CN111138304B - 一种双光子荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双光子荧光探针及其合成方法与应用，本发明公开的双光子荧光探针以丙烯酸酯上的α,β‑不饱和键及游离的醛基作为反应位点，当向体系中加入GSH后，丙烯酸酯上双键与巯基发生加成反应，醛基与氨基形成动态亚胺键，从而生成一个新的十六圆环作为荧光信号的报告基团，从而高效监测GSH的存在。本发明通过紫外‑可见吸收光谱法、荧光光谱法等研究了双光子荧光探针对多种氨基酸的识别效果，结果表明本发明荧光探针在PBS缓冲溶液中能够高效选择性识别GSH，且对GSH具有很高的响应灵敏度，及在HeLa细胞、小鼠大脑组织切片和植物组织切片中也可以实现GSH的可视化检测。

Description

一种双光子荧光探针及其合成方法与应用

技术领域

本发明属于生物硫醇检测技术领域，涉及一种用于检测谷胱甘肽(GSH)的方法策略，尤其涉及一种双光子荧光探针及其合成方法与应用。更具体地，涉及一种基于丙烯酸酯-4-二乙氨基水杨醛的零背景检测双光子荧光探针SA，同时还涉及该探针的合成方法及其在检测GSH中的应用。

背景技术

GSH(谷胱甘肽)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，能帮助机体维持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化和解毒作用，比如修复肝肾等器官受损，排除体内重金属等，此外谷胱甘肽还具有美白的功效。因此，对谷胱甘肽含量的检测可以为身体疾病的诊断和身体健康程度的评估提供有效的数据。

现今对谷胱甘肽的检测主要有改良Tietze还原酶法、Giffith法、量热法、色谱法、分光光度法、毛细管电泳法等，这些方法对仪器设备的要求比较高或有其他物质干扰实验结果，且与发光测定法相比，传统的测定方法灵敏度较低。相比之下，荧光分析法可以在活细胞中进行原位成像，具有特异性、高灵敏度，并有较为广阔的商用价值，是目前对GSH定量检测比较具有应用价值的分析方法。

综上，如何开发一种高灵敏度、高选择性且无背景信号的用于检测谷胱甘肽的荧光探针是本领域技术人员亟待解决的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种高选择性、高灵敏性且用于检测谷胱甘肽的双光子荧光探针。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种双光子荧光探针，其结构式为：

所述双光子荧光探针是一种基于丙烯酸酯-4-二乙氨基水杨醛的零背景检测双光子荧光探针，该探针以丙烯酸酯上的α,β-不饱和键及游离的醛基作为反应位点，当向体系中加入GSH后，丙烯酸酯上双键与巯基发生加成反应，醛基与氨基形成动态亚胺键，从而生成一个新的十六圆环作为荧光信号的报告基团，以高效监测出GSH的存在。

示范性的，参见说明书附图，本发明通过核磁共振氢谱(图1)、核磁共振碳谱(图2)、质谱及紫外光谱对所述双光子荧光探针进行了结构表征，以表征所述荧光探针合成成功。

本发明的另一目的是提供一种上述双光子荧光探针的合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种双光子荧光探针的合成方法，具体步骤包括：

(1)以二氯甲烷为反应溶剂，以4-二乙氨基水杨醛为底物，丙烯酰氯为反应原料，及以三乙胺为反应用碱，低温反应得到反应物1；

(2)将反应物1减压蒸馏后柱层析分离，得到目标产物双光子荧光探针。

通过采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：

本发明公开的合成方法与传统的荧光探针合成方法相比，操作简便、提纯分离方便，适于工业推广与应用。

优选的，所述步骤(1)中，以二氯甲烷为反应溶剂，底物4-二乙氨基水杨醛与丙烯酰氯的摩尔比为1:(1～5)，反应用碱三乙胺与丙烯酰氯的摩尔比为1：1；且低温条件为0℃，反应时间为2h～12h。

示范性的，本发明公开的双光子荧光探针具体合成方案如下：

在100mL圆底烧瓶中，加入10mL的无水二氯甲烷，降温至0℃，加入1mmol的4-二乙氨基水杨醛，搅拌至完全溶解，加入3mmol的三乙胺，最后加入3mmol溶于5mL无水二氯甲烷的丙烯酰氯，反应2h，即可得到本发明双光子荧光探针SA。

具体的，本发明的合成路线：

本发明还有一个目的，就是提供双光子荧光探针在溶剂体系中选择性识别谷胱甘肽的应用。

需要说明的是，所述的溶剂体系中水的体积含量为98％～100％。

具体的，所述双光子荧光探针在纯水体系中检测GSH的检测机理如下：

本发明公开的荧光探针本身无荧光发色团，且探针结构上面连有反应基团丙烯酸酯，在GSH存在下，丙烯酸酯的双键可以与GSH的巯基发生加成反应，而GSH上的氨基可以与探针的醛基发生席夫碱反应，形成碳氮双键，并生成超大的环，从而生成了新的发色团，同时在420-540nm处出现新的明显发射峰。

在一些应用场景中，还包括所述双光子荧光探针在对谷胱甘肽的选择性识别和定量检测中的应用。

在一些应用场景中，还包括所述双光子荧光探针在以谷胱甘肽为标志物的检测及成像中的应用。

在一些应用场景中，还包括所述双光子荧光探针在制备诊断、预测及其治疗监测与谷胱甘肽功能障碍相关疾病的诊断试剂及医疗器械中的应用。

该策略检测谷胱甘肽的优点在于，所述双光子荧光探针能够高效选择性识别谷胱甘肽，且对谷胱甘肽具有较高的灵敏度，少量的探针即可对谷胱甘肽作出定量检测及响应。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种双光子荧光探针及其合成方法与应用，具有如下优异效果：

首先，本发明公开的双光子荧光探针，该探针以丙烯酸酯上的α,β-不饱和键及游离的醛基作为反应位点，当向体系中加入GSH后，丙烯酸酯上双键与巯基发生加成反应，醛基与氨基形成动态亚胺键，从而生成一个新的十六圆环作为荧光信号的报告基团，以实现对谷胱甘肽的表征。

其次，本发明还公开了所述双光子荧光探针的合成方法，该合成方法操作简便、提纯方便快捷，具有良好的工业化应用潜力。

最后，本发明公开了所述双光子荧光探针的应用，所述双光子荧光探针可以高效选择性识别谷胱甘肽，且对谷胱甘肽具有较高的灵敏度，少量的探针即可对谷胱甘肽作出定量检测及响应；所述双光子荧光探针对谷胱甘肽的最低检测限为7.50×10^-9mol·L^-1，适用于谷胱甘肽的高效监测；并且，所述双光子荧光探针可在纯水体系中特异性检测识别谷胱甘肽，在细胞成像，以及制备诊断、预测、治疗监测与谷胱甘肽功能障碍相关的疾病的诊断试剂或医疗器械中具有良好的应用潜力和研究价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明双光子荧光探针的核磁共振氢谱图。

图2为本发明双光子荧光探针的核磁共振碳谱图。

图3为本发明双光子荧光探针(1.0×10^-5mol·L^-1)在纯水体系中与GSH相互作用时的紫外可见光谱图。

图4为本发明双光子荧光探针(1.0×10^-5mol·L^-1)在纯水体系中与各种氨基酸相互作用在470nm处荧光散点柱状图。

图5为本发明双光子荧光探针(1.0×10^-5mol·L^-1)在纯水体系中与0-45μM GSH反应在470nm处的荧光散点图；本发明双光子荧光探针(1.0×10^-5mol·L^-1)在纯水体系中与0-10μM GSH反应的线性曲线图。

图6为本发明双光子荧光探针(1.0×10^-5mol·L^-1)在纯水体系中与GSH的反应时间荧光光谱图。

图7为本发明双光子荧光探针(1.0×10^-5mol·L^-1)在细胞培养液体系中与HeLa细胞共培养后激光共聚焦显微镜成像图；其中(a)为细胞与探针孵育30分钟后的荧光成像；(b)为NEM预处理30分钟后在与探针孵育30分钟后的荧光成像；(c,d,e)是细胞经NEM预处理30分钟后，分别加入Cys,Hcy和GSH，在与探针孵育后的荧光成像。图中标尺为20微米。

图8为本发明双光子荧光探针(1.0×10^-5mol·L^-1)与小鼠大脑切片共孵育后激光共聚焦显微镜成像图；其中a)为小鼠全脑组织成像图，b)为100μm深处脑组织成像图，c)为用NEM处理后100μm深处脑组织成像图。图中标尺a为300微米；b,c为100微米。

图9为本发明双光子荧光探针(1.0×10^-5mol·L^-1)与植物组织切片共孵育后激光共聚焦显微镜成像图；其中a)为圣女果，b)为黄瓜，c)为苹果。图中标尺为100微米。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种高灵敏度、高选择性的用于检测谷胱甘肽的双光子荧光探针及其合成方法与应用。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

本发明公开了一种双光子荧光探针，所述荧光探针的结构式为：

本发明还公开了一种双光子荧光探针的合成方法，具体步骤包括：

本发明以二氯甲烷为反应溶剂，以4-二乙氨基水杨醛为底物，丙烯酰氯为反应原料，以三乙胺为反应用碱，0℃反应2h；减压蒸馏除去溶剂，再用柱层析分离法(二氯甲烷作为洗脱剂)，得到纯净的目标产物。

具体的荧光探针合成方法如下:

在100mL圆底烧瓶中，加入10mL的无水二氯甲烷，降温至0℃，加入1mmol的4-二乙氨基水杨醛，搅拌至完全溶解，加入3mmol的三乙胺，最后加入3mmol溶于5mL无水二氯甲烷的丙烯酰氯，反应2h，即可得到双光子荧光探针SA。

下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。

实施例1

一种双光子荧光探针的合成方法：

将4-二乙氨基水杨醛(2mmol)与丙烯酰氯(2mmol)混合于无水二氯甲烷(10mL)中，滴加三乙胺(2mmol)，0℃条件下反应2h，反应结束后，减压蒸馏除去溶剂二氯甲烷，最后通过柱层析分离法得到纯净的目标产物—丙烯酸酯-4-二乙氨基水杨醛。

实施例2

将4-二乙氨基水杨醛(2mmol)与丙烯酰氯(6mmol)混合于无水二氯甲烷(10mL)中，滴加三乙胺(6mmol)，0℃条件下反应2h，反应结束后，减压蒸馏除去溶剂二氯甲烷，最后通过柱层析分离法得到纯净的目标产物—丙烯酸酯-4-二乙氨基水杨醛。

实施例3

将4-二乙氨基水杨醛(2mmol)与丙烯酰氯(8mmol)混合于无水二氯甲烷(10mL)中，滴加三乙胺(8mmol)，0℃条件下反应2h，反应结束后，减压蒸馏除去溶剂二氯甲烷，最后通过柱层析分离法得到纯净的目标产物—丙烯酸酯-4-二乙氨基水杨醛。

实施例4

将4-二乙氨基水杨醛(2mmol)与丙烯酰氯(10mmol)混合于无水二氯甲烷(10mL)中，滴加三乙胺(10mmol)，0℃条件下反应2h，反应结束后，减压蒸馏除去溶剂二氯甲烷，最后通过柱层析分离法得到纯净的目标产物—丙烯酸酯-4-二乙氨基水杨醛。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

本发明内容不仅限于上述各实施例的内容，其中一个或几个实施例的组合同样也可以实现本发明目的。

为了进一步验证本发明的优异效果，发明人还进行了如下实验：

实验1：探针的合成及结构表征

1、双光子荧光探针(丙烯酸酯-4-二乙氨基水杨醛)的合成

将4-二乙氨基水杨醛(2mmol)与丙烯酰氯(6mmol)混合于无水二氯甲烷(10mL)中，滴加三乙胺(6mmol)，0℃条件下反应2h，反应结束后，减压蒸馏除去溶剂二氯甲烷，最后通过柱层析分离法得到纯净的目标产物—丙烯酸酯-4-二乙氨基水杨醛。

2、测试分析：

图1为探针的¹HNMR图谱，具体谱峰值为：

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ(ppm)9.62(s,1H),7.64(d,J＝8.8Hz,1H),6.69(dd,J＝8.8,2.2Hz,1H),6.52(d,J＝17.2Hz,1H),6.47–6.38(m,2H),6.15(d,J＝10.1Hz,1H),3.43(q,J＝7.0Hz,4H),1.11(t,J＝7.0Hz,6H)；

图2为探针的¹³C NMR图谱，具体谱峰值为：

¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ(ppm)186.45,164.40,153.48,153.25,133.82,128.06,115.96,109.01,104.83,56.44,44.55,42.32,40.17,42.32,41.80,40.17,12.67。

通过对核磁谱的分析，可以确定成功合成了双光子荧光探针SA。

实验2：双光子荧光探针对GSH的选择性识别

分别取2mL的双光子荧光探针SA水溶液(10μmol)于一系列5mL离心管中，向每支离心管中滴加20μL CTAB(0.5mmol)，最后依次向每支比色管中分别加入GSH，Cys，Na₂S，NaHSO₃，Hcy，Asp，Arg，Glu，Gln，His，Ile，Leu，Lys，Phe，Pro，Thr，Trp，Tyr的水溶液(10mmol)4μL，此时，氨基酸及离子化合物的浓度为荧光探针浓度的2倍，摇匀后静置20分钟，测试紫外吸收光谱(图3)和荧光光谱(图4)。

由图3的紫外-可见吸收光谱可以看出，GSH的加入使双光子荧光探针SA纯水体系在354nm的吸收峰减弱，在400nm的吸收峰会有增强，而其他氨基酸和离子化合物的加入，都不会对纯水体系的紫外光谱有明显的影响。

由图4的荧光光谱可以看出，GSH的加入使双光子荧光探针SA纯水体系在420-540nm处出现新的明显发射峰，且本探针的纯水体系，在紫外灯的照射下会呈现亮绿色，且而其他氨基酸和离子化合物的加入，都不会对双光子荧光探针SA纯水体系的荧光光谱产生影响。

综上，本发明合成的SA荧光探针可在纯水体系中选择性识别谷胱甘肽。

实验3：双光子荧光探针对谷胱甘肽最低检测限的测定

利用荧光发射光谱，根据双光子荧光探针SA对GSH溶液的滴定实验，在470nm处取散点图，并做出了相应的线性响应曲线(图5)，通过3σ/K计算，得到SA体系对GSH的最低检测限为7.50×10^-9mol·L^-1，说明双光子荧光探针SA对GSH的检测灵敏度高，表明该探针在纯水体系中对GSH的检测方面有极大的潜在应用价值。

实验4：双光子荧光探针对谷胱甘肽响应时间的测定

利用荧光发射光谱(图6)，对双光子荧光探针SA与GSH溶液的反应时间进行了监测，通过在470nm处取散点图可得出结论，大约20min，SA与GSH溶液反应达到平衡，说明双光子荧光探针SA对GSH的检测反应时间短，表明该探针在快速定量检测GSH的方面应用价值很高。

实验5：双光子荧光探针对HeLa细胞中GSH的检测

对五个培养皿中正常培养的HeLa细胞采用不同的处理方法，分别是：1、仅加入双光子荧光探针SA与细胞共孵育；2、NEM处理30分钟后，加入双光子荧光探针SA与细胞共孵育；3、NEM处理30分钟后，加入双光子荧光探针SA与细胞共孵育，最后加入Cys与细胞孵育；4、NEM处理30分钟后，加入双光子荧光探针SA与细胞共孵育，最后加入Hcy与细胞孵育；5、NEM处理30分钟后，加入双光子荧光探针SA与细胞共孵育，最后加入GSH与细胞孵育。

由图7的激光共聚焦成像可看出，1号培养皿出现荧光，2号培养皿几乎无荧光，3号培养皿几乎无荧光，4号培养皿几乎无荧光，5号培养皿有荧光。说明双光子荧光探针SA体系可以检测HeLa细胞中的GSH，细胞内的Cys、Hcy等生物硫醇不会干扰成像结果，表明本发明探针对细胞内检测GSH有很高的应用价值。

实验6：双光子荧光探针对小鼠脑切片中GSH的检测

把新鲜的小鼠大脑切片与双光子荧光探针SA共孵育，之后用载玻片、盖玻片封装，用激光共聚焦成像(如图8)，可以观察到明显的亮绿色荧光，即使在100μm深处也可以观察到绿色荧光，说明双光子荧光探针SA对脑组织内的GSH也可以进行成像，表明本发明探针在生物活体检测GSH方面有很大的应用潜力。

实验7：双光子荧光探针对植物切片中GSH的检测

把新鲜的植物(圣女果、黄瓜、苹果)组织切片与双光子荧光探针SA共孵育，之后封装植物切片，对切片进行激光共聚焦成像(如图9)，可观察到圣女果呈现出亮绿色的荧光，黄瓜呈现较亮的绿色荧光，苹果呈现较暗的荧光，说明植物组织切片会因植物本身GSH浓度的不同，出现不同亮度的绿色荧光，即双光子荧光探针SA体系可以进行定量检测植物中的GSH，表明本发明荧光探针对植物体内的GSH的定量检测同样具有很高的应用价值。

综上所述，本发明通过较为简便的有机合成步骤得到丙烯酸酯-4-二乙氨基水杨醛探针，该探针可在纯水体系中特异性识别GSH，并在HeLa细胞、小鼠大脑组织切片和植物组织切片中可以特异性识别GSH，且该探针对GSH的灵敏度高、检测时间短。因此，本发明公开的双光子荧光探针及其合成方法极具市场推广与应用前景。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种双光子荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：

2.如权利要求1所述的一种双光子荧光探针的合成方法，其特征在于，具体步骤包括：

(1)以二氯甲烷为反应溶剂，以4-二乙氨基水杨醛为底物，丙烯酰氯为反应原料，及以三乙胺为反应用碱，低温反应得到反应物1；

(2)将反应物1减压蒸馏后层析分离，得到目标产物双光子荧光探针。

3.根据权利要求2所述的一种双光子荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中，4-二乙氨基水杨醛与丙烯酰氯的摩尔比为1:(1～5)，三乙胺与丙烯酰氯的摩尔比为1：1。

4.根据权利要求2或3所述的一种双光子荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中，低温条件为0℃，反应时间为2h～12h。

5.一种如权利要求1所述的双光子荧光探针或如权利要求2所述方法合成的荧光探针在溶剂体系中选择性识别谷胱甘肽的应用。

6.根据权利要求5所述的一种双光子荧光探针的应用，其特征在于，还包括所述荧光探针在对谷胱甘肽的选择性识别和定量检测中的应用。

7.根据权利要求5所述的一种双光子荧光探针的应用，其特征在于，还包括所述荧光探针在以谷胱甘肽为标志物的检测及成像中的应用。

8.根据权利要求5所述的一种双光子荧光探针的应用，其特征在于，还包括所述荧光探针在制备诊断、预测及其治疗监测与谷胱甘肽功能障碍相关疾病的诊断试剂及医疗器械中的应用。

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