CN111297790A - 茶叶外囊泡的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于提取物技术领域，尤其涉及茶叶外囊泡的应用。本发明提供了茶叶外囊泡在化妆品或药品中的应用，实验结果表明，采用茶叶外囊泡应用于化妆品或药品中，使得化妆品或药品能够改善皮肤水分和油分，调节皮肤水油平衡，具有保湿、美白、抗氧化、晒后修复等多重功效，并且效果显著、刺激性小。

Description

茶叶外囊泡的应用

技术领域

本发明属于提取物技术领域，尤其涉及茶叶外囊泡的应用。

背景技术

茶叶的成分复杂，含有茶多酚、嘌呤喊类、氨基酸、蛋白质、维生素类、矿物质元素、茶皂素等成分，上述成分具有营养、护肤和洁肤的功效，是各类日用品常用的功能性添加剂。但采用常规提取分离方法对茶叶进行提取物的提取分离，获取的成分比较单一，例如文献中可见单一提取茶叶中的茶多糖用于清除细胞内的自由基，儿茶素促进水分吸收而保湿，但基本都是单一指标，护肤作用有限，不能兼顾保湿、美白、抗氧化、修复等多重作用。

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等，主要由微囊泡(Microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes,Exs)组成，微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm到1000nm；外泌体由细胞内的多泡小体(multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm到100nm。细胞外囊泡最初被认为是细胞碎片，但EVs现在越来越被认为是细胞间通讯的重要载体。细胞外囊泡广泛、稳定地存在于机体中，是细胞进行物质运输、信号转导、实现生理功能的重要工具。

然而，细胞外囊泡的应用价值还有待于开发。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了茶叶外囊泡的应用，茶叶外囊泡应用于化妆品或药品中，使得化妆品或药品能够调节皮肤水油平衡，具有保湿、抗氧化、晒后修复等功效。

本发明的具体技术方案如下：

茶叶外囊泡在化妆品或药品中的应用。

随着人们生活水平的提高，对美容护肤的要求越来越高，天然草本护肤的理念得到越来越多的关注和认可，天然植物类产品已经成为最受欢迎的护肤品。茶叶在我国有几千年的应用历史，其应用于美容护肤及治疗皮肤疾病的历史也很悠久。本发明中，茶叶外囊泡携带有细胞来源的各种生物分子，包括各种蛋白质、脂类、矿物质、维生素、DNA、mRNA等，实验结果表明，采用茶叶外囊泡应用于化妆品或药品中，使得化妆品或药品能够调节皮肤水油平衡，具有保湿、美白、抗氧化、晒后修复等多重功效，并且效果显著、刺激性小。

优选的，所述茶叶外囊泡由茶叶提取得到；

所述茶叶外囊泡的粒径为30nm～120nm。

本发明中，茶叶为茶树的新鲜叶片，茶树为山茶科、山茶属灌木或小乔木Camelliasinensis(L.)O.Ktze.。茶叶可为各类绿茶、红茶、黑茶、白茶、黄茶、乌龙茶的原植物新鲜叶片。

优选的，所述茶叶外囊泡的提取方法包括以下步骤：

a)对茶叶进行提取得到茶叶原液，再进行离心，收集上清液；

b)对所述上清液进行离心，收集沉淀，得到茶叶外囊泡粗提物；

c)将所述茶叶外囊泡粗提物进行纯化和纳米级均质处理，得到所述茶叶外囊泡。

优选的，步骤a)所述离心的速度为1000rpm～3000rpm，时间为50min～90min；

步骤b)所述离心的速度为20000rpm～25000rpm，时间为3h～5h。

优选的，步骤a)所述提取的提取试剂为囊泡隔离缓冲液；

所述茶叶与所述提取试剂的质量体积比为(10～100)g：(30～400)mL。

优选的，步骤c)所述纯化具体为：

对所述茶叶外囊泡粗提物采用梯度浓度的Percoll水溶液进行离心，收集沉淀。

本发明中，步骤c)纳米级均质处理具体为：采用高剪切乳化分散器进行均质化处理，获得颗粒均匀分布的茶叶外囊泡。

优选的，步骤a)之后，步骤b)之前，还包括：对所述上清液进行浓缩。

更具体的，茶叶外囊泡的提取方法包括以下步骤：

1)将茶叶放入搅拌机中，加入囊泡隔离缓冲液进行榨取，得到茶叶原液，将茶叶原液以1000rpm～2000rpm转速离心20min～40min，弃去沉淀后收集得到第一上清液；

2)将第一上清液以6000rpm～8000rpm转速离心60min～100min，弃去沉淀后，得到第二上清液；

3)将第二上清液以20000rpm～25000rpm转速离心3h～5h，收集沉淀，采用PBS重悬沉淀得到茶叶外囊泡粗提物；

4)将茶叶外囊泡粗提物置于离心管中，向离心管中依次加入浓度为15wt％～30wt％、30wt％～45wt％和30wt％～60wt％的Percoll水溶液(倾斜45度缓慢加入，可见明显分层)，将茶叶外囊泡置于顶层，再在4℃下80000～120,000×g离心2h～5h，收集沉淀，再采用高剪切乳化分散器进行均质化处理，通过Zeta电位及激光粒度分析仪检测粒径，确定提取物为茶叶外囊泡。茶叶外囊泡可用不同体积生理盐水重悬可以得到不同浓度的茶叶外囊泡，不同浓度的茶叶外囊泡用于不同剂型。

本发明中，通过榨汁获取茶叶原液后，还可用差速离心的方法逐渐把大颗粒分离，直到提取分离出茶叶外囊泡粗提物。Percoll水溶液可以形成不一样的密度梯度，对茶叶外囊泡粗提物采用梯度Percoll水溶液，可通过离心力的作用分离不同分子量的物质，进而纯化茶叶纳米囊泡。

本发明茶叶外囊泡的提取方法具有简单、高效、易行、纯度高等优点。

需要说明的是，本发明茶叶外囊泡的提取不限于本发明提供的茶叶外囊泡的提取方法，可根据需要进行确定。

本发明还提供一种具有保湿、抗衰老和/或晒后修复功效的化妆品，包括茶叶外囊泡。

优选的，所述茶叶外囊泡在所述化妆品的质量分数为2％～10％。

优选的，所述化妆品选自洁面乳、化妆水、乳液、精华、面膜、面霜、洗发液或沐浴乳。

综上所述，本发明提供了茶叶外囊泡在化妆品或药品中的应用，实验结果表明，采用茶叶外囊泡应用于化妆品或药品中，使得化妆品或药品能够改善皮肤水分和油分，调节皮肤水油平衡，具有保湿、美白、抗氧化、晒后修复等多重功效，并且效果显著、刺激性小。

具体实施方式

本发明提供了茶叶外囊泡的应用，茶叶外囊泡应用于化妆品或药品中，使得化妆品或药品能够调节皮肤水油平衡，具有保湿、抗氧化、晒后修复等功效。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

具体实施例中，茶叶采自华南农业大学茶园，品种为Camellia sinensis(L.)O.Ktze.。

囊泡隔离缓冲液(VIB)的配置：配置1L，在蒸馏水中加入20mM MES(吗啡啉乙磺酸)水合物(4.264g)、2mM氯化钙(0.222g)和0.1M氯化钠(5.850g)后，加入氢氧化钠调整pH值为6，并在121℃高压20min，配置得到囊泡隔离缓冲液。

Percoll溶液的配置：采用HBSS稀释100％Percoll，配置得到梯度浓度分别为33wt％、65wt％、80wt％和95wt％的Percoll溶液。

实施例1

取20g新鲜茶叶放入搅拌机中，加入80mL囊泡隔离缓冲液进行榨取，得到茶叶原液；将收集的茶叶原液以1000rpm转速离心30min，弃去沉淀后收集第一上清液，再以7000rpm转速离心55min，弃去沉淀后收集第二上清液；将第二上清液以20000rpm转速离心180min，收集沉淀，采用PBS重悬沉淀得到茶叶外囊泡粗提物；将茶叶外囊泡粗提物依次采用浓度为95wt％、80wt％、65wt％和33wt％的Percoll水溶液在4℃下125000g离心1.5h，收集有明显条带的沉淀，用不同体积生理盐水重悬得到不同浓度的茶叶外囊泡，后续根据不同剂型采用不同浓度的茶叶外囊泡。其中，外囊泡粒径通过Zeta电位及激光粒度分析仪确定。

取300g水相基质与200g油相基质，将其同时放入98℃水浴锅中加热搅拌至溶解或熔化，待水相基质和油相基质同时达到80℃时，取出，将油相基质缓缓加入至水相基质中，边加入边剧烈搅拌，待乳化完全后转慢搅拌慢降温，加入香精，加入5wt％茶叶外囊泡液体50mL，冷却至室温即得乳膏剂。其中，水相基质通过丙二醇100g、十二烷基硫酸钠10g、β-环糊精12.5g和苯甲酸7.5g加水至500g后混合得到，油相基质为凡士林175g和液体石蜡25g。

实施例2

将卡波姆940用蒸馏水预先溶解，然后加入甘油，在45℃水浴中加热搅拌直至甘油完全溶解得到A相，将B相水浴加热至80℃溶解，搅拌条件下将A相加入B相并搅拌45min以上；自然冷却至45℃后，加入C相水浴恒温(45℃)搅拌25min，加入D相继续搅拌至室温，成霜体得到茶叶外囊泡保湿霜，装瓶密封保存。其中，茶叶外囊泡面霜的成分如表1所示。

表1实施例2茶叶外囊泡保湿霜的成分

实施例3

本实施例对实施例2茶叶外囊泡保湿霜进行短效测试和长效测试。

短效测试：10名20-25岁女性志愿者洁面后，使用实施例2茶叶外囊泡面霜15min，分别于使用前，使用后1h，4h，测试皮肤含水量(皮肤角质层含水量)，在试验期间，不涂抹任何化妆品。

长效测试：女性志愿者每天晚上洁面后，厚敷实施例2茶叶外囊泡保湿霜15min，按摩吸收后无需洁面和涂抹其他任何化妆品,连续8周；在使用前、使用1周、4周时各随访1次，共计3次，要求受试者每次随访为日间同一时间。

仪器测量方法：1.皮肤角质层含水量测量(皮肤含水量)：使用水分测试仪测量左脸颊部位角质层含水量，测量4次取平均值；2.面部皮肤经皮水分流失(TEWL值)测量：使用皮肤水分流失仪，测量左面部经皮水分流失，测量2次取平均值；3.面部成像：采用VISIA面部图像分析系统对受试者面部进行拍照(正面左、右侧45°方向)，提取皱纹分值，取平均值。统计学分析：采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。统计分析前对各参数进行正态分布和方差齐性检验。采用重复测量的方差分析，显著性水平为95％的置信区间。

结果请参阅表2，结果表明使用茶叶外囊泡保湿霜前皮肤含水平均值为30左右，使用1h后即可见皮肤含水值显著上升(P＜0.01)，使用4h后略有降低但仍有显著性差异(P＜0.01)；坚持使用一段时间后皮肤含水量保湿良好；同时面部皮肤经皮水分流失减少(P＜0.01)，皱纹分值减少(P＜0.01)。

表2受试者使用实施例2茶叶外囊泡面霜前后的测试结果

*与使用前比p＜0.05；**与使用前比p＜0.01。

实施例4

本实施例检测对小鼠皮肤UVB损伤的修复作用

健康昆明种小鼠18只，雌雄各半，体重18g-22g。小鼠在7天适应性培养后，随机分3组，每组6只，分别为空白组、模型组和样品组。小鼠用剃须刀剃长毛，2％的硫化钠脱毛，得到3cm×3cm剃毛区。自制紫外辐射装置，灯管距离地面20cm，空白组不进行照射，其余组每天照射2h UVB(灯管辐照剂量0.9W/m²)，模型组照射后涂抹对应溶剂(蒸馏水)，样品组照射后涂抹实施例2保湿霜，每只均匀涂抹0.5g。实验周期28天，最后一天照射结束后，观察实验区域皮肤，处死小鼠并取背部皮肤进行后续实验。采用试剂盒检测皮肤匀浆检测氧化指标SOD、MDA和GSH-Px水平。

UVB对皮肤照射造成的氧化损伤不仅仅直接破坏皮肤正常结构，导致角质增生，还会诱导一系列的炎症反应，导致皮肤红肿瘙痒等症状。实验中空白组小鼠背部皮肤红润光滑，表皮细嫩，没有皮屑脱落；模型组小鼠背部皮肤泛红，有红斑出现，表皮粗糙有皮屑脱落，同时皮纹加深且有皮肤皱纹出现；使用样品乳霜后小鼠背部皮肤略显红斑，表皮比较平滑没有皮屑脱落，没有出现皮纹加深与皱纹现象。如表3所示，在UVB诱导下，模型组皮肤内MDA含量显著增加(P＜0.01)，SOD与GSH-Px活力显著下降(P＜0.01)，样品组皮肤内MDA含量降低(P＜0.01)，SOD与GSH-Px活力上升(P＜0.01)。病理学检查结果表明，样品组与模型组比较表皮增厚程度减小，表皮及真皮水肿明显减轻，淋巴细胞浸润明显减少，真皮血管扩张充血现象缓解，炎性细胞浸润减少。

表3小鼠实验结果

	SOD	MDA	GSH-Px
				正常组	180.98±1.72	6.65±0.23	1242.7±29.66
模型组	155.40±3.24##	8.81±0.17##	965.18±11.46##
				样品组	174.28±4.25**	7.35±0.20**	1053.78±30.76**

##与正常组比p＜0.01；**与模型组比p＜0.01；

本发明所使用的创新性茶叶外囊泡提取纯化方法，具有简单、高效、易行、纯度高等优点，在美容护肤领域的应用方法有着效果显著、刺激性小等优点，保证了产品的规模应用的可能性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.茶叶外囊泡在化妆品或药品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述茶叶外囊泡由茶叶提取得到；

所述茶叶外囊泡的粒径为30nm～120nm。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述茶叶外囊泡的提取方法包括以下步骤：

a)对茶叶进行提取得到茶叶原液，再进行离心，收集上清液；

b)对所述上清液进行离心，收集沉淀，得到茶叶外囊泡粗提物；

c)将所述茶叶外囊泡粗提物进行纯化和纳米级均质处理，得到所述茶叶外囊泡。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤a)所述离心的速度为1000rpm～3000rpm，时间为50min～90min；

步骤b)所述离心的速度为20000rpm～25000rpm，时间为3h～5h。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤a)所述提取的提取试剂为囊泡隔离缓冲液；

所述茶叶与所述提取试剂的质量体积比为(10～100)g：(30～400)mL。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤c)所述纯化具体为：

对所述茶叶外囊泡粗提物采用梯度浓度的Percoll水溶液进行离心，收集沉淀。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤a)之后，步骤b)之前，还包括：对所述上清液进行浓缩。

8.一种具有保湿、抗衰老和/或晒后修复功效的化妆品，其特征在于，包括茶叶外囊泡。

9.根据权利要求8所述的化妆品，其特征在于，所述茶叶外囊泡在所述化妆品的质量分数为2％～10％。

10.根据权利要求8所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品选自洁面乳、化妆水、乳液、精华、面膜、面霜、洗发液或沐浴乳。