CN111171110A - 一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,包括以下步骤:将水飞蓟制药渣粕真空干燥,研磨得到渣粕粉;向渣粕粉中添加NaOH、维生素C和纯净水,恒温浸提后,离心得到浸提上清液I和浸提残渣I;向浸提上清液I中,添加盐酸调节pH值,静置沉淀后,离心获得蛋白沉淀I;对浸提液残渣I二次浸提,浸提悬浊液离心获得浸提液上清II;向浸提液上清II中,添加盐酸调节pH值,沉淀、离心获得蛋白沉淀II;合并步骤蛋白沉淀I和蛋白沉淀II,得到总蛋白提取物,冷冻干燥总蛋白提取物,得到水飞蓟粗蛋白粉。本发明提高水飞蓟蛋白的产率、总蛋白回收率和蛋白纯度,从而形成优化的从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的制备工艺。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白提取技术,尤其涉及一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法。
背景技术
水飞蓟是菊科水飞蓟属草本植物,作为传统的要用植物,从水飞蓟籽仁中提取的水飞蓟素具有较好的保肝护肝、抗氧化、抑制癌细胞等功效,收到保健品市场的青睐。水飞蓟渣粕是水飞蓟素提取后的剩余物,传统的方法水飞蓟渣粕主要作为畜禽蛋白饲料处理,产值和利润均较低。但是,水飞蓟渣粕中含有较高的植物蛋白,约占渣粕总干重的5-10%,且水飞蓟蛋白的氨基酸种类齐全是一种较好的植物蛋白源。我国水飞蓟渣粕的年产量约为2000-50000吨,仅辽宁省地区就可达到500-1000吨,若将水飞蓟渣粕中的植物蛋白进行工业化的分离提取,不仅会为社会创造较好的植物源性蛋白保健食品,还会为企业带来可观的产品收益,一举多得。
传统的蛋白提取工艺主要以碱提酸沉工艺为主,但是针对水飞蓟渣粕的蛋白提取还存在诸多不足,主要表现在如下几方面:1)传统方法的NaOH添加剂量不足,一般以达到溶液pH11即0.001mol/L为目标,NaOH添加浓度过低导致蛋白提取率较小,一般不足2%;2)NaOH的添加方法不准确,以达到目标pH11为标准,极容易造成NaOH的添加量不稳定,导致多次提取结果不稳定,可重复性差;3)蛋白在提取过程中,受氧化作用影响,颜色不断加深,产品必须进行脱色处理;4)等电点沉淀方法,容易造成蛋白沉淀不充分,进一步降低了蛋白的沉淀比率和产率。
发明内容
本发明的目的在于,针对目前水飞蓟制药渣粕的利用率低,以及蛋白提取困难的问题,提出一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,该方法能有效提取蛋白,同时稳定蛋白的纯度、提取率和实际产率。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,包括以下步骤:
步骤(1)水飞蓟制药渣粕经回收集中后,进行真空干燥处理,去除制药浸提过程中的有机溶剂残余,利用真空条件尽可能去除水飞蓟素提取过程中残余的有机试剂,同时达到干燥渣粕的目的;
步骤(2)将步骤(1)中干燥后的水飞蓟制药渣粕,经粉碎机研磨粉碎过(10目)筛,得到粒径不大于2mm的水飞蓟渣粕粉;
步骤(3)每克水飞蓟渣粕粉添加0.03-0.05g NaOH,混合均匀,再添加0.005-0.02g维生素C,混合均匀,然后添加10mL纯净水,搅拌均匀后,在20℃到50℃的条件下恒温浸提,且持续搅拌或震荡2-6h;其中,维生素C是浸提还原剂,可有效抑制浸提溶液变棕变黑的进程;
步骤(4)浸提悬浊液离心得到浸提上清液和浸提残渣;
步骤(5)分离步骤(4)的浸提上清液,使用(1mol/L的)盐酸调节pH值至4.0-4.5,室温下静置沉淀0.5-2h,随后离心获得蛋白沉淀I;
步骤(6)分离步骤(4)的浸提液残渣,并对此残渣进行二次浸提,按照每克初始渣粕粉计,向步骤(4)的浸提残渣中添加0.021-0.035g NaOH以及7mL纯净水,混合搅拌均匀后,再添加0.0035-0.014g维生素C,混合搅拌均匀后,在20℃到50℃的条件下恒温搅拌或震荡0.5-2h,进行二次浸提;
步骤(7)将步骤(6)的浸提悬浊液离心获得浸提液上清;分离浸提液上清,使用(1mol/L)盐酸调节pH值至4.0-4.5,并静置沉淀0.5-2h,随后离心获得蛋白沉淀II;
步骤(8)合并步骤(5)中的蛋白沉淀I和步骤(7)中的蛋白沉淀II,得到总蛋白提取物,冷冻干燥总蛋白提取物,得到水飞蓟粗蛋白。
进一步地,步骤(1)中水飞蓟制药渣粕为水飞蓟素提取后的渣粕,其中残余的溶剂常见为乙酸乙酯、丙酮、正己烷,含量为200-20000ppm,经过真空干燥后,浓度可降于100ppm以下。
进一步地,步骤(1)所述真空干燥,为相对真空度-0.1Mpa的条件下,真空干燥6-24h,且优选时间为12h。
进一步地,步骤(2)所述过筛采用10目筛网,得到粒径不大于2mm的水飞蓟渣粕粉。
进一步地,步骤(3)NaOH的添加量为0.035-0.045g,维生素C的添加量为0.01-0.02g。更优选的,步骤(3)NaOH的添加量为0.04g,维生素C的添加量为0.01g。
进一步地,步骤(3)的浸提温度为30℃到40℃,其中优选温度为40℃,浸提时间为3-5h,优选条件为3h。
进一步地,步骤(4)、步骤(5)和步骤(7)所述离心为4000-10000转/min条件下,离心5-20min,其中优选条件为8000转/min离心10min。
进一步地,步骤(5)和步骤(7)中使用1mol/L的盐酸调节pH值至4.1-4.4,其中优选条件为调节pH值至4.3,沉淀时间为1-2h,优选时间为1h。
进一步地,步骤(6)NaOH的添加量为0.025-0.030g,维生素C的添加量为0.005-0.010g,其中NaOH的优选添加量为0.028g,维生素C的优选添加量为0.007g。进一步地,步骤(6)的浸提温度为30℃到40℃,其中优选温度为40℃,浸提时间为1-2h,优选时间为1h。
进一步地,步骤(7)中使用1mol/L的盐酸调节pH值至4.0-4.5,其中优选条件为调节pH值至4.3,沉淀时间为0.5-2h,优选时间为1h。
进一步地,步骤(8)冷冻干燥,为相对真空度-0.1Mpa、温度-20℃、真空干燥6-24h,且优选时间为16h。
本发明是一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,选取水飞蓟素提取后的水飞蓟渣粕作为原材料,利用添加还原剂的碱性提取液,浸提渣粕中的水飞蓟蛋白,浸提液离心获得上清后,通过调节pH值超过水飞蓟蛋白等电点的方法,获得水飞蓟蛋白沉淀,并且通过两次浸提的方法提高了水飞蓟蛋白的总产率和回收率。具体地,与现有技术相比较具有以下优点:
1)水飞蓟蛋白提取的现有技术,主要以水飞蓟籽仁粕为原材料,未有针对水飞蓟制药渣粕的应用技术,水飞蓟制药渣粕与籽仁粕相比,蛋白含量较低,约为水飞蓟仁粕蛋白含量的一半,蛋白结构受到一定程度的破坏,蛋白性质有一定的改变,不容易被彻底提取,而且制药渣粕中残留有一定的有机试剂,需要在提取蛋白前彻底去除。本发明考虑到水飞蓟制药渣粕的以上特点,研发出一条整体的水飞蓟蛋白提取工艺路线,在去除有机溶剂残余的同时,通过优化提取方法的具体工艺参数,得到较高纯度和产量的粗蛋白粉。
2)本发明中使用的NaOH添加剂量,换算为溶液的摩尔浓度,为0.075mol/L-0.125mol/L(一次浸提与二次浸提相同),而传统方法使用pH11的NaOH溶液,等同于0.001mol/L的NaOH溶液,即本发明所使用的的NaOH浓度为传统方法的75-125倍,最优条件为传统方法的100倍。在效果上,碱量的提升,有效提高了蛋白的提取效率,但是仅用高碱,对植物细胞的破坏性也较强,加之制药渣粕中的蛋白本身受到一定程度的破坏,导致提取液和最终的蛋白粉呈现深绿色-黑色的状态,即所获得的蛋白必需进行脱色处理。本发明通过添加抗氧化保护剂维生素C,成功控制了高碱浸提对植物细胞和蛋白的不利影响,通过反复实验,优化了维生素C的最优添加剂量,使得维生素C的添加在充分保护所提取的蛋白的同时,剂量和成本可控。添加维生素C以后,提取过程中的浸提液呈淡黄色,蛋白产物呈乳白色,蛋白产品无需进行脱色处理,且纯度较高,品质较好。对于碱的添加方法,本发明使用了添加固体NaOH的方式,按照原料的质量进行比例换算后添加,这种方式减少了了预先配制NaOH溶液的操作,生产工艺容易放大,同时减少了pH值测量和调节步骤,显著提高了实际操作中的可重复性、准确性和便捷性,降低了由于pH值调节不准所造成的操作误差以及由此引发的不同批次产品间的差异。
3)水飞蓟蛋白沉淀使用了过等电点的沉淀方法,水飞蓟蛋白的等电点在5.0-6.0之间,传统方法使用调节pH值至5.5进行蛋白沉淀,本发明改进了沉淀条件,使用调节pH值至4.0-4.5,且优选为4.3的条件,由此,在略低于蛋白等电点的pH值条件下,进行水飞蓟蛋白沉底,获得了更高的蛋白沉淀效率和产率,这可能与沉淀后的蛋白不再重溶,且凝聚效应增大有关。
4)本发明经反复实验,优化了碱和抗氧化保护剂的添加量、最佳提取温度、两次浸提的操作方法、以及过等电点沉淀条件,四步联用,最终提高了蛋白产率、保证了所获得蛋白的质量,使得在最优条件下,水飞蓟制药渣粕中的蛋白纯度约86%,蛋白提取率约41%,蛋白实际产率约11%,与之相对应的传统方法,所得到的蛋白纯度约78%,蛋白提取率约4%,蛋白实际产率约1%。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进一步说明:
实施例1
本实施例公开了一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,具体地,包括以下步骤:
步骤(1)水飞蓟制药渣粕经回收集中后,进行真空干燥处理,在相对真空度-0.1Mpa的条件下,真空干燥6h,去除制药浸提过程中的乙酸乙酯、丙酮或正己烷溶剂残余;
步骤(2)步骤(1)中干燥后的水飞蓟渣粕,经粉碎机研磨粉碎过10目筛,得到粒径不大于2mm的水飞蓟渣粕粉;
步骤(3)每克水飞蓟渣粕粉添加0.03g NaOH,混合均匀,再添加0.005g维生素C,混合均匀,然后添加10mL纯净水,搅拌均匀后,在20℃的条件下恒温浸提,且持续搅拌或震荡2h;
步骤(4)浸提悬浊液在4000转/min条件下,离心5min,得到浸提上清液和浸提残渣;
步骤(5)分离步骤(4)的浸提上清液,使用1mol/L的盐酸调节pH值至4.0,室温下静置沉淀0.5h,随后在4000转/min条件下,离心5min,获得蛋白沉淀I;
步骤(6)分离步骤(4)的浸提液残渣,并对此残渣进行二次浸提,按照每克初始渣粕粉计,向步骤(4)的浸提残渣中添加0.021g NaOH以及7mL纯净水,混合搅拌均匀后,再添加0.0035g维生素C,混合搅拌均匀后,在20℃的条件下恒温搅拌或震荡0.5h,进行二次浸提;
步骤(7)将步骤(6)的浸提悬浊液在4000转/min条件下,离心5min,获得浸提液上清;分离浸提液上清,使用1mol/L的盐酸调节pH值至4.0,并在室温下静置沉淀0.5h,随后在4000转/min条件下,离心5min获得蛋白沉淀II;
步骤(8)合并步骤(5)中的蛋白沉淀I和步骤(7)中的蛋白沉淀II,得到总蛋白提取物,冷冻干燥总蛋白提取物,条件为相对真空度-0.1Mpa、温度-20℃、真空干燥6h,得到水飞蓟粗蛋白。
本实施例最终得到的蛋白纯度为81%,蛋白提取率约33%,蛋白实际产率约8.8%。其中,蛋白提取率为蛋白粉质量与制药渣粕中总蛋白质量的比率,蛋白实际产率为蛋白粉质量与制药渣粕质量的比率。
实施例2
本实施例公开了一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,具体地,包括以下步骤:
步骤(1)水飞蓟制药渣粕经回收集中后,进行真空干燥处理,在相对真空度-0.1Mpa的条件下,真空干燥12h,去除制药浸提过程中的乙酸乙酯、丙酮或正己烷溶剂残余;
步骤(2)步骤(1)中干燥后的水飞蓟渣粕,经粉碎机研磨粉碎过10目筛,得到粒径不大于2mm的水飞蓟渣粕粉;
步骤(3)每克水飞蓟渣粕粉添加0.04g NaOH,混合均匀,再添加0.01g维生素C,混合均匀,然后添加10mL纯净水,搅拌均匀后,在40℃的条件下恒温浸提,且持续搅拌或震荡3h;
步骤(4)浸提悬浊液在8000转/min条件下,离心10min,得到浸提上清液和浸提残渣;
步骤(5)分离步骤(4)的浸提上清液,使用1mol/L的盐酸调节pH值至4.3,室温下静置沉淀1h,随后在8000转/min条件下,离心10min,获得蛋白沉淀I;
步骤(6)分离步骤(4)的浸提液残渣,并对此残渣进行二次浸提,按照每克初始渣粕粉计,向步骤(4)的浸提残渣中添加0.028g NaOH以及7mL纯净水,混合搅拌均匀后,再添加0.007g维生素C,混合搅拌均匀后,在40℃的条件下恒温搅拌或震荡1h,进行二次浸提;
步骤(7)将步骤(6)的浸提悬浊液在8000转/min条件下,离心10min,获得浸提液上清;分离浸提液上清,使用1mol/L的盐酸调节pH值至4.3,并在室温下静置沉淀1h,随后在8000转/min条件下,离心10min获得蛋白沉淀II;
步骤(8)合并步骤(5)中的蛋白沉淀I和步骤(7)中的蛋白沉淀II,得到总蛋白提取物,冷冻干燥总蛋白提取物,条件为相对真空度-0.1Mpa、温度-20℃、真空干燥16h,得到水飞蓟粗蛋白。
本实施例最终得到的蛋白纯度为86%,蛋白提取率约41%,蛋白实际产率约11%。其中,蛋白提取率为蛋白粉质量与制药渣粕中总蛋白质量的比率,蛋白实际产率为蛋白粉质量与制药渣粕质量的比率。
实施例3
本实施例公开了一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,具体地,包括以下步骤:
步骤(1)水飞蓟制药渣粕经回收集中后,进行真空干燥处理,在相对真空度-0.1Mpa的条件下,真空干燥24h,去除制药浸提过程中的乙酸乙酯、丙酮或正己烷溶剂残余;
步骤(2)步骤(1)中干燥后的水飞蓟渣粕,经粉碎机研磨粉碎过10目筛,得到粒径不大于2mm的水飞蓟渣粕粉;
步骤(3)每克水飞蓟渣粕粉添加0.05g NaOH,混合均匀,再添加0.02g维生素C,混合均匀,然后添加10mL纯净水,搅拌均匀后,在50℃的条件下恒温浸提,且持续搅拌或震荡3h;
步骤(4)浸提悬浊液在10000转/min条件下,离心20min,得到浸提上清液和浸提残渣;
步骤(5)分离步骤(4)的浸提上清液,使用1mol/L的盐酸调节pH值至4.5,室温下静置沉淀2h,随后在10000转/min条件下,离心20min,获得蛋白沉淀I;
步骤(6)分离步骤(4)的浸提液残渣,并对此残渣进行二次浸提,按照每克初始渣粕粉计,向步骤(4)的浸提残渣中添加0.035g NaOH以及7mL纯净水,混合搅拌均匀后,再添加0.014g维生素C,混合搅拌均匀后,在50℃的条件下恒温搅拌或震荡2h,进行二次浸提;
步骤(7)将步骤(6)的浸提悬浊液在10000转/min条件下,离心20min,获得浸提液上清;分离浸提液上清,使用1mol/L的盐酸调节pH值至4.5,并在室温下静置沉淀2h,随后在10000转/min条件下,离心20min获得蛋白沉淀II;
步骤(8)合并步骤(5)中的蛋白沉淀I和步骤(7)中的蛋白沉淀II,得到总蛋白提取物,冷冻干燥总蛋白提取物,条件为相对真空度-0.1Mpa、温度-20℃、真空干燥24h,得到水飞蓟粗蛋白。
本实施例最终得到的蛋白纯度为84%,蛋白提取率约39%,蛋白实际产率约10.4%。其中,蛋白提取率为蛋白粉质量与制药渣粕中总蛋白质量的比率,蛋白实际产率为蛋白粉质量与制药渣粕质量的比率。
对比例1
一种水飞蓟蛋白的提取方法,具体地,包括以下步骤:
步骤(1)水飞蓟制药渣粕,经粉碎机研磨粉碎过10目筛,得到粒径不大于2mm的水飞蓟渣粕粉;
步骤(2)每克水飞蓟制药渣粕粉添加0.0004g NaOH,混合均匀,然后添加17mL纯净水,搅拌均匀后,在50℃的条件下恒温浸提,且持续搅拌或震荡6h;
步骤(3)浸提悬浊液在10000转/min条件下,离心20min,得到浸提上清液和浸提残渣;
步骤(4)分离步骤(3)的浸提上清液,使用1mol/L的盐酸调节pH值至5.5,室温下静置沉淀2h,随后在10000转/min条件下,离心20min,获得蛋白沉淀;
步骤(5)将步骤(4)中的蛋白沉淀,冷冻干燥,条件为相对真空度-0.1Mpa、温度-20℃、真空干燥16h,得到水飞蓟粗蛋白。
本对比例最终得到的蛋白纯度为78%,蛋白提取率约4%,蛋白实际产率约1%。其中,蛋白提取率为蛋白粉质量与制药渣粕中总蛋白质量的比率,蛋白实际产率为蛋白粉质量与制药渣粕质量的比率。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤(1)水飞蓟制药渣粕经回收集中后,进行真空干燥处理,去除制药浸提过程中的有机溶剂残余;
步骤(2)将步骤(1)中干燥后的水飞蓟制药渣粕,经粉碎机研磨粉碎过筛,得到粒径不大于2mm的水飞蓟渣粕粉;
步骤(3)每克水飞蓟渣粕粉添加0.03-0.05g NaOH,混合均匀,再添加0.005-0.02g维生素C,混合均匀,然后添加10mL纯净水,搅拌均匀后,在20℃到50℃的条件下恒温浸提,且持续搅拌或震荡2-6h;
步骤(4)浸提悬浊液离心得到浸提上清液和浸提残渣;
步骤(5)分离步骤(4)的浸提上清液,使用盐酸调节pH值至4.0-4.5,室温下静置沉淀0.5-2h,随后离心获得蛋白沉淀I;
步骤(6)分离步骤(4)的浸提液残渣,并对此残渣进行二次浸提,按照每克初始渣粕粉计,向步骤(4)的浸提残渣中添加0.021-0.035g NaOH以及7mL纯净水,混合搅拌均匀后,再添加0.0035-0.014g维生素C,混合搅拌均匀后,在20℃到50℃的条件下恒温搅拌或震荡0.5-2h,进行二次浸提;
步骤(7)将步骤(6)的浸提悬浊液离心获得浸提液上清;分离浸提液上清,使用盐酸调节pH值至4.0-4.5,并在室温下静置沉淀0.5-2h,随后离心获得蛋白沉淀II;
步骤(8)合并步骤(5)中的蛋白沉淀I和步骤(7)中的蛋白沉淀II,得到总蛋白提取物,冷冻干燥总蛋白提取物,得到水飞蓟粗蛋白粉。
2.根据权利要求1所述从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,步骤(1)中水飞蓟制药渣粕为水飞蓟素提取后的渣粕,其中残余的溶剂常见为乙酸乙酯、丙酮、正己烷,含量为200-20000ppm。
3.根据权利要求1所述从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,步骤(1)所述真空干燥,为相对真空度-0.1Mpa的条件下,真空干燥6-24h。
4.根据权利要求1所述从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,步骤(3)NaOH的添加量为0.035-0.045g,维生素C的添加量为0.01-0.02g。
5.根据权利要求1所述从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,步骤(3)的浸提温度为30℃到40℃,浸提时间为3-5h。
6.根据权利要求1所述从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,步骤(4)、步骤(5)和步骤(7)所述离心为4000-10000转/min条件下,离心5-20min。
7.根据权利要求1所述从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,步骤(5)和步骤(7)中调节pH值至4.1-4.4,沉淀时间为1-2h。
8.根据权利要求1所述从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,步骤(6)NaOH的添加量为0.025-0.030g,维生素C的添加量为0.005-0.010g。
9.根据权利要求1所述从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,步骤(6)浸提温度为30℃到40℃,浸提时间为1-2h。
10.根据权利要求1所述从水飞蓟制药渣粕中提取水飞蓟蛋白的方法,其特征在于,步骤(8)冷冻干燥,为相对真空度-0.1Mpa、温度-20℃、真空干燥6-24h。
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