CN111269971A - 自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法 - Google Patents

自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法，通过两组(或多组)发射光强和荧光值确定初始发射光强值。再使用初始发射光强对第1孔进行连续扫描15次，15次扫描测试得到的荧光值均在所需区间范围内，此单孔光强标定完毕，记录数据；然后执行下一孔的标定，直到所有孔都标定完，第2～n孔的标定均用所得初始发射光强开始执行进行标定。可以将人从繁杂的手工劳动中解放出来去从事更具创新性的工作，同时，自动标定结果无主观因素干扰，结果一致性优于手动标定。为仪器的生产提供了大大的便利。

Description

自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法
技术领域
本发明涉及一种标定技术，特别涉及一种自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法。
背景技术
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA(或RNA)片段的分子生物学技术。PCR基因扩增仪是利用PCR(Polymerase chainreaction，聚合酶链反应)技术对特定DNA扩增的一种仪器设备，是分子生物学研究极其重要的工具，主要应用于病原体检测、药物疗效考核、肿瘤基因检测、基因表达研究、转基因研究、单核苷酸多态性(SNP)及突变分析等细分研究方向，在食品检测、临床检验、疾病控制、检验检疫、科研实验室、食品安全、化妆品检测、环境卫生等生命科学领域有着广泛的应用。
在PCR反应中，无论是定性还是定量分析，分析的都是PCR的终产物。若想分析未经PCR放大的起始模板量，则需借助RT-qPCR技术。RT-qPCR技术即是在PCR的反应过程中加入荧光探针。一种荧光探针的5’端标记有报告基团R可发出荧光信号，3’端标记有荧光淬灭基团Q可吸收荧光信号。当探针完整时，报告基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收，从而不被检测出来。当PCR扩增至探针所在位置时，TaqDNA聚合酶具有的核酸外切酶活性会将探针5’端的报告基团切断，使其远离探针本身，这时产生的荧光信号就不能被淬灭基团吸收，而被仪器检测出来。每扩增一条DNA链就会有一个荧光分子产生，通过荧光信号的积累量实时监测整个PCR反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
近几年国内PCR荧光检测仪的研发和生产大量涌现，但是与进口仪器相比，国内仪器普遍存在一致性差、生产效率低、成本高等问题。主要是因为国内生产的PCR仪出厂之前需要进行荧光信号标定，而标定方法主要是：设使用光强为Iek(k＝1,2,3……n)的激发光源照射同一管荧光试剂，接收到的荧光强度为Idk(k＝1,2,3……n)。标定前，Iek设置为相同的数值，由于仪器每个孔之间存在细微差异，导致每个孔的荧光结果Idk不一致，并不是全部分布在目标区间内，如图1所示。标定过程即是调整每个孔的Iek使其Idk能够分布在目标区间范围内，如图2所示。
目前的标定方法是，荧光试剂放在第1孔，首先根据经验值设置孔1的发射光强，查看接收荧光结果与目标区间的差距后手动调节孔1发射光强，直至孔1荧光结果连续15次均稳定在目标区间内，保存15次稳定的荧光结果；之后，手动将荧光试剂移至下一孔，并将上一孔确定的发射光强值作为待标定孔的初始给定值，重复上一步骤……直至n个孔全部标定完毕。
手动标定不但工作效率低、工作内容枯燥，而且最终的标定结果也不能保持很好的一致性。设计实现自动标定方法，可以将人从繁杂的手工劳动中解放出来去从事更具创新性的工作，同时，自动标定结果无主观因素干扰，结果一致性优于手动标定。
发明内容
本发明是针对PCR基因扩增仪中标定方法效率低的问题，提出了一种自动标定聚合酶链式反应荧光信号，可以将人从繁杂的手工劳动中解放出来去从事更具创新性的工作，提高仪器的生产效率。同时，自动标定结果无主观因素干扰，结果一致性优于手动标定。
本发明的技术方案为：一种自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法，具体包括如下步骤：
1)针对第1孔进行标定，确定初始发射光强：输入两个发射光强值1、2和目标荧光值及目标荧光值区间范围，光强值2>光强值1，使用两个发射光强值1、2扫描照射第1孔的荧光试剂，记录输出荧光值1、2，根据目标荧光值及区间范围判断输出荧光值1、2是否在所需区间范围内；
如有一个在区间一个不在区间，则在区间内的对应发射光强作为初始发射光强；如果两个荧光值均在所需区间范围内，则取两者的对应的发射光强平均值作为初始发射光强值；如果两个荧光值均不在所需区间范围内，则根据发射光强值与荧光值的线性对应关系选取目标荧光值区域对应的理想发射光强值3，用发射光强值3扫描照射第1孔的荧光试剂，记录输出荧光值3，如荧光值3落在所需区间范围内则发射光强值3为初始发射光强，进行下一步，否则重复返回重新选取初始光强值1、2，重复测试，直到得到初始发射光强；
4)使用得到的初始发射光强对第1孔进行连续扫描15次，15次扫描测试得到的荧光值均在所需区间范围内，认为此为满足条件的发射光强，记录得到的荧光数据；如在前15次扫描测试得到的荧光数值有不在所需区间范围内，则对发射光强进行微调，直到连续15次测试荧光值都落在目标区间内，此单孔光强标定完毕，记录数据；
5)执行下一孔的标定，直到所有孔都标定完，第2～n孔的标定均用步骤1)所得初始发射光强开始执行步骤2)进行标定。
所述步骤2)中微调方法为：以步骤1)最后一次循环的发射光强1、2和荧光值1、2为x1、x2和y1、y2，拟合出一条直线y＝kx+b，设运行中的发射光强值为xrun，对应荧光值为yrun，目标荧光值为yobj，则微调后的发射光强值xobj表示为：
Figure BDA0002385838240000031
所述步骤2)中返回重新选取初始光强值1、2的方法为：将第一次荧光值1～3中与目标荧光值相差较小的两个所对应的发射光强值赋给新一轮循环的发射光强1、2。
本发明的有益效果在于：本发明自动标定聚合酶链式反应荧光信号，实现自动标定PCR仪器的荧光信号，节省了人力和时间，生产效率得到大大的提高，同时，改善了仪器的一致性。
附图说明
图1为现有技术标定前示意图；
图2为现有技术标定后示意图；
图3为本发明自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法流程图；
图4为本发明中发射光强插值示意图。
具体实施方式
如图3所示自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法流程图。包括两步，step1针对第1孔进行标定，确定初始发射光强：输入两个发射光强值1、2和目标荧光值及目标荧光值区间范围(注意:光强值2>光强值1，且范围较宽)，使用两个发射光强值1、2扫描照射第1孔的荧光试剂，记录输出荧光值1、2，根据目标荧光值及区间范围判断输出荧光值1、2是否在所需区间范围内，如有一个在区间一个不在区间，则在区间内的对应发射光强作为初始发射光强；如果两个荧光值均在所需区间范围内，则取两者的对应的发射光强平均值作为初始发射光强值；如果两个荧光值均不在所需区间范围内，则根据发射光强值与荧光值的线性对应关系选取目标荧光值区域对应的理想发射光强值3，用发射光强值3扫描照射第1孔的荧光试剂，记录输出荧光值3，如荧光值3落在所需区间范围内则发射光强值3为初始发射光强，进行下一步step2，否则重复返回重新选取初始光强值1、2，重复测试，直到得到初始发射光强。
通过两组(或多组)发射光强和荧光值确定初始发射光强值。再执行step2,step2：使用step1得到的初始发射光强对第1孔进行连续扫描15次，15次扫描测试得到的荧光值均在所需区间范围内，为此为满足条件的发射光强，记录得到的荧光数据；如在前15次扫描测试得到的荧光数值有不在所需区间范围内，则对发射光强进行微调，直到连续15次测试荧光值都落在目标区间内，此单孔光强标定完毕，记录数据；然后执行下一孔的标定，直到所有孔都标定完，第2～n孔的标定均用step1所得初始发射光强开始执行step2进行标定。
其中step1中发射光强插值的步骤为：
发射光强插值方法如图4所示，先给一个较小光强值1，再给一个较大光强值2，根据线性对应关系给出较为理想发射光强值3(根据发射光强1、2和荧光值1、2，做出直线，取荧光值区间范围内所对应的的发射光强值)，如荧光值落在区间内则得到初始发射光强，进行下一步。
其中step1中重给定发射光强的方法为：
当step1执行一次荧光值不在区间内时，需再次执行step1，重新给定发射光强1、2。重给定方法为：将第一次荧光值1～3中与目标荧光值相差较小的两个所对应的发射光强值赋给新一轮循环的发射光强1、2。
其中step2中微调发射光强的方法为：
step1中已经确定了发射光强初值，在此初值下机器循环运行，如运行15次得到结果均在目标区间内则结束运行，否则需要根据荧光值与目标荧光值的偏差对发射光强进行微调。
微调方法为：以step1最后一次循环的发射光强1、2和荧光值1、2为x1、x2和y1、y2，拟合出一条直线y＝kx+b。设运行中的发射光强值为xrun，对应荧光值为yrun，目标荧光值为yobj，则微调后的发射光强值xobj可表示为式(1)，
Figure BDA0002385838240000051

Claims (3)

1.一种自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)针对第1孔进行标定，确定初始发射光强：输入两个发射光强值1、2和目标荧光值及目标荧光值区间范围，光强值2>光强值1，使用两个发射光强值1、2扫描照射第1孔的荧光试剂，记录输出荧光值1、2，根据目标荧光值及区间范围判断输出荧光值1、2是否在所需区间范围内；
如有一个在区间一个不在区间，则在区间内的对应发射光强作为初始发射光强；如果两个荧光值均在所需区间范围内，则取两者的对应的发射光强平均值作为初始发射光强值；如果两个荧光值均不在所需区间范围内，则根据发射光强值与荧光值的线性对应关系选取目标荧光值区域对应的理想发射光强值3，用发射光强值3扫描照射第1孔的荧光试剂，记录输出荧光值3，如荧光值3落在所需区间范围内则发射光强值3为初始发射光强，进行下一步，否则重复返回重新选取初始光强值1、2，重复测试，直到得到初始发射光强；
2)使用得到的初始发射光强对第1孔进行连续扫描15次，15次扫描测试得到的荧光值均在所需区间范围内，认为此为满足条件的发射光强，记录得到的荧光数据；如在前15次扫描测试得到的荧光数值有不在所需区间范围内，则对发射光强进行微调，直到连续15次测试荧光值都落在目标区间内，此单孔光强标定完毕，记录数据；
3)执行下一孔的标定，直到所有孔都标定完，第2～n孔的标定均用步骤1)所得初始发射光强开始执行步骤2)进行标定。
2.根据权利要求1所述自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法，其特征在于，所述步骤2)中微调方法为：以步骤1)最后一次循环的发射光强1、2和荧光值1、2为x1、x2和y1、y2，拟合出一条直线y＝kx+b，设运行中的发射光强值为xrun，对应荧光值为yrun，目标荧光值为yobj，则微调后的发射光强值xobj表示为：
Figure FDA0002385838230000011
3.根据权利要求1所述自动标定聚合酶链式反应荧光信号的方法，其特征在于，所述步骤2)中返回重新选取初始光强值1、2的方法为：将第一次荧光值1～3中与目标荧光值相差较小的两个所对应的发射光强值赋给新一轮循环的发射光强1、2。
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