CN111172150B - 一种铁单原子纳米酶反应器的制备及其在合成α-酮戊二酸中的应用 - Google Patents

一种铁单原子纳米酶反应器的制备及其在合成α-酮戊二酸中的应用 Download PDF

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Abstract

一种铁单原子纳米酶反应器的制备及其在合成α‑酮戊二酸中的应用属于纳米材料制备及其生物化工应用领域。本发明通过表面包覆L‑谷氨酸氧化酶形成纳米酶反应器并将其应用于分解底物L‑谷氨酸钠，发挥其类过氧化氢酶活性，快速有效地清除系统产生的副产物H2O2，实现α‑酮戊二酸的生成，从而达到将廉价的L‑谷氨酸钠快速转化为市场价格昂贵的α‑酮戊二酸，有希望解决目前发酵合成法、酶法以及全细胞转化法时空产率低、稳定性差、反复使用性低及副产物多等难题，为后续工业合成提供了理论基础，具有较高的工业化生产应用价值。

Description

一种铁单原子纳米酶反应器的制备及其在合成α-酮戊二酸中 的应用
技术领域
本发明属于纳米材料制备及其生物化工应用领域，特别涉及铁单原子纳米酶反应器构建。
背景技术
催化在科学研究和工业应用中均发挥了重要的作用，超过90％的化学品是通过催化过程制造的。截至目前，约有20项关于催化的研究获得诺奖。鉴于其巨大的潜力可以帮助创造可持续的未来，对催化的学术兴趣持续增长。近年来，无机纳米催化剂因成本低、易制备、环境友好等优点受到了广泛关注，该领域的最新突破是能够构建分散在许多不同类型载体上的孤立单原子位点，金属单原子与载体构成了新的催化剂家族，对总体催化性能有了空前影响，其特征是具有确定的活性中心和最大的原子利用率。这些催化剂中的金属位点通过与固态载体上的配位原子化学键锚定，金属位点的隔离导致原子利用率接近100％，该特点使其具有取代化学品绿色合成中的传统催化剂尤其是天然酶的经济性和实用性优势。此外，纳米酶具有比表面积大，活性位点可控、重复利用率高等优势，在化学品合成的纳米酶反应器构建中显示出巨大的潜力。
α-酮戊二酸作为一种化学中间体，在医药、有机合成、营养强化剂等领域有着重要的应用价值，目前合成该中间体的方法有化学合成法、全细胞转化法、酶法等，例如，CN103911400A、CN104152498A公开了一些基于微生物培养与合成生物学技术提高α-酮戊二酸转化率的体系建立，解决了化学合成法生产的步骤繁琐、产率低、环境污染严重的问题，但这些方法面临成本高、产物容易被微生物摄取利用、市场效益低等问题，工业化应用仍存在困难。
近年来，在生物催化工业生产体系中，以廉价的L-谷氨酸钠为底物，采用L-谷氨酸脱氨酶或L-谷氨酸氧化酶来催化生产α-酮戊二酸，如CN105331642A公开了一种L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其简单、快速、高效生产的优势引人注目，但酶的稳定性、中间产物的传递及底物、产物抑制等都是限制转化效率的重要因素。因此，在这里我们模仿天然的纳米酶反应器，构建人工铁单原子酶组装体，可有效负载L-谷氨酸氧化酶完成催化过程并原位清除副产物H2O2，防止终产物α-酮戊二酸被氧化为丁二酸，从而提高α-酮戊二酸产率。此外，经负载后的L-谷氨酸氧化酶热稳定性以及pH耐受性得到了改善，同时解决了将生物酶与催化产物分离回收困难的问题，有效提高了整个纳米酶反应器的催化效率。
发明内容
本发明旨在提供一种铁单原子纳米酶反应器，及其构建方法。
本发明另一个目的是提供一种高效合成α-酮戊二酸的铁单原子纳米酶反应器体系。
铁单原子纳米酶反应器具有如下特征：
(1)较为均一的尺寸，粒径约为140～180nm。
(2)较大比表面积，BET面积表面积为970.6383m2/g。
(3)较高的类过氧化氢酶活性。
本申请采用如下方案实现上述目的。
根据本发明提供的铁单原子纳米酶反应器，优选地，所述的铁单原子纳米酶反应器本身具有优异的类过氧化氢酶活性，具备在较广pH范围内均能将底物H2O2分解的特性，更优选地，所述的铁单原子纳米酶通过负载L- 谷氨酸氧化酶形成铁单原子纳米酶反应器，可有效催化底物L-谷氨酸钠分解为α-酮戊二酸，最优选地，所述的铁单原子纳米酶反应器可原位消耗副产物 H2O2，防止α-酮戊二酸被氧化从而大大提升转化率，具有高效、快速、可重复利用和环境友好等优势。
本发明还提供了上述铁单原子纳米酶反应器的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先将1.5～5.0g六水合硝酸锌溶于150～300mL甲醇中，再加入65～150mg六水合硫酸亚铁铵，搅拌5～10分钟，将2.0～5.0g 2-甲基咪唑溶于150～300mL甲醇后搅拌10～15分钟，随后将上述两批溶液混合并置于搅拌器(转速为300～350转/分钟)上搅拌18～24小时，通过离心方法分离得到铁掺杂的沸石咪唑结构ZIF-8，将该固体产物用乙醇洗涤2～4次，置于40～60℃真空干燥箱中干燥6～12小时。
(2)将步骤(1)得到的干燥固体研磨后置于管式炉中，将系统温度设置为800～1000℃(升温速度5℃/分钟)在1～2小时内完成热裂解合成铁单原子纳米酶，然后待管式炉冷却至室温取出固体。
(3)将步骤(2)中得到的材料取出置于PBS缓冲液中(pH＝7.0，室温)，超声10～30分钟，以铁单原子纳米酶与L-谷氨酸氧化酶质量比 10:1～15:1添加混匀后以130转/分钟放入4℃摇床内恒温震荡2～4小时，随后以转速为5000转/分钟离心弃去上清获得载有L-谷氨酸氧化酶的铁单原子纳米酶反应器。
根据本发明的制备方法，在步骤(1)中，添加的六水合硝酸锌、 2-甲基咪唑与甲醇溶液的比例可调，当甲醇与六水合硝酸锌摩尔比为980:1，～1300:1时，制得的铁单原子纳米酶对应尺寸分别约为200～70nm。为保证材料尺寸、比表面积适用于后期应用，将甲醇与六水合硝酸锌摩尔比约为1200:1， 2-甲基咪唑与六水合硝酸锌摩尔比均控制为2:1～5:1。
根据本发明制备的方法，在步骤(1)中，选用六水合硫酸亚铁铵作为铁源，其优势在于硫酸亚铁铵容易电离铵根离子并逐步释放亚铁粒子，这不仅有利于ZIF-8稳定性增强，也能保证有足够量的铁相对均匀地掺杂至该骨架上。
根据本发明制备的方法，在步骤(2)中，将温度设置为1000℃，有利于更多的单原子位点形成，并且该过程中可能被空气氧化的Fe3+倾向于向Fe2+转化，能提高该铁单原子纳米酶的催化活性。此外，由于温度高于 800℃，步骤(1)中获得的ZIF-8骨架上的Zn2+表现出升华的特性，能为铁的掺杂提供更多位点，从而形成更稳定的Fe-N-C结构。
本发明制备的铁单原子纳米酶是以ZIF-8为模板并经过热裂解形成，其活性位点充分暴露，催化活性高，具有尺寸和比表面积可控等优势。此外，本发明提供的铁单原子纳米酶反应器获得方法简易、耗时短且需控制的复杂因素少，另一方面，相比于游离L-谷氨酸氧化酶体系，该铁单原子纳米酶反应器有效拓宽了L-谷氨酸氧化酶的pH和温度耐受范围，同时该铁单原子纳米酶反应器在重复使用5次之后仍保留其初始活力的80％以上，这对其工业应用是具有极大鼓励意义的。
附图说明
图1是本发明制备的铁单原子纳米酶的TEM图像。
图2是本发明制备的铁单原子纳米酶反应器的SEM图像。
图3是建立的铁单原子纳米酶反应器催化合成α-酮戊二酸的路径。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例一
一种以沸石咪唑结构ZIF-8为模板的铁单原子纳米酶的制备方法包括以下步骤：
(1)用分析天平准确称量1.695g的六水合硝酸锌粉末，放入容量为 500mL的圆底烧瓶中，再加入150mL甲醇，配制成备用溶液1。
(2)使用分析天平称取68.63mg六水合硫酸亚铁铵粉末，将其加入备用溶液1中后放置于磁力搅拌器上，以300转/分钟速度搅拌5分钟，配制成备用溶液2。
(3)使用分析天平准确称量2g 2-甲基咪唑粉末，放入容量为250mL的圆底烧瓶中，加入150mL甲醇，将其放置于磁力搅拌器上，以300转/分钟速度搅拌10分钟，配制成备用溶液3。
(4)将上述备用溶液3混入备用溶液2中，在室温下置于磁力搅拌器上，以350转/分钟速度搅拌24小时。
(5)通过离心方法分离出经搅拌后的沉淀物，用乙醇洗涤3次，其中3 次的离心转速和时间分别为9000转/分钟，5分钟；10000转/分钟，8分钟； 11000转/分钟，10分钟。最后将分离出的固体物质放入真空干燥箱中40℃干燥6小时。
(6)取出干燥固体研磨成细粉末后放入规格为90*40*20mm的刚玉舟中，后放入管式炉中，以流通的氮气作为保护气，将系统温度设置为1000℃(升温速度5℃/分钟)在2小时内完成裂解合成铁单原子纳米酶，然后待管式炉冷却至室温取出固体即可获得具有铁单原子分布的纳米酶。
该次制备方法中，控制甲醇与六水合硝酸锌摩尔比约为1300:1， 2-甲基咪唑与六水合硝酸锌摩尔比均控制为4.3:1，制备出铁单原子纳米酶粒径约为70nm。
实施例二
一种以沸石咪唑结构ZIF-8为模板的铁单原子纳米酶的制备方法包括以下步骤：
(1)用分析天平准确称量2.45g的六水合硝酸锌粉末，放入容量为500mL 的圆底烧瓶中，再加入200mL甲醇，配制成备用溶液1。
(2)使用分析天平称取90mg六水合硫酸亚铁铵粉末，将其加入备用溶液1中后放置于磁力搅拌器上，以300转/分钟速度搅拌5分钟，配制成备用溶液2。
(3)使用分析天平准确称量2.7g 2-甲基咪唑粉末，加入200mL甲醇，放入容量为250mL的圆底烧瓶中，将其放置于磁力搅拌器上，以300转/分钟速度搅拌10分钟，配制成备用溶液3。
(4)将上述备用溶液3混入备用溶液2中，在室温下置于磁力搅拌器上，以350转/分钟速度搅拌24小时。
(5)通过离心方法分离出经搅拌后的沉淀物，用乙醇洗涤3次，其中3 次的离心转速和时间分别为9000转/分钟，5分钟；10000转/分钟，8分钟； 11000转/分钟，10分钟。最后将分离出的固体物质放入真空干燥箱中40℃干燥12小时。
(6)取出干燥固体研磨成细粉末后放入规格为90*40*20mm的刚玉舟中，后放入管式炉中，以流通的氮气作为保护气，将系统温度设置为1000℃(升温速度5℃/分钟)在2小时内完成裂解合成铁单原子纳米酶，然后待管式炉冷却至室温取出固体即可获得具有铁单原子分布的纳米酶。
该次制备方法中，控制甲醇与六水合硝酸锌摩尔比约为1200:1， 2-甲基咪唑与六水合硝酸锌摩尔比均控制为4:1，制备出铁单原子纳米酶粒径约为130nm。
实施例三
一种以沸石咪唑结构ZIF-8为模板的铁单原子纳米酶的制备方法包括以下步骤：
(1)用分析天平准确称量5.0g的六水合硝酸锌粉末，放入容量为500mL 的圆底烧瓶中，再加入300mL甲醇，配制成备用溶液1。
(2)使用分析天平称取150mg六水合硫酸亚铁铵粉末，将其加入备用溶液1中后放置于磁力搅拌器上，以300转/分钟速度搅拌5分钟，配制成备用溶液2。
(3)使用分析天平准确称量4.6g 2-甲基咪唑粉末，加入150mL甲醇，放入容量为250mL的圆底烧瓶中，将其放置于磁力搅拌器上，以300转/分钟速度搅拌10分钟，配制成备用溶液3。
(4)将上述备用溶液3混入备用溶液2中，在室温下置于磁力搅拌器上，以350转/分钟速度搅拌24小时。
(5)通过离心方法分离出经搅拌后的沉淀物，用乙醇洗涤3次，其中3 次的离心转速和时间分别为9000转/分钟，5分钟；10000转/分钟，8分钟； 11000转/分钟，10分钟。最后将分离出的固体物质放入真空干燥箱中40℃干燥12小时。
(6)取出干燥固体研磨成细粉末后放入规格为90*40*20mm的刚玉舟中，后放入管式炉中，以流通的氮气作为保护气，将系统温度设置为1000℃(升温速度5℃/分钟)在2小时内完成裂解合成铁单原子纳米酶，然后待管式炉冷却至室温取出固体即可获得具有铁单原子分布的纳米酶。
该次制备方法中，控制甲醇与六水合硝酸锌摩尔比约为980:1，2- 甲基咪唑与六水合硝酸锌摩尔比均控制为2:1，制备出铁单原子纳米酶粒径约为200nm。
实施例四
一种以沸石咪唑结构ZIF-8为模板的铁单原子纳米酶的制备方法包括以下步骤：
(1)用分析天平准确称量2.8g的六水合硝酸锌粉末，放入容量为500mL 的圆底烧瓶中，再加入200mL甲醇，配制成备用溶液1。
(2)使用分析天平称取92mg六水合硫酸亚铁铵粉末，将其加入备用溶液1中后放置于磁力搅拌器上，以300转/分钟速度搅拌5分钟，配制成备用溶液2。
(3)使用分析天平准确称量2.6g 2-甲基咪唑粉末，加入200ml甲醇，放入容量为250ml的圆底烧瓶中，将其放置于磁力搅拌器上，以300转/分钟速度搅拌10分钟，配制成备用溶液3。
(4)将上述备用溶液3混入备用溶液2中，在室温下置于磁力搅拌器上，以350转/分钟速度搅拌24小时。
(5)通过离心方法分离出经搅拌后的沉淀物，用乙醇洗涤3次，其中3 次的离心转速和时间分别为9000转/分钟，5分钟；10000转/分钟，8分钟； 11000转/分钟，10分钟。最后将分离出的固体物质放入真空干燥箱中50℃干燥8小时。
(6)取出干燥固体研磨成细粉末后放入规格为90*40*20mm的刚玉舟中，后放入管式炉中，以流通的氮气作为保护气，将系统温度设置为900℃(升温速度5℃/分钟)在2小时内完成裂解合成铁单原子纳米酶，然后待管式炉冷却至室温取出固体即可获得具有铁单原子分布的纳米酶。
该次制备方法中，控制甲醇与六水合硝酸锌摩尔比约为1050:1，2-甲基咪唑与六水合硝酸锌摩尔比均控制为3.4:1，热裂解温度为900℃，制备出铁单原子纳米酶粒径约为140nm。
将制得的实施例一至四的制得的铁单原子纳米酶均用乙醇配制成浓度为0.2mg/ml的溶液，用移液器取0.2mL滴加至微栅铜网上，用高分辨率球差电镜测定其单原子位点。
实施例五
将实施例一至四的制得的铁单原子纳米酶用PBS配置成2mg/ml 的溶液，用DMSO配置浓度为20mg/ml的四甲基联苯二胺溶液为显色底物，用PBS配置浓度为10mM的H2O2溶液。取96孔板，每孔加入4μl四甲基联苯二胺溶液，80μl的H2O2溶液(原浓度为10mM)，676μl的PBS，40μl的铁单原子纳米酶溶液，形成总体积为800μl的体系，铁单原子纳米酶、四甲基联苯二胺和H2O2终浓度分别为100μg/ml、200μg/ml和1mM。随着铁单原子纳米酶溶液的加入，H2O2被还原产生自由基物质和氧气，四甲基联苯二胺被氧化为蓝色的二亚胺化合物，在波长为620nm处产生特征吸收峰，故将所述的 800μl体系静置孵育5分钟后，测定其在620nm处的吸收值，结果显示，实施例一至四的制得的铁单原子纳米酶催化活性呈现出粒径相关的变化趋势，粒径越小，其催化H2O2的能力越强，620nm处吸收值越高，反应体系的蓝色越深。热裂解温度为1000℃的铁单原子纳米酶催化性质优于热裂解温度为900℃的。
实施例六
一种负载L-谷氨酸氧化酶的铁单原子纳米酶反应器的构建，制备方法如下：
将制得的铁单原子纳米酶(实施例二中粒径为130nm的材料)取出，用分析天平称取10mg，置于PBS缓冲液中(pH＝7.0，室温)，配制成终浓度为 2mg/mL的溶液5mL，超声20分钟，以铁单原子纳米酶与L-谷氨酸氧化酶质量比10:1添加L-谷氨酸氧化酶，混匀后放入4℃摇床内，以130转/分钟震荡速度恒温震荡2小时，随后以转速为5000转/分钟离心弃去上清获得载有L- 谷氨酸氧化酶的铁单原子纳米酶反应器。
铁单原子纳米酶反应器的L-谷氨酸氧化酶载量测定：将铁单原子纳米酶体系负载L-谷氨酸氧化酶形成贴单原子纳米酶反应器前后的上清液采用BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定。
酶活测试体系：0.1g/L的铁单原子纳米酶反应器，10mM L-谷氨酸钠，PBS缓冲液(pH＝7.0)。酶活力测定条件为30℃，于800转/分钟的震荡金属浴反应5分钟。在30℃条件下，每分钟催化L-谷氨酸钠氧化反应生成 1μmol产物α-酮戊二酸所需的酶量为1个酶活单位。
实施例七
铁单原子纳米酶反应器的应用：使用0.5g/L的L-谷氨酸氧化酶负载于铁单原子纳米酶反应器载体上作为催化剂，反应液中L-谷氨酸钠的终浓度设定为150mM，PBS缓冲液(pH7.0)，将其放置于温度30℃，200转/ 分钟的摇床振荡条件下进行催化反应。反应2.5小时后底物完全消耗，铁单原子纳米酶反应器体系反应快速进行，达到90.4％的转化率。
铁单原子纳米酶反应器热稳定性的测定：将铁单原子纳米酶反应器在30℃的温度下孵育时间达到5小时，然后测定其残留酶活。酶活测试体系：0.1g/L的铁单原子纳米酶反应器，10mM L-谷氨酸钠，PBS缓冲液 (pH＝7.0)。酶活力测定条件为30℃，于800转/分钟的震荡金属浴反应5分钟。在30℃条件下，每分钟催化L-谷氨酸钠氧化反应生成1μmol产物α-酮戊二酸所需的酶量为1个酶活单位。当孵育温度为30℃时，负载L-谷氨酸氧化酶的铁单原子反应器热稳定性较游离酶均得到有效提升，在孵育时间达到5 小时后，其酶的残余活力仍达到93.4％。
铁单原子纳米酶反应器pH耐受范围测定：通过测定不同pH范围 (3.0～10.0)的缓冲液中该铁单原子纳米酶反应器的酶活以检测铁单原子纳米酶反应器pH耐受范围。酶活测试体系：0.1g/L的L-谷氨酸氧化酶(负载于铁单原子纳米酶载体)，10mM L-谷氨酸钠，PBS缓冲液(pH＝7.0)。酶活力测定条件为30℃，于800转/分钟的震荡金属浴反应5分钟。在30℃条件下，每分钟催化L-谷氨酸钠氧化反应生成1μmol产物α-酮戊二酸所需的酶量为1 个酶活单位。当pH值为6.5时，铁单原子纳米酶反应器的活性达到最高。除此之外，在碱性环境下保持比酸性环境下较高活性，具有较宽的pH耐受性。
铁单原子纳米酶反应器重复次数的重复测定：通过离心铁单原子纳米酶反应器反应体系并移除上清重复测定该铁单原子纳米酶反应器的酶活以检测其重复利用效率及可回收性。酶活测试体系：0.1g/L的L-谷氨酸氧化酶(负载于铁单原子纳米酶载体)，10mM L-谷氨酸钠，PBS缓冲液(pH＝7.0)。酶活力测定条件为30℃，于800转/分钟的震荡金属浴反应5分钟。在30℃条件下，每分钟催化L-谷氨酸钠氧化反应生成1μmol产物α-酮戊二酸所需的酶量为1个酶活单位。在重复使用5次上述催化过程之后该反应器仍保留其初始活力的80％以上。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (4)

1.一种铁单原子纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤为：1.5~5.0g六水合硝酸锌溶于150~300 mL甲醇中，再加入65~150 mg六水合硫酸亚铁铵，搅拌5~10分钟，将2.0~5.0g 2-甲基咪唑溶于150~300 mL甲醇后搅拌10~15分钟，随后将上述两批溶液混合并置于搅拌器上搅拌18~24小时，通过离心方法分离得到铁掺杂的沸石咪唑结构ZIF-8，将ZIF-8用乙醇洗涤2~4次，置于40~60℃真空干燥箱中干燥6~12小时；随后将得到的干燥固体研磨后置于管式炉中，以流通的氮气作为保护气，将系统温度设置为1000℃，在1~2小时内完成热裂解合成铁单原子纳米酶，然后待管式炉冷却至室温取出固体；
甲醇与六水合硝酸锌摩尔比为980:1~1300:1，2-甲基咪唑与六水合硝酸锌摩尔比控制为2:1~5:1。
2.一种铁单原子纳米酶反应器的制备方法，其特征在于：
将权利要求1所述方法制备的铁单原子纳米酶取出置于PBS缓冲液中，超声10~30分钟，以铁单原子纳米酶与L-谷氨酸氧化酶质量比10:1~15:1添加混匀后放入摇床内恒温震荡2~4小时，随后离心弃去上清获得载有L-谷氨酸氧化酶的铁单原子纳米酶反应器；所述的摇床震荡温度为4℃，所述震 荡的转速为150~200转/分钟。
3.权利要求2所述的制备方法得到的铁单原子纳米酶反应器在分解底物L-谷氨酸钠生产α-酮戊二酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在PBS缓冲液中，添加终浓度为100~150mM的L-谷氨酸钠，将其放置于反应温度为30~35℃，200 转/分钟的摇床振荡条件下进行反应时间为2-3小时，催化合成α-酮戊二酸。
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