CN116510777B - 一种植物微环境响应型双原子纳米酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物微环境响应型双原子纳米酶及其制备方法和应用，制备方法包括：1）将乙二胺四乙酸铁钠和尿素混合，氮气保护下煅烧，得到含单原子铁纳米酶的混合物；2）在步骤1）得到的混合物中加入溶剂溶解，过滤，烘干，得到单原子铁纳米酶；3）将步骤2）得到的单原子铁纳米酶与锌盐混合，氮气保护下煅烧，得到锌铁双原子纳米酶固体。该纳米酶在中性条件下表现出类过氧化氢酶活性，可有效分解H2O2生成氧气和水。在酸性条件下表现出类过氧化物酶活性，催化H2O2在其表面原位产生•OH，进而实现对酚酸的原位降解。本发明可有效提高植物的抗酚酸胁迫性能，同时锌微肥可供给植物营养，促进逆境环境下植物生长。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗逆纳米材料设计领域，特别涉及一种植物微环境响应型双原子纳米酶及其制备方法和应用。
背景技术
我国各类农作物秸秆产量大，每年高达7亿吨之多，但秸秆利用率依旧处于较低水平。秸秆还田是秸秆利用的一种有效途径，秸秆中含有大量的酚酸类结构物质，在秸秆还田后，秸秆经过微生物腐解等作用，大量酚酸残留在土壤中，造成酚酸的过量累积，严重影响水稻等作物的正常生长。
酚酸对作物的胁迫主要表现在以下两个方面，1）酚酸可通过抑制细胞的分裂和伸长，使植物根细胞膜透性增加，内溶物外溢而导致根系生长缓慢或死亡。同时可使膜脂过氧化，造成原生质体膜的破坏，K+外溢增加，根系吸收功能遭到破坏；2）过量酚酸会导致植物体内活性氧（ROS）积累递增，最终影响作物的正常生长发育。
一种有效的缓解酚酸胁迫方法是开发削减酚酸物质的技术，这是从根源上缓解酚酸胁迫的最有效措施。现有方法主要以增施有益微生物、淹水、施加生石灰或加入功能材料来削减秸秆腐解和使用过程中的酚酸毒害作用。上述方法面临的问题是，微生物或材料是直接播撒在土壤或接种在秸秆中，使用量大、成本高，难以大规模推广使用。除上述方法外，利用基因编辑和遗传育种技术提高作物抗逆性也极具前景。然而，基因编辑和遗传育种研发周期长、成本高。
纳米酶技术应用在缓解植物非生物胁迫方面已有研究。与传统的遗传育种、基因编辑、微生物及功能材料施加技术不同的是，纳米酶可在不改变现有种植模式基础上，极少量纳米酶对作物进行处理，即可有效缓解植物非生物胁迫，进而实现作物高产和品质提升。利用纳米酶缓解植物非生物胁迫主要集中在盐胁迫、氧化胁迫和重金属胁迫。到目前为止，将纳米酶用于作物抗酚酸胁迫方面却未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物微环境响应型双原子纳米酶及其制备方法和应用，本发明设计的双原子SAZnFe-CDs纳米酶因具备特定植物微环境下的响应性功能，可实现植物体内H2O2和酚酸的同步消除，有效提高植物的抗酚酸胁迫性能，同时锌微肥可供给植物营养，在植物体内缓慢释放，促进逆境环境下植物生长。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种植物微环境响应型双原子纳米酶的制备方法，包括：
1）将乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和尿素混合，氮气保护下煅烧，得到含单原子铁纳米酶的混合物。
2）在步骤1）得到的混合物中加入溶剂溶解，过滤，烘干，得到单原子铁纳米酶；
3）将步骤2）得到的单原子铁纳米酶与锌盐混合，氮气保护下煅烧，得到锌铁双原子纳米酶固体。
进一步的，步骤1）中，所述的乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和尿素的质量比为1：（0.1~1）。
进一步的，步骤1）中，所述的煅烧温度为300~400℃，煅烧时间为1~6 h。
进一步的，步骤2）中，所述溶剂为甲醇、乙醇或丙醇中的一种。
进一步的，步骤2）中，所述过滤的滤膜孔径为0.01 μm~0.3 μm。
进一步的，步骤2）中，所述的烘干温度为50~100℃，时间为4~24h。优选烘干温度为60~100℃，烘干时间为4~12h。
进一步的，步骤3）中，所述的锌盐为氯化锌、硫酸锌和硝酸锌中的一种。
进一步的，步骤3）中，所述的单原子铁纳米酶与锌盐的质量比为1：（0.05~0.5），优选1：（0.08~0.2）。
进一步的，步骤3）中，所述的煅烧温度为250~400℃，煅烧时间为1~6 h。
本发明还提供了上述方法制备的双原子纳米酶。
所述双原子纳米酶尺寸为3~5 nm，且完全水溶，可顺利进入植物体胞外和胞内环境。
所述双原子纳米酶具有植物微环境响应型功能，在中性条件下，表现出类过氧化氢酶（CAT酶）活性，在酸性条件下，表现出类过氧化物酶（POD酶）活性；双原子纳米酶还具有供养功能，在植物体内可缓慢释放锌离子。
本发明又提供了上述纳米酶在提高植物抗酚酸胁迫和供给植物营养中的应用。
进一步的，所述植物为单子叶植物如水稻或小麦。
进一步的，所述双原子纳米酶使用方法为浸种或叶面喷施或两者混合，使用浓度为100~600 mg/L，使用溶剂为水。
本发明的有益效果如下：
高含氮尿素的引入，在煅烧过程中有利于形成Fe-N5活性中心。Fe-N5活性位点由轴向和横向配位的N原子构成，因氮原子的强配位作用，铁原子电子密度显著增强。Zn原子内嵌在载体上，载体为水溶性碳量子点（CDs）。在中性条件下，可表现出类过氧化氢酶（CAT酶）活性，可有效分解H2O2生成氧气和水。在酸性条件下，铁原子电子密度因氢质子与Fe-N5相互作用而显著降低，可表现出类过氧化物酶（POD酶）活性，催化H2O2在其表面原位产生•OH，进而实现对载体表面酚酸的原位降解。此外，锌元素可在植物体内缓慢释放，供给植物微量元素。因此，设计的双原子SAZnFe-CDs纳米酶具备抗逆和供养的双重功能。
现有缓解植物酚酸胁迫的方法用量大、成本高，本发明利用纳米酶和单原子催化理念，利用廉价前体，设计出一种植物微环境响应型双原子纳米酶。利用其具备特定植物微环境下的酶响应性功能，通过浸种和叶面喷施手段，有效提高植物抗酚酸胁迫性能。此外，微量元素锌在植物体内可缓慢释放，进一步促进逆境环境下植物生长。此发明中的纳米酶用量少、价格低、环境安全性高，可为植物抗酚酸胁迫双功能纳米酶的设计提供一条切实可行的技术路线，有利于秸秆还田的进一步推广。
附图说明
图1为本发明双原子SAZnFe-CDs纳米酶的制备方法流程图。
图2 为本发明双原子SAZnFe-CDs纳米酶的光学照片和相关表征。
图3 a)为水稻发芽光学图片；b)为在300 mg/L水杨酸胁迫浓度下采用不同浓度的SAZnFe-CDs纳米酶处理对水稻种子茎长、茎粗、根长的影响；c)为在300 mg/L水杨酸胁迫浓度下采用不同浓度的SAZnFe-CDs纳米酶处理对水稻种子发芽率的影响。
图4 a)为秸秆育秧盘水稻育苗光学图片；b)为不同浓度SAZnFe-CDs纳米酶处理对出芽率的影响；c)为不同浓度SAZnFe-CDs纳米酶处理对茎干重的影响；d)为不同浓度SAZnFe-CDs纳米酶处理对茎湿重的影响；e)为不同浓度SAZnFe-CDs纳米酶处理对茎长、茎粗的影响。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
结合图1，本发明的技术要点包括：
1）将乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和尿素以一定比例混合，氮气保护下煅烧；利用尿素的高含氮比例，在低温碳化下形成Fe-N5配位结构的单原子铁纳米酶混合物。
2）将步骤1）中得到的混合物中加入适量溶剂，震荡、离心、钠滤膜过滤、烘干，得到单原子铁纳米酶；该步骤可以利用单原子铁纳米酶的可溶性将其溶解在有机溶剂中。再通过烘干得到单原子铁纳米酶固体，该纳米酶具有大量含氧官能团，导致其具有很好的水溶性。
3）将步骤2）所得样品与锌盐按一定比例混合，在适当温度下煅烧，得到锌铁双原子纳米酶。该步骤可以利用碳点中的空位如羧基、氨基、羟基等，与锌离子形成强相互作用。通过氮气保护下煅烧，锌原子嵌入到碳点载体中，得到双原子纳米酶固体。
SAZnFe-CDs纳米酶中催化活性中心由Fe-N5构成，此外，Zn原子内嵌在载体上，载体为富官能团的水溶性碳量子点（CDs），尺寸为3~5 nm，且完全水溶，可顺利进入植物体胞外和胞内环境。在中性条件下，表现出类过氧化氢酶（CAT酶）活性，可有效分解H2O2生成氧气和水。在酸性条件下，表现出类过氧化物酶（POD酶）活性，催化H2O2在其表面原位产生•OH，进而实现对酚酸的原位降解。SAZnFe-CDs纳米酶因具备特定植物微环境下的响应性功能，可实现植物体内H2O2和酚酸的同步消除，有效提高植物的抗酚酸胁迫性能，同时锌微肥可供给植物营养，在植物体内缓慢释放，促进逆境环境下植物生长。
本发明制备的纳米酶使用量低、成本低、环境安全性好，具备抗逆和营养的双重功能，其使用有利于秸秆还田的进一步推广，助力酚酸胁迫下植物的丰产增效。
实施例1
（1）将2.0 g乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和0.4 g尿素混合，氮气保护下，于300℃下煅烧2 h，得到含铁单原子纳米酶的混合物。
（2）将上述得到的混合物中加入20 mL甲醇，震荡、离心，0.2 μm纳滤膜过滤，于60℃下烘干8 h，得到单原子铁纳米酶（SAFe-CDs）。
（3）将上述1 g SAFe-CDs与0.2 g硝酸锌混合，研磨均匀。于350℃下煅烧2 h，得到锌铁双原子纳米酶（SAZnFe-CDs）。其光学照片和相关表征如图2所示。
实施例2
（1）将2.0 g乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和0.4 g尿素混合，氮气保护下，于300℃下煅烧6h，得到含铁单原子纳米酶的混合物。
（2）将上述得到的混合物中加入20 mL乙醇，震荡、离心，0.2 μm纳滤膜过滤，于80℃下烘干4 h，得到单原子铁纳米酶（SAFe-CDs）。
（3）将上述1 g SAFe-CDs与0.15 g氯化锌混合，研磨均匀。于350℃下煅烧2 h，得到锌铁双原子纳米酶（SAZnFe-CDs）。
实施例3
（1）将2.0 g乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和0.2 g尿素混合，氮气保护下，于350℃下煅烧2 h，得到含铁单原子纳米酶的混合物。
（2）将上述得到的混合物中加入20 mL丙醇，震荡、离心，0.3 μm纳滤膜过滤，于60℃下烘干8 h，得到单原子铁纳米酶（SAFe-CDs）。
（3）将上述1 g SAFe-CDs与0.1 g硝酸锌）混合，研磨均匀。于350℃下煅烧2 h，得到锌铁双原子纳米酶（SAZnFe-CDs）。
实施例4
（1）将2.0 g乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和0.2 g尿素混合，氮气保护下，于400℃下煅烧1h，得到含铁单原子纳米酶的混合物。
（2）将上述得到的混合物中加入20 mL甲醇，震荡、离心，0.01 μm纳滤膜过滤，于100℃下烘干4 h，得到单原子铁纳米酶（SAFe-CDs）。
（3）将上述1 g SAFe-CDs与0.08 g硫酸锌混合，研磨均匀。于350℃下煅烧2 h，得到锌铁双原子纳米酶（SAZnFe-CDs）。
实施例5
（1）将2.0 g乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和2.0 g尿素混合，氮气保护下，于300℃下煅烧2 h，得到含铁单原子纳米酶的混合物。
（2）将上述得到的混合物中加入20 mL甲醇，震荡、离心，0.2 μm纳滤膜过滤，于60℃下烘干12h，得到单原子铁纳米酶（SAFe-CDs）。
（3）将上述1 g SAFe-CDs与0.1 g硝酸锌混合，研磨均匀。于400℃下煅烧2 h，得到锌铁双原子纳米酶（SAZnFe-CDs）。
测试例
本测试例是以实施例1制备的SAZnFe-CDs纳米酶为例进行测试以展示其效果，其他几个实施例的测试结果与实施例1基本一致，不存在明显差异。
1）水稻种子酚酸胁迫下的发芽实验
本项目选取水稻（南粳47，江苏省农业科学院粮食作物研究所提供）为受试植物进行发芽实验。发芽试验步骤如下：将种子浸泡在30%的H2O2中30 min进行表面消毒，随后用蒸馏水冲洗若干次后备用。配置不同浓度的模型水杨酸溶液（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L）和不同浓度的SAZnFe-CDs纳米酶溶液（100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L）。于含有双层无菌滤纸的培养皿中，分别放入30粒受试种子，随后分别加入5.0 mL HoagLand营养液，其中选取4个作为空白对比，设置4个不同浓度水杨酸处理和25个水杨酸+SAZnFe-CDs纳米酶处理，每个处理设4次平行，共计104个培养皿。所有培养皿置于25℃的恒温恒湿培养箱，湿度设置为80%，于黑暗条件下进行培养。每天记录水稻种子的发芽数，用毫米刻度尺测量种子根长和茎长，用数显游标卡尺测量茎粗。种子发芽势（RE）、发芽率（GR）和种子活力指数（SVI）的计算利用如下公式（Sun, X. D.; Yuan, X. Z.;Jia, Y.; Feng, L. J.; Zhu, F. P.; Dong, S. S.; Liu, J.; Kong, X.; Tian, H.;Duan, J. L.; Ding, Z.; Wang, S. G.; Xing, B., Differentially chargednanoplastics demonstrate distinct accumulation in Arabidopsis thaliana.Nature Nanotechnology 2020, 15, 755-760.）
上述式中：M1为发芽过程中日发芽种子数最大时的发芽数量；M2为发芽试验结束时发芽种子的数量；M为供测种子总数；S为发芽试验结束时种子茎长；R为试验结束时种子根长。
如图3所示，将SAZnFe-CDs纳米酶作为浸种剂对水稻种子进行处理，通过考察其在300 mg/L的水杨酸溶液中的发芽率以及发芽7天后水稻幼苗的胚芽茎长、茎粗和根长后可知，300 mg/L水杨酸显著抑制水稻种子发芽，经不同浓度的SAZnFe-CDs溶液处理后，与未处理样品对比，SAZnFe-CDs能够明显提高水稻种子的发芽率和基本理化指标，且表现出一定的浓度依耐性。因此，经300 mg/L的SAZnFe-CDs纳米酶溶液处理后，可显著提高水稻种子的抗酚酸胁迫能力。
2）水稻酚酸胁迫下的苗期实验
待上述发芽实验结束后，将培养皿继续置于人工气候培养箱中进行水稻苗期实验，培养箱内的培养条件设置为白天光照16 h，温度为25℃，湿度为80%，光照强度为10000lx；夜间8 h不进行光照，温度为25℃，湿度为80%。培养26 d后，用毫米刻度尺测量水稻秧苗茎长和茎粗。同时立即收集地上植物生物量并称重，记录湿重。然后，将样品在65℃的烘箱中干燥72小时，并记录干重。其余基本理化指标测试方式如下。
如图4所示。秸秆育秧盘实验表明，SAZnFe-CDs纳米酶处理后，水稻幼苗的出芽率明显提高，且长势更齐、茎叶更壮，秧苗干重提高近18%。以上实验初步证实，设计的新型SAFe-CDs纳米酶可有效缓解水稻酚酸胁迫，改善水稻秧苗长势和品质。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种植物微环境响应型双原子纳米酶的制备方法，包括：
1）将乙二胺四乙酸铁钠和尿素混合，氮气保护下煅烧，得到含单原子铁纳米酶的混合物；
2）在步骤1）得到的混合物中加入溶剂溶解，过滤，烘干，得到单原子铁纳米酶；
3）将步骤2）得到的单原子铁纳米酶与锌盐混合，氮气保护下煅烧，得到锌铁双原子纳米酶固体。
2.根据权利要求1所述的一种植物微环境响应型双原子纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤1）中，所述的乙二胺四乙酸铁钠和尿素的质量比为1：0.1~1；和/或煅烧温度为300~400℃，煅烧时间为1~6 h。
3.根据权利要求1所述的一种植物微环境响应型双原子纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述溶剂为甲醇、乙醇或丙醇中的一种；和/或所述的过滤的滤膜孔径为0.01μm~0.3 μm；和/或所述的烘干温度为50~100℃，时间为4~24h。
4.根据权利要求1所述的一种植物微环境响应型双原子纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述的锌盐为氯化锌、硫酸锌和硝酸锌中的一种；和/或所述的单原子铁纳米酶与锌盐的质量比为1：0.05~0.5；和/或煅烧温度为250~400℃，煅烧时间为1~6 h。
5.权利要求1~4任意一项所述的一种植物微环境响应型双原子纳米酶的制备方法制备的双原子纳米酶。
6.根据权利要求5所述的双原子纳米酶，其特征在于，所述双原子纳米酶尺寸为3~5nm，且完全水溶，可顺利进入植物体胞外和胞内环境。
7.根据权利要求5所述的双原子纳米酶，其特征在于，所述双原子纳米酶具有植物微环境响应型功能，在中性条件下，表现出类过氧化氢酶活性，在酸性条件下，表现出类过氧化物酶活性；所述双原子纳米酶还具有供养功能，在植物体内可缓慢释放锌离子。
8.权利要求5所述的双原子纳米酶在提高植物抗酚酸胁迫和供给植物营养中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物包括水稻或小麦。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述双原子纳米酶使用方法为浸种或叶面喷施或两者混合，使用浓度为100~600 mg/L，使用溶剂为水。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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