(Heliothis zea)昆虫病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、北美浣熊痘病毒、其它痘病毒、腺病毒、巨细胞病毒(如中间早期启动子)、猴肾病毒40、逆转录病毒、肌动蛋白、反转录病毒长末端重复、劳氏肉瘤病毒、热休克、磷酸盐和硝酸盐转录控制基因、以及能控制原核或真核细胞基因表达的其它序列。另外的适当转录控制基因包括组织特异性启动子和增强子。
编码昆虫酯酶或它们突变体的多核苷酸也可以(a)含有分泌信号(即信号片断核酸序列)使得表达出的昆虫酯酶或它们突变体能从产生该多肽的细胞中分泌出来，和/或(b)含有融合序列。合适的信号片断实例包括能指导昆虫酯酶或它们突变体分泌的任何信号片断。优选的信号片断包括，但不限于，组织纤溶酶原激活物(t-PA)、干扰素、白介素、生长激素、组织相容性和病毒包膜糖蛋白信号片断，以及天然的信号序列。此外，编码昆虫酯酶或它们突变体的多核苷酸可以结合到指导编码蛋白成为蛋白体的融合片断上，如遍在蛋白融合片断。
宿主细胞
本发明的另一个实施方案包括重组细胞，它由一个或多个编码昆虫酯酶或它们突变体的多核苷酸转化的宿主细胞组成。向细胞转化多核苷酸分子可以通过多核苷酸插入到细胞的任何方法获得。转化技术包括，但不限于，转染、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附和原生质体融合。一个重组细胞可以保持单细胞或可以生长成为组织、器官或一种多细胞生物。编码昆虫酯酶或它们突变体的转化多核苷酸可以保持在染色体外，或在转化(即重组)细胞内整合到一个或多个染色体位点上，以这样的方式使得它们能够保持表达能力。
适合转化的宿主细胞包括可以被编码昆虫酯酶或它们突变体的多核苷酸转化的任何细胞。本发明的宿主细胞能内源性地(即天然地)产生昆虫酯酶或它们突变体，或者在用至少一种编码昆虫酯酶或它们突变体的多核苷酸转化后，能产生这种蛋白。本发明的宿主细胞可以是能产生至少一种昆虫酯酶或它们突变体的任何细胞，包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、节肢动物、动物和植物细胞。更优选的宿主细胞包括杆菌、分枝杆菌、酵母、节肢动物和哺乳动物细胞。更优选的宿主细胞包括沙门氏菌属、埃希氏菌属、杆菌属、李司忒氏菌属、酵母菌属、夜蛾、分枝杆菌属、粉纹夜蛾、BHK(幼年仓鼠肾)细胞，MDCK细胞(为犬疱疹病毒培养的正常犬肾细胞系)、CRFK细胞(为猫疱疹病毒培养的正常猫肾细胞系)、CV-1细胞(非洲猴肾细胞系，用于例如培养北美浣熊痘病毒)、COS(如COS-7)细胞和Vero细胞。尤其优选的宿主细胞是大肠杆菌，包括大肠杆菌K-12变种；伤寒沙门氏菌；鼠伤寒沙门氏菌，包括减毒株；草地夜蛾；粉纹夜蛾；BHK细胞；MDCK细胞；CRFK细胞；CV-1细胞；COS细胞；Vero细胞和非成瘤性的鼠成肌细胞G8细胞(如ATCC CRL 1246)。其它合适的哺乳动物宿主细胞包括其它肾细胞系，其它成纤维细胞系(如人、鼠或小鸡胚成纤维细胞系)，骨髓瘤细胞系，中国仓鼠卵巢细胞，鼠NIH/3T3细胞，LMTK细胞和/或HeLa细胞。
通过操纵重组DNA技术可用来提高转化多核苷酸分子的表达，如宿主细胞中多核苷酸分子的拷贝数，多核苷酸分子的转录效率，转录产物翻译的效率，翻译后修饰的效率。用于增加编码昆虫酯酶或它们突变体的多肽表达的重组体技术包括，但不限于，可操作性将多核苷酸分子连接到多拷贝数质粒，将多核苷酸分子整合到一个或多个宿主细胞染色体上，向质粒中附加载体稳定性序列，代换或修饰转录控制信号(如启动子、操纵基因、增强子)，代换或修饰翻译控制信号(如核糖体结合部位、Shine-Dalgarno序列)，修饰本发明的多核苷酸分子与宿主细胞的密码子选择相符，去除转录不稳定的序列。
组合物
用于本发明或者含有本发明多肽的组合物，包括赋形剂，此处也指“可接受的载体”。赋形剂是可以被处理的动物、植物、植物或动物材料、或环境(包括土壤或水样品)可进行处理的任何材料。这种赋形剂的例子包括水、盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液、Hank’s溶液和其它生理平衡盐溶液。非水载体，如固态油、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯都可以使用。其它有用的剂型包括含有粘度增强剂的悬浮液，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。赋形剂液可含有微量添加剂，如增强等渗压性和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，而防腐剂的例子包括硫柳汞或o-甲酚，福尔马林和苯甲醇。赋形剂也可用于增加组分的半衰期，例如，但不限于，聚合控释载体、生物可降解的植入物、脂质体、细菌、病毒、其它细胞、油、酯和乙二醇。
此外，昆虫酯酶或其突变体可被供给到一组分中，该组分可增加疏水酯类杀虫剂或毒素的降解率和/或降解度，或可增加多肽的稳定性。例如，昆虫酯酶或其突变体可被固定化到聚氨酯底物上(Gordon等，1999)，或包裹到适当的脂质体上(Petrikovics等，2000a和b)。与昆虫酯酶或其突变体结合的组分中含有如通常在灭火中使用的泡沫等物质(LeJeune等，1998)。
如本领域技术人员所理解的，WO0064539公开了昆虫酯酶或其突变体能够容易地在海绵或泡沫中使用的方法，它们的内容在此处完全引入。
本发明的一个实施方案是一种控释剂型，它能将含有昆虫酯酶或它们突变体的组分缓慢释放到动物、植物、动物或植物材料或环境(包括土壤和水样品)中。如此处所用，控释剂型配方是在一种控释载体中包含昆虫酯酶或其突变体。合适的控释载体包括，但不限于，生物相容聚合物、其它聚合基质、胶囊、微囊剂、微粒、大丸剂、渗透泵、扩散装置、脂质体、脂球(liposphere)和透皮输送体系。优选的控释剂型是生物降解的(即生物可侵蚀的)。
本发明优选的控释剂型能将昆虫酯酶或其突变体释放到用疏水酯类杀虫剂或毒素喷射区域的土壤或水中。该剂型优选释放1至12个月的时间段。本发明优选的控释剂型能有效处理优选至少约1个月，更优选至少约3个月，甚至更优选至少约6个月，甚至更优选至少约9个月，甚至更优选至少约12个月。
昆虫酯酶或它们突变体(或表达昆虫酯酶或它们突变体的宿主细胞)的浓度要必须产生有效降解疏水酯类杀虫剂或毒素的组分，该浓度的选择取决于被净化样品的性质、样品中疏水酯类杀虫剂或毒素的浓度和组分的配方。组分中昆虫酯酶或它们突变体(或表达昆虫酯酶或它们突变体的宿主细胞)的有效浓度可用本领域技术人员所了解的实验方法容易地确定。
表面活性剂
可以理解本发明方法中表面活性剂的使用可以从任何样品的沉淀中释放出疏水酯类杀虫剂和/或毒素，从而能增加本发明方法的有效性。
表面活性剂是具有亲水和疏水(通常是碳水化合物)部分的两性分子，它在液相的具有不同的极性和氢键的界面之间进行优先分配，如油/水或空气/水界面。这种性质使得表面活性剂能减少表面和界面的张力，并在碳氢化合物溶解水或水溶解碳氢化合物的地方形成微乳。表面活性剂具有许多有用的性质，包括分散性状。
生物表面活性剂是一组由微生物合成的结构上不同的表面活性分子。这些分子在水溶液和碳水混合物中减少了表面和界面的张力。与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂具有几个优点，例如更低的毒性、更高的生物降解能力、更好的环境相容性、更高起泡沫的能力、在极端温度、PH和盐度下的高选择性和特异性，以及从再生资源中被合成的能力。
用于本发明生物除污方法的生物表面活性剂包括，但不限于：糖脂如鼠李糖脂(来源于，如绿浓杆菌)、海藻糖脂(来源于，如红球菌属)、槐糖脂(来源于，如球拟酵母属)和纤维二糖脂(来源于，如玉米黑粉菌，Ustilago zeae)；脂肽和脂蛋白如serrawettin(来源于，如粘质沙雷氏杆菌)、枯草菌表面活性剂(来源于，如枯草杆菌)、枯草菌蛋白酶(来源于，如枯草杆菌)、短杆菌肽(来源于，如短杆菌)和多粘菌素(来源于，如多粘芽孢杆菌)；脂肪酸、中性脂质和磷脂；聚合表面活性剂如乳化胶(来源于，如乙酸钙不动杆菌)、生物分散剂(来源于，如乙酸钙不动杆菌)、甘露聚糖脂蛋白(来源于，如热带念珠菌)、脂乳化剂(来源于如解脂假丝酵母Candida lypolytica)、PA蛋白(来源于，如铜绿假单孢菌)；以及微粒生物表面活性剂如来源于乙酸钙不动杆菌A.calcoaceticus的泡囊和纤毛。
转基因植物
术语“植物”是指整体植物、植物器官(如叶、茎、根等)、种子、植物细胞等等。预备用于本发明实验的植物包括单子叶植物和双子叶植物。典型的单子叶植物包括小麦、大麦、黑麦、杂交麦、燕麦、稻等等。
本发明范围内的转基因植物包括植物(以及所述植物的部分和细胞)和已经用重组DNA技术进行基因修饰的它们的后代，它们i)使得昆虫酯酶或其突变体在期望的植物或植物器官中产生。
一些技术可以将外源基因材料引入到植物细胞中。这种技术包括加速包裹在微粒上的基因材料直接进入到细胞内(参见，如US4945050和US 5141131)。植物可以利用农杆菌技术进行转化(参见，如US 5177010，US 5104310，US 5004863，US 5159135)。电穿孔技术也被用于转化植物(参见，如WO 8706614，US 5472869，5384253，WO 9209696和WO 9321335)。除了许多转化植物的技术，与外源基因相连的组织类型也可以改变。这种组织包括，但不限于胚胎组织、I和II型胼胝体组织、胚轴、分生组织等等。几乎所有的植物组织可以在发育和/或分化期间使用文中所描述的适当技术来转化。
许多适合稳定转染的植物细胞或适合建立转基因植物的载体已经被描述于如，Pouwels等，Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985，增刊1987；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，1989；以及Gelvin等，Plant MolecularBiology Manual，Kluwer Academic Press，1990。典型地，植物表达载体包括，例如一种或多种由5’和3’调节序列和主要可选择的标示进行转录控制的克隆植物基因。这种植物表达载体也含有启动子调节区域(如控制诱导或构成的调节区域，环境或发育的调节，或细胞或组织特异性表达)，转录起始位点，核糖体结合部位和RNA加工信号，转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
植物启动子的实例包括，但不限于核酮糖-1，6-二磷酸羧化酶小亚基、β-伴球蛋白启动子、云扁豆蛋白启动子、ADH启动子、热激启动子和组织特异性启动子。启动子也可以包括能提高转录效率的特定的增强子序列元件。典型的增强子包括但不限于Adh-内含子1和Adh-内含子6。
组成型启动子在所有细胞类型和所有时间指导连续基因表达(如肌动蛋白，泛素，CaMV 35S)。组织特异性启动子负责特异细胞和组织类型如叶子或种子中的基因表达(例如玉米蛋白、油质蛋白、napin、ACP、球蛋白等等)，并且这些启动子也可以被使用。在某些植物发育的特定时期，启动子也可像在植物组织和器官中一样的活性。这种启动子的例子包括但不限于花粉特异性、胚胎特异性、玉米须特异性、棉纤维特异性、根特异性、种子胚乳特异性启动子等等。
在某种情况下，需要使用诱导型启动子。一种诱导型启动子负责在特异信号下进行相应的基因表达，如物理刺激(热激基因)；光(RUBP羧化酶)；激素(Em)；代谢产物和应激反应。其它作用于植物的转录或翻译元件也可使用。
除了植物启动子之外，各种来源的启动子可以有效地用于植物细胞来表达外源基因。例如，细菌源的启动子、如章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子、甘露碱合酶启动子；病毒源的启动子、如花椰菜花叶病毒(35S和19S)等等都可使用。
以下为说明目的提供的实施例的意图并不以任何方式限制或限定本发明。
实施例
实施例1：突变体构建
E3酶氨基酸序列和一种脊椎动物的乙酰胆碱酯酶(TcAChE，它的三维结构是已知的；Sussman等，1991)的排列示于图1。E3和EST23突变体使用Stratagene的QuickChangeTM定点突变试剂盒来构建，并根据改变的残基的数量和所改变的性质来命名。例如，E3W251L是野生型酶(即E3WT)中在251位置的Trp残基被Leu取代的E3突变体。
E3和EST23酶使用如Newcomb等(1997)所描述的杆状病毒的表达系统来表达，但使用HyQ SFX-昆虫无血清培养基(HyClone)来增加表达。在0.1M的磷酸缓冲液，PH为7.0，含有0.05％TritonX-100的条件下通过溶解细胞每ml 108个细胞来制备细胞提取物。然后用荧光分析法滴定提取物得到酯酶分子的数量，荧光分析根据被二乙香豆磷酸酯(dECP)酶磷酸化的初始释放的香豆素(一种发荧光的化合物)。
图2说明了酰化反应中E3活性部位的假定构型(基于脊椎动物AChE的三维结构)。我们已经检验了七个E3残基中相应于已知的AChE活性部位的三个清楚的亚部位区域的突变体。它们是氧离子空穴(E3残基137)，阴离子部位(E3残基148，217和354)以及酰基结合口袋(E3残基250，251和309)。在Jarv命名法中(1984)，阴离子部位和酰基结合口袋相应于p1和p2亚部位。
氧离子空穴中的突变
在TcAChE中，氧离子空穴包括Gly118、Gly119和Ala201，它们相应于E3中的Gly136，Gly137和Ala219。这些残基在整个羧基/胆碱酯酶多基因族中高度保守(Oakeshott等，1999)，并且对于来自一些胆碱酯酶和脂肪酶的X射线结晶的研究，为氧离子空穴结构的保守性提供了实验的证据(Cygler和Schrag，1997)，虽然一些脂肪酶在界面活化期间结构发生了改变(Derewenda等，1992)。在催化期间由羧基底物的羰氧基作为第一次过渡态，它们对于稳定氧化阴离子形成起作用，也提供了相应结构上的证据(Grochulski等，1993；Martinez等，1994)。这种稳定性通过与肽链上三个主要残基形成氢键网络而获得(Ordentlich等，1998)。最近，Koellner等(2000)也已经显示AChE氧离子空穴的两个Gly残基通过氢键与浸入的“结构”水分子的结合，这种结合在催化反应中一直保留，因此被认为起到润滑剂作用，以促进活性部位的底物和产物传递。
除了自然发现于OP抗性L.cuprina中的G137D，E3的Gly137进而有三种突变。首先，在G137E突变中，Glu被其它氨基酸取代。其次突变体G137H通过在同一位置进行突变而被构建，因为His在中性PH下(pKa，对于Asp和Glu约6.5比4.4)也是非质子化的，并且发现当His在人丁酰胆碱酯酶中的氧离子空穴内取代任一Gly时，给予了酶一些OP水解性能(Broomfield等，1999)。最后Arg(pKa约12)在位置137被取代，以检验可能性最强的基本取代的有效性。
在酰基结合口袋的突变
结构上表征胆碱脂酶的酰基结合口袋主要由四个非极性残基组成，其中的三个通常是芳香族的。它们一起构成了强疏水袋以供给结合底物的酰基部分。这四个残基在TcAChE中为Trp233，Phe288，Phe290和Val400相应于在E3中的Trp251，Val307，Phe309和Phe422。类似的疏水残基的排列在大部分羧基/胆碱脂酶的部位是保守的(Oakeshott等，1993；Robin等，1996；Yao等，1997；Harel等，2000)。在胆碱脂酶和大部分羧酸酯酶的残基233/251的Trp和290/309的Phe尤其非常保守，尽管在一些脂酶和少数羧酸酯酶中是Leu或Ile。与TcAChE的Phe288相应的残基典型地是胆碱酯酶的支链脂肪族氨基酸，优选为长链如丁酰胆碱。这包括哺乳动物丁酰胆碱脂酶和一些具有类似丁酰胆碱酯酶底物特异性的昆虫乙酰胆碱酯酶。在乙酰结合口袋中，支链脂肪族氨基酸似乎为适应更大的乙酰基团提供了更大的空间。
通过在一些胆碱酯酶中的288/307和290/309的突变研究证实了它们在确定酰基基团身份的底物特异性方面起了关键作用。如果在人AchE中在任一位置用更小的残基如Ala取代Phe，那么在使用了具有比自然酰基(硫代)胆碱底物更大的酰基基团如丙基-或丁基-(硫代)胆碱时会改善酶的动力学(Ordentlich等，1993)。对于来自黑腹果蝇(D.Melanogaster)和家蝇(Musca domestica)的AchE，它们290/309的天然突变与用更大的极性的Tyr替代的OP抗性的目标部位相比，对乙酰胆碱和OP都具有相对更低的反应性(Fournier等，1992；Walsh等，2001)。对于黑腹果蝇的AchE，用更小的Leu取代Phe残基实现了预期的OP的灵敏度的提高，惊奇的是，用其它小的残基如Gly，Ser或Val却不会如此(Villatte等，2000)。
Trp233/251在胆碱酯酶的突变研究中很少被关注，但是我们在E3早期研究发现再用更小的Leu残基取代会增加对如马拉硫磷这种具有较大酰基部分的羧酸酯的反应性，或增加对于OP的反应性(Campbell等，1998a，b；Devonshire等，2002)。Gly的突变也已经在来自黄蜂(Anisopteromalus calandrae)的同源物中被发现，这种突变显示其具有增强的马拉硫磷羧酸酯酶(MCE)动力学特性(Zhu等，1999)，而发现来自家蝇(M.Domestica)的同源物中Ser的突变可能与马拉硫磷抗性相关(Claudianos等，2002)。关于OP水解酶的活性，Devonshire等(2002)认为这种突变的特殊益处在于有利于在反应进行的第二步水解阶段时实现必要的磷的反转。值得注意的是Devonshire等(2002)发现，E3W251L对于OP水解酶活性的kcat值dMUP于dECP比高一个数量级，因为它带有比dECP的二乙基磷酸基团的更小的二甲基磷酸基团。这意味着即使在具有较大酰基袋的突变体中的反转也会保持严密的立体约束。
我们已经对E3的W251和F309残基、以及与W251接近的P250进行了突变。除了先前表征的天然W251L突变体，我们现在已经分析在W251S、W251G、W251T和W251A用四种其它的小氨基酸进行代换。W251L和P250S的双重突变的分析显示，M.demesnes中在250和251位置分别突变为Ser和Leu时，这种E3同源天然突变体具有高的MCE活性。F309L作为唯一检验的F309代换，其AchE产物应具有增强的MCE和OP的水解活性。F309L被单独分析并用W251L作为双重突变体。
阴离子部位的突变
胆碱酯酶的阴离子部位有时称为第四结合部位(对应于乙酰胆碱内的季铵)，或在Jarv的原始命名法(1984)中称为p1亚部位。它主要涉及Trp84，Glu 199和Phe 330，也涉及Phe 331和Tyr 130(TcAChE命名法)。除了Glu199之外，它是一个高度疏水的部位。Glu199直接与催化的Ser200邻接。在胆碱酯酶和更小的范围如许多羧酸酯酶中，关键的残基是高度保守的(Oakeshott等，1993；Ordentlich等，1995；Robin等，1996；Claudianos等，2002)。除了Trp84(图1的序列排列显示E3缺失了相应于AchE残基74-85的残基)，E3在相应的位置(分别为217，354和148)上与TcAChE具有相同的残基。有趣地，在一些脂肪酶和特定的羧酸酯酶中，Glu199的等效物是Gln，并且Phe330的等效物是Leu，这些酶的底物已知具有小的离去基团(Thomas等，1999；Campbell等，2001；Claudianos等，2002)。
对于阴离子部位在胆碱酯酶催化中的作用，结构和突变研究已经提供了详细的描述。关键残基在活性部位的底部形成了部分氢键网络，Tyr 130和Glu 199也与结构水分子共价接触(Ordentlich等，1995；Koellner等，2000)。当底物与酯酶活性部位咽喉处的外围结合部位结合时，阴离子部位发生了构象变化，新的构象适应于底物的胆碱(离去)基团，并使它的羰基碳原子容易与催化的Ser200之间的相互作用(Shafferman等，1992；Ordentlich等，1995；1996)。因此，该部位首先主要起作用于酶酰化反应步骤，尤其是形成非共价过渡态的步骤(Nair等，1994)。关键残基的突变主要影响Km而不是kcat。胆碱离去基团的相互作用主要通过非极性和π-电子相互作用来调节，主要涉及Trp 84和Phe 330(Ordentlich等，1995)。
对OP抑制剂的研究暗示胆碱酯酶的阴离子部位也适应于它们的离去基团，但是也有部分部位(主要是Glu 199和Tyr 130；也可能是Ser226)影响磷酸酶反应性的一些证据(Qian和Kovach，1993；也参见Ordentlich等，1996；Thomas等，1999)。
很少有对相应于AchE阴离子部位的羧酸酯酶部位的突变分析，但是一个有趣的例外涉及黑腹果蝇的EST6，它在Glu199的等效处为His。该His被Glu取代的突变体显示对各种羧酸酯酶底物的减少的活性，但是获得了一些乙酰硫胆碱的水解活性(Myers等，1993)。蚜虫(Myzus persicae)的E4羧酸酯酶，在该位置为Met，且该酶不通常与OP起反应(Devonshire和Moores，1982)。然而目前还不清楚是否就是Met引起了OP的水解活性。类似地，Y148F代换是家蝇的OP抗性菌株(也即G137D)E3同源体中几个已标明的记录之一，但是是否这种改变直接导致了OP水解酶活性还是未知的(Claudianos等，1999)。
在E3中的Y148，E217和F354的残基现在已经被突变。E217M和Y148F突变被用来检测是否在上述桃蚜(M.persicae)和家蝇的酶中相应的突变直接引起它们的OP反应性。在G137D双突变体中也检测了Y148F，因为这种突变在抗性家蝇中被同时发现。F354被发现在该位置上可以突变成较小的Leu残基和较大的Trp残基，Leu通常在脂肪酶的同样位置被发现。
实施例2：酶滴定
每种表达脂肪酶分别在微量培养板1-4列的四个100μl反应器中进行：
空白孔含有0.025％的Triton X-100，0.1M pH7.0的磷酸缓冲液；空白底物在0.025％的Triton X-100，0.1M pH7.0的磷酸缓冲液中含有100μM的dECP；
空白细胞含有50μl细胞提取物，与1∶1的0.1M pH7.0的磷酸缓冲液混合；
滴定反应含有50μl的细胞提取物，与1∶1的含有200μM dECP的0.1M pH7.0的磷酸缓冲液混合。
除了dECP(在缓冲液中以200μM的浓度新鲜制备)外的所有成分被置于孔中。一些酶同时在培养板中被测定，通过同时在每列的第二和第四个孔下添加dECP来开始反应。为随后的计算，记录下第一次读数的间隔(典型地为1分钟)。
在进一步计算之前用所有读数减去培养板空白孔的平均值(A)。各种细胞提取物的预实验显示，它们在460nm处发荧光，将它们加入分析产物如7-羟基香豆素的溶液时39(±7)％的荧光熄灭。滴定反应的荧光值(D)在减去细胞提取物的内在荧光之后，由于存在这种熄灭现象应对其进行相应校正(C)。最后，减去视为所有在培养板中同时进行检测的空白底物(B)以得到校正的因酶释放的香豆素引起的荧光。这些校正对于以非常低水平表达脂肪酶的细胞系(＜1pmol/ul提取物)是非常重要的。
充分校正的数据被绘制成进展曲线，平衡斜率外推到起始时间并通过与抑制剂(在10-20分钟100μM浓度的dECP产生足够饱和的所有这些酶的酯酶催化部位)的化学计量比的相互作用来确定酯酶数量。根据所有培养板的反应制备7-羟基香豆素的校正曲线，并用于计算酶和生成产物的摩尔浓度。
图3显示了在含有表达酯酶的杆状病毒的细胞提取物中进行的代表性的滴定实验的结果。
实施例3：苄氯菊酯水解测定
检测表达酶的苄氯菊酯水解活性，通过对酸-标记化合物使用放射分配检测或对乙醇部分中的那些标记进行基于TLC的检测(Devonshire等Moores，1982)。检测方法特征包括：保持苄氯菊酯浓度低于它在水溶液中的公开溶解度(0.5μM)，洗涤剂(用于从表达它的昆虫细胞中提取酶)的浓度低于临界胶束浓度(对Triton X-100为0.02％)，检测快速进行(即10-30分钟之内)以使底物粘到检测试管的壁上(玻璃试管用来减小粘性)为最小。在这种苄氯菊酯浓度下，酶没有被底物饱和，所以Km值不能确定。然而特异性常数(kcat/Km)可以精确地算出每种酶的苄氯菊酯活性，从而可以在低底物浓度下直接比较它们的有效性。将苄氯菊酯的顺反式异构体进行分离会提高分析能力。
(a)分离苄氯菊酯的顺和反式异构体
商业制备的苄氯菊酯包括四种立体异构体：1S顺式，1R顺式，1S反式，1R反式(图4)。在硅石上预先的薄层色谱法(TLC)被用来分离异构体成为两种对映异构体对：1S/1R顺式和1S/1R反式。对映异构体不能进一步拆分。酶制剂然后用来检测每个对映异构体对的水解。
(b)测试方案
在拟除虫菊酯的酸部分进行放射性标记
该检测(Devonshire和Moores，1982)适用于苄氯菊酯异构体。它利用带有放射性标记的底物与酯酶进行反应，然后提取未变化的底物到有机溶剂中，测量水相中的放射性环丙烷羧化物阴离子。基于以前的经验，最好的提取方式为使用2∶1(体积比)的甲醇和氯仿的混合物。当以适当比例将检测培养物等分试样与随后单相的缓冲液、甲醇和氯仿的混合物进行混合时，达到了终止酶反应和保证拟除虫菊酯完全溶解的目的。随后加入过量的氯仿和缓冲剂，超过了与甲醇一起保持相层的能力，将有机相除去且在水相中检测产物。详细的，该过程如下所述。
磷酸缓冲液(0.1M，pH7.0)被加入到放射性标记的苄氯菊酯(在丙酮中50μM)中以得到1μM的溶液，然后加入等量适当溶解在同一缓冲液中的表达酯酶并开始检测。预备工作已经制定出培养中的洗涤剂(用于从获得的细胞中提取酯酶的Triton X-100)的浓度必须低于它的CMC(0.02％的临界胶束浓度)，以避免亲脂性的拟除虫菊酯分配到胶束中而成为不能利用的酶。典型地，检测的最终体积为500-1000μl，底物和丙酮浓度分别为0.5M和1％。在30℃温度下，30秒至10分钟范围的时间间隔内，移取100μl的培养等分试样，加入到含有300μl的2∶1比例的甲醇氯仿混合物中并涡旋-混合。既可以在培养结束时或也可在延长的取样间隔过程中将该试管置于室温下直到一批可以进一步同时加工。加入50μl缓冲液和100μl的氯仿之后，化合物被涡旋-混合、离心并且将较低的有机相用500μl的Hamilton注射器移取并弃掉。在进一步加入100μl氯仿后，重复提取，然后上层的200μl水相被移取(用细尖移液管)进行闪烁计数。关键要避免移走任何有机相。由于水相的最终体积是260μl(包括一些甲醇)，因此在最初的100μl等分试样中产生的总数需要校正。在拟除虫菊酯的醇部分进行放射性标记
i)苄氯菊酯的I型拟除虫菊酯-二溴类似物(NRDC157)
在氯仿甲醇提取步骤中，这些酯水解时形成的3-苯氧苄醇没有分配到水相中。因此有必要从硅石上通过TLC分离这种产物(Devonshire和Mooers，1982)。详细的，该步骤如下所述。
如对酸标记底物一样进行培养。不时从反应溶液中移取100μl的等分样品，该等分样品通过与200μl的丙酮在-79℃(固态CO2)立即混合来终止反应。然后移取100μl的混合物与3μl非放射性的3-苯氧基苄醇(在丙酮中2％)到LinearQ具沟的硅石F245培养板的载样区(Whatman)。在10∶3的甲苯混合物(用蚁酸使之饱和)中用二乙醚显影后，底物和产物被固定6-7天(证实对于在UV光下显示的冷标准3-苯氧苄醇具有相同的产物迁移率)进行放射自显影。TLC培养板的这些区域然后浸入Neatan(Merck)并干燥，此后它们从玻璃支撑物上脱落并被转移到小瓶中进行闪烁计数。由于最初的100μl溶液在点样于硅石上之前用丙酮进行了3倍稀释，所以该计数应该进行校正。
ii)II型拟除虫菊酯-溴氰菊酯异构体
采用文献报道的由氰醇水解产物经非酶促反应快速转变为酸的方法进行预备实验得到3-苯氧安息香酸，采用同上方法用TLC分析培养液。由于TLC检测比氯仿-甲醇提取步骤需要更长时间，因而采用后者(如上述对酸标记拟除虫菊酯)检测从这些底物中产生的3-苯氧基苯甲酸盐阴离子。
对于所有的检测，形成产物的摩尔数由已知的放射性标记底物的比活性来计算。表达E3WT酯酶的早期实验显示，当苄氯菊酯的浓度低于0.5μM时，水解率直接与检测中1RS顺或1RS反苄氯菊酯的浓度成比例，也即没有Michaelis复合物的积累。大于0.5μM(即接近公开的苄氯菊酯的水溶性)浓度的检测会得到不稳定的结果，因此阻碍了Km和kcat的测量。而且，对于外消旋底物，一旦接近50％的底物被水解时水解速度显著地减慢，这标志着两种对映异构体(1R或1S以相等数量存在的外消旋混合物)中的应该只有一种容易水解，与以前公开的来自蚜虫酯酶的数据相符(Devonshire和Moores，1982)。在每对对映异构体中，检测条件因而被调节到利于测量更容易水解的那种对映异构体。将E3WT匀浆和反苄氯菊酯进行连续培养证实1S反式异构体更易于水解。因为在所有情况下都无法区分动力学参数，所以利用0.5μM(或对于在外消旋底物中为0.25μM)时的水解速率，连同通过dECP滴定确定的酯酶摩尔数来计算特异性常数(kcat/Km)。关于底物溶解度和对浓度响应比值的相同考虑也适用于所有的酶和底物。
(c)特异性常数的计算
图5给出了反-和顺-苄氯菊酯被E3W251L酶水解的实验结果。
当底物浓度低于0.5uM时(即没有显著形成Michaelis复合物)，苄氯菊酯异构体的水解速率直接与所用的底物浓度成比例，因此不可能单独的测量参数Km和kcat。在充分低于Km的浓度下，Michaelis-Menten方程式简化如下：
V = k cat K m [ S ] [ E ]
由上述方程式可知，利用起始水解速率(pmol/min，从已知的放射性标记底物的比活性计算出)以及检测中底物浓度和酶的浓度可以计算出特异性常数(即kcat/Km)。特异性常数扩散限度的最大值是108-109M-1sec-1(Stryer，1981)。
实施例4：马拉硫磷的水解检测
MCE活性的检测已经由Campbell等(1998)如上公开，那些Km值较低的酶，对14C马拉硫磷(25mCi mmol-1)的比活性并没有减弱。这是一种终端检测，其中马拉硫磷被释放到有机相，而作为剩余的水解产物即被放射性标记的马拉硫磷羧酸保留在水相中。在50nM至1μM的范围内检测活性以确定Km和kcat，并使用Enzfitter 1.05软件(Elsevier-Biosoft)通过非线性回归分析，利用输出的图表显示Michaelis-Menten动力学参数的任意偏差。特性常数由Km和kcat值直接计算。
实施例5：E3和EST23变异体的苄氯菊酯水解活性
表2总结了利用顺-和反-苄氯菊酯作为底物的18个E3和3个EST23突变体的动力学数据。酶的马拉硫磷水解活性也给出作为对照。在每种情况下，数据代表了来自每个1S/1R顺式和1S/1R反式异构体对中水解最快的对映异构体的水解(如上所述)。
在OP敏感的丽蝇中发现的E3WT酶和它的EST23黑腹果蝇同源体，表现出显著的对反式异构体特异的苄氯菊酯水解活性。野生型酶表现出对马拉硫磷至少高一个数量级的活性(虽然这种高MCE活性并没有给予丽蝇马拉硫磷抗性，因为该酶容易被产生于蝇体内产生的马拉氧磷抑制；Campbell等，1998)。E3酶活性部位中酰基结合口袋或阴离子部位区域的突变体会导致对苄氯菊酯的反式和顺式异构体活性的显著增加。苄氯菊酯水解的增加并不主要与苄氯菊酯水解活性的增加相关。
a)氧离子空穴突变体
E3G137D突变体是造成对羊蝇中的二嗪农抗性的原因。在这种突变体中，在酶活性部位的氧离子空穴区域的非常小的脂肪族的中性Gly残基被一种酸性的Asp取代，从而允许对氧束缚的OP分子的水解。然而，相比较于野生型酶，这种突变(和它的黑腹果蝇同源体)已经特定地减少了对反苄氯菊酯的活性。通过用His或Glu取代Gly-137并不会使酶活性增加。然而，用Arg取代Gly-137并不会明显地影响对顺-或反-苄氯菊酯的活性。Arg的线性性质使它可以容易地折叠而不会妨碍苄氯菊酯结合到活性部位。这组突变体的MCE活性特别广泛地与它们对反苄氯菊酯的活性相关，说明G137取代对调节和稳定底物酰基基团的作用。对苄氯菊酯的效果通常比马拉硫磷的小，但是这与苄氯菊酯具有稍小的酰基基团一致。
b)酰基结合口袋突变
E3W251L突变体通常在活性部位的酰基袋用较小的脂肪族的Leu取代大的芳香族的Trp残基，它导致了反-苄氯菊酯水解能力的7倍增加并获得了充分的顺-苄氯菊酯水解能力。该突变体正是羊蝇中获得马拉硫磷抗性的原因。该突变体的MCE活性高于野生型酶的2倍。EST23中的W251L效果基本与E3相同。在E3中用七个更小的残基(以大小减少的顺序为Thr，Ser，Ala和Gly)取代Trp-251也会导致苄氯菊酯水解活性的增加，虽然这些突变体的活性没有E3W251L中的高。明显地，立体因素并不是突变体活性的唯一值得考虑的因素。例如，Thr和Ser二者都含有羟基基团并且是亲水性的。而且，Ala既是脂肪族的和疏水的(像Leu)甚至比Leu更小，但这种突变体对苄氯菊酯的活性与W251L突变体的活性相同。展开W251L突变体(即E3P250S/W251L)的氧离子空穴也减少了它对顺-和反-苄氯菊酯的活性，虽然该活性仍然高于野生型的。令人感兴趣地注意到，与野生型相比，苄氯菊酯对E3中的W251以及EST23中的W251L的所有突变体的特异性常数的增加一律对顺式异构体更为显著。相对于野生型酶，产生反：顺的比率至少为20∶1，对于W251突变体仅仅为2-6∶1。由这些菌株提供的酰基袋的额外空间明显地最有益于水解其它更难水解的顺式异构体。
E3-251突变体的MCE活性并不与苄氯菊酯的水解活性相关。在这组突变体中，E3W251G具有将近高于该组其余突变剩余突变体10倍的MCE活性，但它的苄氯菊酯水解活性却是其中最低的。
将W251L和G137D突变体结合到同一E3分子中增加了对顺式苄氯菊酯的酶活性，并超过野生型水平，但是降低了对反-苄氯菊酯和马拉硫磷的活性。然而，双突变体的活性并不象只包括E3W251L突变的突变体那么大(即，突变并不是加和地起作用)。
一些脂酶已知在相应于在L.cuprina E3中的Phe309的位置具有Leu残基。因而该E3F309L突变体的构建目的是提供对亲脂性底物如拟除虫菊酯的活性。正如从表2可知，E3F309L突变体对两种异构体的活性都比E3WT更好。它对反-苄氯菊酯的活性甚至比E3W251L更好，虽然其对顺式异构体的活性不如E3W251L。然而，该突变体的MCE活性小于野生型酶的一半。在同一E3分子上结合F309L和W251L突变会增加对顺-苄氯菊酯的活性并减少对反-苄氯菊酯的活性到E3W251L水平。换句话说，F309L突变对于W251L突变体对苄氯菊酯的活性仅起了非常小的影响，但是降低了它对马拉硫磷的活性。
c)阴离子部位突变
在L.cuprina E3中相应于Phe 354的位置，一些脂酶已知具有Leu残基。然而，在E3中用Leu取代Phe 354并没有略微增加它对苄氯菊酯的活性，却大大减少了它对马拉硫磷的活性。用较大的芳香族残基Trp取代Phe354反而会将它对顺-和反-苄氯菊酯的活性增加3-4倍，但轻微减少了MCE活性。或许有点令人惊奇的是F354W，而非F354L应该对特别亲脂的苄氯菊酯显示增加的活性，假定在一些自然存在的脂酶中是Leu取代Phe。
虽然Y148F对MCE活性具有很小的意义，但是它对苄氯菊酯动力学具有很大的影响，并且该影响与依赖遗传背景的方向相反。与野生型相比，作为一种单突变体，它显示出对顺和反苄氯菊酯5-6倍增强的活性。作为带有G137D(它作为单突变体比野生型的值低很多)的双突变体，它显示了对反苄氯菊酯活性两倍的减少，并几乎消除了对顺苄氯菊酯的活性。后面的结果清楚地揭示了Y148和氧离子空穴在苄氯菊酯水解方面具有强的相互作用。
Glu-217是直接与催化丝氨酸相邻的残基，被认为在水解反应中对稳定过渡态中间体是非常重要的。然而，突变这种残基成为Met(E3E217M)，正如在蚜虫M.Persicae的酯酶E4中自然发现的，对于苄氯菊酯活性具有很小的影响，但却大大减少了它的MCE活性。
实施例6：水解溴-苄氯菊酯类似物
表2也总结了使用两个苄氯菊酯的顺-二溴乙烯基类似物(NRDC157)针对获自E3和EST23变体的动力学数据。该苄氯菊酯的二溴类似物的1S顺式异构体用除E3F309L和F309L/W251L之外的所有酶水解，与1R/1S顺式苄氯菊酯同样有效。这意味着更大的溴原子并没有明显地阻碍该底物到达它的催化中心。虽然E3WT和EST23WT酶的活性对异构体之间明显的差异来说太低，但是除了E3F309L和F309L/W251L的其它酶显示了10到100倍更快的1S异构体的水解活性。对于在环丙烷环中的C1的这种构型是同样优先的，正如以前对蚜虫M.persicae中的1S反式苄氯菊酯一样(Devonshireand Moores，1982)。
F309L在NRDC157动力学上显示了惊人的影响。该单突变与野生型相比对1S顺式显示出很小的不同，W251L的双突变与W251L单突变相比对该异构体显示出更小的活性。然而，1S/1R的优先选择是颠倒的，单突变中比值是0.7∶1，在双突变中比值是0.4∶1。结果是对于1R顺式的活性在所有给出数据中是两个最高的。双突变的值事实上比任何一种单突变都高10倍。
实施例7：通过表达酶水解II型拟除虫菊酯
表3总结了通过使用四种溴氰菊酯顺式异构体获得了E3和EST23突变体亚型的动力学数据。除了E3W251L和E3F309L之外，溴氰菊酯的1R顺式异构体(不论是αS或αR)的水解都与1R顺NRDC157(可被认为在性质上是苄氯菊酯和溴氰菊酯之间的中间体，因其具有二溴乙烯基取代但缺少α氰基基团)等效。与1R顺式异构体的活性相反，αR构象比αS构象异构体的活性更强。E3W251L和E3F309L对溴氰菊酯的1R顺式异构体明显地比NRDC157的相应异构体的有效性要小。
表2：L.cuprina酯酶E3和D.melanogaster EST23的天然和合成变异体对顺-和反-苄氯菊酯、马拉硫磷和苄氯菊酯的两种二溴乙烯基类似物(NRDC157)的特异性常数。也显示了对反和顺苄氯菊酯，以及对1S顺和1R顺NRDG157的特异性常数的比率。
表2
    酶                      特异性常数(kcat/KmM-1sec-1)
1S/1R-反苄氯菊酯 1S/1R顺-苄氯菊酯(反：顺比率)  马拉硫磷  NRDC1571S顺  NRDC157 1R顺(1S∶1R比率)
 E3WT  90000  3400(27∶1)  2600000  4700  630(8∶1)
 氧离子空穴突变体：
 E3G137DE3G137RE3G137HE3G137E  960085000260002400  1800(5∶1)3900(22∶1)1600(16∶1)280(9∶1)  51001200000880019000  ND1NDNDND  NDNDNDND
 酰基结合口袋突变体
 E3W251LE3W251SE3W251GE3W251TE3W251AE3F309LE3W251L/F309LE3W251L/G137D  90000014000095000150000300000120000081000024000  460000(2∶1)36000(4∶1)24000(4∶1)24000(6∶1)72000(4∶1)48000(25∶1)430000(2∶1)11000(2∶1)  4800000650000057000000450000054000001000000140000060000  3700003500027000240006700057002600012000  5400(68∶1)2900(12∶1)1700(16∶1)900(26∶1)1200(56∶1)8000(0.7∶1)69100(0.4∶1)1100(11∶1)
 E3P250S/W251L  340000  110000(3∶1)  1400000  ND  ND
 阴离子部位突变体
 E3Y148FE3Y148F/G137DE3E217ME3F345WE3F345W  580000410093000350000104400  17000(34∶1)47(87∶1)4400(21∶1)8800(40∶1)2700(38∶1)  310000012000770001600000106000  NDNDNDNDND  NDNDNDNDND
 EST23酶
 EST23WTEST23W251LEST23G137D  21002600002500  890(24∶1)1600000(2∶1)-2  27000002300000-  99072000ND  330(3∶1)1200(60∶1)ND
1不确定
2与对照使用的细胞提取物获得的数值没有明显的区别
明显地，具有最高溴氰菊酯活性的251突变体是W251S，而W251L(对其它两种拟除虫菊酯最高)和W251G(对马拉硫磷最高)在五个251突变体中获得了最低的溴氰菊酯活性。这意味着适应离去基团的α氰基部分可能是溴氰菊酯有效水解的主要障碍，足够阻止野生型E3的任何重要的水解活性。为了对不同的底物实现酶的底物适应，就明显需要对酶活性部位不同空间位点的利用，对比于W251，在酰基口袋用较小的氨基酸取代就特别有利于对αR异构体的底物的适应。然而，重要的是，空间需要的详细资料以及最有效的突变体是对其它拟除虫菊酯有区别的。
带有溴氰菊酯1S顺式异构体的所有酶的活性惊人地小于缺少α氰基基团的NRCC157的相应异构体。该氰基基团的惊人的影响类似于在环丙烷基团的C1的1S构型的结果。除了一些活性最小的突变株，与1S顺式异构体不同的是通常是这些酶对于αR构象的活性大于αS构象的活性。
实施例8-总结讨论
总之，通过对于251系列突变体与苄氯菊酯和NRDC157的反应结果，得到了一些有关E3/EST23中的酰基结合约束的非常有力而又简单的结论。一般地，251取代应当产生更大的酰基袋，以易于适应/稳定如马拉硫磷这些具有的较大的酰基基团的底物。这些取代有利于对含有两个手性活性中心的环丙烷的所有异构体进行水解，野生型酶对于反式异构体的选择性非常强，该突变体则可以较好地水解至少部分顺式异构体的混合物。然而，在顺式异构体中突变体的改进对1S顺式异构体的选择性更强。1R顺式异构体对野生型酶来说是所有
表3：四种溴氰菊酯顺式异构体的特异性常数
  酶            特异性常数(kcat/KmM-1sec-1)
1S顺αR溴氰菊酯 1S顺αS溴氰菊酯 1R顺αR溴氰菊酯 1R顺αS溴氰菊酯
E3WT -1 - - -
  E3G137DE3G137RE3G137HE3G137E   --NDND   --NDND   890670NDND   560350NDND
  E3W251LE3W251SE3W251GE3W251TE3W251AE3F309LE3W251L/G137D   99046007002900200024003600   8802460170520660810410   380ND26902100130016002700   -ND35013007308401100
  EST23WTEST23W251L   450980   750550   -1000   -430
1与对照使用的细胞提取物获得的数值没有明显的区别
2不确定
构型中最难利用的，而在突变体中存在同样的问题。在突变体系列中，动力学的改善并不能简单地由侧链大小的减少来解释；最小的取代并不会得到最高的活性，如对于马拉硫磷。事实上最好的动力学在W251L中获得，虽然Leu含有所有实验的取代中最大的侧链。
相比于相对简单就可以看出并且很一致的有关苄氯菊酯和NRDC157的结论，251系列突变体对溴氰菊酯的结果十分复杂且很难解释。正如所预期的，它们不但对其它底物提高了动力学性能，同时对四种顺式溴氰菊酯异构体的动力学性能也全面高于野生型酶，但与其它底物相比高于野生型的绝对值很小。然而，关于1S异构体优于1R异构体的现象在底物为NRDC157时尤其明显，而在溴氰菊酯数据中不明显。另一方面，所有突变体优选αR而非αS异构体的倾向十分明显。一般二者的比值为2∶1，但应注意的是它与由野生型EST23显示的趋势正相反。乍一看，没有预料到这些假定的酰基结合口袋取代应影响αR/αS的立体优先选择，因为后者在(醇)底物的离去基团提供了α-cynano部分。
总的F309L数据清楚地显示了该残基对拟除虫菊酯水解动力学的主要影响。它们与W251系列突变体在同一水平上，基于酰基结合口袋中提供了更大的空间，预期其动力学性能应该有所提高，而两组数据也证实了其动力学性能的确有所提高。然而，也存在重要的区别，W251系列对苄氯菊酯的顺式和反式异构体具有不成比例的活性，而F309L对顺NRDC157的1R和1S异构体具有不成比例的活性。在两个部位的取代也显示了强相互作用，与它们在酰基结合口袋内共有的机构和功能相一致。例如，W251突变体对顺苄氯菊酯不成比例的的增强和F309L对1R顺NRDC157的不成比例的增强在双突变体中表现为显著的特征。251和309突变体在活性方面具有数量上相似的增强效应且在涉及溴氰菊酯水解时具有同样的立体专一性，该立体专一性的差异用更小的拟除虫菊酯类也不能被看出。然而，我们证明了在它的离去基团添加大体积的酰基部分需要根本的活性部位周围空间的再分配，以至于较小的拟除虫菊酯类的明显立体专一性是盈余的。
本领域技术人员可以理解，如在特定实施方案中说明的对本发明所做的许多变异和/或修饰不会脱离本发明广泛描述的目的和范围。目前的实施方案因而在各个方面被认为是说明性的而非限制性的。
上述所有的公开文献都被完全引入本文。
本发明说明书中包括的对任何文件、学术论文、材料、仪器、文章等的论述仅仅是以提供本发明完整的上下文为目的。并不因为它们的公开先于本申请的每一个权利要求的优先权日期存在，而承认任何的或所有的这些物质成为现有技术基础的一部分或成为与本发明领域相关的一般常识。
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                         序列表
<110>联邦科学技术研究组织
<120>疏水酯类杀虫剂和毒素的降解
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>570
<212>PRT
<213>Lucilia cuprina
<400>1
Met Asn Phe Asn Val Ser Leu Met Glu Lys Leu Lys Trp Lys Ile Lys
1             5               10               15
Cys Ile Glu Asn Lys Phe Leu Asn Tyr Arg Leu Thr Thr Asn Glu Thr
          20               25               30
Val Val Ala Glu Thr Glu Tyr Gly Lys Val Lys Gly Val Lys Arg Leu
       35               40               45
Thr Val Tyr Asp Asp Ser Tyr Tyr Ser Phe Glu Gly Ile Pro Tyr Ala
    50              55               60
Gln Pro Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Gln Arg Pro Thr
65               70               75               80
Pro Trp Asp Gly Val Arg Asp Cys Cys Asn His Lys Asp Lys Ser Val
             85               90               95
Gln Val Asp Phe Ile Thr Gly Lys Val Cys Gly Ser Glu Asp Cys Leu
          100              105              110
Tyr Leu Ser Val Tyr Thr Asn Asn Leu Asn Pro Glu Thr Lys Arg Pro
      115               120              125
Val Leu Val Tyr Ile His Gly Gly Gly Phe Ile Ile Gly Glu Asn His
   130               135              140
Arg Asp Met Tyr Gly Pro Asp Tyr Phe Ile Lys Lys Asp Val Val Leu
145              150              155              160
Ile Asn Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ala Leu Gly Phe Leu Ser Leu Asn
             165              170              175
Ser Glu Asp Leu Asn Val Pro Gly Asn Ala Gly Leu Lys Asp Gln Val
          180              185              190
Met Ala Leu Arg Trp Ile Lys Asn Asn Cys Ala Asn Phe Gly Gly Asn
       195              200              205
Pro Asp Asn Ile Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ala Ser Thr
   210              215              220
His Tyr Met Met Leu Thr Glu Gln Thr Arg Gly Leu Phe His Arg Gly
225              230              235              240
Ile Leu Met Ser Gly Asn Ala Ile Cys Pro Trp Ala Asn Thr Gln Cys
             245              250              255
Gln His Arg Ala Phe Thr Leu Ala Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Gly Glu
          260              265              270
Asp Asn Asp Lys Asp Val Leu Glu Phe Leu Met Lys Ala Lys Pro Gln
       275              280              285
Asp Leu Ile Lys Leu Glu Glu Lys Val Leu Thr Leu Glu Glu Arg Thr
   290              295              300
Asn Lys Val Met Phe Pro Phe Gly Pro Thr Val Glu Pro Tyr Gln Thr
305              310              315              320
Ala Asp Cys Val Leu Pro Lys His Pro Arg Glu Met Val Lys Thr Ala
             325              330              335
Trp Gly Asn Ser Ile Pro Thr Met Met Gly Asn Thr Ser Tyr Glu Gly
          340              345              350
Leu Phe Phe Thr Ser Ile Leu Lys Gln Met Pro Met Leu Val Lys Glu
       355              360              365
Leu Glu Thr Cys Val Asn Phe Val Pro Ser Glu Leu Ala Asp Ala Glu
   370              375              380
Arg Thr Ala Pro Glu Thr Leu Glu Met Gly Ala Lys Ile Lys Lys Ala
385              390              395              400
His Val Thr Gly Glu Thr Pro Thr Ala Asp Asn Phe Met Asp Leu Cys
             405              410              415
Ser His Ile Tyr Phe Trp Phe Pro Met His Arg Leu Leu Gln Leu Arg
          420              425              430
Phe Asn His Thr Ser Gly Thr Pro Val Tyr Leu Tyr Arg Phe Asp Phe
       435              440              445
Asp Ser Glu Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Arg Ile Met Arg Ser Gly Arg
   450              455              460
Gly Val Lys Gly Val Ser His Ala Asp Glu Leu Thr Tyr Phe Phe Trp
465              470              475              480
Asn Gln Leu Ala Lys Arg Met Pro Lys Glu Ser Arg Glu Tyr Lys Thr
             485              490              495
Ile Glu Arg Met Thr Gly Ile Trp Ile Gln Phe Ala Thr Thr Gly Asn
          500              505              510
Pro Tyr Ser Asn Glu Ile Glu Gly Met Glu Asn Val Ser Trp Asp Pro
       515              520              525
Ile Lys Lys Ser Asp Glu Val Tyr Lys Cys Leu Asn Ile Ser Asp Glu
   530              535              540
Leu Lys Met Ile Asp Val Pro Glu Met Asp Lys Ile Lys Gln Trp Glu
545              550              555              560
Ser Met Phe Glu Lys His Arg Asp Leu Phe
             565             570
<210>2
<211>572
<212>PRT
<213>Drosophila melanogaster
<400>2
Met Asn Lys Asn Leu Gly Phe Val Glu Arg Leu Arg Gly Arg Leu Lys
1             5               10               15
Thr Ile Glu His Lys Val Gln Gln Tyr Arg Gln Ser Thr Asn Glu Thr
          20               25               30
Val Val Ala Asp Thr Glu Tyr Gly Gln Val Arg Gly Ile Lys Arg Leu
       35               40               45
Ser Leu Tyr Asp Val Pro Tyr Phe Ser Phe Glu Gly Ile Pro Tyr Ala
   50               55               60
Gln Pro Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Gln Arg Pro Ile
65               70               75               80
Pro Trp Glu Gly Val Arg Asp Cys Ser Gln Pro Lys Asp Lys Ala Val
             85               90               95
Gln Val Gln Phe Val Phe Asp Lys Val Glu Gly Ser Glu Asp Cys Leu
          100              105              110
Tyr Leu Asn Val Tyr Thr Asn Asn Val Lys Pro Asp Lys Ala Arg Pro
      115               120              125
Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Ile Ile Gly Glu Ala Asn
   130               135              140
Arg Glu Trp Tyr Gly Pro Asp Tyr Phe Met Lys Glu Asp Val Val Leu
145              150               155              160
Val Thr Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ala Leu Gly Phe Met Ser Leu Lys
             165               170              175
Ser Pro Glu Leu Asn Val Pro Gly Asn Ala Gly Leu Lys Asp Gln Val
          180              185              190
Leu Ala Leu Lys Trp Ile Lys Asn Asn Cys Ala Ser Phe Gly Gly Asp
      195               200              205
Pro Asn Cys Ile Thr Val Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Ala Ser Thr
    210             215               220
His Tyr Met Met Leu Thr Asp Gln Thr Gln Gly Leu Phe His Arg Gly
225              230              235              240
Ile Leu Gln Ser Gly Ser Ala Ile Cys Pro Trp Ala Tyr Asn Gly Asp
             245              250              255
Ile Thr His Asn Pro Tyr Arg Ile Ala Lys Leu Val Gly Tyr Lys Gly
          260              265              270
Glu Asp Asn Asp Lys Asp Val Leu Glu Phe Leu Gln Asn Val Lys Ala
       275              280              285
Lys Asp Leu Ile Arg Val Glu Glu Asn Val Leu Thr Leu Glu Glu Arg
   290              295              300
Met Asn Lys Ile Met Phe Arg Phe Gly Pro Ser Leu Glu Pro Phe Ser
305              310              315              320
Thr Pro Glu Cys Val Ile Ser Lys Pro Pro Lys Glu Met Met Lys Thr
             325              330              335
Ala Trp Ser Asn Ser Ile Pro Met Phe Ile Gly Asn Thr Ser Tyr Glu
          340              345              350
Gly Leu Leu Trp Val Pro Glu Val Lys Leu Met Pro Gln Val Leu Gln
       355              360              365
Gln Leu Asp Ala Gly Thr Pro Phe Ile Pro Lys Glu Leu Leu Ala Thr
   370              375              380
Glu Pro Ser Lys Glu Lys Leu Asp Ser Trp Ser Ala Gln Ile Arg Asp
385              390              395               400
Val His Arg Thr Gly Ser Glu Ser Thr Pro Asp Asn Tyr Met Asp Leu
             405              410               415
Cys Ser Ile Tyr Tyr Phe Val Phe Pro Ala Leu Arg Val Val His Ser
          420              425              430
Arg His Ala Tyr Ala Ala Gly Ala Pro Val Tyr Phe Tyr Arg Tyr Asp
       435              440              445
Phe Asp Ser Glu Glu Leu Ile Phe Pro Tyr Arg Ile Met Arg Met Gly
    450              455              460
Arg Gly Val Lys Gly Val Ser His Ala Asp Asp Leu Ser Tyr Gln Phe
465              470              475              480
Ser Ser Leu Leu Ala Arg Arg Leu Pro Lys Glu Ser Arg Glu Tyr Arg
             485              490              495
Asn Ile Glu Arg Thr Val Gly Ile Trp Thr Gln Phe Ala Ala Thr Gly
          500              505              510
Asn Pro Tyr Ser Glu Lys Ile Asn Gly Met Asp Thr Leu Thr Ile Asp
       515              520              525
Pro Val Arg Lys Ser Asp Glu Val Ile Lys Cys Leu Asn Ile Ser Asp
   530              535              540
Asp Leu Lys Phe Ile Asp Leu Pro Glu Trp Pro Lys Leu Lys Val Trp
545              550              555              560
Glu Ser Leu Tyr Asp Asp Asn Lys Asp Leu Leu Phe
             565              570
<210>4
<211>576
<212>PRT
<213>Torpedo californica
<400>4
Ala Asp Asp Asp Ser Glu Leu Leu Val Asn Thr Lys Ser Gly Lys Val
1             5               10               15
Met Arg Thr Arg Ile Pro Val Leu Ser Ser His Ile Ser Ala Phe Leu
          20               25               30
Gly Ile Pro Phe Ala Glu Pro Pro Val Gly Asn Met Arg Phe Arg Arg
       35              40                45
Pro Glu Pro Lys Lys Pro Trp Ser Gly Val Trp Asn Ala Ser Thr Tyr
   50               55               60
Pro Asn Asn Cys Gln Gln Tyr Val Asp Glu Gln Phe Pro Gly Phe Pro
65               70               75               80
Gly Ser Glu Met Trp Asn Pro Asn Arg Glu Met Ser Glu Asp Cys Leu
             85               90               95
Tyr Leu Asn Ile Trp Val Pro Ser Pro Arg Pro Lys Ser Ala Thr Val
          100              105              110
Met Leu Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Gly Ser Ser Thr Leu
       115              120              125
Asp Val Tyr Asn Gly Lys Tyr Leu Ala Tyr Thr Glu Glu Val Val Leu
   130              135              140
Val Ser Leu Ser Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Ala Leu His
145              150              155              160
Gly Ser Gln Glu Ala Pro Gly Asn Met Gly Leu Leu Asp Gln Arg Met
             165              170               175
Ala Leu Gln Trp Val His Asp Asn Ile Gln Phe Phe Gly Gly Asp Pro
          180              185              190
Lys Thr Val Thr Leu Phe Gly Glu Ser Ala Gly Arg Ala Ser Val Gly
       195              200              205
Met His Ile Leu Ser Pro Gly Ser Arg Asp Leu Phe Arg Arg Ala Ile
   210              215              220
Leu Gln Ser Gly Ser Pro Asn Cys Pro Trp Ala Ser Val Ser Val Ala
225              230              235              240
Glu Gly Arg Arg Arg Ala Val Glu Leu Arg Arg Asn Leu Asn Cys Asn
             245              250              255
Leu Asn Ser Asp Glu Asp Leu Ile Gln Cys Leu Arg Glu Lys Lys Pro
          260              265              270
Gln Glu Leu Ile Asp Val Glu Trp Asn Val Leu Pro Phe Asp Ser Ile
       275              280              285
Phe Arg Phe Ser Phe Val Pro Val Ile Asp Gly Glu Phe Phe Pro Thr
   290              295               300
Ser Leu Glu Ser Met Leu Asn Ala Gly Asn Phe Lys Lys Thr Gln Ile
305              310              315              320
Leu Leu Gly Val Asn Lys Asp Glu Gly Ser Phe Phe Leu Leu Tyr Gly
             325              330              335
Ala Pro Gly Phe Ser Lys Asp Ser Glu Ser Lys Ile Ser Arg Glu Asp
          340              345              350
Phe Met Ser Gly Val Lys Leu Ser Val Pro His Ala Asn Asp Leu Gly
       355              360              365
Leu Asp Ala Val Thr Leu Gln Tyr Thr Asp Trp Met Asp Asp Asn Asn
   370              375               380
Gly Ile Lys Asn Arg Asp Gly Leu Asp Asp Ile Val Gly Asn His Asn
385              390              395              400
Val Ile Cys Pro Leu Met His Phe Val Asn Lys Tyr Thr Lys Phe Gly
             405              410              415
Asn Gly Thr Tyr Leu Tyr Phe Phe Asn His Arg Ala Ser Asn Leu Val
          420              425              430
Trp Pro Glu Trp Met Gly Val Ile His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val
       435              440              445
Phe Gly Leu Pro Leu Val Lys Glu Leu Asn Tyr Thr Ala Glu Glu Glu
    450              455              460
Ala Leu Ser Arg Arg Ile Met His Tyr Trp Ala Thr Phe Ala Lys Thr
465              470              475              480
Gly Asn Pro Asn Glu Pro His Ser Gln Glu Ser Lys Trp Pro Leu Phe
             485              490              495
Thr Thr Lys Glu Gln Lys Phe Ile Asp Leu Asn Thr Glu Pro Ile Lys
          500              505              510
Val His Gln Arg Leu Arg Val Gln Met Cys Val Phe Trp Asn Gln Phe
       515              520              525
Leu Pro Lys Leu Leu Asn Ala Thr Glu Thr Ile Asp Glu Ala Glu Arg
   530              535              540
Gln Trp Lys Thr Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Met His Trp
545              550              555              560
Lys Asn Gln Phe Asp Gln Tyr Ser Arg His Glu Asn Cys Ala Glu Leu
             565              570              575

Claims (40)

1、一种去除或减少样品中疏水酯类杀虫剂或毒素浓度的方法，该方法包含将该样品与昆虫酯酶或其突变体相接触。
2、权利要求1所述的方法，其中昆虫酯酶是一种α-羧酸酯酶。
3、权利要求1所述的方法，其中突变体昆虫酯酶是一种α-羧酸酯酶，且在酯酶活性部位的氧离子空穴、酰基结合口袋或阴离子部位区域或其任何组合区域具有突变。
4、权利要求3所述的方法，其中突变体昆虫酯酶选自如下一组：E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
5、权利要求2或3所述的方法，其中α-昆虫酯酶或其突变体包括选自如下一组的一个序列：
i)示于SEQ ID NO：1的序列
ii)示于SEQ ID NO：2的序列和
iii)至少与i)或ii)有40％相同性，并且能水解疏水酯类杀虫剂或毒素的序列。
6、权利要求6所述的方法，其中所述序列与i)或ii)至少具有80％的相同性。
7、权利要求6所述的方法，其中所述序列与i)或ii)至少具有90％的相同性。
8、权利要求1-7中任一所述的方法，其中该方法使用两种或多种昆虫酯酶或其突变体。
9、根据权利要求1-8中任一所述的方法，其中疏水酯类杀虫剂或毒素是一种拟除虫菊酯。
10、权利要求9所述的方法，其中拟除虫菊酯是I型或II型拟除虫菊酯。
11、权利要求10所述的方法，其中I型拟除虫菊酯选自如下组成的组：1S/1R反式苄氯菊酯，1S/1R顺式苄氯菊酯，NRDC157 1S顺式和NRDC157 1R顺式。
12、权利要求10所述的方法，其中II型拟除虫菊酯是溴氰菊酯。
13、权利要求1-12任一所述的方法，其中该方法在含有液体的环境中进行。
14、权利要求1-13任一所述的方法，其中昆虫酯酶或其突变体直接提供到样品中。
15、权利要求1-13任一所述的方法，其中昆虫酯酶或其突变体通过编码昆虫酯酶或其突变体的多核苷酸的表达，从含有该多核苷酸的宿主细胞被提供到样品中。
16、权利要求1-13任一所述的方法，其中昆虫酯酶或其突变体以聚合的海绵或泡沫被提供，所述泡沫或海绵含有被固定到聚合的多孔载体上的昆虫酯酶或其突变体。
17、权利要求1-16任一所述的方法，其中该方法进一步包括当疏水酯类杀虫剂或毒素与昆虫酯酶或其突变体接触时，存在表面活性剂。
18、权利要求17所述的方法，其中表面活性剂是一种生物表面活性剂。
19、一种基本上纯化的多肽，它是一种昆虫酯酶的突变体，其中一种或多种突变位于选自如下组成的组的酯酶区域内：氧离子空穴、酰基结合口袋和阴离子部位，其中突变体昆虫酯酶能水解疏水酯类杀虫剂或毒素，附带条件是昆虫酯酶不是E3W251L、E3W251S、E3W251G或E3G137D。
20、权利要求19所述的多肽，其中昆虫酯酶是α-羧酸酯酶。
21、权利要求20所述的多肽，选自如下组成的组：
i)示于SEQ ID NO：1的突变体序列，和
ii)示于SEQ ID NO：2的突变体序列，其中所述突变体与SEQ ID NO：1或2的至少一种具有至少40％的相同性。
22、权利要求21所述的多肽，其中所述突变体与SEQ ID NO：1或2的至少一种具有至少80％的相同性。
23、权利要求21所述的多肽，其中所述突变体与SEQ ID NO：1或2的至少一种具有至少90％的相同性。
24、权利要求19-23中任一所述的多肽，其中所述突变是一种点突变。
25、权利要求21所述的多肽，包括的序列选自如下组成的组：E3G137R、E3G137H、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
26、一种包含权利要求19-25任一所述多肽与至少一种其它多肽序列融合的融合多肽。
27、一种编码权利要求19-26中的任一多肽的分离多肽。
28、一种复制和/或表达权利要求27所述多核苷酸的载体。
29、一种用权利要求28所述载体转化或转染的宿主细胞。
30、一种水解疏水酯类杀虫剂或毒素的组合物，该组合物包括权利要求19-26中任一所述的多肽，和一种或多种可接受的载体。
31、一种产生和选择水解疏水酯类杀虫剂或毒素的方法，所述方法包括：
(i)将一种或多种突变体引入到昆虫酯酶中或已经被突变的昆虫酯酶中，和
(ii)确定该突变昆虫酯酶水解疏水酯类杀虫剂或毒素的能力。
32、权利要求31所述的方法，其中一种或多种突变体增强了水解活性和/或改变了酯酶的立体专一性。
33、权利要求31或32所述的方法，其中昆虫酯酶是一种α-羧酸酯酶。
34、权利要求33所述的方法，其中所述α-羧酸酯酶的序列选自如下组成的组：
i)示于SEQ ID NO：1的序列，
ii)示于SEQ ID NO：2的序列，和
iii)与i)或ii)至少有40％相同性的序列。
35、权利要求34所述的方法，其中所述序列与i)或ii)具有至少80％的相同性。
36、权利要求34所述的方法，其中所述序列与i)或ii)具有至少90％的相同性。
37、权利要求31-36任一所述的方法，其中一种或多种突变发生在选自如下组成的组的酯酶的区域：氧离子空穴、酰基结合口袋和阴离子部位。
38、权利要求31-37任一项所述的方法，其中所述突变是点突变。
39、权利要求31所述的方法，其中已经被突变的昆虫酯酶选自如下组成的组：E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354L和EST23W251L。
40、一种由权利要求31-39中任一所述的方法获得的酶。
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Granted publication date: 20071205