CN111182886A - 包含皂苷元和外排体作为有效成分的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含外排体和皂苷元作为有效成分的组合物。根据本发明的组合物可促进前脂肪细胞增殖、脂肪细胞中脂质积聚和/或脂肪细胞分化，并且降低由皂苷元成分引起的细胞毒性。因此，本发明的组合物可方便地施加至并用于由于脂质不足所致体积小而不令人满意的复杂身体区域中，以及施加至由脂质不足引起的皮肤缺陷区域，同时降低对人体或皮肤的副作用。

Description

包含皂苷元和外排体作为有效成分的组合物

技术领域

本发明涉及包含皂苷元与外排体的组合作为活性成分的组合物，并且更具体地涉及用于预防、减轻、改善或恢复由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域的组合物。

此外，本发明涉及包含上述组合物的化妆品组合物和皮肤外用制剂。

背景技术

随着对面部或身体等的外观的关注提高，对化妆品的需求也在提高，以改善皮肤状况并修饰外观的下部。特别地，对于目的在于改善皮肤皱纹和皮肤外观的另一些状况的美容方法的关注持续增加。例如，存在通过将肉毒毒素或填充剂表面注射至皮肤中来改善皮肤皱纹的方法。

近年来，对美容方法给予很多关注，所述美容方法可使由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的身体部位(所谓的“遭受自卑情结的身体部位”)填充并使该身体部位看起来漂亮。由于填充剂具有填充效果，因此其可被局部施加至显示缺陷的身体部位，例如看起来较不饱满的唇、鼻、前额、颊、乳房、生殖器等等，并且使这些身体部位填充。然而，透明质酸填充剂具有填充剂随着时间在体内降解的问题，并且因此需要将其周期性地注射至显示缺陷的身体部位中以使该身体部位保持填充。另外，填充剂注射具有疼痛的问题。

因此，有必要开发新的化妆品材料，其可将脂肪引入由于脂质不足而看起来较不饱满的显示缺陷的不满意身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域中，以使这些身体部位或皮肤区域填充，但不会引起疼痛且易于使用。有鉴于此，已经提出了使用包含知母皂苷元(sarsasapogenin)的植物提取物来使皮下脂肪组织扩张的方法。然而，知母皂苷元应在其制剂的稳定性、由其细胞毒性引起的副作用的可能性以及其效力的增强方面来进行改进。

最近，有报道称细胞分泌组(secretome)包含调节细胞行为的多种生物活性分子。特别地，细胞分泌组包含具有细胞间信号传导功能的“外排体(exosome)”，并且因此已积极地对其组分和功能进行了研究。

细胞向其细胞外环境脱落多种膜囊泡，并且这些释放的囊泡通常称为胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)。胞外囊泡也被称为细胞膜来源囊泡、核外颗粒体、脱落囊泡、微粒、外排体等，并且在一些情况下也与外排体区别使用。

外排体是尺寸为数十至数百纳米的囊泡，其由与细胞膜具有相同结构的磷脂双层膜组成。该外排体包含被称为外排体载物(cargo)的蛋白质、核酸(mRNA、miRNA等)等。已知，外排体的载物包括范围广泛的信号传导因子，并且这些信号传导因子对细胞类型具有特异性且根据分泌细胞的环境而受到不同调节。已知，外排体是由细胞分泌的细胞间信号传导介质，并且通过其传输的多种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。根据外排体来源于的细胞的性质和状态，外排体包含特定的遗传物质和生物活性因子。来源于增殖中干细胞的外排体调节细胞行为，例如细胞迁移、增殖和分化，并且概括参与组织再生的干细胞的特征(Nature Review Immunology 2002(2)569-579)。

然而，尽管已进行了表明使用外排体来治疗一些疾病的可能性的多个外排体研究，但是对于可稳定地维持和储存外排体以及使外排体与多种医学或美容技术联系用于提高外排体的便利性和效力的新制剂的开发并没有给予很多关注。

本发明人已对外排体的新应用以及外排体与医学或美容技术的联系进行了广泛的研究，并且作为结果，已发现皂苷元与外排体的组合促进前脂肪细胞增殖、脂肪细胞中脂质摄入和脂肪生成，而且降低由皂苷元引起的细胞毒性，从而完成本发明。

同时，应当理解的是，作为背景技术描述的内容仅旨在帮助理解本发明的背景，并不被认为是针对本发明的现有技术。

发明内容

技术挑战

本发明的一个目的是提供用于预防、减轻、改善或恢复由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域的组合物，其包含皂苷元与外排体的组合作为活性成分。

本发明的另一个目的是提供包含上述组合物的功能性化妆品组合物和皮肤外用制剂。

本发明的又一个目的是提供除治疗目的之外的美容方法，其包括：将上述组合物局部施加至哺乳动物的显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域，以及使已施加有组合物的身体部位或皮肤区域填充。

然而，如上所述的本发明目的是举例说明性的并且本发明的范围不限于此。另外，通过以下描述、所附权利要求书和附图，本发明的其他目的和优点将更加明显。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供了用于预防、减轻、改善或恢复由脂质不足引起的显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域的组合物，其包含皂苷元与外排体的组合作为活性成分。

本文中使用的术语“外排体”是指尺寸为数十至数百纳米(优选地，约30至200nm)的囊泡，其由与细胞膜具有相同结构的磷脂双层膜组成(然而，根据外排体分离自的细胞的类型、分离方法和测量方法，外排体的颗粒尺寸是可变的)(Vasiliy S.Chemyshev et al.，“Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes”，AnalBioanal Chem，(2015)DOI 10.1007/s00216-015-8535-3)。这些外排体包含被称为外排体载物的蛋白质、核酸(mRNA、miRNA等)，等等。已知，外排体的载物包括范围广泛的信号传导因子，并且这些信号传导因子对细胞类型具有特异性且根据分泌细胞的环境而受到不同调节。已知，外排体是由细胞分泌的细胞间信号传导介质，并且通过其传输的多种细胞信号调节细胞行为，包括靶细胞的活化、生长、迁移、分化、去分化、凋亡和坏死。

本文中使用的术语“皂苷元”是指皂苷的苷元，其中一些作为游离形式分布在植物系统中。皂苷元是可从多种植物中提取的天然来源化合物，并且已知改善血流量且具有镇咳、祛痰、利尿和抗癌作用。皂苷元的类型是不受限制的，但是作为实例而不是对本发明进行限制，皂苷元可以是薯蓣皂苷元(diosgenin)、海柯皂苷元(hecogenin)、异菝葜皂苷元(smilagenin)、表异菝葜皂苷元(epismilagenin)、知母皂苷元、异知母皂苷元(isosarsasapogenin)、表知母皂苷元(episarsasapogenin)、洋菝葜皂苷元(parigenin)、提果皂苷元(tigogenin)、表提果皂苷元(epitigogenin)、新提果皂苷元(neotigogenin)、洋菝葜皂苷(parillin)、知母皂苷(timosaponin)、西陵皂苷(xilingsaponin)、知母皂苷(filiferin)、雅姆皂苷元(yamogenin)或丝兰皂苷元(yuccagenin)，并且优选地，其可以是薯蓣皂苷元。

本文中使用的术语“生物溶液”是指外排体分散、混悬、沉淀、漂浮或混合在其中的具有生物来源的液体溶液。生物溶液的一些实例包括细胞培养物的条件培养基、细胞培养物的上清液、干细胞培养物的条件培养基、干细胞培养物的上清液、全血、血清、脐带血、血浆、腹水、脑流体和脑脊液、胎盘提取物和骨髓抽吸物。然而，应理解的是，本发明不限于此，并且不排除来源于多种生物体例如多种动物、植物、细菌、真菌、藻类等的溶液。可将生物溶液在释放和/或分泌外排体的条件下进行培养或孵育，并且也可冷冻和解冻。

同时，本文中使用的术语“外排体”旨在包括从多种动物、植物、细菌、真菌、藻类等的细胞(优选干细胞)分泌并释放至胞外空间中且具有纳米尺寸囊泡结构和与外排体的组成类似的组成的所有囊泡(例如，外排体样囊泡)。

然而，作为用于本发明的外排体，当然可使用本领域中距在使用或在未来可能使用的多种外排体，只要它们有效地预防、减轻、改善或恢复由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域并且不会对人体造成不良作用即可。因此，应当注意的是，根据下述实施例的分离方法分离的外排体应理解为可用于本发明的外排体的一个实例，并且本发明不限于此。

本文中使用的术语“显示缺陷的身体部位”或“显示缺陷的皮肤区域”是指由于脂质不足等而看起来较不饱满的身体部位，例如小乳房或生殖器，或者缺乏皮下脂肪的皮肤区域，等等。显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域可导致例如皮肤松弛、颊凹陷、眼凹陷、皮肤皱纹(例如面部皱纹、颈部皱纹、手部皱纹等)、皮肤弹性降低、细纹、皱纹、粗和深皱纹、皮肤裂纹、隆起(bump)、皮肤干燥，等等。

另外，本文中使用的术语“填充”可指1)“使由于脂质不足等而看起来较不饱满的不满意身体部位填充”，2)“预防、减轻、改善或恢复由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域”，或者3)通过上述1)和/或2)“使身体或皮肤看起来漂亮”。作为实例而不是对本发明进行限制，表述“预防、减轻、改善或恢复由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域”包括以下过程：促进前脂肪细胞增殖、脂肪细胞中脂质摄入和/或脂肪生成，以及刺激脂肪细胞向显示脂质不足的皮肤区域中的引入和生长。脂肪细胞的这种引入和生长可逐步地显著提高皮肤的厚度，从而产生饱满、体积增大(volume-up)和皮肤紧致效果，使皮肤具有弹性并预防、减轻、改善或消除皮肤缺陷。

例如，表述“预防、减轻、改善或恢复由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域”可包括预防、减轻、改善或消除皮肤松弛、颊凹陷、眼凹陷、皮肤皱纹(例如面部皱纹、颈部皱纹、手部皱纹等)、皮肤弹性降低、细纹、皱纹、粗和深皱纹、皮肤裂纹、隆起、瘢痕、萎缩纹等，或者使这些状况恢复至正常状态；皮肤再生、脂肪组织再生、轮廓矫正、软组织缺陷矫正、组织增大、体积增大、乳房增大、生殖器增大、皮肤保湿等等。然而，本发明中的表述“预防、减轻、改善或恢复由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域”不限于上述这些，并且可包括促进前脂肪细胞增殖、脂肪细胞中脂质摄入和/或脂肪生成，以及刺激脂肪细胞向显示脂质不足的区域中的引入和生长，从而预防、减轻、改善、消除或恢复显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域，所述缺陷代表由多种原因引起的脂质不足。

根据本发明一个实施方案的组合物包含外排体与皂苷元的组合作为活性成分。

在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体与皂苷元的组合可通过将外排体与皂苷元一起孵育来获得。

在根据本发明一个实施方案的组合物中，外排体与皂苷元的组合可通过将外排体与皂苷元混合并将外排体与皂苷元的混合物进行孵育来获得。在外排体与皂苷元的组合中，皂苷元可渗透到外排体中或至少与外排体缔合以装载在外排体中。

根据本发明一个实施方案的组合物可促进前脂肪细胞增殖、脂肪细胞中脂质摄入或脂肪生成中的至少一种。另外，根据本发明一个实施方案的组合物可降低由皂苷元引起的细胞毒性。

作为一个实例而不是对本发明进行限制，外排体可通过进行以下步骤来获得：(a)向生物溶液中添加海藻糖；(b)过滤已添加有海藻糖的生物溶液；(c)通过切向流过滤(tangential flow filtration，TFF)从经过滤的生物溶液中分离外排体；以及(d)向用于渗滤的缓冲液中添加海藻糖，并使用已添加有海藻糖的缓冲液通过TFF对分离的外排体进行渗滤。

同时，当在步骤(d)中将海藻糖添加至用于渗滤的缓冲液中时，可有效获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体(参见图6A至6E)。在本发明中，通过在使用TFF分离外排体之前的预过滤过程(步骤(b))中和在外排体分离之后使用TFF进行的渗滤过程(步骤(d))中使用海藻糖，可以以高产率获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体。同时，在本发明中，海藻糖用于将外排体与杂质例如细胞碎片、废物、蛋白质和大颗粒有效地区分开。

渗滤可连续或不连续地进行。渗滤可使用体积是分离的外排体的至少4倍、优选至少6至10倍、更优选至少12倍的缓冲液来进行。另外，TFF可使用0.05μm过滤器或者具有100,000Da(道尔顿)、300,000Da、500,000Da或750,000Da的截留分子量(molecular weightcutoff，MWCO)的TFF过滤器来进行。步骤(c)还可包括通过TFF将分离的外排体浓缩至1/100至1/25的体积。

作为一个实例而不是对本发明进行限制，生物溶液可以是干细胞培养物的条件培养基。干细胞不限于其种类，而可优选地是间充质干细胞，例如，脂肪、骨髓、脐带或脐带血来源的干细胞，更优选脂肪来源干细胞。脂肪来源干细胞不限于其种类，只要其没有感染病原体的风险并且不引起免疫排斥即可，但是其可优选地是人脂肪来源干细胞。

然而，本发明中使用的外排体不限于通过上述分离方法获得的外排体，并且当然可使用在本领域中正在使用或可能在未来使用的多种外排体。应当注意的是，根据分离方法分离的外排体应理解为可用于本发明的组合物中的外排体的一个实例，并且本发明不限于此。

根据本发明一个实施方案的组合物可有效地用于预防、减轻、改善或恢复由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域。

根据本发明一个实施方案的组合物可以是功能性化妆品组合物或皮肤外用制剂。

同时，当根据本发明一个实施方案的组合物被制备为皮肤外用制剂和/或化妆品组合物时，在不损害本发明作用的范围内，根据需要，其可适当地包含化妆品产品或皮肤外用制剂中通常使用的组分，例如保湿剂、抗氧化剂、油性组分、UV吸收剂、乳化剂、表面活性剂、增稠剂、醇、粉组分、着色剂、水性组分、水和多种皮肤营养素等。

此外，除了皂苷元与外排体的组合之外，根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物还可包含现有技术中使用的表现出组织增大或重构特性的组分，只要这些组分不损害该组合的作用(即预防、减轻、改善或恢复由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域的作用)即可。例如，构成本发明组合物的皂苷元和外排体可包含在水凝胶、透明质酸、透明质酸的盐(例如透明质酸钠等)或透明质酸凝胶中的至少一种中或与其混合。在根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物中，水凝胶的种类没有特别限制，但是水凝胶可优选地通过将胶凝聚合物分散在多元醇中来获得。胶凝聚合物可以是选自以下的至少一种：普朗尼克、纯化琼脂、琼脂糖、结冷胶、藻酸、卡拉胶、肉桂胶、黄原胶、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、果胶、纤维素、瓜尔胶和槐豆胶，并且多元醇可以是选自以下的至少一种：乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、异丁二醇、二丙二醇、山梨糖醇、木糖醇和甘油。

根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可以以多种形式使用，例如，贴片

片装面膜

面膜巾

霜

活肤水

软膏

混悬剂

乳剂

糊剂

化妆水

凝胶剂

油剂

剥撕式面膜

喷雾剂

气雾剂

雾剂

粉底

粉

和油纸

例如，皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可被施加至贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面或浸在所述贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面中。

当将根据本发明一个实施方案的组合物制备成化妆品组合物时，其用于预防、改善、减轻或恢复由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的不满意身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域的目的，并且所述化妆品组合物可制备成本领域中通常制备的任何制剂。例如，其可配制成：贴片、片装面膜、面膜巾、皮肤软化剂、营养品、收敛化妆水、滋养霜、按摩霜、眼霜、清洁霜、精华、眼部精华、清洁化妆水、清洁泡沫、清洁水、防晒霜、唇膏、肥皂、洗发香波、含表面活性剂的清洁剂、浴用制剂、身体洗剂、身体霜、身体油、身体精华、身体清洁剂、染发剂、生发剂等，但不限于此。

根据本发明一个实施方案的皮肤外用制剂和/或化妆品组合物包含通常在皮肤外用制剂和/或化妆品产品中使用的组分。例如，皮肤外用制剂和/或化妆品组合物可包含常规的辅料和载体，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料。另外，根据皮肤外用制剂和/或化妆品组合物的类型或预期用途，本领域技术人员可毫无困难地适当选择皮肤外用制剂和/或化妆品组合物的每种制剂中的其他组分。

本发明的另一个实施方案提供了除治疗目的之外的美容方法，其包括将上述组合物局部施加至哺乳动物的显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域，以及使已施加有组合物的身体部位或皮肤区域填充。例如，填充可以是皮肤饱满、体积增大、皮肤紧致或皮肤弹性改善。

根据本发明的一个实施方案的美容方法包括：(a)将所述组合物直接施加至哺乳动物皮肤；或者(b)使贴片、片装面膜或面膜巾与哺乳动物皮肤接触或附着至哺乳动物皮肤，所述贴片、片装面膜或面膜巾具有向其施加或浸在其中的所述组合物；或者依次进行(a)和(b)。

有益效果

包含皂苷元与外排体的组合作为活性成分的本发明组合物能够促进前脂肪细胞增殖、脂肪细胞中脂质摄入和/或脂肪生成，而且降低由皂苷元引起的细胞毒性。因此，本发明的组合物可减少对身体或皮肤的副作用，并且可使用使得其方便地施加至由于脂质不足等而看起来较不饱满的显示缺陷的不满意身体部位或由脂质不足引起的显示缺陷的皮肤区域。

另外，本发明的组合物能够通过脂肪细胞的引入和生长而逐步地显著提高皮肤的厚度，从而表现出皮肤缺陷矫正、饱满、体积增大和紧致皮肤效果。因此，本发明的组合物可用作功能性化妆品组合物和皮肤外用制剂，用于在显示脂质不足的皮肤区域中促进脂肪细胞中脂质摄入和脂肪生成以及刺激脂肪细胞的引入和生长。

应当理解的是，本发明的范围不限于前述效果。

附图说明

图1是举例说明根据本发明一个实施方案由生物溶液制备外排体的方法中分离和纯化外排体的方法的流程图。

图2示出了测量根据本发明一个实施方案由生物溶液(例如干细胞培养基)制备外排体的每个步骤中溶液中包含的蛋白质的相对量的结果。每个步骤中蛋白质的相对量表示为每个步骤的溶液中蛋白质的总量与生物溶液中蛋白质的总量的相对比。所示实验结果是分别从两个不同批次获得的结果。

图3示出了测量根据本发明一个实施方案获得的外排体的生产率和纯度的结果。外排体的生产率作为每mL生物溶液(例如干细胞条件培养基(CM))所获得的外排体颗粒的数目进行计算，并且外排体的纯度作为最终级分中包含的每μg蛋白质的外排体颗粒数目进行计算。所示实验结果是分别从五个不同批次获得的结果。

图4A至4E示出了分析根据本发明一个实施方案获得的外排体的物理特性的结果。“图4A”示出了通过可调电阻脉冲传感(tunable resistive pulse sensing，TRPS)分析获得的颗粒尺寸分布和颗粒数目。“图4B”示出了通过纳米粒追踪分析(nanoparticletracking analysis，NTA)获得的颗粒尺寸分布和颗粒数目。“图4C”示出了通过透射电子显微术(transmitted electron microscopy，TEM)分析获得的不同放大率的颗粒图像。“图4D”示出了根据本发明一个实施方案获得的外排体的Western印迹分析的结果。“图4E”示出了在对根据本发明一个实施方案获得的外排体的标志物的分析中CD63和CD81的流式细胞术的结果。

图5A至5C示出了颗粒尺寸分布的NTA分析的结果，其显示通过添加海藻糖获得了具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体。随着添加的海藻糖的量提高，可获得具有单峰的颗粒尺寸分布。

图6A至6C示出了NTA分析的结果，其显示根据在根据本发明一个实施方案的制备外排体的过程中是否添加海藻糖而获得的颗粒尺寸分布。“图6A”示出了在整个制备过程中添加海藻糖时所获得的结果；“图6B”示出了在条件培养基被冷冻储存并解冻并随后向解冻的培养基中添加海藻糖的情况下所获得的结果；并且“图6C”示出了在未添加海藻糖时获得的结果。“图6D”示出了将通过图6A至6C的方法分离的外排体的相对生产率和相对浓度进行比较的结果。“图6E”示出了通过图6A至6C的方法分离的外排体的平均尺寸。

图7示出了显示当用根据本发明一个实施方案的外排体处理人成纤维细胞HS68细胞时该外排体没有细胞毒性的结果。

图8示出了显示根据本发明一个实施方案用皂苷元与外排体的组合进行处理用于诱导3T3-L1细胞脂肪生成导致细胞中脂滴的积聚量和尺寸增大的光学显微照片。

图9示出了通过在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后6天用油红O对3T3-L1细胞进行染色而获得的光学显微照片。

图10是显示作为相对于阴性对照的百分比的经油红O染色3T3-L1细胞中脂质积聚量的提高的图。

图11示出了在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后3天获得的光学显微照片。图11显示死细胞失去其原始形状并且从底部脱离而漂浮在培养基中。

图12是显示通过在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后3天进行MTT测定获得的作为相对于阴性对照的百分比的细胞生存力结果的图。

图13是显示在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后6天对PPAR-γ基因进行实时PCR的结果的图。

图14是显示在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后0、1和4天对C/EBP-α基因进行实时PCR的结果的图。

图15是显示在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后0、1和4天对FAS基因进行实时PCR的结果的图。

图16是显示在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后0、1和4天对ACC基因进行实时PCR的结果的图。

图17是显示在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后0、1和4天对GPDH基因进行实时PCR的结果的图。

图18是显示在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后0、1和4天对GAPDH基因进行实时PCR的结果的图。

图19是显示在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导3T3-L1细胞分化之后0、1和4天对Pref-1基因进行实时PCR的结果的图。

图20是显示根据本发明一个实施方案用皂苷元与外排体的组合处理的组中前脂肪细胞的增殖速率高于作为阳性对照经吡格列酮处理的组中前脂肪细胞的增殖速率的图。

具体实施方式

在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅是举例说明本发明并且不旨在限制或约束本发明的范围。本领域技术人员可从本发明的发明详述和实施例中容易地推断出的那些被解释为落入本发明的范围内。本发明中提及的参考文献通过引用并入本文。

应当理解的是，在本说明书通篇，当任何部分被提及“包含”任何组分时，除非另有指明，否则其不排除其他组分，而是还可包含其他组分。

实施例

实施例1：细胞培养

在37℃、5％CO₂下，将购自ATCC的人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast，HDF)HS68细胞在包含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；购自ThermoFisherScientific)和1％抗生素-抗真菌剂(购自ThermoFisher Scientific)的DMEM(购自ThermoFisher Scientific)培养基中进行传代培养。此外，在37℃、5％CO₂下，将购自ATCC的3T3-L1前脂肪细胞在包含10％NBCS(新生牛血清(New Born CalfSerum))和1％青霉素/链霉素的DMEM(购自ThermoFisher Scientific)中进行传代培养。

根据本发明所属技术领域中已知的细胞培养方法，在37℃、5％CO₂下培养脂肪来源干细胞。接下来，用磷酸缓冲盐水(购自ThermoFisher Scientific)洗涤细胞，并随后用不含血清、不含酚红的培养基替代培养基，并将细胞培养1至10天。回收上清液(在下文中称为“条件培养基(CM)”)。

为了在外排体分离过程中获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体，向条件培养基中添加2wt％的海藻糖。在添加海藻糖之后，通过0.22μm过滤器过滤条件培养基以去除杂质，例如细胞碎片、废物、大颗粒等。立即从经过滤的条件培养基中分离外排体。另外，经过滤的条件培养基储存在冰箱(10℃或低于10℃)中，并随后用于外排体分离。此外，经过滤的条件培养基冷冻储存在-60℃或低于-60℃的超低温冷冻箱中，解冻，并随后进行外排体分离。此后，通过TFF从条件培养基中分离外排体。

实施例2：通过TFF方法的外排体分离和纯化

为了从实施例1中通过0.22μm过滤器过滤的条件培养基中分离、浓缩和渗滤外排体，使用了TFF方法。作为用于TFF方法的过滤器，使用了筒式过滤器(也称为中空纤维过滤器；购自GE Healthcare)或盒式过滤器(购自Pall、Sartorius或Merck Millipore)。可选择具有不同截留分子量(MWCO)的TFF过滤器。使用具有选定MWCO的过滤器，将外排体分离并浓缩，并去除小于该MWCO的颗粒、蛋白质、脂质、核酸、低分子量化合物等。

为了分离和浓缩外排体，使用具有100,000Da(道尔顿)、300,000Da或500,000Da的MWCO的TFF过滤器。通过TFF方法通过去除小于该MWCO的物质并将条件培养基浓缩至约1/100至1/25的体积，从条件培养基中分离外排体。

将分离和浓缩的外排体溶液使用TFF方法另外进行渗滤。使用体积是分离的外排体的至少4倍、优选至少6至10倍、更优选至少12倍的缓冲液连续地(连续渗滤)或不连续地(不连续渗滤)进行渗滤。为了获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体，向缓冲液中添加在PBS中的2wt％海藻糖。图6A至6E示出了通过添加海藻糖可以以高产率获得具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体的结果。

实施例3：分离的外排体的特征分析

使用BCA比色测定(购自ThermoFisher Scientific)或FluoroProfile荧光测定(购自Sigma)测量分离的外排体、条件培养基和TFF分离过程中级分的蛋白质的量。对于通过根据一个实施方案的TFF方法分离和浓缩的外排体，通过蛋白质测定监测蛋白质、脂质、核酸、低分子量化合物等被去除的程度，并且监测结果示于图2中。作为结果，可以看出，通过根据一个实施方案的TFF方法非常有效地去除了条件培养基中存在的蛋白质。

图3示出了当通过根据一个实施方案的TFF方法分离外排体时将五个独立批次各自中外排体的生产率和纯度进行比较的结果。分析了从五个独立批次获得的结果，并且作为结果，确定通过根据一个实施方案的TFF方法非常稳定地分离了外排体。

分离的外排体的颗粒尺寸和浓度通过纳米粒追踪分析(NTA)仪器(购自Malvem)或可调电阻脉冲传感(TRPS)仪器(购自Izon Science)进行测量。通过透射电子显微术(TEM)分析了分离的外排体的均一性和尺寸。图4A至图4C示出了通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体的TRPS、NTA和TEM的结果。

在通过TFF方法分离外排体之后，根据是否添加海藻糖通过NTA分析外排体的尺寸分布。分析的结果示于图5A至5C中。海藻糖的浓度从0wt％提高至1wt％和2wt％(在图5A至5C中从顶部到底部)，并且实验重复进行3次。确定，当不使用海藻糖时，观察到尺寸为300nm或更大的颗粒，然而随着添加的海藻糖的量提高，尺寸为300nm或更大的颗粒的数目降低并且外排体的尺寸分布变得均一。

另外检测了在通过TFF方法分离外排体的过程中由添加海藻糖引起的作用。如图6A至6C中所示，当在制备外排体的整个过程中添加在PBS中的2wt％海藻糖时，可获得具有均一尺寸分布的外排体(图6A)。然而，当使用在不添加海藻糖的情况下冷冻储存的条件培养基而仅在渗滤过程中添加海藻糖的情况下进行TFF过程，或者在未添加任何海藻糖的情况下进行TFF过程时，获得了包含大量大颗粒的不均一的外排体(图6B和6C)。

对分离的外排体的相对生产率和浓度进行比较，并且作为结果，当在整个外排体产生过程中添加海藻糖时，可以以非常高的生产率获得外排体。所获得的外排体的浓度是对照(其中在整个外排体产生过程中未添加海藻糖)的至少5倍(图6D)。如NTA分析结果所示，确定当在整个外排体产生过程中添加海藻糖时，分离的外排体的平均尺寸是均一的(200nm)(图6E)。

图4D示出了通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体的Western印迹分析的结果。如其中所示，确定了CD9、CD63、CD81和TSG101标志物的存在。作为针对每种标志物的抗体，分别使用抗CD9(购自Abcam)、抗CD63(购自System Biosciences)、抗CD81(购自System Biosciences)和抗TSG101(购自Abcam)。

图4E示出了通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体的流式细胞术的结果。如其中所示，确定了CD63和CD81标志物的存在。为了分离CD63阳性外排体，根据制造商的说明书使用外排体-人CD63分离/检测试剂盒(购自ThermoFisher Scientific)。用PE-小鼠抗人CD63(购自BD)或PE-小鼠抗人CD81(购自BD)对标志物进行染色，并随后使用流式细胞仪(ACEA Biosciences)进行分析。

综合以上结果，可确定根据本发明一个实施方案的分离方法可通过在基于切向流过滤的制造过程中添加海藻糖而以高产率经济且有效地分离和纯化具有均一颗粒尺寸分布和高纯度的外排体。另外，可以看出，根据本发明一个实施方案的分离方法的过程可按扩大规模，并且仍适合于GMP。

实施例4：外排体处理之后细胞毒性的测量

为了评价通过根据本发明一个实施方案的分离方法分离的外排体在人真皮成纤维细胞HS68细胞中的细胞毒性，用不同浓度的外排体处理细胞，并检测细胞的增殖速率。将HS68细胞悬浮于含10％FBS的DMEM中，随后接种并培养至80％至90％汇合，并在37℃、5％CO₂下在培养箱中培养24小时。在24小时之后，去除培养基，并用实施例2中制备的不同浓度的外排体处理细胞。然后，在细胞培养24至72小时时评价细胞的生存力。细胞生存力使用WST-1试剂(购自Takara)、MTT试剂(购自Sigma)、CellTiter-Glo试剂(购自Promega)或alamarBlue试剂(购自ThermoFisher Scientific)用微板阅读仪(购自MolecularDevices)进行测量。

使用未用外排体处理的在常规细胞培养基中培养的细胞作为对照。经确定，本发明的外排体在测试中使用的浓度范围内没有表现出细胞毒性(图7)。

实施例5：皂苷元与外排体的组合的制备

皂苷元与外排体的组合如下制备并使用：

(1)将皂苷元与外排体混合并在室温下孵育，并且完整使用反应产物(“皂苷元-外排体混合物”)；和

(2)将皂苷元与外排体混合并在室温下孵育，并且在去除未渗透到外排体中的皂苷元之后使用反应产物(“皂苷元-外排体”)。为了去除未与外排体缔合的皂苷元，使用了尺寸排阻柱，例如MW 3000离心柱(购自ThermoFisher)。

作为一个实例而不是对本发明进行限制，使用薯蓣皂苷元作为皂苷元。

在下文中，上述(1)和(2)二者都被称为皂苷元与外排体的组合。

实施例6：针对诱导脂肪生成的脂质摄入的评价

通过克隆扩增获得足够数目的3T3-L1前脂肪细胞并使用。对于3T3-L1前脂肪细胞的脂肪生成的诱导，如下评价由皂苷元与外排体的组合引起的细胞中脂质积聚的量。

将3T3-L1前脂肪细胞以8×10³细胞/cm²的密度接种至24孔板的每个孔中，并随后在37℃、5％CO₂下在培养箱中培养3至4天。接下来，在补充有0.5mM IBMX(购自Sigma)、0.5μM地塞米松(购自Sigma)和5μg/mL胰岛素(购自Sigma)(在下文中称为“分化混合物”)的包含10％FBS(胎牛血清)和5％青霉素/链霉素的DMEM培养基(在下文中称为“分化培养基”)中培养3T3-L1细胞并诱导其分化2天。根据用于诱导分化的分化条件将受试组划分如下：

(1)阴性对照：在分化培养基中培养的组；

(2)吡格列酮：在分化培养基中培养并用吡格列酮(购自Sigma；终浓度为10μM)进行处理的组(阳性对照)(在图10中由“P”表示)；

(3)薯蓣皂苷元：在分化培养基中培养并用薯蓣皂苷元(购自Sigma；终浓度为10μM)进行处理的组(在图10中由“D”表示)；以及

(4)薯蓣皂苷元与外排体的组合(薯蓣皂苷元+外排体)：在分化培养基中培养并用薯蓣皂苷元(终浓度为10μM)与在实施例2中制备的外排体(终浓度为4μg/mL)的组合进行处理的组(在图10中由“D+Exo”表示)。

在分化培养基中培养3T3-L1前脂肪细胞以开始诱导分化之后2天，将每组的分化培养基更换为补充有5μg/mL胰岛素的包含10％FBS(胎牛血清)和5％青霉素/链霉素的DMEM培养基(在下文中称为“成熟培养基”)，然后培养细胞并诱导其成熟2至20天。此时，每两天更换一次成熟培养基。

将成熟的3T3-L1细胞洗涤，固定，然后用油红O进行染色。通过图像分析对细胞中脂质的积聚量进行定量。另外，用苏木精对核进行染色，以使积聚在细胞质中的脂滴与核区分开，然后采集光学显微照片。细胞质中积聚的脂滴被油红O染成红色，而核被苏木精染成紫色(图8)。

如图8中所示，可确定的是，对于3T3-L1细胞的脂肪生成的诱导，与仅用分化培养基处理的阴性对照组中积聚的脂滴相比，在根据本发明一个实施方案用皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合处理的细胞中积聚了远远更大数目的脂滴。用皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合处理的细胞中脂滴的尺寸也大于仅用分化培养基处理的阴性对照组中脂滴的尺寸。

同时，由于3T3-L1细胞中脂滴的形成是指示脂肪生成的标志，因此，在用特定受试物质处理之后对3T3-L1细胞中脂滴的积聚量进行测量使得可客观地评价受试物质是否具有刺激脂质积聚和促进脂肪生成的作用。为此，对于每组在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导分化之后6天，用油红O对3T3-L1细胞进行染色并采集光学显微照片(图9)。另外，用异丙醇洗脱经染色脂滴中的油红O染料，然后在510nm处测量洗脱的溶液的吸光度，从而确定每组3T3-L1细胞中脂质的积聚量。此外，将相对于阴性对照的每组的脂质积聚量提高以百分比进行评价(图10)。

作为结果，确定根据一个实施方案用皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合处理的细胞中脂质的积聚量与阴性对照组中相比显著提高，并且与用单独皂苷元(薯蓣皂苷元)处理的细胞中相比也显著提高。从这些结果可以看出，与用单独皂苷元处理的组相比，当在根据本发明一个实施方案用皂苷元与外排体的组合处理前脂肪细胞的情况下诱导前脂肪细胞的脂肪生成时，细胞中脂质的积聚量显著提高并且促进脂肪生成。

因此，当将根据本发明的包含皂苷元与外排体的组合的组合物施加至由脂质不足引起的显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域时，所施加的组合物能够通过提高脂质积聚量而显示出皮肤缺陷矫正、饱满、体积增大和紧致皮肤效果。

实施例7：针对诱导脂肪生成的细胞保护作用的评价

已知皂苷元在高浓度下可诱导细胞死亡。为了评价根据本发明一个实施方案的皂苷元与外排体的组合的细胞保护作用，以与实施例6相同的方式诱导3T3-L1前脂肪细胞的脂肪生成，并对细胞生存力进行评价。根据用于诱导分化的分化条件将受试组划分如下：

(1)阴性对照：在分化培养基中培养的组；

(2)薯蓣皂苷元：在分化培养基中培养并用高浓度的薯蓣皂苷元(终浓度为30μM)进行处理的组(在图12中由“D”表示)；以及

(3)薯蓣皂苷元与外排体的组合(薯蓣皂苷元+外排体)：在分化培养基中培养并用高浓度的薯蓣皂苷元(终浓度为30μM)与实施例2中制备的外排体(终浓度为4μg/mL)的组合进行处理的组(在图12中由“D+Exo”表示)。

根据实施例6的方法在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导分化之后3天，用光学显微镜采集每组的3T3-L1细胞的照片。如图11中所示，观察到在仅用高浓度皂苷元(薯蓣皂苷元)处理的组中，发生3T3-L1细胞的细胞死亡，并且因此许多3T3-L1细胞失去其原始形状并从底部脱离而漂浮在培养基中。相比之下，当根据本发明一个实施方案用高浓度皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合处理3T3-L1细胞时，观察到3T3-L1细胞的细胞死亡相对较低。另外，为了定量评价观察到的结果，通过进行MTT测定测量细胞生存力。对于每组在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导分化之后3天，使用0.5mg/mL的溴化噻唑蓝四唑

(thiazolyl blue tetrazolium bromide)进行MTT测定。在570nm处测量吸光度，并且将相对于阴性对照组的每组的细胞生存力以百分比进行评价(图12)。

作为结果，确定与用单独的高浓度皂苷元(薯蓣皂苷元)处理的组中细胞生存力相比，当根据本发明一个实施方案用高浓度皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合处理细胞时，细胞生存力显著提高。可以看出，当在根据本发明一个实施方案用皂苷元与外排体的组合处理前脂肪细胞的情况下诱导前脂肪细胞的脂肪生成时，与用单独的皂苷元处理的组中相比，细胞中脂质摄入量提高，并且保护细胞免受由高浓度皂苷元引起的细胞毒性。

因此，根据本发明的包含皂苷元与外排体的组合的组合物与单独的皂苷元相比能够提高脂肪细胞中脂质摄入和促进脂肪生成并且还表现出皮肤缺陷矫正、饱满、体积增大和紧致皮肤效果，同时通过降低由皂苷元引起的细胞毒性降低对皮肤的副作用。

实施例8：通过测量脂肪生成标志物的表达水平对促进脂肪生成作用的评价

根据本发明一个实施方案的皂苷元与外排体的组合的促进脂肪生成作用如下评价。

将3T3-L1前脂肪细胞悬浮于补充有10％NBCS(新生牛血清)和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基)(购自ThermoFisher Scientific)中。接下来，将细胞以8×10³细胞/cm²的密度接种至12孔板的每个孔中，然后在37℃、5％CO₂下在培养箱中培养72小时。在此之后，将3T3-L1细胞在补充有0.5mM IBMX(购自Sigma)、0.5μM地塞米松(购自Sigma)和5μg/mL胰岛素(购自Sigma)(在下文中称为“分化混合物”)的包含10％FBS(胎牛血清)和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基(在下文中称为“分化培养基”)中培养并诱导其分化48小时。根据用于诱导分化的分化条件将受试组划分如下：

(1)生长培养基：代替分化培养基在DMEM培养基中培养的组；

(2)分化培养基：在分化培养基中培养的组；

(3)吡格列酮：在分化培养基中培养并用吡格列酮(终浓度为10μM)进行处理的组(阳性对照)；以及

(4)薯蓣皂苷元与外排体的组合(薯蓣皂苷元+外排体)：在分化培养基中培养并用薯蓣皂苷元(终浓度为10μM)与实施例2中制备的外排体(终浓度为6μg/mL)的组合进行处理的组。

在分化培养基中培养3T3-L1前脂肪细胞以开始诱导分化之后48小时，用补充有5μg/mL胰岛素的包含10％FBS(胎牛血清)和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基(在下文中称为“成熟培养基”)更换每组的分化培养基，然后将细胞培养48小时以诱导其成熟。

在分化培养基中培养3T3-L1细胞以开始诱导分化之后0、1、4和6天，通过实时PCR测量每组的脂肪生成相关标志物的表达水平，以确定根据本发明一个实施方案的皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合的促进脂肪生成作用。由从每组的3T3-L1细胞中分离的RNA合成cDNA，并通过实时PCR方法测量以下脂肪生成相关标志物的mRNA表达水平：PPAR-γ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、C/EBP-α(CCAAT/增强子结合蛋白α)、FAS(脂肪酸合酶)、ACC(乙酰辅酶A羧化酶)、GDPH(甘油-3-磷酸脱氢酶)、GADPH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和Pref-1(前脂肪细胞因子1)。将每组的mRNA表达水平与其他组的mRNA表达水平进行比较。作为用于使上述基因归一化的参考基因，使用PPIA(肽基脯氨酰异构酶A)基因。在实时PCR中使用的引物的序列示于下表1中。

表1：在实时PCR中所使用引物的核苷酸序列

作为结果，在开始诱导分化之后6天，与用单独的分化培养基进行处理相比，根据本发明一个实施方案用皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合进行处理显著提高了脂肪生成标志物PPAR-γ的mRNA表达水平(图13)。特别地，在开始诱导分化之后6天，与作为阳性对照用吡格列酮进行处理或者用单独的薯蓣皂苷元进行处理相比，根据本发明一个实施方案用皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合进行处理提高了PPAR-γ的mRNA表达水平。因此，可确定的是，当根据本发明一个实施方案用皂苷元与外排体的组合处理前脂肪细胞时，该组合在诱导脂肪生成之后的某个时间点表现出优于吡格列酮的促进脂肪生成作用。

另外，在开始诱导分化之后4天，与用单独的分化培养基进行处理相比，根据本发明一个实施方案用皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合进行处理显著提高了C/EBP-α(成熟脂肪细胞中存在的标志物)的mRNA表达水平(图14)。此外，根据本发明一个实施方案用皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合进行处理在开始诱导分化之后随时间提高了脂肪生成相关标志物FAS、ACC、GDPH和GADPH的mRNA表达水平(图15至18)。

同时，已确定，根据本发明一个实施方案用皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合进行处理显著降低了前脂肪细胞标志物Pref-1(前脂肪细胞因子1)的mRNA表达水平(图19)。

从上述实验结果可以看出，根据本发明的包含皂苷元与外排体的组合的组合物具有促进从前脂肪细胞进行脂肪生成变成脂肪细胞的作用。因此，当将本发明的组合物局部施加至由脂质不足引起的显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域时，其能够促进脂肪生成并刺激脂肪细胞的引入和生长，从而预防、减轻、改善或恢复显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域，所述缺陷代表由多种原因引起的脂质不足。

实施例9：前脂肪细胞的增殖速率的评价

为了确定根据本发明一个实施方案的皂苷元与外排体的组合是否促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖，如下进行实验。将3T3-L1前脂肪细胞悬浮于补充有10％NBCS(新生牛血清)和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基)(购自ThermoFisherScientific)中。接下来，将细胞以8×10³细胞/cm²的密度接种至96孔板的每个孔中，并用吡格列酮(终浓度为10μM)或者薯蓣皂苷元(终浓度为10μM)与实施例2中制备的外排体(终浓度为6μg/mL)的组合进行处理。接下来，将细胞在37℃、5％CO₂下在培养箱中培养48小时。在48小时之后，将细胞用包含0.5mg/mL的溴化噻唑蓝四唑

(购自Sigma)的DMEM培养基进行处理，然后培养2小时。

在去除培养基之后，将紫色晶体用二甲基亚砜(购自AMRESCO)进行溶解，并在570nm处测量吸光度，以评价根据本发明一个实施方案的皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合的促进前脂肪细胞增殖作用。作为结果，确定根据本发明一个实施方案用皂苷元(薯蓣皂苷元)与外排体的组合进行处理的组中前脂肪细胞的增殖速率高于作为阳性对照用吡格列酮进行处理的组中前脂肪细胞的增殖速率(图20)。

从前述实验结果可以看出，根据本发明的包含皂苷元与外排体的组合的组合物具有促进前脂肪细胞增殖的作用。因此，当将本发明的组合物局部施加至由脂质不足引起的显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域时，其能够促进前脂肪细胞的增殖，并且也提高所产生脂肪细胞的数目，从而预防、减轻、改善或恢复显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域，所述缺陷代表由多种原因引起的脂质不足。

尽管已参照一些实施方案描述了本发明，但是本发明的范围不限于这些实施方案。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可进行多种修改和改变，并且这些修改和改变也落入本发明的范围内。

<110> ExoCoBio Inc.

<120> 包含皂苷元和外排体作为有效成分的组合物

<130> OP18-0015PCT

<150> KR 10-2017-0128463

<151> 2017-09-30

<150> KR 10-2018-0109879

<151> 2018-09-13

<160> 16

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pref-1正向引物

<400> 1

tgcacactgg gttctctgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pref-1反向引物

<400> 2

atcgtagccg caaccaacag 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPAR-γ正向引物

<400> 3

ggagcctaag tttgagtttg ctgtg 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPAR-γ反向引物

<400> 4

tgcagcaggt tgtcttggat g 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C/EBP-α正向引物

<400> 5

cagcttacaa caggccaggt ttc 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> C/EBP-α反向引物

<400> 6

gctggcgaca tacagtacac acaa 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAS正向引物

<400> 7

ttgctggcac tacagaatgc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAS反向引物

<400> 8

aacagcctca gagcgacaat 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACC正向引物

<400> 9

gcgtcgggta gatccagtt 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACC反向引物

<400> 10

ctcagtgggg cttagctctg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPDH正向引物

<400> 11

ggcaagatct gtgaccagct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GPDH反向引物

<400> 12

atcagcacgc tcatgggaat 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH正向引物

<400> 13

ctttggtatc gtggaaggac tc 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH反向引物

<400> 14

gtagaggcag ggatgatgtt ct 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPIA正向引物

<400> 15

atcttgtcca tggcaaatgc tg 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPIA反向引物

<400> 16

aaacgctcca tggcttccac 20

Claims (12)

1.用于预防、减轻、改善或恢复由脂质不足引起的显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域的组合物，所述组合物包含皂苷元与外排体的组合作为活性成分。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述皂苷元与外排体的组合通过将所述外排体与所述皂苷元一起孵育来获得。

3.权利要求2所述的组合物，其中所述皂苷元与外排体的组合通过将所述外排体与所述皂苷元混合并将所述外排体与所述皂苷元的混合物进行孵育来获得。

4.权利要求3所述的组合物，其中在所述皂苷元与外排体的组合中的皂苷元渗透到所述外排体中或者至少与所述外排体缔合以装载在所述外排体中。

5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述组合物促进前脂肪细胞增殖、脂肪细胞中脂质摄入或脂肪生成中的至少一种。

6.权利要求5所述的组合物，其中所述组合物降低由所述皂苷元引起的细胞毒性。

7.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述组合物是功能性化妆品组合物或皮肤外用制剂。

8.权利要求7所述的组合物，其中所述组合物以选自以下的至少一种形式使用：贴片、片装面膜、面膜巾、霜、活肤水、软膏、混悬剂、乳剂、糊剂、化妆水、凝胶剂、油剂、剥撕式面膜、喷雾剂、气雾剂、雾剂、粉底、粉和油纸。

9.权利要求8所述的组合物，其中所述组合物被施加至所述贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面或者浸在所述贴片、片装面膜或面膜巾的至少一个表面中。

10.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述皂苷元是选自以下的至少一种：薯蓣皂苷元、海柯皂苷元、异菝葜皂苷元、表异菝葜皂苷元、知母皂苷元、异知母皂苷元、表知母皂苷元、洋菝葜皂苷元、提果皂苷元、表提果皂苷元、新提果皂苷元、洋菝葜皂苷、知母皂苷、西陵皂苷、知母皂苷、雅姆皂苷元和丝兰皂苷元。

11.除治疗目的之外的美容方法，所述美容方法包括将权利要求1至4中任一项中限定的组合物局部施加至哺乳动物的显示缺陷的身体部位或显示缺陷的皮肤区域，以及使已施加有所述组合物的所述身体部位或所述皮肤区域填充。

12.权利要求11所述的除治疗目的之外的美容方法，所述美容方法包括：(a)将所述组合物直接施加至哺乳动物皮肤；或者(b)使贴片、片装面膜或面膜巾与所述哺乳动物皮肤接触或附着至所述哺乳动物皮肤，所述贴片、片装面膜或面膜巾具有向其施加或浸在其中的所述组合物；或者依次进行(a)和(b)。

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