CN111285911A - Gem-1mt两亲小分子化合物及其制剂、制备方法和应用 - Google Patents

Gem-1mt两亲小分子化合物及其制剂、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种GEM‑1MT两亲性小分子化合物及其制剂、制备方法和应用，GEM‑1MT两亲性小分子化合物具有式(I)所示化学结构：
Figure DDA0002392812040000011
本发明不仅解决了1MT效力不足、水溶性差、疏水性强、靶向性差，以及GEM耐药、稳定性差、毒性大、药物载体内递送困难的缺点，而且通过GEM与1MT协同治疗，能够重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤效果。

Description

GEM-1MT两亲小分子化合物及其制剂、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及GEM-1MT两亲小分子化合物及其制剂、制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能有着密切的关系。通过免疫监视，机体能够针对肿瘤细胞产生有效的免疫应答，从而清除肿瘤细胞。但是肿瘤细胞可通过多种途径诱导机体产生对自身的免疫耐受，导致肿瘤细胞的免疫逃逸。吲哚胺-2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)是一种细胞内含亚铁血红素的酶，是肝以外唯一可催化色氨酸分子沿犬尿酸途径分解代谢的关键限速酶。IDO分解肿瘤位点和肿瘤引流淋巴结中的色氨酸，使T细胞停滞于细胞周期中的G0期，从而无法增殖并抑制其免疫应答反应。
1-甲基色氨酸(1-methyltryptophan，1MT，CAS号：26988-72-7)作为IDO的特异性抑制剂，它可以通过阻断色氨酸的代谢从而逆转IDO介导的免疫逃逸。发明人发现，由于1-甲基色氨酸具有效力不足、水溶性差、靶向性差的缺点，以及有研究表明单独给予1MT治疗并不能有效抑制肿瘤的生长，因此其临床应用受到阻碍，需要联合用药。
吉西他滨(Gemcitabine，GEM，CAS号：95058-81-4)作为一种临床上化疗广泛用药，是一种具有广谱抗肿瘤活性的核苷酸类似物，包括胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等。发明人发现，由于吉西他滨的亲水性太强无法被动地穿过质膜，因此其细胞内化强烈依赖于核苷转运蛋白hENT1，从而导致耐药性，此外，吉西他滨在血液循环中稳定性较差，并且具有较大的毒性。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种GEM-1MT两亲小分子化合物及其制剂、制备方法与应用，本发明不仅解决了1MT效力不足、水溶性差、疏水性强、靶向性差，以及GEM耐药、稳定性差、毒性大、药物体内递送困难的缺点，而且以GEM-1MT的形式使GEM与1MT协同治疗，能够重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤效果。
具体地，本发明具有如下所述的技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种GEM-1MT两亲性小分子化合物，其具有式(I)所示化学结构：
Figure BDA0002392812020000021
吉西他滨进入体内后在脱氧胞嘧啶激酶活化下，5’-OH发生磷酸化形成吉西他滨磷酸盐(dFdCMP)、吉西他滨二磷酸盐(dFdCDP)和吉西他滨三磷酸盐(dFdCTP)，其中dFdCDP和dFdCTP为活性物质，可以抑制DNA合成，最终导致细胞凋亡。本发明的GEM-1MT两亲性小分子化合物中，吉西他滨部分的5’-OH以1-甲基色氨酸(1MT)进行修饰，以化学的方法阻断了其上述毒性(毒副作用)，并且极好的提高了在血液循环中的生理稳定性。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备式(I)所示GEM-1MT两亲性小分子化合物的方法，其包括：以吉西他滨(GEM)和1-甲基色氨酸(1MT)为原料，首先用Boc(叔丁氧羰基)保护吉西他滨的3’-OH和4-NH2得到4-N-3’-O-bis(Boc)GEM，如化合物1所示，以及用Boc保护1MT的NH2得到Boc-1MT，如化合物2所示，化合物1和化合物2进行反应得到Boc保护的GEM-1MT，如化合物3所示，最后进行脱保护，得到式(I)化合物；
Figure BDA0002392812020000031
在本发明的实施方式中，化合物1和化合物2进行反应的过程包括：采用NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和EDC(1,2-二氯乙烷)活化Boc-1MT的羧基，再与4-N-3’-O-bis(Boc)GEM及DMAP(4-二甲氨基吡啶)混合后，在惰性气体氛围下，常温反应生成Boc保护的GEM-1MT。
本发明所涉及的反应路线如下式所示：
Figure BDA0002392812020000032
在本发明的一些实施方式中，化合物1和化合物2进行反应的过程包括：将NHS溶液和EDC溶液滴加至Boc-1MT溶液中，在惰性气体氛围下，常温反应6-15h，优选12h；再将4-N-3’-O-bis(Boc)GEM溶液以及DMAP溶液加入上述已反应溶液中，在惰性气体氛围下，常温反应10-48h，优选48h。
在一些实施方式中，Boc-1MT以无水二氯甲烷为溶剂；NHS溶液以无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂；EDC溶液以乙醇为溶剂；4-N-3’-O-bis(Boc)GEM以无水二氯甲烷为溶剂；DMAP溶液以无水二氯甲烷为溶剂。
在本发明的实施方式中，Boc-1MT、NHS与EDC的摩尔比为1：1～2：1～2，优选为1:2:2。
在本发明的实施方式中，Boc-1MT、4-N-3’-O-bis(Boc)GEM与DMAP的摩尔比为1：1～2：1～2，优选为1:1.5:1.5。
在本发明的一些实施方式中，化合物1和化合物2进行反应得到Boc保护的GEM-1MT后还包括提纯的步骤；在一些实施方式中，所述提纯操作包括：反应完成后去除溶剂获得Boc保护的GEM-1MT的粗产品，采用无水二氯甲烷将该粗产品溶解后进行硅胶柱色谱提纯，提纯过程采用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱；在一些实施方式中，所述洗脱程序为石油醚和乙酸乙酯按以下体积进行洗脱：50:1→40:1→30:1→25:1→20:1→15:1→12:1→10:1，当比例变为10:1时，产物被洗脱出来。本领域技术人员可据此进行调整，调整的操作是本领域技术人员能够掌握的技能。
在本发明的实施方式中，所述脱保护的步骤包括：将Boc保护的GEM-1MT加入到盐酸/乙酸乙酯的饱和溶液中，在惰性气体氛围下，常温反应生成GEM-1MT。
本发明所涉及的反应路线如下式所示：
Figure BDA0002392812020000041
在一些实施方式中，在脱保护步骤中，Boc保护的GEM-1MT与盐酸/乙酸乙酯饱和溶液的摩尔体积比为0.08mmol：30～35mL，优选为0.08mmol：30mL。
在一些实施方式中，在脱保护步骤中，常温下反应时间为12-36h，优选为36h。
在一些实施方式中，在脱保护步骤中，常温下反应结束后，去除乙酸乙酯，采用无水乙醚洗涤，然后进行真空干燥。
在本发明的第三方面，本发明还提供了一种纳米制剂，其包含上述第一方面中所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物和/或包含由上述第一方面中所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物聚集得到的纳米粒(GEM-1MT NPs)。
在本发明的实施方式中，本发明所述纳米制剂中的纳米粒的粒径约为80-100nm，粒径均匀。
本发明所述的纳米制剂由GEM-1MT两亲小分子化合物自组装(自发共聚形成或自发聚集)形成，具有EPR效应，具有靶向性，能够在肿瘤部位蓄积滞留，不仅解决了1MT疏水性强、GEM耐药，药物体内递送困难的缺点，还可以在肿瘤细胞内通过GEM与1MT协同治疗，重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤效果。并且，本发明的纳米制剂能够以细胞内吞的方式进入肿瘤细胞，增加细胞内化效率，进而增强对肿瘤细胞的毒性作用，具有较好的抗肿瘤作用。
在本发明的第四方面，本发明还提供了制备上述第三方面中所述的纳米制剂的方法，其包括将上述第一方面中所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物溶液逐滴滴加至水中，自发形成纳米聚集体。
在本发明的实施方式中，所述GEM-1MT两亲性小分子化合物溶液以甲醇为溶剂；在一些实施方式中，在超声条件下逐滴加入GEM-1MT两亲性小分子化合物；在超声条件下GEM-1MT两亲性小分子化合物自发聚集形成纳米粒；在一些实施方式中，该方法还包括除去溶剂的操作，除去溶剂可采用本领域的常规操作方式，但本发明中较为优选的方式为旋转蒸发法，温度条件为28～32℃，优选为30℃。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种药物载体或药物递送系统，其含有上述第一方面中所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物或者上述第三方面中所述的纳米制剂。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有上述第一方面中所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物或者上述第三方面中所述的纳米制剂或者上述第五方面中所述的药物载体。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种药物制剂，含有上述第一方面中所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物或者上述第三方面中所述的纳米制剂或者上述第五方面中所述的药物载体；可选地含有至少一种药学上可接受的辅料。
所述药物制剂可以为液体制剂或者固体制剂，比如注射剂、冻干粉针剂等等，本领域技术人员可根据需要选择适宜的辅料。尤其，本发明所述的纳米制剂中的纳米粒粒径小于200nm，适合作为静脉注射，并且可以通过EPR效应蓄积于肿瘤部位。所述EPR效应即高渗透长滞留效应，是英文名称enhanced permeability and retention effect的缩写，是指一些特定大小的物质(如脂质体、纳米颗粒以及一些大分子药物)更容易渗透进入肿瘤组织并长期滞留(和正常组织相比)的现象。
在本发明的第八方面，本发明提供了上述第一方面中所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物或者上述第三方面中所述的纳米制剂或者上述第五方面中所述的药物载体或者上述第六方面所述的药物组合物或者上述第七方面中所述地药物制剂在制备抗癌或抗肿瘤药物中的应用。
在本发明的实施方式中，所述癌或肿瘤包括胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、黑色素细胞瘤等等。
在本发明的实施方式中，本发明所述的纳米制剂相较于原料GEM或者1MT以及GEM和1MT的混合物在多种浓度(0.1-100μM)下对黑色素瘤细胞的体外抑制实验中，均具有更高的细胞抑制率，因为本发明的纳米制剂可以以细胞内吞的方式进入细胞，具有更高的细胞内化效率，增强细胞毒性。
以及，在本发明的实施方式中，本发明的纳米制剂相较于IDO的特异性抑制剂1MT而言，在不同浓度下(20-100μM)对黑色素瘤细胞的IDO酶的抑制率实验中，表现出更为优异的活性。
以及，在本发明的实施方式中，在对黑色素瘤实体瘤的抑制实验中，本发明的纳米制剂相较于1MT组、GEM组以及GEM+1MT组(GEM与1MT的混合)肿瘤生长更为缓慢，具有更好的抗肿瘤效果。
相较于现有技术，本发明的有益效果包括：
(1)本发明首次合成新型GEM-1MT两亲小分子化合物，能够自组装形成纳米粒作为靶向制剂。该靶向制剂不仅解决了1MT疏水性强、GEM耐药，药物体内递送困难的缺点，还可以通过GEM与1MT协同治疗，重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤效果。
(2)本发明制得的纳米制剂形态均匀，粒径小于200nm，适合静脉注射，可以通过EPR效应蓄积于肿瘤部位。
(3)本发明通过体外细胞实验表明GEM-1MT NPs制剂对黑色素瘤细胞(B16F10)显示较强的细胞毒性，表明该制剂细胞内化效果好，提高化疗效果。
(4)本发明通过体外细胞实验表明GEM-1MT NPs制剂对黑色素瘤细胞(B16F10)的IDO抑制效果较强，提高免疫治疗效果。
(5)本发明体内抗肿瘤实验表明GEM-1MT NPs制剂具有强大的抑瘤效果。
(6)本发明的GEM-1MT NPs制剂具有缓释作用，通过EPR效应蓄积于肿瘤部位，并通过细胞内吞作用进入肿瘤细胞，缓慢释放GEM和1MT，在肿瘤细胞内的作用时间更为持久，可以避免多次分开给药，减轻患者的耐受性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明实施例2的Boc保护的GEM-1MT及GEM-1MT的核磁图谱。
图2为本发明实施例4的GEM-1MT NPs体外细胞毒性24h和48h的实验表征图。
图3为本发明实施例4的GEM-1MT NPs体外细胞IDO酶抑制实验表征图。
图4为本发明实施例5的GEM-1MT NPs的体内抗肿瘤效应表征图；上图为瘤体积的变化曲线，下图为肿瘤重量和肿瘤抑制率的表征图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1GEM-1MT的合成
分析天平精密称取一定量的Boc-1MT，溶于无水二氯甲烷中，并置于圆底烧瓶中。称取一定量的NHS和EDC，溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和乙醇的混合溶剂中，加入正在搅拌的上述Boc-1MT的溶液中，氮气保护、常温条件下反应12小时。其中Boc-1MT：NHS：EDC的物质的之比为1:2:2。12h后，分析天平精密称量一定量的4-N-3’-O-bis(Boc)GEM和DMAP，溶于无水二氯甲烷中，滴加到上述反应完的混合溶液中，继续常温反应48h。反应结束后，减压旋蒸除去无水DMF、二氯甲烷及乙醇，真空干燥过夜，得到粗产物。将粗产物溶于二氯甲烷中，少许柱层层析硅胶拌样，硅胶柱色谱提纯，石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱程序为50:1→40:1→30:1→25:1→20:1→15:1→12:1→10:1，当比例变为10:1时，产物被洗脱出来，得到Boc保护的GEM-1MT纯品为浅黄色固体，产率为35％。
GEM-1MT的合成
分析天平精密称取Boc保护的GEM-1MT，直接溶解于盐酸/乙酸乙酯的饱和溶液中，Boc保护的GEM-1MT与盐酸/乙酸乙酯饱和溶液的摩尔体积比为0.08mmol：30mL，常温避光反应36h。反应结束后，过滤获得粗产品，然后用无水乙醚洗涤，真空干燥得到GEM-1MT浅黄色固体，产率为80％。
实施例2核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定Boc保护的GEM-1MT及GEM-1MT的化学结构
称取按实施例1的方法制备的Boc保护的GEM-1MT及GEM-1MT各约5mg，分别用氘代氯仿(DMSO-d6)和氘代水(D2O)溶解并置于核磁管内，采用400MHz核磁共振氢谱仪测定其核磁共振氢谱，记录化合物的化学位移值(ppm)。结果如图1所示，核磁结果可以证实，新合成的分子中出现了原料分子GEM和1MT的峰，证实Boc保护的GEM-1MT及GEM-1MT的成功合成。
实施例3GEM-1MT NPs的制备
精密称取按实施例1的方法制备的GEM-1MT约10mg，溶于200μL甲醇中。然后在超声条件下，逐滴滴加入1mL水中。混合物继续超声半小时，纳米聚集体自发形成。最后在真空下使用旋转蒸发仪在30℃的条件下将甲醇完全蒸发，得到GEM-1MT NPs，其粒径大小均一，约为95±5nm，适合用于静脉注射。
实施例4GEM-1MT NPs制剂体外细胞毒性实验
1、细胞的培养
选取B16F10细胞(小鼠黑色素瘤细胞)作为研究对象。取冻存细胞，用培养基于37℃、5％CO2条件下培养，待细胞生长至高密度时传代，按比例转移至培养瓶中继续培养并进行细胞计数。
2、细胞毒性实验
收集对数生长期的B16F10细胞，比较游离药物与纳米粒的细胞毒性。用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞并将其制成单细胞悬液后，按照每孔8000个细胞的数量将其接种到96孔板中培养过夜。待细胞贴壁后，加入用培养基稀释的一系列不同浓度的GEM·HCl(表示为GEM)，1MT，GEM·HCl与1MT混合物(表示为GEM+1MT)，GEM-1MT纳米粒(GEM-1MT NPs，实施例3制备，在此实施例中表示为GEM-1MT)溶液各200μL，使样品的最终浓度0.1、1、5、10、25、50、75、100μM，每个浓度设3个复孔，每块板都设不加细胞的空白对照组和不加药的阳性对照组，置于培养箱中孵育24h和48h。达到孵育时间后，每个孔中加入20μL MTT溶液，继续培养4h，然后吸取上清，每个孔中加入100μL DMSO，在酶标仪的570nm波长处测定每个孔吸光度。细胞抑制率按照以下公式计算：
Figure BDA0002392812020000101
其中，A阴性表示未经药物处理的细胞的孔的吸光度，A样品表示各种样品处理过的细胞的孔的吸光度，A空白表示没有接种细胞且没有药物处理的孔的吸光度。
不同样品在不同浓度下对B16F10细胞抑制率实验结果如图2。由图2可以看出，与原料药GEM、1MT、GEM+1MT相比，GEM-1MT纳米制剂的细胞抑制率显著增加，并且相较于游离药物，本发明制备的GEM-1MT NPs以细胞内吞的方式入肿瘤细胞，具有更高的细胞内化效率，所以GEM-1MT NPs的细胞抑制作用优于GEM/1MT混合物(GEM+1MT)，更优于游离的GEM、1MT。通过细胞抑制率实验，可以得出结论：本发明实施例中制备的的GEM-1MT NPs可以以细胞内吞的方式增加细胞内化效率，从而增强对肿瘤细胞的毒性，以提高肿瘤治疗效果。
3、IDO酶抑制实验
将B16F10细胞以1×104个细胞接种在48孔板，培养基中加入50ng/mL的IFN-γ刺激IDO的表达。48h后，加入用培养基稀释的一系列不同浓度的1MT、GEM-1MT NPs各800μL，同时加入100μM L-Trp(L-色氨酸)提供反应物。使样品的最终浓度为10、20、40、60、80、100μM，每个浓度设3个复孔，置于孵箱中继续培养48h。然后取出上清液140μL置于新EP管中，每个管加入15μL 30％三氟乙酸TCA(沉淀蛋白)，于50℃孵育30min后，3000G离心10min，取上清液100μL，然后加入100μL二甲氨基苯甲醛/醋酸(2％g/mL)，混合后置于96孔板，在480nm处测量吸收。
不同样品在不同浓度下对B16F10细胞的IDO酶抑制率实验结果如图3。GEM-1MTNPs由于EPR效应在肿瘤部位蓄积滞留，并通过内吞作用进入肿瘤细胞，进入肿瘤细胞的GEM-1MT NPs缓慢释放出GEM和1MT，在肿瘤细胞内通过GEM与1MT协同治疗，重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤效果；由图3可以看出，GEM-1MT NPs具有缓释能力，在与游离1MT相同给药浓度下，由于对1MT的缓释行为，与游离1MT相比对抑制IDO途径的活性略有不及，但仍具有良好的抑制IDO途径的活性。
实施例5GEM-1MT NPs制剂体内抗肿瘤实验
C57BL/6小鼠腋下荷瘤(每只100万个B16F10细胞)，等瘤长至80mm3左右，随机分成5组，每组6只，分别静脉注射生理盐水(NS)、GEM·HCl(表示为GEM)、1MT以及GEM·HCl与1MT的混合溶液(表示为GEM+1MT)和GEM-1MT NPs(表示为GEM-1MT)。在治疗过程中记录瘤体积的变化。5次治疗过后，处死老鼠，取出肿瘤，称重并计算抑瘤率。
Figure BDA0002392812020000111
其中，wNS是生理盐水组老鼠的平均瘤重，w样品是其他各组老鼠的平均瘤重。
结果如图4所示。从图4可以看出，由于肿瘤靶向的化疗与免疫治疗的协同作用，GEM-1MT NPs组老鼠瘤体积生长最为缓慢，且对肿瘤的抑制率最高。由于制剂的EPR效应，肿瘤部位药物蓄积多，对肿瘤细胞具有靶向性，而且GEM-1MT NPs可通过内吞作用进入肿瘤细胞，提高细胞的内化效率，在肿瘤细胞内通过缓慢释放GEM与1MT，使其协同治疗，重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤效果，而游离1MT水溶性差，靶向性差，游离GEM在血液循环中稳定性差，两者本身及其物理混合物均难以实现对肿瘤细胞的精准作用，靶向性差，效力不足。所以GEM-1MT NPs制剂抑瘤效果明显优于GEM、1MT以及GEM+1MT混合物组，并且具有缓释作用，在肿瘤细胞内的作用时间更为持久，并且避免多次分开给药，减轻患者的耐受性。本发明制备的GEM-1MT NPs抑瘤率高达95％，与GEM和1MT的物理混合物相比，相同浓度下，对肿瘤的抑制率提升高达20％以上。表明该肿瘤靶向的免疫治疗化疗极大地提高了抗黑色素瘤效果。
本发明实施例中首次合成GEM-1MT两亲性小分子化合物，该化合物能在水中自组装形成纳米粒。这个线粒体靶向的纳米组装结构不仅解决了疏水性1MT的体内递送问题，还解决了GEM的耐药及毒副作用，同时增强免疫治疗和化疗的效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种GEM-1MT两亲性小分子化合物，其具有式(I)所示化学结构：
Figure FDA0002392812010000011
2.一种制备权利要求1中所述GEM-1MT两亲性小分子化合物的方法，其包括：以GEM和1MT为原料，首先用Boc保护GEM的3’-OH和4-NH2得到4-N-3’-O-bis(Boc)GEM，如化合物1所示，以及用Boc保护1MT的NH2得到Boc-1MT，如化合物2所示，化合物1和化合物2进行反应得到Boc保护的GEM-1MT，如化合物3所示，最后进行脱保护，得到式(I)化合物；
Figure FDA0002392812010000012
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，化合物1和化合物2进行反应的过程包括：采用NHS和EDC活化Boc-1MT的羧基，再与4-N-3’-O-bis(Boc)GEM及DMAP混合后，在惰性气体氛围下，常温反应生成Boc保护的GEM-1MT；
优选地，化合物1和化合物2进行反应的过程包括：将NHS溶液和EDC溶液滴加至Boc-1MT溶液中，在惰性气体氛围下，常温反应6-15h，优选12h；再将4-N-3’-O-bis(Boc)GEM溶液以及DMAP溶液加入上述已反应溶液中，在惰性气体氛围下，常温反应10-48h，优选48h；
优选地，Boc-1MT以无水二氯甲烷为溶剂；
优选地，NHS溶液以无水DMF为溶剂；
优选地，EDC溶液以乙醇为溶剂；
优选地，4-N-3’-O-bis(Boc)GEM以无水二氯甲烷为溶剂；
优选地，DMAP溶液以无水二氯甲烷为溶剂；
优选的，Boc-1MT、NHS与EDC的摩尔比为1：1～2：1～2，优选为1:2:2；
优选地，Boc-1MT、4-N-3’-O-bis(Boc)GEM与DMAP的摩尔比为1：1～2：1～2，优选为1:1.5:1.5。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，化合物1和化合物2进行反应得到Boc保护的GEM-1MT后还包括提纯的步骤；
优选地，所述提纯操作包括：反应完成后去除溶剂获得Boc保护的GEM-1MT的粗产品，采用无水二氯甲烷将该粗产品溶解后进行硅胶柱色谱提纯，提纯过程采用石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱保护的步骤包括：将Boc保护的GEM-1MT加入到盐酸/乙酸乙酯的饱和溶液中，在惰性气体氛围下，常温反应生成GEM-1MT；
优选地，在脱保护步骤中，Boc保护的GEM-1MT与盐酸/乙酸乙酯饱和溶液的摩尔体积比为0.08mmol：30～35mL，优选为0.08mmol：30mL；
优选地，在脱保护步骤中，常温下反应时间为12-36h，优选为36h；
优选地，在脱保护步骤中，常温下反应结束后，去除乙酸乙酯，采用无水乙醚洗涤，然后进行真空干燥。
6.一种纳米制剂，其包含权利要求1所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物和/或包含由权利要求1中所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物聚集得到的纳米粒；
优选地，所述纳米制剂中的纳米粒的粒径小于200nm，优选为80-100nm。
7.权利要求6所述的纳米制剂的制备方法，其包括将权利要求1所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物溶液逐滴滴加至水中，自发形成纳米聚集体；
优选地，所述GEM-1MT两亲性小分子化合物溶液以甲醇为溶剂；
优选地，在超声条件下逐滴加入GEM-1MT两亲性小分子化合物；
优选地，在超声条件下GEM-1MT两亲性小分子化合物自发聚集形成纳米粒，除去溶剂，即得纳米制剂。
8.一种药物载体或药物递送系统，其含有权利要求1所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物或者权利要求6所述的纳米制剂。
9.药物组合物或药物制剂，其含有权利要求1所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物或者权利要求6所述的纳米制剂或者权利要求8所述的药物载体；
或者，还可以进一步地含有至少一种药学上可接受的辅料。
10.权利要求1所述的GEM-1MT两亲性小分子化合物或者权利要求6所述的纳米制剂或者权利要求8所述的药物载体或者权利要求9所述的药物组合物或药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
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