CN111154744B - 一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶及其制备方法和应用，羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，包含羟基磷灰石55‑97wt％,α葡聚糖酶1‑40wt％以及烷基酰谷氨酸0.5‑5wt％。采用体外合成的牙齿主要成分羟基磷灰石作为载体，吸附固定化α葡聚糖酶，形成固化α葡聚糖酶的羟基磷灰石，并通过烷基酰谷氨酸修饰固定化α葡聚糖酶的羟基磷灰石表面，使羟基磷灰石表面通过烷基酰谷氨酸中的谷氨酸的分子间的氢键作用，形成烷基疏水化修饰，提高了α葡聚糖酶的化学稳定性，极大的降低了牙膏基质辅料对α葡聚糖酶酶活的影响进而降低α葡聚糖酶牙膏的生产工艺的复杂性。

Description

一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及口腔护理领域，具体涉及一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶及其制备方法和应用。

背景技术

在口腔疾病中，龋齿和牙周病是造成牙齿缺失的主要原因。有研究结果证明：致龋的变形链球菌生长在含蔗糖的培养基上可产生葡聚糖，且同时观察到变形链球菌的富集现象。葡聚糖是一种粘性的胶体物质，它能使多种病原菌聚集，在牙齿上形成菌斑。而产酸病原菌产生的有机酸又会引起牙釉质脱钙，进而形成龋齿。

为了防治龋齿，现有技术中一般采用两种方法，一种是药物制剂，但存在耐药性等诸多不利因素，另一种是用生物活性制剂。近年来，许多科学家和医务工作者用多种复合酶制剂加入牙膏中，对于治疗菌斑和龋齿已取得良好的效果。

现有的含酶牙膏大部分是将各种原料及生物酶混为一体，然后罐装于软管中，然而生物酶的稳定性比较差，需要在特定条件保持其稳定性。在牙膏中添加生物酶，既要保障牙膏膏体的稳定，又要确保生物酶的活性和稳定性，这样使得含酶牙膏的生产工艺较为复杂。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的由于生物酶稳定性较差从而使得含酶牙膏的生产工艺较为复杂的缺陷，从而提供一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

本发明还提供一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶的制备方法。

本发明还提供一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶的应用。

为此,本发明提供一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，包含羟基磷灰石55-97wt％,α葡聚糖酶1-40wt％以及烷基酰谷氨酸0.5-5wt％。

所述烷基酰谷氨酸为脂肪酸与谷氨酸通过酰胺键合形成，通过本领域常规的合成方法可以实现，也可以通过购买市售产品得到。

进一步地，含包含有戊二醛1-5wt％。

进一步地，所述烷基酰谷氨酸中烷基的碳原子数为8-18。

进一步地，所述烷基酰谷氨酸为十二烷酰谷氨酸、十六烷酰谷氨酸和油酰谷氨酸中的一种或几种。

进一步地，所述纳米羟基磷灰石的粒径为10-200nm。

进一步地，所述纳米羟基磷灰石的粒径为15-100nm。

进一步地，所述纳米羟基磷灰石的粒径为20-60nm。

本发明还提供一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：

S1，35-45℃条件下,将α葡聚糖酶和烷基酰谷氨酸溶于水中，得到透明水溶液；

S2，35-45℃条件下,将羟基磷灰石加入到透明水溶液中，搅拌，得到悬浊液；以及

S3，将悬浊液沉淀、洗涤、冷冻干燥得到羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

所述沉淀、洗涤的操作在室温条件下进行，冷冻干燥通过常规的操作即可，不做特殊限定。

进一步地，包括以下步骤：

S1，35-45℃条件下,将α葡聚糖酶和烷基酰谷氨酸溶于水中，得到透明水溶液；

S2，35-45℃条件下,将羟基磷灰石加入到透明水溶液中，搅拌，得到悬浊液；

S3'，35-45℃条件下,向悬浊液中加入戊二醛，搅拌；沉淀、洗涤、冷冻干燥得到羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

所述沉淀、洗涤的操作在室温条件下进行，冷冻干燥通过常规的操作即可，不做特殊限定。

本发明还提供一种上述的羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶或上述的制备方法得到的羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶在牙膏中的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，采用体外合成的牙齿主要成分羟基磷灰石作为载体，吸附固定化α葡聚糖酶，形成固化α葡聚糖酶的羟基磷灰石，并通过烷基酰谷氨酸修饰固定化α葡聚糖酶的羟基磷灰石表面，使羟基磷灰石表面通过烷基酰谷氨酸中的谷氨酸的分子间的氢键作用，形成烷基疏水化修饰，提高了α葡聚糖酶的化学稳定性，极大的降低了牙膏基质辅料对α葡聚糖酶酶活的影响进而降低α葡聚糖酶牙膏的生产工艺的复杂性；通过烷基酰谷氨酸修饰羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶增强了羟基磷灰石在牙齿表面的沉积，从而增加了α葡聚糖酶在牙齿表面的停留时间，延长了α葡聚糖酶的作用时间，增强了预防牙菌斑的作用；通过烷基酰谷氨酸修饰纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶提高了利用α葡聚糖酶的酶解作用，增强了羟基磷灰石对牙釉的修复作用。

2.本发明提供的羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，限定羟基磷灰石的粒径为10-200nm，优选为15-100nm，最优为20-60nm，该粒径范围的纳米羟基磷灰石容易进入牙釉质小管，能够堵住牙釉质小管，对牙釉质进行修复，能够长时间停留在牙釉表面，更有效的预防牙菌斑的形成。进一步还添加有戊二醛，主要是将酶及烷基谷氨酸与羟基磷灰石交联到一起。

3.本发明提供的含有羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶的牙膏，可以起到预防牙菌斑及修复牙釉的作用。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1

一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，包含粒径为100nm羟基磷灰石97wt％,α葡聚糖酶1.5wt％、肉豆蔻酰谷氨酸0.5wt％以及戊二醛1wt％。

上述羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶通过以下方法制备：

35℃条件下，将1.5wt％的α葡聚糖酶、及0.5wt％的肉豆蔻酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入97wt％的粒径为100nm的羟基磷灰石，35℃条件下搅拌1h；然后再向其中加入1wt％的戊二醛，搅拌3h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

实施例2

一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，包含粒径为60nm羟基磷灰石91wt％,α葡聚糖酶5wt％、肉豆蔻酰谷氨酸1wt％以及戊二醛3wt％。

上述羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶通过以下方法制备：

40℃条件下，将5wt％的α葡聚糖酶、及1wt％的肉豆蔻酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入91wt％的粒径为60nm的羟基磷灰石，40℃条件下搅拌3h；然后再向其中加入3wt％的戊二醛，搅拌2h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

实施例3

一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，包含粒径为10nm羟基磷灰石73.5wt％,α葡聚糖酶20wt％、棕榈油酰谷氨酸3.5wt％以及戊二醛3wt％。

上述羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶通过以下方法制备：

45℃条件下，将20wt％的α葡聚糖酶、及3.5wt％的棕榈油酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入73.5wt％的粒径为10nm的羟基磷灰石，45℃条件下搅拌3h；然后再向其中加入3wt％的戊二醛，搅拌2h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

实施例4

一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，包含粒径为15nm羟基磷灰石72wt％,α葡聚糖酶20wt％、油酰谷氨酸4wt％以及戊二醛4wt％。

上述羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶通过以下方法制备：

40℃条件下，将20wt％的α葡聚糖酶、及4wt％的油酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入72wt％的粒径为15nm的羟基磷灰石，45℃条件下搅拌3h；然后再向其中加入4wt％的戊二醛，搅拌2h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

实施例5

一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，包含粒径为20nm羟基磷灰石55wt％,α葡聚糖酶35wt％、肉豆蔻酰谷氨酸5wt％以及戊二醛5wt％。

上述羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶通过以下方法制备：

45℃条件下，将35wt％的α葡聚糖酶、及5wt％的肉豆蔻酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入55wt％的粒径为20nm的羟基磷灰石，45℃条件下搅拌3h；然后再向其中加入5wt％的戊二醛，搅拌3h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

实施例6

一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，包含粒径为200nm羟基磷灰石55wt％,α葡聚糖酶40wt％、肉豆蔻酰谷氨酸5wt％。

上述羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶通过以下方法制备：

45℃条件下，将40wt％的α葡聚糖酶、及5wt％的肉豆蔻酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入55wt％的粒径为200nm的羟基磷灰石，45℃条件下搅拌3h；再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

对比例1

一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶，包含粒径为60nm羟基磷灰石92wt％,α葡聚糖酶5wt％、以及戊二醛3wt％。

上述羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶通过以下方法制备：

40℃条件下，将5wt％的α葡聚糖酶溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入92wt％的粒径为60nm羟基磷灰石，40℃条件下搅拌3h；然后再向其中加入3wt％的戊二醛，搅拌2h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

实验例

将羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶与非固定化α葡聚糖酶分别按照0.5wt％、及0.025wt％的比例分别加入到市售隆力奇白茶多效牙膏胶体中，放置在40℃恒温条件下，分别在第一周、第六周及第十二周检测其酶活变化。

酶活性测试：取900ul的2％的葡聚糖(T2000)溶液，置于50℃恒温水浴中保温5min，然后加入100mg的含酶牙膏料体。50rmp磁力搅拌反应10min，立即加入2ml 3,5-二硝基水杨酸(DNS)终止反应，并于沸水中保温5min，迅速冷却，用蒸馏水定溶至25ml，离心取上清液，于540nm下测定其吸光度，根据葡聚糖标准曲线，计算相应的葡聚糖的量，并折算出酶活。酶活：每分钟从葡聚糖底物中释放出1umol还原糖所需的量为1个酶活单位，以U/g表示。

表1

由表可知，采用通过烷基酰谷氨酸修饰固定化的酶可以较好的保持牙膏中α葡聚糖酶活的稳定性，对比例1没有通过烷基酰谷氨酸修饰，牙膏中酶活稳定性就明显下降。直接加入非固定化酶到牙膏基质中，酶活稳定性就显著下降。说明通过固定化酶可以有效的提高酶在牙膏中的稳定性，并且通过烷基酰谷氨酸修饰固定化酶后，可以有效保持酶在牙膏中的稳定性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，通过以下方法制备：

40℃条件下，将5wt％的α葡聚糖酶、及1wt％的肉豆蔻酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入91wt％的粒径为60nm的羟基磷灰石，40℃条件下搅拌3h；然后再向其中加入3wt％的戊二醛，搅拌2h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

2.一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，通过以下方法制备：

45℃条件下，将20wt％的α葡聚糖酶、及3.5wt％的棕榈油酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入73.5wt％的粒径为10nm的羟基磷灰石，45℃条件下搅拌3h；然后再向其中加入3wt％的戊二醛，搅拌2h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

3.一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，通过以下方法制备：

40℃条件下，将20wt％的α葡聚糖酶、及4wt％的油酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入72wt％的粒径为15nm的羟基磷灰石，45℃条件下搅拌3h；然后再向其中加入4wt％的戊二醛，搅拌2h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

4.一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，通过以下方法制备：

45℃条件下，将35wt％的α葡聚糖酶、及5wt％的肉豆蔻酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入55wt％的粒径为20nm的羟基磷灰石，45℃条件下搅拌3h；然后再向其中加入5wt％的戊二醛，搅拌3h，再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。

5.一种羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，通过以下方法制备：

45℃条件下，将40wt％的α葡聚糖酶、及5wt％的肉豆蔻酰谷氨酸溶于50倍的去离子水中，搅拌溶解形成透明溶液；再向其中加入55wt％的粒径为200nm的羟基磷灰石，45℃条件下搅拌3h；再离心取沉淀，沉淀用去离子水洗涤2次，最后冷冻干燥得到疏水化纳米羟基磷灰石固定化α葡聚糖酶。