JP4546091B2 - 疎水性エステル殺虫剤および毒素の分解 - Google Patents
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Description
Newcomb, R. D., Campbell, P. M., Ollis, D. L., Cheah, E., Russell, R. J. and Oakeshott, J. G.(1997)Proc Natl Acad Sci U S A 94, 7464-8 Campbell, P. M., Yen, J. L., Masoumi, A., Russell, R. J., Batterham, P., McKenzie, J. A., and Oakeshott, J. G.(1998b) J. Econ. Entomol. 91 : 367-375 Oakeshott, J. G., Claudianos, C., Russell, R. J. and Robin, G. C.(1999) BioEssays 21, 1031-42 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984) J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991) D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996) F. M. Ausubel et al.(Editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988) Needleman, S. B. and Wunsch, C. D.(1970) JMol Biol 48, 443-53 Patten, P.A., Howard, R. J. and Stemmer, W. P.(1997) Curr Opin Biotechnol 8, 724-33 Gordon, R. K., Feaster, S. R., Russell, A. J., LeJeune, K. E., Maxwell, M. D., Lenz, D. E., Ross, M. and Doctor, B. P.(1999) ChemBiol Interact 14, 463-70 Petrikovics, I., Cheng, T. C., Papahadjopoulos, D., Hong, K., Yin, R., DeFrank, J. J., Jaing, J., Zong, Z. H., McGuinn, W. D., Sylvester, D., Pei, L., Madec, J., Tamulinas, C., Jaszberenyi, J. C., Barcza, T. and Way, J. L.(2000a) Toxicol Sci 57, 16-21 Petrikovics, I., McGuinn, W. D., Sylvester, D., Yuzapavik, P., Jaing, J., Way, J. L., Papahadjopoulos, D., Hong, K., Yin, R., Cheng, T. C., and DeFrank, J. J.(2000b) Drug Delivery 7: 83-89 LeJuene, K. E., Wild, J. R. and Russell, A. J.(1998) Nature 395, 27-8
i) 配列番号1で示される配列、
ii) 配列番号2で示される配列、および
iii) i)またはii)と少なくとも40%が同一である配列
からなる群から選択され、疎水性エステル殺虫剤または毒素の加水分解が可能な配列を有する。より好ましくは、ポリペプチドはi)またはii)と、少なくとも50%同一、より好ましくは少なくとも60%同一、より好ましくは少なくとも70%同一、より好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、より好ましくは少なくとも95%同一、さらにより好ましくは少なくとも97%同一である。
i) 配列番号1で示される配列の変異体、
ii) 配列番号2で示される配列の変異体
(ここで、変異体は配列番号1または2のうちの少なくとも1つと少なくとも40%が同一である)配列からなる群から選択される。より好ましくは、変異体は配列番号1または2のうちの少なくとも1つと少なくとも80%同一である。さらに好ましくは、変異体は配列番号1または2のうちの少なくとも1つと少なくとも90%同一である。
疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解する酵素を生成および選択する方法であって:
(i)昆虫エステラーゼまたは既に変異した昆虫エステラーゼ中に1または複数の変異を導入すること、および
(ii)変異体昆虫エステラーゼの疎水性エステル殺虫剤または毒素の加水分解能力を決定すること
を含む方法を提供する。
i) 配列番号1で示される配列、
ii) 配列番号2で示される配列、
iii) i)またはii)と少なくとも40%が同一である配列
からなる群から選択される配列を有する。より好ましくは、ポリペプチドはi)またはii)と、少なくとも50%同一、より好ましくは少なくとも60%同一、より好ましくは少なくとも70%同一、より好ましくは少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、より好ましくは少なくとも95%同一、さらに好ましくは少なくとも97%同一である。
配列番号1:ヒツジキンバエ(Lucilia cuprina)E3α-カルボキシルエステラーゼのアミノ酸配列。
配列番号2:キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)EST23 α-カルボキシルエステラーゼのアミノ酸配列。
配列番号3:カリフォルニアシビレエイ(Torpedo californica)アセチルコリンエステラーゼの部分的なアミノ酸配列。
特に断らない限り、本発明で利用した組み換えDNA技術は標準的操作であり当業者にはよく知られている。そのような技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)およびF. M. Ausubel et al.(Editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までのすべての改訂を含む)(これらは参照によって本願に組み込まれる)などの文献全体にわたって記載され説明されている。
ピレスロイドは除虫菊殺虫剤の合成アナログである。例えば、ピレスロイドとしては次のもの (いずれの場合も殺虫剤マニュアル(The Pesticide Manual)、第12の版に従う一般名):ペルメトリン、フェンバレレート、エスフェンバレレート、シペルメトリン、アルファ-シペルメトリン、デルタメトリン、フェンプロパトリン、フルバリネート、フルシトリナート、シフルトリン、アクリナトリン、トラロメトリン、シクロプロトリン(cycloprothrin)、ラムダ-サイハロトリン、テフルトリン、ビフェントリン、トランスフルトリン、ゼータ-シペルメトリンおよびハルフェンプロックスが挙げられる。
「実質的に純粋な」とは、それがその天然状態で結合している大部分の脂質、核酸、他のポリペプチドおよび他の汚染分子から分離されたポリペプチドを意味する。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、それがその天然状態で結合しているか連結しているポリヌクレオチド配列から分離されたポリヌクレオチドを意味する。さらに、「ポリヌクレオチド」という用語は、本願では「核酸分子」という用語と交換可能に使用する。
組換えベクターは、本発明の方法で使用するために昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体を発現するために使用することができる。さらに、本発明の別の実施形態は、本発明の少なくとも1つの分離されたポリヌクレオチド分子を含み、宿主細胞にポリヌクレオチド分子を運ぶことができる任意のベクターに挿入された、その組換えベクターを含む。そのようなベクターは、天然状態では昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドに隣接して見出されず、好ましくは、エステラーゼが由来する種以外の種に由来するポリヌクレオチド配列である、異種起源のポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、RNAまたはDNA、原核生物または真核生物のいずれでもよく、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。
本発明の別の実施形態としては、昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードする1または複数のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を含む組換え細胞が挙げられる。ポリヌクレオチド分子による細胞の形質転換は、ポリヌクレオチド分子を細胞に挿入できる任意の方法で遂行できる。形質転換技術としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、顕微鏡下注射、リポフェクション(lipofection)、吸着および原形質融合が挙げられる(但し、これらに限定されない)。組換え細胞は単細胞のままでもよいし、または組織、器官もしくは多細胞の有機体まで成長させてもよい。昆虫エステラーゼまたはそれらの変異体をコードする形質転換されたポリヌクレオチドは、染色体外にとどまってもよいし、または発現されるその能力が保持されるようにして形質転換された(すなわち、組換え)細胞の染色体内の1または複数のサイトに一体化させてもよい。
本発明の方法に有用な組成物、または本発明のポリペプチドを含む組成物は、賦形剤(本願では「許容されるキャリアー」とも呼ぶ)を含む。賦形剤は処置する動物、植物、植物もしくは動物材料、または(土および水の試料を含む)環境が許容できる任意の材料であり得る。そのような賦形剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、ハンク溶液および他の水性の生理学的にバランスのとれた塩溶液が挙げられる。不揮発性油、胡麻油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの非水性ビヒクルも使用できる。他の有用な処方は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどの増粘剤を含む懸濁液を含む。また、賦形剤は、等張性および化学的安定性を増強する物質など少量の添加剤を含むことができる。バッファーの例としてはリン酸塩バッファー、重炭酸ソーダバッファーおよびトリスバッファーが挙げられ、予防薬の例としては、チメロサールまたはo-クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。賦形剤はまた、例えば、組成物の半減期を増加させるために使用することができ、例えば、重合体の徐放性ビヒクル、生物分解性インプラント、リポソーム、バクテリア、ウイルス、他の細胞、油、エステル、およびグリコールなどが挙げられる(但し、これらに限定されない)。
本発明の方法における界面活性剤の使用は、試料中の何らかの、例えば、析出物に由来する疎水性エステル殺虫剤および/または毒素を遊離し得ることを想定している。これにより、本発明の方法の効率は増大する。
「植物」という用語は、植物全体、植物組織(例えば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞その他を指す。本発明を実施する上で使用が考えられる植物には、単子葉植物、双子葉植物の両方が含まれる。単子葉植物の例としては、小麦、大麦、ライ麦、ライ小麦、オートミール、米などが挙げられる。
変異体の構築
E3酵素アミノ酸配列の脊椎動物アセチルコリンエステラーゼ(TcAChE;その3次元構造は知られている; Sussman et al., 1991)のそれとのアラインメントを図1に示す。E3とEST23の変異体は、StratageneのQuickChange(商標)サイト特異的突然変異生成キットを使用して構築し、変更された残基の数およびその変更の性質によって命名される。例えば、変異体E3W251Lは野生型酵素(すなわち、E3WT)中の位置251でのTrp残基が、Leuに変異したE3変異体である。
TcAChE中で、オキシアニオンホールは、Gly118、Gly119およびAla201を含み、これらはE3中のGly136、Gly137およびAla219に対応する。いくつかのリパーゼ(Derewenda et al., 1992)中での界面活性化の間、構造が変わるとはいえ、これらの残基は、カルボキシル/コリンエステラーゼ多重遺伝子族(Oakeshott et al., 1999)の全体にわたって高度に保存されており、いくつかのコリンエステラーゼおよびリパーゼに関するX線の結晶学的な研究(Cygler and Schrag, 1997)からは、オキシアニオンホール構造の保存を立証すべき実験的な証拠がある。また、カルボキシルエステル基質のカルボニル化合物酸素によって形成されたオキシアニオンの安定化において、触媒作用中の第1の遷移状態としてのその機能を示す実験的な構造上の証拠もある(Grochulski et al., 1993; Martinez et al., 1994)。この安定化は、ペプチド鎖中の3つの重要な残基のアミド基への水素結合のネットワークによって達成される(Ordentlich et al., 1998)。最近、Koellner et al.(2000)は、AChE オキシアニオンホール中の両方のGly残基は、埋められた「構造的」水分子と水素結合を形成し、これが触媒作用の間中、維持され、活性サイト内の基質と生成物の出入り(traffic)を容易にする潤滑剤の役割をしていることを示した。
構造上特徴づけられたコリンエステラーゼのアシル結合ポケットを、主に4つの無極性の残基(さらに、それらのうちの3つは一般に芳香性である)から形成する。これらは一緒になって強疎水性のポケットを形成し、結合基質のアシル部分を収容する。TcAChE中の4つの残基は、Trp233、Phe288、Phe290およびVal400であり、これらはE3中のTrp251、Val307、Phe309およびPhe422に対応する。疎水性残基の同様の配列は、ほとんどのカルボキシル/コリンエステラーゼの対応するサイトで保存されているように思われる(Oakeshott et al., 1993; Robin et al., 1996; Yao et al., 1997; Harel et al., 2000)。特にTrpは、強く残基233/251で保存され、290/309は、いくつかのリパーゼおよび少数のカルボキシルエステラーゼ中でLeuまたはIleであるが、コリンエステラーゼおよびほとんどのカルボキシルエステラーゼ中でPheである。TcAChE Phe288に対応する残基は、典型的にはブチリルコリンなどの長鎖エステルに対する優先性を示すコリンエステラーゼ中の分岐鎖脂肪族のアミノ酸である。これは哺乳類ブチリルコリンエステラーゼおよびいくつかの昆虫アセチルコリンエステラーゼ (それらはブチリルコリンエステラーゼ様の基質特異性を有する)を含む。分岐鎖脂肪族のアミノ酸は、アシル結合ポケット中により大きなスペースを提供するためより大きなアシル基を収容するように思われる。
コリンエステラーゼのアニオン性サイトは4級結合サイトと呼ばれ(アセチルコリン中の4級アンモニアに因む)、またはJarv(1984)の本来の命名法ではp1サブサイトと呼ばれることがある。それは、主に、Trp84、Glu 199およびPhe 330を含み、Phe 331およびTyr130(TcAChE命名法)も含まれる。Glu 199を除いて、それはこのように高度に疎水性なサイトである。Glu 199は、触媒作用を有するSer200に直に隣接している。重要な残基は、コリンエステラーゼ全体にわたって高度に保存されており、多くのカルボキシルエステラーゼではその程度はより少ない(Oakeshott et al., 1993; Ordentlich et al., 1995; Robin et al., 1996; Claudianos et al., 2002)。Trp84(図1中の配列アラインメントは、E3がAChE 残基74〜85に対応する失われた残基であることを示す)を除いて、E3は対応する位置(それぞれ217、354および148)でTcAChEに対して同一の残基を有する。興味深いことに、Glu199に相当するのはGlnであり、Phe 330に相当するのは、いくつかのリパーゼおよびある種のカルボキシルエステラーゼ(その基質は小さな離脱基を有することが知られている) 中のLeuである(Thomas et al., 1999; Campbell et al., 2001; Claudianos et al., 2002)。
酵素滴定
以下のマイクロプレートカラム1〜4でそれぞれ発現されたエステラーゼのために4つの100μl反応液をセットアップした。
0.025%トライトンX-100、0.1Mリン酸塩バッファーpH 7.0を含むプレートウエルブランク;
0.025%トライトンX-100、0.1Mリン酸塩バッファーpH 7.0中に100μM dECPを含む基質ブランク;
0.1Mリン酸塩バッファーpH 7.0と1:1で混合した50μl細胞抽出物を含む細胞ブランク;
200μM dECPを含む0.1Mリン酸塩バッファーpH 7.0と1:1で混合した50μl細胞抽出物を含む滴定反応。
ペルメトリン加水分解アッセイ
発現された酵素は、酸標識化合物についての放射計分配アッセイ(radiometric partition assay)、またはアルコール部分中に標識が付されたものについてのTLCに基づくアッセイを使用してペルメトリン加水分解活性に関して試験した(Devonshire and Moores,1982)。このアッセイの特徴としては、ペルメトリンの濃度を水溶液中でのその文献記載値(0.5μM)未満に保ち、界面活性剤(酵素が発現される昆虫細胞から酵素を抽出するために使用した)の濃度を臨界ミセル濃度(トライトンX100については0.02%)未満に維持し、アッセイを迅速 (つまり10〜30分以内)に実行することで、分析チューブ(粘着性を最小限にするためにガラス管を使用した)の管壁に付着する基質を最小限にした点が挙げられる。これらのペルメトリン濃度では、酵素は基質によって飽和されず、したがって、Km値を決定することはできないこともある。しかし、ペルメトリン活性を有する酵素(これらは低い基質濃度ではそれらの効率の直接比較が可能である)の各々について特異性定数(kcat/Km)を正確に計算することができた。シスとトランスの異性体にペルメトリンを分離することにより分析パワーを増加させた。
ペルメトリンの市販製剤は、1Sシス、1Rシス、1Sトランスおよび1Rトランスの4つの立体異性体を含む(図4)。シリカ上での分取薄層クロマトグラフィー(TLC)を使用して2つの対掌体ペア1S/1Rシスおよび1S/1Rトランスに異性体を分離した。対掌体はそれ以上は分離できなかった。次いで、各対掌体ペアの加水分解のために酵素調製物を分析してもよい。
酸性部分中に放射性標識されたピレスロイド
この分析(Devonshire and Moores, 1982)はペルメトリン異性体のために使用される。これは、発現されたエステラーゼを放射性標識された基質とともにインキュベートし、そして次に、未変化の基質を有機溶媒中に抽出した後、水相中で放射性シクロプロパンカルボキシレートアニオンを測定することによる。事前の経験に基づいて、最良の抽出プロトコルは、2:1(体積比)のメタノールとクロロホルムの混合物を使用する。適当な割合でアッセイインキュベーションのアリコートと混合した時点で、得られるバッファー、メタノールおよびクロロホルムの混合物は単一相であるが、これを、酵素反応を止め、ピレスロイドの完全な可溶化を確実にする目的に用いる。次いでクロロホルムおよびバッファーの過剰量を添加すると、相を一緒にしておくメタノールの能力を超過する。その結果、有機相を除去することができ、水相中の生成物が測定される。プロトコルは詳細には以下のとおりである。
i) タイプIピレスロイド-ペルメトリンのジブロモアナログ(NRDC157):
これらのエステルの加水分解で形成された3-フェノキシベンジルアルコールは、クロロホルム-メタノール抽出操作では水相に分配されない。したがって、シリカ上のTLC(Devonshire and Mooers, 1982)によって基質からこの生成物を分離する必要があった。プロトコルは詳細には以下のとおりである。
予備実験(その中で上記TLCによってインキュベーションを分析した)では、主として3-フェノキシ安息香酸が形成することが示された。これは、初期のシアノヒドリン加水分解生成物は非酵素的に酸に急速に変換されるという文献報告と一致していた。TLCアッセイはクロロホルム-メタノール抽出操作より時間が掛かるので、これらの基質から生産された3-フェノキシ安息香酸アニオンを測定するには、後者(酸標識したピレスロイドについて上に記載)を採用した。
図5は、ペルメトリンのトランスおよびシス異性体をE3W251L酵素によって加水分解したときの実験結果を示す。
マラチオン加水分解
MCE活性はCampbell et al.(1998)に記載されるようにしてアッセイした。但し、低いkmを有すると思われる酵素については、14Cマラチオン(25mCimmol-1)の特異的活性を希釈しなかった。これは、放射性標識したマラチオンカルボン酸(加水分解生成物)を水相に維持したまま、マラチオンを有機相中に抽出する終点アッセイである。50nM 〜1μMの範囲にわたって活性を測定してKm とkcatを決定し、Enzfitter 1.05ソフトウェア(Elsevier-Biosoft)を用いた非線形回帰により分析し、グラフ出力してMichaelis-Menten動力学からのずれをすべて明らかにした。特異性定数は、Km とkcatから直接計算した。
E3とEST23変種のペルメトリン加水分解活性
表2に、基質としてシスおよびトランスペルメトリンを使用し、18種のE3および3種のEST23変種について得られた動的データをまとめた。酵素のマラチオン加水分解活性も比較のために示した。いずれの場合も、データは、1S/1Rシスおよび1S/1Rトランス異性体ペア各々のうち最も速く加水分解する対掌体の加水分解を表す(上記参照)。
E3G137D変異はヒツジキンバエにおけるダイアジノン耐性の原因である。この変異体では、酵素の活性サイトのオキシアニオンホール領域中の非常に小さい脂肪族、中性のGly残基が酸性Aspと置き替えられ、結合オキソンOP分子の加水分解を可能にしている。しかし、この変異体(およびそのD.melanogaster オーソログ)は、野生型の酵素のそれと比較して、特にトランス-ペルメトリンについての活性が低減されている。この活性は、HisまたはGluのいずれかによってGly-137を置換することによって増加しなかった。しかし、Gly-137のArgによる置換はシス-またはトランス-ペルメトリンのいずれについても活性にほとんど影響しなかった。Argが線状であるという性質は、それが容易に折れ曲がり、活性サイトへのペルメトリンの結合を妨害しないことを意味するかもしれない。変異体のこのグループのMCE活性は、特にトランスペルメトリンのその活性と広く対応していた。これは、基質のアシル基の収容および安定化に対するG137置換の影響を示している。影響はマラチオンに対してよりもペルメトリンに対して一般的に小さいが、これはペルメトリンのアシル基が幾分小さいことと一致している。
E3W251L変異は、活性サイトのアシルポケットにおいて、大きな芳香族Trp残基をより小さな脂肪族のLeuに置き換えるものであり、トランス-ペルメトリン加水分解の7倍の増加および実質的なシス-ペルメトリン加水分解の獲得をもたらした。これは、ヒツジクロバエにおけるマラチオン耐性獲得の原因である。この変異体のMCE活性は野生型酵素のそれよりも2倍高かった。EST23におけるW251Lの効果は実質的にE3におけるのと同一であった。E3(サイズの減少順に、Thr、Ser、AlaおよびGly)におけるTrp-251のさらにより小さな残基への置換も、ペルメトリンの加水分解活性の増加をもたらした(もっとも、これらの変異体の活性はそのE3W251Lにおけるそれほどには高くはなかった)。明らかに、立体的要因は変異体の活性におけるただ1つの要素ではない。例えば、ThrとSerは両方とも水酸基を含んでおり親水性である。さらに、Alaは(Leuのように)脂肪族であるとともに疎水性でLeuよりさらに小さいが、それでも、この変異体はペルメトリンに対してはW251L変異体と同じくらい活性であった。W251L変異体(すなわち、E3P250S/W251L)のオキシアニオンホールを開いた場合も、活性は野生型のそれよりはまだ高いものの、シス-およびトランス-ペルメトリン活性の両方についてその活性が減少した。E3中のすべてのW251変異体に対するペルメトリンの特異性定数およびEST23の中のW251Lが野生型のものと比較して増加しているが、その増加がシス異性体に対して一様により明らかであるという点に着目することは興味深い。野生型酵素はトランス:シス比率が少なくとも20:1であるが、この比率はW251変異体では2〜6:1にすぎない。これらの変異体によって提供されるアシルポケット中の余分なスペースは、一見すると、他のより問題のあるシス異性体の加水分解のため最も大きな利益があった。
いくつかのリパーゼは、L.cuprina E3中のPhe 354に対応する位置にLeu残基を有することが知られている。しかし、E3中のLeuに対するPhe 354の置換は、ペルメトリンに対するその活性をあまり増加させなかったが、マラチオンに対するその活性は顕著に低減した。他方、Phe 354のより嵩高い芳香族残基Trpでの置換は、シス-およびトランス-ペルメトリン両方について活性を3〜4倍増加させたが、MCE活性はわずかに減少させた。いくつかの天然に存在するリパーゼ中でPheに置換するのがLeuであるとすれば、F354LではなくF354Wが非常に脂肪親和性の強いペルメトリンに対して活性の増加を示すことは恐らく驚くべきである。
ブロモ-ペルメトリンアナログの加水分解
表2も、ペルメトリン(NRDC157)の2つのシスジブロモビニルアナログを使用して、E3とEST23変種について得られた動的データをまとめたものである。ペルメトリンのこのジブロモアナログの1Sシス異性体は、E3F309LおよびF309L/W251L以外のすべての酵素によって、1R/1Sシスペルメトリンに対してと同様の効率で加水分解された。これは、より大きな臭素原子がこの基質の触媒中心へのアクセスを実質的に妨害しなかったことを示す。E3WTおよびEST23WT酵素による活性は異性体間の有意な比較には低すぎたが、E3F309LとF309L/W251L以外の他のすべての酵素は1S異性体より10〜100倍速い加水分解を示した。これはM.persicae における1Sトランスペルメトリンに対し以前に見出されたシクロプロパン環のC1におけるこのコンフィグレーションに対するのと同じ優先性である(Devonshire and Moores, 1982)。
発現された酵素によるタイプIIピレスロイドの加水分解
表3は、4種のデルタメトリンシス異性体を使用して、E3とEST23変種のサブセットに対して得られた動力学的データをまとめたものである。E3W251LとE3F309Lを例外として、デルタメトリン(αSまたはαR)の1Rシス異性体は、1Rシス NRDC157(ジブロモビニル置換基を有するがαシアノ基を欠く点においてペルメトリンとデルタメトリンの中間の性質であると考えることができる)に対してと同様の効率で加水分解された。1Rシス異性体に対する活性は、αSコンホメーションよりαRで常により大きかった。E3W251LとE3F309Lは、NRDC157の対応する異性体との場合に比べデルタメトリンの1Rシス異性体との場合に著しく低効率であった。
一般的な議論
251のシリーズ変異体についてのペルメトリンとNRDC157の結果は、E3/EST23の中でのアシル結合制約に関するいくつかの全く強く単純な推論を生じさせる。全体として、マラチオンに関して、より広いアシルポケットを生成するべき251の置換が、これらの基質の嵩高いアシル基の収容/安定化を促進する。これらの置換は、シクロプロパン環を横切る2つの立体中心によって生じるすべての異性体の加水分解にとって有益である。トランス異性体が野生型酵素によって強く好まれる一方、変異体も少なくともシス異性体混合物の一部によって、比較的よく加水分解される。しかし、シス異性体内において、変異体における改良は、1Sシス異性体に対してより遥かに著しい。1Rシス異性体(それらは野生型酵素にとってはどのコンフィグレーションでも最も問題のものである)は、変異体にとってもやはり最も問題のあるものである。変異体シリーズ内では、改善された動力学は、単に側鎖サイズの縮小によっては説明されない。マラチオンについてと同様に、最も小さなものへの置換が最も高い活性を与える訳ではないからである。実際、最良の動力学は、W251Lで得られるが、Leuは試験したすべての置換の中で最も大きな側鎖サイズがある。
Claims (19)
- 試料を昆虫エステラーゼまたはその変異体と接触させることを含む、試料中の疎水性エステル殺虫剤または毒素を除去し、またはその濃度を低減する方法であって、
昆虫エステラーゼまたはその変異体が、
i) 配列番号1で示される配列、
ii) 配列番号2で示される配列、および
iii) i)またはii)と少なくとも90%が同一であって、疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解可能である配列
からなる群から選択される配列を有する方法。 - 変異体昆虫エステラーゼが、エステラーゼの活性サイトのオキシアニオンホール、アシル結合ポケットもしくはアニオン性サイト領域またはそれらの任意の組合せに変異を有する請求項1に記載の方法。
- 変異体昆虫エステラーゼが、E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354LおよびEST23W251Lからなる群から選ばれ、ここで、E3は配列番号1によって、かつ、EST23は配列番号2によって表される請求項2に記載の方法。
- 2以上の昆虫エステラーゼまたはその変異体を用いて行われる請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 疎水性エステル殺虫剤または毒素がピレスロイドである請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ピレスロイドがタイプIまたはタイプIIピレスロイドである請求項5に記載の方法。
- タイプIピレスロイドが、1S/1Rトランスペルメトリン、1S/1Rシスペルメトリン、NRDC157 1SシスおよびNRDC157 1Rシスからなる群から選択される請求項6に記載の方法。
- タイプIIピレスロイドがデルタメトリンである請求項6に記載の方法。
- 方法が液体を含む環境中で実行される請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 昆虫エステラーゼまたはその変異体が試料に直接与えられる請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 昆虫エステラーゼまたはその変異体が、昆虫エステラーゼまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドの発現により、ポリヌクレオチドを含む宿主細胞から試料に与えられる請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 昆虫エステラーゼまたはその変異体が、昆虫エステラーゼまたはその変異体を重合体多孔性支持体上に固定化して含む重合体スポンジまたは発泡体として与えられる請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 疎水性エステル殺虫剤または毒素が昆虫エステラーゼまたはその変異体に接触させられるときにさらに界面活性剤の存在を含む請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 界面活性剤がバイオサーファクタントである請求項13に記載の方法。
- 疎水性エステル殺虫剤または毒素を加水分解する酵素を生成および選択する方法であって:
(a)昆虫エステラーゼまたは既に変異した昆虫エステラーゼ中に1または複数の変異を導入すること、および
(b)変異体昆虫エステラーゼの疎水性エステル殺虫剤または毒素の加水分解能力を調べること
を含む方法であって、
昆虫エステラーゼまたはその変異体が、
i) 配列番号1で示される配列、
ii) 配列番号2で示される配列、および
iii) i)またはii)と少なくとも90%が同一である配列
からなる群から選択される配列を有する方法。 - 1または複数の変異が、加水分解活性を増強しかつ/またはエステラーゼの立体特異性を変更する請求項15に記載の方法。
- 1つまたは複数の変異が、エステラーゼの、オキシアニオンホール、アシル結合ポケットおよびアニオン性サイトからなる群から選択される領域内にある請求項15または16に記載の方法。
- 変異が点突然変異である請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
- 既に変異した昆虫エステラーゼが、E3G137R、E3G137H、E3W251L、E3W251S、E3W251G、E3W251T、E3W251A、E3W251L/F309L、E3W251L/G137D、E3W251L/P250S、E3F309L、E3Y148F、E3E217M、E3F354W、E3F354LおよびEST23W251Lからなる群から選ばれ、ここで、E3は配列番号1によって、かつ、EST23は配列番号2によって表される請求項15に記載の方法。
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