CN111303136A - 6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物、合成方法、应用、药物 - Google Patents

6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物、合成方法、应用、药物 Download PDF

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CN111303136A CN202010279417.1A CN202010279417A CN111303136A CN 111303136 A CN111303136 A CN 111303136A CN 202010279417 A CN202010279417 A CN 202010279417A CN 111303136 A CN111303136 A CN 111303136A
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Abstract

本申请公开了一种6‑(1,3‑苯并二氧基‑5‑(甲)基)‑取代尿嘧啶衍生物、合成方法、应用、药物，具有结构通式如式I：
Figure DDA0002445992950000011
其中，n＝0或1；R1选自C1～C3的烷基；R2选自烯丙基、具有式(1)所示结构式的基团或具有式(2)所示结构式的基团中任意一种；以S‑DABO类化合物和二苯胺酯类化合物SPJ‑L‑5为先导，基于药效团拼接和分子杂合的药物分子设计策略，将SPJ‑L‑5的核心药效团1,3‑苯并二氧基引入S‑DABO类化合物嘧啶环的C‑6位，同时保留C‑2位的优选基团，以开发广谱高效，价格适中的优良抗HIV药物候选物。

Description

6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物、合成方 法、应用、药物
技术领域
本申请涉及一种6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物、合成方法、应用、药物，属于化学及药物领域。
背景技术
艾滋病即获得性免疫缺陷综合症(acquired immunedeficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)所引起的流行性传染病。HIV病毒可以破坏人类免疫系统从而导致各种并发症并最终发展成艾滋病。由于其特殊的入侵机制和易突变的特性，让艾滋病的治疗至今仍然是医学界的一大难题。
虽然抑制多种HIV蛋白在治疗上是可行的，但HIV逆转录酶(RT)仍然是现今治疗的主要靶点之一。通过抑制RT酶的活性，可以阻止病毒复制DNA，从而达到迅速、高效、专一地发挥抗病毒的作用。现今的HIV逆转录酶抑制剂主要分为两类，一类是核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)，另一类即非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)。
现已上市的NNRTIs主要有6种，分别是奈韦拉平(Nevirapine)、地拉韦啶(Delavirdine)、依法韦仑(Efavirenz)、依曲韦林(Etravirine)、利匹韦林(Rilpivirine)和最新上市的多拉维林(Doravirine)。虽然它们在急性HIV感染的治疗方面有较好的作用，但一方面由于HIV病毒容易变异，导致变异株和耐药株不断的产生。另一方面上述药物可能造成的毒副作用也限制了其在临床上的应用。所以开发新的，高效低毒的NNRTIs是十分必要的。
发明内容
本申请提供了一种6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物、合成方法、应用、药物，用于解决现有抗HIV药物毒副作用大、无法有效抑制变异株和耐药株的技术问题。
本申请提供了一种6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物，结构通式如式I：
Figure BDA0002445992930000011
其中，n＝0或1；R1选自C1～C3的烷基；
R2选自烯丙基、具有式(1)所示结构式的基团或具有式(2)所示结构式的基团中任意一种；
取代苯乙酮：
Figure BDA0002445992930000012
其中，X选自氢、卤素、羟基或含有芳环的酯基的基团中任意一种；
5’-芳基吡唑基：
Figure BDA0002445992930000013
其中，Ar1选自单取代苯环基、单取代吡啶环基、单取代噻吩环基、单取代恶唑环基、多取代苯环基、多取代吡啶环基、多取代噻吩环基或多取代恶唑环基中任意一种。
优选地，所述含有芳环的酯基中的芳环选自苯、吡啶、噻吩或恶唑中任意一种；
更优选地，所述含有芳环的酯基中的芳环为苯环。
优选地，所述Ar1为单取代苯环；
优选地，所述Ar1上的取代基选自氢、羟基、卤素、甲基或甲氧基中任意一种。
优选地，结构通式如式1b：
Figure BDA0002445992930000021
优选地，结构通式如式1c：
Figure BDA0002445992930000022
优选地，结构通式如式1r：
Figure BDA0002445992930000023
本申请的另一方面还提供了一种6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物的合成方法，包括以下步骤：
在碱性环境中，含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶的原料与含溴代侧链的化合物发生烃基化反应，得到所述6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物。
该反应的方程式如下：
Figure BDA0002445992930000031
其中1分子式为含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶的原料；2分子式为含溴代侧链的化合物，3分子式为产物6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物。
优选地，所述含溴代侧链的化合物选自溴代烯丙基、具有式(3)所示结构式的基团或具有式(4)所示结构式的基团中任意一种，
Figure BDA0002445992930000032
其中，Ar2选自苯、吡啶、噻吩、恶唑中任意一种，R3选自氢、羟基、卤素、甲基或甲氧基中任一种；
Figure BDA0002445992930000033
其中，R4选自氢、F、Cl、Br、羟基或含有芳环的酯基中任意一种；Ar3选自苯基、吡啶基、噻吩基、恶唑基中任意一种；
具体地，含溴代侧链的化合物选自：
Figure BDA0002445992930000034
Figure BDA0002445992930000035
Figure BDA0002445992930000036
中任意一种。式(5)～式(13)可通过商业途径获取。
含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶的原料(S-DABOs反应物)选自：
Figure BDA0002445992930000041
Figure BDA0002445992930000042
中任意一种。
式(14)或式(15)的S-DABOs反应物按文献Attia,M.I.；El-Brollosy,N.R.；Kansoh,A.L；Ghabbour,H.A.；Al-Wabli,R.I.；Fun,H.K.Synthesis,Single Crystal X-RayStructure,and AntimicrobialActivity of6-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-5-ethyl-2-{[2-(morpholin-4-yl)ethyl]sulfanyl}pyrimidin-4(3H)-one.J.Chem.2015,2014(4),1-8)中公开方法制备得到。
式(16)的S-DABOs反应物的制备反应方程式如下：
Figure BDA0002445992930000043
其中反应方程式中a)步骤：在250ml圆底烧瓶中加入胡椒酸(0.05mol)和乙腈(150ml)，然后缓慢加入羰基二咪唑(0.06mol)发生取代反应，在室温下搅拌一小时，停止反应，得到第一反应液，备用。
取500ml三口瓶加入0.05mol乙基单钾盐和200ml乙腈充分搅拌混匀，依次加入三乙胺(Et3N)(0.07mol)和无水MgCl2(0.06mol)，室温下搅拌一小时，然后缓慢加入第一反应液并在85℃条件下加热回流搅拌，发生缩合反应，反应时间12h；
反应完成后停止反应并冷却到室温，将反应液倒入500ml的烧杯中，用13％的盐酸调节pH为2-3，减压除去溶剂后剩下水层；水层用3×100ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，分别用饱和NaHCO3、饱和食盐水洗三次，合并有机层用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得到β-酮酯，所得β-酮酯可以不经进一步纯化直接进行下一步反应；
反应方程式中b)步骤：取250ml圆底三口瓶，加入150ml无水乙醇，将金属钠(0.12mol)剪碎在搅拌条件下分批加入无水乙醇中，搅拌直至钠完全溶解，加入硫脲(0.05mol)，搅拌约1h，待完全溶解后缓慢滴加β-酮酯，85℃下加热回流8h，发生缩合反应，TLC跟踪原料点消失后停止反应，冷却到室温，减压蒸除溶剂得到淡黄色固体。
将所得固体溶于150mL冰水中，用13％的HCl调节pH＝6左右，产生大量白色沉淀，过滤，
用水洗涤沉淀，得到6-(1,3-苯并二氧基-5-基)-2-巯基-5-乙基-3H-嘧啶-4-酮)纯品。
优选地，所述原料与所述含溴代侧链的化合物按摩尔比为1:1～2发生所述反应；
优选地，所述Ar3和/或Ar2为苯环；
优选地，所述碱性环境为碱性溶剂，所述碱性溶剂为吡啶、DMF或甲苯中任一种；
优选地，所述烃基化反应的反应温度为20～85℃范围内，反应时间为2～12小时。
在具体制备过程中，含溴代侧链的化合物可分一次或等分为多次加入均可。
优选地，上述方法可以合成如上述6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物。
本申请的另一方面还提供了一种如上述的含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶的原料，含有如式(16)结构通式的化合物：
Figure BDA0002445992930000051
优选地，所述如式(16)结构通式化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤a)：向胡椒酸和乙腈的混合物中缓慢加入羰基二咪唑，在20～30℃温度范围内搅拌下发生取代反应，反应时间在1～2小时范围内，得到第一反应液；
向乙基单钾盐和乙腈的混合物中依序缓慢加入三乙胺和无水MgCl2，在20～30℃温度范围内搅拌下反应，反应时间在1～2小时范围内，缓慢加入第一反应液并在80～90℃温度范围内回流搅拌条件下，发生缩合反应，反应时间在10～15h范围内，分离后得到β-酮酯；
步骤b)：将金属Na溶解于无水乙醇中，加入硫脲搅拌至溶解后，缓慢滴加β-酮酯，在80～90℃温度范围内加热回流8h，发生缩合反应，TLC跟踪原料点消失后停止反应，分离后得到结构式如式(16)所示的6-(1,3-苯并二氧基-5-基)-2-巯基-5-乙基-3H-嘧啶-4-酮)。
优选地，所述胡椒酸和乙腈按摩尔：体积比为1:2000～4000范围内混合；
优选地，所述乙基单钾盐和乙腈按摩尔：体积比为1:3000～5000范围内混合。
式(16)的制备方法反应方程式如式III所示。具体制备方法与前述相同，在此不累述。
上述方法中所述“范围内”是指在该范围内任一数值均可发生对应反应。
本申请的另一方面还提供了一种6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物在制备抗HIV药物中的应用，所述衍生物为上述的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物、根据上述的方法制备得到的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物中的至少一种。
本申请提供衍生物可根据需要制备为所需剂型的药物，并能在该药物中发挥对变异株和耐药株的抑制作用，同时毒副作用小。
本申请另一方面还提供了一种具有抗HIV活性的药物，包含：上述的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物、根据上述的方法制备得到的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物中的至少一种。
本申请提供的衍生物，可根据抗HIV药物常规制备方法制备得到各类剂型。在将上述的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物制成各类剂型时，本领域技术人员可根据需要添加合理使用范围内的各类辅料或药学上可接受的载体。例如注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、片剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂或透皮贴剂剂型。加入辅料及载体后，不影响该药物效果的发挥。
该类化合物用途是作为抗艾滋病药物候选物，或者是作为不同剂型的抗HIV药物组合物的活性成分。
该药物可单独使用或与其他药物联合使用，或与其他组分制成药物组合物。给药方式口服给药、皮下注射、肌肉注射、静脉注射、舌下给药、直肠给药、经皮给药或喷雾吸入。
本申请中，"EC50"是指半数效应浓度，引起受试对象50％个体产生一种特定效应的药物剂量。
本申请中，"CC50"是指是指药物抑制病毒复制的能力，是能够抑制50％病毒复制时的药物浓度。
本申请中，所述“烷基”为烷烃化合物失去任意一个氢原子所形成的基团。烷烃化合物包括直链烷烃、支链烷烃、环烷烃。
本申请中，C1～C3表示基团所含碳原子的数量。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物，以S-DABO类化合物和二苯胺酯类化合物SPJ-L-5为先导，基于药效团拼接和分子杂合的药物分子设计策略，将SPJ-L-5的核心药效团1,3-苯并二氧基引入S-DABO类化合物嘧啶环的C-6位，同时保留C-2位的优选基团，以开发广谱高效，价格适中的优良抗HIV药物候选物。
2)本申请所提供的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物，该类化合物具有较高的抗HIV活性和较低的细胞毒性，其中化合物1b(EC50＝0.06μm,SI＝1660.63)，1c(EC50＝0.16μm,SI＝749.28)和1r(EC50＝0.16μm,SI>1219.51)对PBMC的毒性较小，对蛋白酶抑制剂耐药株、融合抑制剂耐药株、核苷类逆转录酶抑制剂耐药株复制均有很好的抑制作用，对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药株(包括单点突变株)抑制作用较弱，但对临床分离病毒株均有很好的抑制作用。
3)本申请所提供的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物，该化合物具有1r(EC50＝0.16μm,SI>1219.51)，使其仅针对HIV病毒由负链DNA合成正链DNA的过程进行抑制，现有S-DABOs或其它NNTRIs类化合物均无法实现该抑制效果。
附图说明
图1为本申请实施例一中化合物1b的具有原子标记方案的化合物1b的分子视图；
图2为本申请实施例一中化合物1b的分子结合图及数据，图中氢键显示为虚线，图中a)为化合物1b的分子结合图，b)为仪器输出数据；
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
实施例
如无特别说明，本申请的实施例中的原料、溶剂和实验试剂均通过商业途径购买，不进行处理。
实施例一 制备含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶的原料样品1～3
样品1中所含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶具有如下结构通式：
Figure BDA0002445992930000061
式(16)的制备反应方程式式III如下：
Figure BDA0002445992930000062
按以下步骤制备：
反应方程式中a)步骤：在250ml圆底烧瓶中加入胡椒酸(0.05mol)和乙腈(150ml)，然后缓慢加入羰基二咪唑(0.06mol)发生取代反应，在室温下搅拌一小时，停止反应，得到第一反应液，备用。
取500ml三口瓶加入0.05mol乙基单钾盐和200ml乙腈充分搅拌混匀，依次加入三乙胺(Et3N)(0.07mol)和无水MgCl2(0.06mol)，室温下搅拌一小时，然后缓慢加入第一反应液并在85℃条件下加热回流搅拌，发生缩合反应，反应时间12h；
反应完成后停止反应并冷却到室温，将反应液倒入500ml的烧杯中，用13％的盐酸调节pH为2-3，减压除去溶剂后剩下水层；水层用3×100ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，分别用饱和NaHCO3、饱和食盐水洗三次，合并有机层用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得到β-酮酯，所得β-酮酯可以不经进一步纯化直接进行下一步反应；
反应方程式中b)步骤：取250ml圆底三口瓶，加入150ml无水乙醇，将金属钠(0.12mol)剪碎在搅拌条件下分批加入无水乙醇中，搅拌直至钠完全溶解，加入硫脲(0.05mol)，搅拌约1h，待完全溶解后缓慢滴加β-酮酯，85℃下加热回流8h，发生缩合反应，TLC跟踪原料点消失后停止反应，冷却到室温，减压蒸除溶剂得到淡黄色固体。
将所得固体溶于150mL冰水中，用13％的HCl调节pH＝6左右，产生大量白色沉淀，过滤；
用水洗涤沉淀，得到6-(1,3-苯并二氧基-5-基)-2-巯基-5-乙基-3H-嘧啶-4-酮)纯品，结构式如式(16)所示。
本实施例中，所得具有式(16)结构通式的化合物核磁测试结果如下：
1H NMR(300MHz,DMSO ppm)δ:12.46(1H,s,NH),12.20(1H,s,NH),6.99-6.87(3H,overlap,aromatic),6.08(2H,s,O-CH2-O),2.07(2H,s,Et),0.88(3H,s,CH3).13C NMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ:174.0.161.5.149.2,148.3.147.1.125.2.122.6.116.9.108.7.108.2.101.5.18.6.13.3.C13H12N2O3S(276.06).
样品2中所含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶具有如下结构通式：
Figure BDA0002445992930000071
样品3中所含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶具有如下结构通式：
Figure BDA0002445992930000072
样品2～3中所含具有式(14)～(15)的化合物按Attia,M.I.；El-Brollosy,N.R.；Kansoh,A.L；Ghabbour,H.A.；Al-Wabli,R.I.；Fun,H.K.Synthesis,Single Crystal X-RayStructure,and AntimicrobialActivity of 6-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-5-ethyl-2-{[2-(morpholin-4-yl)ethyl]sulfanyl}pyrimidin-4(3H)-one.J.Chem.2015,2014(4),1-8)中公开方法制备得到。
实施例二 制备6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物化合物1a～1w
按以下步骤分别制备化合物1a～1w：
将6-(1,3-苯并二氧基-5-甲基)-2-巯基-5-乙基-3H-嘧啶-4-酮)(S-DABOs反应物)(3mmol)和K2CO3(3.6mmol)置于圆底烧瓶中，加入无水二甲基甲酰胺(DMF)5ml，于室温下搅拌1h，加入含溴代侧链反应物(3.3mmol)，在室温下搅拌2h，当TLC(薄层色谱分析)跟踪到原料点消失后停止反应。
将反应液倒入100ml冰水中，用EA(乙醇)(50ml×3)反向萃取三次后合并有机层，用水(50ml×3)洗涤三次，再用饱和食盐水(50ml×3)洗涤三次，最后用无水Na2SO4干燥得到目标化合物粗品，经过柱层析纯化或用丙酮/石油醚，乙酸乙酯/石油醚或甲醇/氯仿体系重结晶得到6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物的化合物1a～1w纯品。
纯化步骤为：柱层析纯化或重结晶。柱层析纯化操作中溶剂为体积比。
重结晶操作：用A溶剂将化合物样品溶解，再加B溶剂至所得溶液浑浊停止加入溶剂B，静置后析出大量沉淀。
制备化合物1a～1w中所用反应物、反应条件如下表所列：
表1
Figure BDA0002445992930000081
Figure BDA0002445992930000091
Figure BDA0002445992930000101
Figure BDA0002445992930000111
图1为具有原子标记方案的化合物1b的分子视图，该图中F2的拟合优度为1.223。
参见图2a)化合物1b的分子结合图，测试所得结果列于表2中。表2数据由测试仪器输出结果如图2b)所列。
表2.化合物1b晶体数据和结构细化
Figure BDA0002445992930000112
Figure BDA0002445992930000121
制备所得化合物1a～1w的结构谱图及单晶数据如下：
Figure BDA0002445992930000122
Figure BDA0002445992930000131
Figure BDA0002445992930000141
Figure BDA0002445992930000151
Figure BDA0002445992930000161
实施例三 制备6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物化合物2a～2c
本实施例中，所用制备方法与实施例一中化合物1a所用制备方法区别如下表所列：
表3
化合物编号 烃基化反应温度 反应时间 碱性溶剂
2a 23℃ 2小时 吡啶
2b 84℃ 12小时 甲苯
2c 65℃ 10小时 DMF
实施例四 化合物1a～1w的体外抗HIV活性实验
本申请中公开的化合物1a～1w经中国科学院昆明动物研究所进行HIV逆转录酶活性筛选，具体实验方法和结果如下所述：
所用细胞和病毒：
C8166细胞，传代人T淋巴细胞，RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清)培养，2天传代一次，实验开始前1天，1:2传代，以保证细胞状态。
HIV-1ⅢB毒株，实验室长期传代适应的HIV-1B亚型毒株。
实验方法：
1.细胞培养
实验开始前1天，以1:2传代，以保证细胞处于对数生长期。采用Trypan Blue染色法进行总细胞数和细胞活力定量，用于实验的细胞活力大于95％。
2.化合物的配制
96孔板内，对化合物1a从最大浓度400μmol/L(μM)做5倍梯度稀释，100μl/孔，共6个稀释度，每个稀释度设3个重复孔。
3.药物的细胞毒性检测
1)将C8166细胞250×g离心5min后，用新鲜的生长培养基悬浮，吹打均匀，TrypanBlue染色计数，确定细胞浓度，活细胞百分数必须大于95％方可进行下一步实验。
2)稀释C8166细胞悬液至4×105个/ml。
3)将上述细胞加到含有化合物1a的96孔板中，100μl/孔，设置不含化合物的阴性对照孔和不含细胞的空白对照孔。，在37℃，5％CO2条件下与化合物1a共培养3d。
4)采用MTT法检测化合物1a对C8166细胞的毒性，计算CC50。
4.药物的抗病毒活性检测
1)96孔板内，对化合物1b从最大浓度400μM做5倍梯度稀释，100μl/孔，共6个稀释度，每个稀释度设3个重复孔。
2)将C8166细胞250×g离心5min后，用新鲜的生长培养基悬浮，吹打均匀，TrypanBlue染色计数，确定细胞浓度，活细胞百分数必须大于95％方可进行下一步实验。
3)4×105/mlC8166细胞，加入HIV-1ⅢB病毒，感染复数(multiplicity ofinfection,M O I)为0.005。将上述细胞加到含有化合物1a的96孔板中，100μl/孔，设置不含化合物的阳性对照孔和不含病毒的阴性对照孔。在37℃，5％CO2条件下与化合物1a共培养3d。
4)在倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。计算EC50，即化合物1a抑制50％合胞体形成时的药物浓度。
结果处理：
药物的抗病毒活性表示为：药物的抗病毒活性％＝(测试值-最低均值)/(最高均值-最低均值)×100，用Median Equation方法计算IC50。
量效关系曲线采用Graphpad Prism 5.0软件生成。
统计分析采用SPSS 15.0软件。
按上述步骤将所用化合物1a替换为1b～1w进行试验，所得具体数据见下表。
表4.化合物1a-1w活性和毒性实验数据
Figure BDA0002445992930000181
Figure BDA0002445992930000182
Figure BDA0002445992930000191
表中：NVP(N-乙烯基吡咯烷酮)，AZT(齐多夫定)
实施例五 化合物1b、1c和1r对PBMC毒性试验
本申请中公开的化合物1b、1c和1r经中国科学院昆明动物研究所进行PBMC毒性试验，具体实验方法和结果如下所述：
96孔板内，对化合物1b从最大浓度400μM做5倍梯度稀释，100μl/孔，共6个稀释度，每个稀释度设3个重复孔。
收集经植物血球凝集素p(PHA-P，终浓度为5μg/ml)和白细胞介素-2(IL-2,终浓度为50IU/ml)刺激活化3天的人外周血单个核细胞(PBMC),调细胞浓度至5×106个/ml。
将上述细胞加到含有化合物1b的96孔板中，100μl/孔，设置不含化合物的阴性对照孔和不含细胞的空白对照孔。
在37℃，5％CO2条件下培养箱培养。第4天按100μl/孔补加含有该孔化合物1b浓度及IL-2的培养液，第7天以MTT法检测细胞存活率，计算CC50值。
补加操作中向各孔加入的化合物1b溶液浓度为初始加入溶液浓度；该初始浓度根据各孔内溶液稀释浓度添加，以下各补加操作，于此相同。
按上述步骤将所用化合物替换为1c和1r重复上述试验，所得具体数据见下表。
表5.化合物1b、1c和1r对PBMC毒性试验结果
化合物样品名称 CC<sub>50</sub>(μM)
1b 81.56±19.15
1c 129.50±2.24
1r >400
ETR(依曲韦林) 25.12±1.34
实施例六 化合物1b、1c和1r体外抗HIV耐药株活性实验
本申请中公开的化合物1b、1c和1r经中国科学院昆明动物研究所进行体外抗HIV-1耐药株活性试验。具体实验方法和结果如下所述：
96孔板内，对化合物1b从最大浓度400μM做5倍梯度稀释，100μl/孔，共6个稀释度，每个稀释度设3个重复孔。
4×105个/ml C8166细胞分别感染耐药病毒株HIV-1A17、HIV-1K103N、HIV-1Y181C、HIV-14755-5、NL4-3gp41(36G)V38A,N42T、HIV-1L10R/M46I/L63P/V82T/I84V(MOI＝0.03)，在37℃，5％CO2条件下孵育2h；
PBS(磷酸盐缓冲液)洗细胞2次，RPMI-1640完全培养基重悬；上述细胞液按100μl/孔接种到含有化合物1b的96孔板中，设置不含化合物1b的阳性对照孔和不含细胞的空白对照孔。
在37℃，5％CO2条件下培养3d。
收集培养上清，0.5％Triton-X 100灭活。采用捕捉p24抗原ELISA方法检测化合物1b对上述HIV-1耐药株复制的抑制作用。
按上述步骤将所用化合物1b替换为1c和1r重复上述试验，所得具体数据见下表。
表6.化合物1b、1c和1r体外抗HIV-1耐药株活性结果
Figure BDA0002445992930000192
Figure BDA0002445992930000201
注：HIV-1RF/V82F/184V，蛋白酶抑制剂耐药株；pNL4-3gp41(36G)V38A,N42T，融合抑制剂耐药株；HIV-14755-5，核苷类逆转录酶抑制剂耐药株；HIV-1A17非核苷类逆转录酶抑制剂耐药株；HIV-1K103N、HIV-1Y181，HIV-1逆转录酶单点突变株。
实施例七 化合物1b、1c和1r体外抗HIV临床分离株活性实验
本申请公开化合物1b、1c和1r经中国科学院昆明动物研究所进行体外抗HIV-1临床分离株活性试验。具体实验方法和结果如下所述：
96孔板内，对化合物1b从最大浓度400μM做5倍梯度稀释，100μl/孔，共6个稀释度，每个稀释度设3个重复孔。
收集PHA-P和IL-2共刺激转化72h的PBMC，用含有IL-2(终浓度为50U/ml)的RPMI-1640完全细胞培养基重悬细胞，台盼蓝染色法计数存活率>98％。调细胞浓度为5×106个/ml，吸取所需细胞与HIV-1临床分离株(MOI＝0.05)，加入1μg/ml的Polybrene，37℃、5％CO2感染4h。PBS洗细胞3次去除游离的病毒，用含有IL-2(终浓度为50U/ml)的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，调细胞数至5×106个/ml。
将上述细胞加到含有化合物1b的96孔板中，100μl/孔，设置不含化合物b的阳性对照孔和不含细胞的空白对照孔。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
第4d按100μl/孔补加含有相应浓度化合物1b和IL-2的新鲜细胞培养基，第7d收集培养上清，0.5％Triton-X 100裂解活。采用捕捉HIV-1p24抗原ELISA方法检测化合物1b对HIV-1复制的抑制作用，计算EC50。
按上述步骤将所用化合物1b替换为1c和1r重复试验，所得具体数据见下表。
表7.化合物1b、1c和1r体外抗HIV-1临床分离株活性结果
Figure BDA0002445992930000202
实施例八 化合物1b、1c和1r对重组HIV-1逆转录酶(Reverse Transcriptase,RT)活性的抑制作用实验。
本申请中公开的化合物1b、1c和1r经中国科学院昆明动物研究所进行对重组逆转录酶活性的抑制实验。具体实验方法和结果如下所述：
1.对RT以DNA为模板的DNA聚合酶活性的抑制实验
用hybrid DNA(80nM)稀释重组逆转录酶至适宜的浓度，冰上操作；黑色的96孔板内稀释样品，从最大浓度400μM做5倍梯度稀释，共6个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，100μl/孔；每孔加入50μl(浓度100ng/ml)的HIV-1RT，混匀，室温孵育15min；每孔加入50μldXTP(0.4μM)，混匀；用FLEX Station 3酶标仪读取每孔的荧光值，Ex＝485nm，Em＝530nm，cutoff＝515nm，计算IC50。
2.对RT以RNA为模板的DNA聚合酶活性的抑制实验
本实验采用Roche公司的Reverse Transcriptase Assay,colorimetric试剂盒(cat No.11468120910)，将待测样品用裂解液稀释到终浓度的3倍，再将HIV-1RT用裂解液稀释到100ng/ml(RT工作液)。
96孔板内从最大浓度600μM做5倍梯度稀释，共6个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，20μl/孔，分别加入RT工作液20μl/孔，反应混合液3a(该试剂盒的组分名称)20μl/孔，设置未添加化合物1b的阳性对照、不含RT工作液的阴性对照和空白对照，混匀后在37℃下孵育1h后，转移至试剂盒的酶标板中，37℃下继续孵育1h。
倾尽孔内液体后，250μl/孔洗液洗板5次，1min/次；加入偶联稀释液100X稀释抗-地高辛-过氧化物酶(anti-DIG-POD)，200μl/孔，37℃孵育1h后再洗板5次，然后加入底物反应液200μl/孔，室温反应15-30min，酶标仪读板，波长OD405/490，计算IC50。
按上述步骤将所用化合物1b替换为1c和1r重复试验，所得具体数据见下表。
表8.化合物1b、1c和1r对重组逆转录酶活性的抑制作用结果
Figure BDA0002445992930000211
结论：
由实施例二～六可知，本申请提供的该类化合物具有显著的抗HIV活性，且细胞毒较小。化合物1a～1w样品均显示出一定的体外抗HIV-1活性。
结果表明，除化合物1g(EC50＝12.95μm)外，大多数化合物对WT HIV-1具有显著的抗性，EC50的值在0.06-4.53μm范围内。表现最好的化合物1b活性为0.06μm，与NVP(EC50＝0.04μm)相当。
化合物1a～1w中大多数化合物都表现出较低的细胞毒性，CC50值均大于200μm。
化合物1b(EC50＝0.06μm,SI＝1660.63)，1c(EC50＝0.16μm,SI＝749.28)和1r(EC50＝0.16μm,SI>1219.51)对PBMC的毒性较小，对蛋白酶抑制剂耐药株、融合抑制剂耐药株、核苷类逆转录酶抑制剂耐药株复制均有很好的抑制作用，对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药株(包括单点突变株)抑制作用较弱，但对临床分离病毒株均有很好的抑制作用。
化合物1r仅针对HIV病毒由负链DNA合成正链DNA的过程进行抑制，填补了现有技术的空白。该类化合物展现出了良好的开发前景。
在本说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”、“优选实施例”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本申请的范围内。
尽管这里参照本申请的多个解释性实施例对本申请进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (10)

1.一种6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物，其特征在于，具有结构通式如式I：
Figure FDA0002445992920000011
其中，n＝0或1；R1选自C1～C3的烷基；
R2选自烯丙基、具有式(1)所示结构式的基团或具有式(2)所示结构式的基团中任意一种；
Figure FDA0002445992920000012
其中，X选自氢、卤素、羟基或含有芳环的酯基的基团中任意一种；
Figure FDA0002445992920000013
其中，Ar1选自单取代苯环基、单取代吡啶环基、单取代噻吩环基、单取代恶唑环基、多取代苯环基、多取代吡啶环基、多取代噻吩环基或多取代恶唑环基中任意一种。
2.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，所述含有芳环的酯基中的芳环选自苯、吡啶、噻吩或恶唑中任意一种；
更优选地，所述含有芳环的酯基中的芳环为苯环；
优选地，所述Ar1为单取代苯环；
优选地，所述Ar1上的取代基选自氢、羟基、卤素、甲基或甲氧基中任意一种。
3.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，结构通式如式1b：
Figure FDA0002445992920000021
4.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，结构通式如式1c：
Figure FDA0002445992920000022
5.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，结构通式如式1r：
Figure FDA0002445992920000023
6.一种6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
在碱性环境中，含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶的原料与含溴代侧链的化合物发生烃基化反应，得到所述6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述含溴代侧链的化合物选自溴代烯丙基、具有式(3)所示结构式的基团或具有式(4)所示结构式的基团中任意一种，
Figure FDA0002445992920000031
其中，Ar2选自苯、吡啶、噻吩、恶唑中任意一种，R3选自氢、羟基、卤素、甲基或甲氧基中任一种；
Figure FDA0002445992920000032
其中，R4选自氢、F、Cl、Br、羟基或含有芳环的酯基中任意一种；Ar3选自苯基、吡啶基、噻吩基、恶唑基中任意一种；
优选地，所述原料与所述含溴代侧链的化合物按摩尔比为1:1～2发生所述反应；
优选地，所述Ar3和/或Ar2为苯环；
优选地，所述碱性环境为碱性溶剂，所述碱性溶剂为吡啶、DMF或甲苯中任一种；
优选地，所述烃基化反应的反应温度为20～85℃范围内，反应时间为2～12小时。
8.一种如权利要求6～7中任一项所述合成方法中所用含6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-硫尿嘧啶的原料，其特征在于，含有如式(16)结构通式的化合物：
Figure FDA0002445992920000033
优选地，所述如式(16)结构通式的化合物的制备方法，包括以下步骤：步骤a)：向胡椒酸和乙腈的混合物中缓慢加入羰基二咪唑，在20～30℃温度范围内搅拌下发生取代反应，反应时间在1～2小时范围内，得到第一反应液；
向乙基单钾盐和乙腈的混合物中依序缓慢加入三乙胺和无水MgCl2，在20～30℃温度范围内搅拌下反应，反应时间在1～2小时范围内，缓慢加入第一反应液并在80～90℃温度范围内回流搅拌条件下，发生缩合反应，反应时间在10～15h范围内，分离后得到β-酮酯；
步骤b)：将金属Na溶解于无水乙醇中，加入硫脲搅拌至溶解后，缓慢滴加β-酮酯，在80～90℃温度范围内加热回流8h，发生缩合反应，TLC跟踪原料点消失后停止反应，分离后得到结构式如式(16)所示的6-(1,3-苯并二氧基-5-基)-2-巯基-5-乙基-3H-嘧啶-4-酮)；
优选地，所述胡椒酸和乙腈按摩尔：体积比为1:2000～4000范围内混合；
优选地，所述乙基单钾盐和乙腈按摩尔：体积比为1:3000～5000范围内混合。
9.一种6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物在制备抗HIV药物中的应用，其特征在于，所述衍生物为权利要求1至6任一项所述的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物、根据权利要求7至8中任一项所述的方法制备得到的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物中的至少一种。
10.一种具有抗HIV活性的药物，其特征在于，包含：权利要求1至6任一项所述的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物、根据权利要求7至8中任一项所述的方法制备得到的6-(1,3-苯并二氧基-5-(甲)基)-取代尿嘧啶衍生物中的至少一种。
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