CN111234046B - 茉莉花渣活性多糖的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了茉莉花渣活性多糖的制备方法及其应用，属于植物提取技术领域。本发明利用茉莉花副产物‑茉莉花渣为原料，经茉莉花渣预处理、茉莉花渣总提取物制备、总提取物分级萃取、茉莉花渣粗多糖制备、茉莉花渣多糖分离纯化等步骤制备得到茉莉花渣活性多糖。本发明能够制备不同分子量的茉莉花渣多糖，并高效分离纯化出具有不同功能活性的茉莉花渣多糖。根据分子量的不同，本发明的茉莉花渣多糖可以应用于制备调节免疫力药物、抗失眠症或抗抑郁症药物和抗糖尿病药物等。

Description

茉莉花渣活性多糖的制备方法及其应用
【技术领域】
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及茉莉花渣活性多糖的制备方法及其应用。
【背景技术】
茉莉花渣是木樨科茉莉花属中的茉莉花苞经熏制茶叶后的废异物，是加工生产茉莉花茶过程中的主要废弃物。风干样品呈黄褐色，带有浓厚的茉莉花香味。茉莉花渣中含粗蛋白20.8％、粗脂肪2.4％、粗纤维12.4％、水溶性碳水化合物8.04％、游离氨基酸3.41％、维生素C 0.21％等。茉莉花渣通常作废物处理，造成资源浪费、环境污染。目前，国内外有关茉莉花渣多糖的研究主要集中于多糖提取工艺，对于茉莉花渣多糖的分离纯化鲜有报道。
多糖是由单糖通过糖苷键结合的糖链，广泛分布于植物、动物和微生物中。近年来研究表明，某些具有特定结构的天然多糖具有显著的降血糖、抗癌、美容等作用。但是由于多糖本身结构的复杂性，难以阐明有效成分的化学结构与这些功能活性之间的关系，以及其作用机制难以明确等原因，阻碍了多糖类药物或保健品的开发。
目前，国内外针对多糖提取工艺的研究多采用传统热水浸提法，该方法提取溶剂单一，且多糖物质难以从植物细胞内释放出来；再者实验室常采用水提醇沉得到粗多糖，但现行工艺制备的多糖的分子量较为分散和混乱，有效成分不明且可重复性差，无法进行针对性的研究。因此，如何高效分离不同分子量的茉莉花渣多糖以及如何根据分子量应用到不同领域已成为茉莉花产业化亟需解决的瓶颈问题。
【发明内容】
本发明的目的就是针对现有技术存在的上述问题，提供茉莉花渣活性多糖的制备方法及其应用。本发明先预处理茉莉花渣，再制备茉莉花渣总提取物，然后对茉莉花渣总提取物进行分级萃取，接着通过二次醇沉，制得茉莉花渣粗多糖，最后通过超频震动膜过滤技术，分离出不同分子量的茉莉花渣多糖溶液。本发明能够制备不同分子量的茉莉花渣多糖，并高效分离纯化出具有不同功能活性的茉莉花渣多糖。根据分子量的不同，本发明的茉莉花渣多糖可以应用于制备调节免疫力药物、抗失眠症或抗抑郁症药物和抗糖尿病药物等。
为实现上述目的，本发明技术方案如下：
茉莉花渣活性多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)茉莉花渣预处理：将茉莉花渣烘干至恒重，粉碎过筛，得到茉莉花渣粉末；将茉莉花渣粉末与无水乙醇混匀，超声振荡2-3h后，过滤取滤渣，烘干至恒重，即为脱脂茉莉花渣粉末；
(2)膨发性茉莉花渣粉末制备：将脱脂茉莉花渣粉末套袋，然后在20-27℃、超高压350-450MPa下处理1-3min后瞬间泄压，使茉莉花渣粉末成为膨发性茉莉花渣粉末；
(3)茉莉花渣总提取物制备：在膨发性茉莉花渣粉末中加入水，然后装入聚乙烯塑料袋，混合均匀后，用纯碱调节pH值至7.5-8.5；将真空封口的塑料袋置于温度为15-25℃，压强为500-700MPa的条件下提取，提取时间为5-7min；将提取液离心，收集上清液；在上清液加入柠檬酸至中性；上清液经液氮速冻后，放入微波冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣总提取物；
(4)正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取：在茉莉花渣总提取物中按体积比为1：1.5-2加入正己烷-乙酸乙酯溶剂，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层即为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取物，下层为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物I；下层用同样的方法再萃取两次，得到正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II；
(5)氯仿萃取：在正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II中按体积比1：1.5-2加入氯仿，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为氯仿萃取物，下层为氯仿萃取剩余物I；下层用同样的方法再萃取两次，得到氯仿萃取剩余物II；
(6)正丁醇-甲醇溶剂体系萃取：在氯仿萃取剩余物II中按体积比1：1-3加入正丁醇-甲醇-水溶剂，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为正丁醇-甲醇溶剂体系萃取物，剩余的下层为水相萃取物I；下层再用同样的方法萃取两次，得到水相萃取物II；
(7)茉莉花渣粗多糖制备：向水相萃取物II中加入体积分数95％乙醇并在冰水中静置10-15h进行第一次醇沉，过滤得到沉淀物①；向沉淀物①中加入去离子水，加热溶解后过滤去除不溶物；再加入体积分数95％乙醇并在冰水中放置24h进行第二次醇沉，过滤得到沉淀物②；将所得沉淀②放入超声辅助真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣粗多糖；
(8)茉莉花渣多糖分离纯化：向茉莉花渣粗多糖中加入去离子水，加热溶解，过滤去除不溶物，得到茉莉花渣粗多糖溶液；采用超频震动膜过滤系统，将茉莉花渣粗多糖溶液分别过分子量(Mr)1000kD、500kD、300kD、100kD、50kD、30kD、10kD、3kD和650D滤膜，得到6份分子量不同的茉莉花渣多糖溶液，分别为Mr>1000kD的茉莉花渣多糖溶液、500<Mr≤1000的茉莉花渣多糖溶液、100<Mr≤500的茉莉花渣多糖溶液、30<Mr≤100的茉莉花渣多糖溶液、10<Mr≤30的茉莉花渣多糖溶液和Mr≤10的茉莉花渣多糖溶液。
进一步的，步骤(1)中，所述茉莉花渣粉末与无水乙醇的固液比为1：20mg/mL。
进一步的，步骤(3)中，所述膨发性茉莉花渣粉末与水的固液比为1：20mg/mL。
进一步的，步骤(4)中，所述正己烷-乙酸乙酯溶剂的正己烷：乙酸乙酯为2：5(v/v)；步骤(6)中，所述正丁醇-甲醇-水溶剂的正丁醇：甲醇：水为4：2：5(v/v)。
进一步的，步骤(7)中，所述两次醇沉加入的95％乙醇的体积均为水相萃取物II体积的4倍。
本发明还提供所述的分子量100<Mr≤500茉莉花渣多糖溶液在制备调节免疫力药物/保健品中的应用。
本发明还提供所述的分子量30<Mr≤100茉莉花渣多糖溶液在制备抗失眠症或抗抑郁症药物/保健品中的应用。
本发明还提供所述的分子量10<Mr≤30茉莉花渣多糖溶液在制备抗糖尿病药物/保健品中的应用。
有益效果：
本发明能够高效分离提纯不同分子量的茉莉花渣多糖，为后续的茉莉花渣多糖的发展提供基础研究。本发明先对茉莉花渣进行烘干、粉碎处理，使茉莉花渣的组织结构进行初步破碎；然后采用低温超高压爆破式提取技术，制备茉莉花渣总提取物；接着依次采用不同溶剂体系对茉莉花渣总提取物进行分级萃取，使茉莉花渣中不同极性且不溶于水的物质能够被萃取、分离，剩余水相萃取物；然后采用二次醇沉技术，以乙醇为萃取剂，使茉莉花渣粗多糖进行沉降；最后采用超频震动膜过滤技术，制备不同分子量的茉莉花渣多糖，并高效分离纯化出具有不同功能活性的茉莉花渣多糖。本发明所采用的各个技术手段相互配合、环环相扣，能够达到高效分离提纯茉莉花渣多糖的目的。
本发明中，在茉莉花渣进行提取前，先制备膨发性茉莉花渣粉末，通过低温高压爆破改变茉莉花渣粉末结构，使多糖物质从植物细胞内更快释放出来，提高有效成分的得率。同时该操作在低温下进行，避免了茉莉花渣多糖成分因热效应引起结构变化，避免降低多糖物质生物活性。
本发明中，采用pH值7.5-8.5，温度为15-25℃，压强为500-700MPa的条件下提取制备茉莉花渣总提取物，与传统热水浸提技术相比较，可以大大缩短提取时间、降低能耗、减少杂质成分的溶出。
本发明采用超频震动膜过滤分离茉莉花渣多糖，由于多糖结构的复杂性，其分离、纯化和生化分析难度较大，而且活性多糖一般属于大分子化合物，具有粘性，在膜分离过程中更容易产生膜污染和堵塞。本发明采用超频震动膜过滤分离茉莉花渣多糖，解决了分离纯化多糖中膜污染和膜堵塞的关键问题。
本发明采用MTT比色法，分析在不同分子量的茉莉花渣多糖作用下的RAW264.7巨噬细胞活力，确定了茉莉花渣多糖具有调节免疫功能的特性，特别是100<Mr≤500组，说明分子量100<Mr≤500的茉莉花渣多糖是调节免疫力的关键有效组分。
抑郁症已成为全球第四大疾病，将成为导致残疾的第二大病因。抑郁症常表现为疲劳、淡漠、兴趣减退、情绪低落、反应迟钝等心境障碍症状，同时常常伴有失眠症。失眠症是一种持续的睡眠质和/或量令人不满意的生理障碍。本发明采用CUMS+孤养方式建造抑郁症模型，经茉莉花渣多糖治疗28d后，与治疗前比，所有茉莉花渣多糖组小鼠体质量增加、悬尾不动时间百分比降低、强迫游泳不动时间百分比降低和血清5-HT浓度显著提高，特别是30<Mr≤100组，说明分子量30<Mr≤100的茉莉花渣多糖是改善失眠症、缓解抑郁症的关键有效组分。
糖尿病是一种以高血糖为主要特征的内分泌紊乱代谢综合症，在世界范围内已成为继心脑血管疾病和癌症之后危害人类健康的第三大慢性非传染性疾病。本发明采用腹腔注射四氧嘧啶造成高血糖小鼠模型。茉莉花渣多糖能降低糖尿病小鼠的空腹血糖及提高其免疫器官指数(胸腺指数、脾指数)，缓解糖尿病小鼠“三多一少”症状，特别是分子量10<Mr≤30的茉莉花渣多糖，说明分子量10<Mr≤30的茉莉花渣多糖是降血糖、改善糖尿病症状的关键有效组分。
【具体实施方式】
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
实施例1
茉莉花渣活性多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)茉莉花渣预处理：将茉莉花渣在55℃下烘干至恒重，粉碎并过40目筛，得到茉莉花渣粉末；按照固液比1mg：20mL加入茉莉花渣粉末和无水乙醇，超声振荡2.5h后，过滤取滤渣，在55℃下烘干至恒重，即为脱脂茉莉花渣粉末；
(2)膨发性茉莉花渣样品制备：将脱脂茉莉花渣粉末装入聚乙烯塑料袋，放入设备中，在25℃、超高压400MPa下处理2min后瞬间泄压，使茉莉花渣原料成为膨发性茉莉花渣样品；
(3)茉莉花渣总提取物制备：称取一定量的预处理茉莉花渣粉末，按固液比为1mg：20mL加入水，装入聚乙烯塑料袋。混合均匀后，用纯碱调节pH值至8.0(呈弱碱性)。将真空封口的塑料袋放入装置中提取，温度控制在20℃，压强600MPa，提取时间为6min。提取液在6000r/min离心5min，收集上清液。上清液加入柠檬酸调节至中性。上清液微批次液氮速冻后，放入微波冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣总提取物；
(4)正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取：在茉莉花渣总提取物中按体积比为1：1.8加入正己烷-乙酸乙酯溶剂(2：5，v/v)，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层即为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取物，下层为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物I；下层用同样的方法(即在下层萃取剩余物中按体积比为1：1.8加入正己烷-乙酸乙酯溶剂(2：5，v/v)，振摇，静置，分层)再萃取两次，得到正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II；
(5)氯仿萃取：在正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II中按体积比1：1.6加入氯仿，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为氯仿萃取物，下层为氯仿萃取剩余物I；下层用同样的方法(即下层氯仿萃取剩余物按体积比1：1.6加入氯仿，振摇，静置，分层)再萃取两次，得到氯仿萃取剩余物II；
(6)正丁醇-甲醇溶剂体系萃取：在氯仿萃取剩余物II中按体积比1：2加入正丁醇-甲醇-水溶剂(4：2：5，v/v)，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为正丁醇-甲醇溶剂体系萃取物，剩余的下层为水相萃取物I；下层再用同样的方法(即下层水相萃取物加入体积比1：2加入正丁醇-甲醇-水溶剂(4：2：5，v/v)，振摇，静置，分层)萃取两次，得到水相萃取物II；
(7)茉莉花渣粗多糖制备：向水相萃取物II中加入体积分数95％乙醇并在冰水中静置12h进行第一次醇沉，过滤得到沉淀物①；向沉淀物①中加入适量的去离子水，加热溶解后过滤去除不溶物；再加入体积分数95％乙醇并在冰水中放置24h进行第二次醇沉，过滤得到沉淀物②；将所得沉淀放入超声辅助真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣粗多糖；所述两次醇沉加入的95％乙醇的体积均为水相萃取物II体积的4倍。
(8)茉莉花渣多糖分离纯化：按体积比1:10向茉莉花渣粗多糖中加入去离子水，加热溶解，过滤去除不溶物，得到茉莉花渣粗多糖溶液；采用超频震动膜过滤系统，将1000mL茉莉花渣粗多糖溶液分别过分子量(Mr)1000kD、500kD、300kD、100kD、50kD、30kD、10kD、3kD和650D滤膜，分别得到6份分子量不同的茉莉花渣多糖溶液，分别为Mr>1000kD的多糖溶液150mL、500<Mr≤1000的多糖溶液150mL、100<Mr≤500的多糖溶液150mL、30<Mr≤100的多糖溶液200mL、10<Mr≤30的多糖溶液200mL和Mr≤10的多糖溶液150mL。
实施例2
茉莉花渣活性多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)茉莉花渣预处理：将茉莉花渣烘干至恒重，粉碎过筛，得到茉莉花渣粉末；将茉莉花渣粉末与无水乙醇混匀，所述茉莉花渣粉末与无水乙醇的固液比为1：25mg/mL，超声振荡3h后，过滤取滤渣，烘干至恒重，即为脱脂茉莉花渣粉末；
(2)膨发性茉莉花渣粉末制备：将脱脂茉莉花渣粉末装入聚乙烯塑料袋，然后在20℃、超高压450MPa下处理1min后瞬间泄压，使茉莉花渣粉末成为膨发性茉莉花渣粉末；
(3)茉莉花渣总提取物制备：在膨发性茉莉花渣粉末中加入水，所述膨发性茉莉花渣粉末与水的固液比为1：25mg/mL；然后装入聚乙烯塑料袋，混合均匀后，用纯碱调节pH值至7.5；将真空封口的塑料袋置于温度为15℃，压强为500MPa的条件下提取，提取时间为7min后；将提取液离心，收集上清液；在上清液加入柠檬酸至中性；上清液经液氮速冻后，放入微波冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣总提取物；
(4)正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取：在茉莉花渣总提取物中按体积比为1：1.5加入正己烷-乙酸乙酯溶剂(2：5，v/v)，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层即为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取物，下层为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物I；下层用同样的方法再萃取两次，得到正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II；
(5)氯仿萃取：在正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II中按体积比1：1.5加入氯仿，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为氯仿萃取物，下层为氯仿萃取剩余物I；下层用同样的方法再萃取两次，得到氯仿萃取剩余物II；
(6)正丁醇-甲醇溶剂体系萃取：在氯仿萃取剩余物II中按体积比1：1加入正丁醇-甲醇-水溶剂(4：2：5，v/v)，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为正丁醇-甲醇溶剂体系萃取物，剩余的下层为水相萃取物I；下层再用同样的方法萃取两次，得到水相萃取物II；
(7)茉莉花渣粗多糖制备：向水相萃取物II中加入体积分数95％乙醇并在冰水中静15h进行第一次醇沉，过滤得到沉淀物①；向沉淀物①中加入去离子水，加热溶解后过滤去除不溶物；再加入体积分数95％乙醇并在冰水中放置24h进行第二次醇沉，过滤得到沉淀物②；将所得沉淀②放入超声辅助真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣粗多糖；所述两次醇沉加入的95％乙醇的体积均为水相萃取物II体积的4倍。
(8)茉莉花渣多糖分离纯化：按体积比1:10向茉莉花渣粗多糖中加入去离子水，加热溶解，过滤去除不溶物，得到茉莉花渣粗多糖溶液；采用超频震动膜过滤系统，将1000mL茉莉花渣粗多糖溶液分别过分子量(Mr)1000kD、500kD、300kD、100kD、50kD、30kD、10kD、3kD和650D滤膜，得到6份分子量不同的茉莉花渣多糖溶液，分别为Mr>1000kD的茉莉花渣多糖溶液150mL、500<Mr≤1000的茉莉花渣多糖溶液150mL、100<Mr≤500的茉莉花渣多糖溶液150mL、30<Mr≤100的茉莉花渣多糖溶液200mL、10<Mr≤30的茉莉花渣多糖溶液200mL和Mr≤10的茉莉花渣多糖溶液150mL。
实施例3
茉莉花渣活性多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)茉莉花渣预处理：将茉莉花渣烘干至恒重，粉碎过筛，得到茉莉花渣粉末；将茉莉花渣粉末与无水乙醇混匀，所述茉莉花渣粉末与无水乙醇的固液比为1：25mg/mL，超声振荡2h后，过滤取滤渣，烘干至恒重，即为脱脂茉莉花渣粉末；
(2)膨发性茉莉花渣粉末制备：将脱脂茉莉花渣粉末装入聚乙烯塑料袋，然后在27℃超高压350MPa下处理3min后瞬间泄压，使茉莉花渣粉末成为膨发性茉莉花渣粉末；
(3)茉莉花渣总提取物制备：在膨发性茉莉花渣粉末中加入水，所述膨发性茉莉花渣粉末与水的固液比为1：25mg/mL；然后装入聚乙烯塑料袋，混合均匀后，用纯碱调节pH值至8.5；将真空封口的塑料袋置于温度为25℃，压强为700MPa的条件下提取，提取时间为7min后；将提取液离心，收集上清液；在上清液加入柠檬酸至中性；上清液经液氮速冻后，放入微波冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣总提取物；
(4)正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取：在茉莉花渣总提取物中按体积比为1：2加入正己烷-乙酸乙酯溶剂(2：5，v/v)，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层即为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取物，下层为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物I；下层用同样的方法再萃取两次，得到正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II；
(5)氯仿萃取：在正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II中按体积比1：2加入氯仿，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为氯仿萃取物，下层为氯仿萃取剩余物I；下层用同样的方法再萃取两次，得到氯仿萃取剩余物II；
(6)正丁醇-甲醇溶剂体系萃取：在氯仿萃取剩余物II中按体积比1：3加入正丁醇-甲醇-水溶剂(4：2：5，v/v)，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为正丁醇-甲醇溶剂体系萃取物，剩余的下层为水相萃取物I；下层再用同样的方法萃取两次，得到水相萃取物II；
(7)茉莉花渣粗多糖制备：向水相萃取物II中加入体积分数95％乙醇并在冰水中静置10h进行第一次醇沉，过滤得到沉淀物①；向沉淀物①中加入去离子水，加热溶解后过滤去除不溶物；再加入体积分数95％乙醇并在冰水中放置24h进行第二次醇沉，过滤得到沉淀物②；将所得沉淀②放入超声辅助真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣粗多糖；所述两次醇沉加入的95％乙醇的体积均为水相萃取物II体积的4倍。
(8)茉莉花渣多糖分离纯化：按体积比1:10向茉莉花渣粗多糖中加入去离子水，加热溶解，过滤去除不溶物，得到茉莉花渣粗多糖溶液；采用超频震动膜过滤系统，将1000mL茉莉花渣粗多糖溶液分别过分子量(Mr)1000kD、500kD、300kD、100kD、50kD、30kD、10kD、3kD和650D滤膜，得到6份分子量不同的茉莉花渣多糖溶液，分别为Mr>1000kD的茉莉花渣多糖溶液150mL、500<Mr≤1000的茉莉花渣多糖溶液150mL、100<Mr≤500的茉莉花渣多糖溶液150mL、30<Mr≤100的茉莉花渣多糖溶液200mL、10<Mr≤30的茉莉花渣多糖溶液200mL和Mr≤10的茉莉花渣多糖溶液150mL。
对比例1
茉莉花渣活性多糖的制备方法，与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(2)中，所述操作条件如下：温度为30℃，压力为45MPa下处理10min后瞬间泄压。
对比例2
茉莉花渣活性多糖的制备方法，与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(3)中，茉莉花渣总提取物制备是使用传统热水浸提技术，具体操作参数如下：在70℃下，用质量分数为70％的乙醇溶液提取茉莉花渣粉末3h，所用的料液比为1：20，收集提取液，在50℃进行减压浓缩，即得茉莉花渣总提取物。
对比例3
茉莉花渣活性多糖的制备方法，与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(4)-(6)中，茉莉花渣总提取物萃取是使用各类有机溶剂分级萃取，具体操作参数如下：
石油醚萃取：将300mL茉莉花渣总提取物转入分液漏斗中，加入600mL石油醚，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层即为石油醚萃取物，下层为石油醚萃取剩余物I；下层再萃取两次，得到石油醚萃取剩余物II；
氯仿萃取：将上述石油醚萃取剩余物II转入分液漏斗中，按体积比1：2加入氯仿，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为氯仿萃取物，下层为氯仿萃取剩余物I；下层再萃取两次，得到氯仿萃取剩余物II；
乙酸乙酯萃取：将上述氯仿萃取剩余物II转入分液漏斗中，按体积比1：2加入乙酸乙酯，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为乙酸乙酯萃取物，下层为乙酸乙酯萃取剩余物I；下层再萃取两次，得到乙酸乙酯萃取剩余物II；
正丁醇萃取：将上述乙酸乙酯萃取剩余物II转入分液漏斗中，按体积比1：2加入正丁醇，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为正丁醇萃取物，剩余的下层为水相萃取物I；下层再萃取两次，得到水相萃取物II。
对比例4
茉莉花渣活性多糖的制备方法，与实施例1基本相同，不同之处在于：对茉莉花渣总提取物的分级萃取步骤有所不同，即先进行正丁醇-甲醇溶剂体系萃取，再进行氯仿萃取，然后进行正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取，得到的萃取剩余物再进行茉莉花渣粗多糖的制备，其中涉及的反应参数与实施例1相同。
对比例5
茉莉花渣活性多糖的制备方法，采用传统多糖制备方法，具体操作参数如下：按照固液比1：20mg/mL加入茉莉花渣粉末和水，提取时间3h，加热至95℃以上；冷却后，过滤取滤液，滤渣再提取一次；合并两次滤液，进行减压浓缩；向浓缩液中加入体积分数95％乙醇并在冰水中静置10-15h进行醇沉，过滤得到沉淀物；将所得沉淀物放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，即得茉莉花渣多糖。按体积比1:10向茉莉花渣多糖中加入去离子水，加热溶解，过滤去除不溶物，得到茉莉花渣粗多糖溶液；采用超频震动膜过滤系统，将1000mL茉莉花渣粗多糖溶液分别过分子量(Mr)1000kD、500kD、300kD、100kD、50kD、30kD、10kD、3kD和650D滤膜，得到不同分子量的茉莉花渣多糖溶液。
为了验证本发明的茉莉花渣活性多糖的有效性，发明人做了如下分析：
对比试验1:
本发明采用CUMS+孤养方式建造抑郁症模型。抑郁症模型小鼠90只，按各指标均衡原则随机分为9组，每组10只，分别为抑郁症模型组、茉莉花渣活性多糖实施例组(实施例1组、实施例2组、实施例3组)，茉莉花渣活性多糖对比例组(对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组、对比例5组)，另设正常对照组。各组给予茉莉花渣活性多糖100mg/kg/day(生理盐水溶解)灌胃28d，抑郁症模型组及正常对照组给予等体积的生理盐水灌胃，测定体质量、强迫游泳不动时间和血清5-HT浓度变化。所述各实施例组和各对比例组均选择分子量30<Mr≤100茉莉花渣多糖溶液进行试验，具体试验数据见表1。
表1：
Figure BDA0002421745350000111
5-HT(5-羟色胺)是一种能产生愉悦情绪的信使，5-羟色胺水平较低的人群更容易发生抑郁；因此，与抑郁症模型组相比，血清中5-HT浓度(ng/mL)显著升高，表明茉莉花渣活性多糖有助于改善情绪和治疗抑郁症状。另外，与抑郁症模型组相比，灌胃茉莉花渣活性多糖28d后体质量(g)明显增加，强迫游泳不动时间百分比降低，因此表明表明茉莉花渣活性多糖有助于改善情绪和治疗抑郁症状。而对比例1-5因茉莉花渣多糖制备过程中各步骤的相关技术手段有所改变，所以相对于实施例组，改善情绪和治疗抑郁症状均有不同程度的下降。
对比实验2：
本发明采用CUMS+孤养方式建造抑郁症模型。抑郁症模型小鼠80只，按各指标均衡原则随机分为8组，每组10只，分别为实施例1制备得到的茉莉花渣粗多糖组、实施例1制备得到的茉莉花渣多糖溶液的Mr>1000kD组、500<Mr≤1000kD组、100<Mr≤500kD组、30<Mr≤100kD组、10<Mr≤30kD组、Mr≤10kD组、抑郁组，另设正常对照组。各组给予多糖100mg/kg/day(生理盐水溶解)灌胃28d，抑郁症模型组及正常对照组给予等体积的生理盐水灌胃，测定体质量、强迫游泳不动时间和血清5-HT浓度变化。具体检测结果见表2。
表2：
Figure BDA0002421745350000121
与治疗前比，所有实施例1制备得到的茉莉花渣多糖溶液组小鼠体质量增加、悬尾不动时间百分比降低、强迫游泳不动时间百分比降低和血清5-HT浓度显著提高，特别是30<Mr≤100组，说明分子量30<Mr≤100的茉莉花渣多糖是改善失眠症、缓解抑郁症的关键有效组分。
对比试验3：
采用RIN-5F细胞模型分析茉莉花渣多糖的降血糖和抗糖尿病功能。RIN-5F细胞培养在含有RPMI 1640(11mM葡萄糖)、10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的培养瓶中，并放置在含5％二氧化碳的培养箱内。将RIN-5F细胞(1.5x 106个细胞/孔)培养在含有100μL高糖RPMI 1640(17mM葡萄糖)、20μL尿苷(5mM)和20μL过氧化氢(0.1mM)的培养瓶内培养2h。培养基中的尿苷用于刺激细胞内胰岛素的合成，同时加入过氧化氢以诱导氧化应激反应。将功能性茉莉花渣多糖进行稀释20倍后加入培养瓶中，培养24h和36h。通过MTT法测定细胞活性，用Rat Insulin ELISA试剂盒进行胰岛素分泌能力测定。所述各实施例组和各对比例组均选择分子量10<Mr≤30茉莉花渣多糖溶液进行试验，具体试验数据见表3。
表3：
组别 RIN-5F细胞活性(％) 胰岛素分泌能力(ng/mL)
实施例1 93.88 9.15
实例例2 90.19 8.90
实例例3 92.67 9.07
对比例1 35.19 3.55
对比例2 48.44 4.49
对比例3 52.81 5.31
对比例4 61.05 5.83
对比例5 41.33 3.71
RIN-5F细胞活性(％)越大，表明其降血糖能力越强；胰岛素分泌越多，表明其抗糖尿病能力越强。从表3可以看出，实施例1-3制得的茉莉花渣多糖具有很高的降血糖活性。而对比例1-5因茉莉花渣多糖制备步骤的技术有所改变，所以降血糖活性有不同程度的降低。
对比实验4：
检测实施例1制备得到的茉莉花渣粗多糖和实施例1制备得到的不同分子量的茉莉花渣多糖的体外降血糖活性，具体实验方法参考对比试验3，具体检测结果见表4。
表4：
组别 RIN-5F细胞活性(％) 胰岛素分泌能力(ng/mL)
Mr>1000kD多糖 37.28 3.55
500<Mr≤1000kD多糖 49.29 4.29
100<Mr≤500kD多糖 56.12 5.56
30<Mr≤100kD多糖 68.92 7.04
10<Mr≤30kD多糖 93.88 9.15
Mr≤10kD多糖 41.12 3.91
茉莉花渣粗多糖 71.34 7.59
从表4结果可知，不同分子量的茉莉花渣多糖溶液其降血糖的能力不同，当多糖分子量为10<Mr≤30kD时，RIN-5F细胞活性(％)最强，且胰岛素分泌浓度最高。说明分子量10<Mr≤30的茉莉花渣多糖是降血糖、改善糖尿病症状的关键有效组分。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (6)

1.茉莉花渣活性多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)茉莉花渣预处理：将茉莉花渣烘干至恒重，粉碎过筛，得到茉莉花渣粉末；将茉莉花渣粉末与无水乙醇混匀，超声振荡2-3h后，过滤取滤渣，烘干至恒重，即为脱脂茉莉花渣粉末；
(2)膨发性茉莉花渣粉末制备：将脱脂茉莉花渣粉末套袋，然后在20-27℃、超高压350-450MPa下处理1-3min后瞬间泄压，使茉莉花渣粉末成为膨发性茉莉花渣粉末；
(3)茉莉花渣总提取物制备：在膨发性茉莉花渣粉末中加入水，然后装入聚乙烯塑料袋，混合均匀后，用纯碱调节pH值至7.5-8.5；将真空封口的塑料袋置于温度为15-25℃，压强为500-700MPa的条件下提取，提取时间为5-7min；将提取液离心，收集上清液；在上清液加入柠檬酸至中性；上清液经液氮速冻后，放入微波冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣总提取物；
(4)正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取：在茉莉花渣总提取物中按体积比为1：1.5-2加入正己烷-乙酸乙酯溶剂，所述正己烷-乙酸乙酯溶剂的正己烷：乙酸乙酯为2：5(v/v)；振摇，静置，待溶液完全分层后，上层即为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取物，下层为正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物I；下层用同样的方法再萃取两次，得到正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II；
(5)氯仿萃取：在正己烷-乙酸乙酯溶剂体系萃取剩余物II中按体积比1：1.5-2加入氯仿，振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为氯仿萃取物，下层为氯仿萃取剩余物I；下层用同样的方法再萃取两次，得到氯仿萃取剩余物II；
(6)正丁醇-甲醇溶剂体系萃取：在氯仿萃取剩余物II中按体积比1：1-3加入正丁醇-甲醇-水溶剂，所述正丁醇-甲醇-水溶剂的正丁醇：甲醇：水为4：2：5(v/v)；振摇，静置，待溶液完全分层后，上层溶液即为正丁醇-甲醇溶剂体系萃取物，剩余的下层为水相萃取物I；下层再用同样的方法萃取两次，得到水相萃取物II；
(7)茉莉花渣粗多糖制备：向水相萃取物II中加入体积分数95％乙醇并在冰水中静置10-15h进行第一次醇沉，过滤得到沉淀物①；向沉淀物①中加入去离子水，加热溶解后过滤去除不溶物；再加入体积分数95％乙醇并在冰水中放置24h进行第二次醇沉，过滤得到沉淀物②；将所得沉淀②放入超声辅助真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得茉莉花渣粗多糖；
(8)茉莉花渣多糖分离纯化：向茉莉花渣粗多糖中加入去离子水，加热溶解，过滤去除不溶物，得到茉莉花渣粗多糖溶液；采用超频震动膜过滤系统，将茉莉花渣粗多糖溶液分别过分子量(Mr)1000kD、500kD、300kD、100kD、50kD、30kD、10kD、3kD和650D滤膜，得到6份分子量不同的茉莉花渣多糖溶液，分别为Mr>1000kD的茉莉花渣多糖溶液、500kD<Mr≤1000kD的茉莉花渣多糖溶液、100kD<Mr≤500kD的茉莉花渣多糖溶液、30kD<Mr≤100kD的茉莉花渣多糖溶液、10kD<Mr≤30kD的茉莉花渣多糖溶液和Mr≤10kD的茉莉花渣多糖溶液。
2.如权利要求1所述的茉莉花渣活性多糖的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述茉莉花渣粉末与无水乙醇的固液比为1：20mg/mL。
3.如权利要求1所述的茉莉花渣活性多糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述膨发性茉莉花渣粉末与水的固液比为1：20mg/mL。
4.如权利要求1所述的茉莉花渣活性多糖的制备方法，其特征在于：步骤(7)中，所述两次醇沉加入的95％乙醇的体积均为水相萃取物II体积的4倍。
5.权利要求1-4任一项制备所得的分子量30kD<Mr≤100kD茉莉花渣多糖溶液在制备抗失眠症或抗抑郁症药物中的应用。
6.权利要求1-4任一项制备所得的分子量10kD<Mr≤30kD茉莉花渣多糖溶液在制备抗糖尿病药物中的应用。
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