CN111116331A - 环橄榄树脂素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环橄榄树脂素及其制备方法，该环橄榄树脂素化合物是构型为7S，8S，8’S的(+)‑环异橄榄树脂素，具有如下结构式：

本发明还提供了(+)‑环异橄榄树脂素的制备方法，通过对杜仲树皮进行水回流提取分离，所得的提取物进行富集和分离，依次通过大孔树脂HPD‑100、两次硅胶柱层析和高效液相色谱，最终得到纯化的(+)‑环异橄榄树脂素；本发明得到的(+)‑环异橄榄树脂素首次在杜仲中进行提取和分离，化合物的此种构型首次被鉴定及分离，对该类化合物的对映异构体的活性研究具有重大意义。

Description

环橄榄树脂素及其制备方法

技术领域

本发明涉及植物化学领域，具体涉及环橄榄树脂素及其制备方法。

背景技术

杜仲(学名Eucommia ulmoides Oliver)，又名胶木，为杜仲科杜仲属植物，其干燥树皮为我国特有的名贵滋补中药材，对肝、肾、肌肉和骨骼具有滋补作用。杜仲具有中益精气、强筋骨、安胎等功效，主要用于治疗肾虚腰痛、筋骨无力、妊娠漏血、胎动不安、高血压等症。随着国内外学者大量的深入研究，杜仲已在医疗、保健、工业多领域进行开发和利用，因此，对于杜仲的研究具有广阔的前景和应用价值。

目前已知的杜仲的化学成分中主要有木脂素类(松脂醇二葡萄糖苷)、环烯醚萜类(京尼平酸、京尼平苷、桃叶珊瑚苷)、苯丙素类(绿原酸、咖啡酸、阿魏酸)、黄酮类(槲皮素、芦丁)、多糖类及杜仲扩真菌蛋白，此外富含多种氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素等。

木脂素类化合物类由两分子苯丙素衍生物(即C6-C3单体)聚合而成的天然化合物，多数呈游离状态，少数与糖结合成苷而存在于植物的木部和树脂中，故而得名。木脂素类化合物多存在于植物中，属于一种植物雌激素，具有清除体内自由基，具有抗氧化的作用。亚麻籽及芝麻中木脂素的含量较高，谷物类食物(如黑麦，小麦，燕麦，大麦等)，大豆和十字花科植物(如西兰花)和一些水果(如草莓)中也含木脂素。前期研究发现杜仲中的木脂素具有抗氧化、抗炎、抗纤维化作用，能缓解高血压引起的肾脏血管重构。最近研究还发现能够显著提高MCAO大鼠的神经功能评分，减少梗死面积，提示其可能具有神经保护作用。因此，从天然产物中提取和分离具有活性的新结构的木脂素类化合物具有重要意义。1988年，Abe等人分离得到了(+)-环橄榄树脂素，但并未对该化合物进行应用等方面的研究。但后续研究(如中国发明专利CN100438860A)记载了该化合物具有多种抗氧化及药理活性(如环磷酸二酯酶抑制性、抗高血压和Ca²⁺拮抗剂活性和与人类性激素结合等)。目前，尚未有关于该化合物同分异构体及其分离方法的相关报道。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种环橄榄树脂素，具有新的构型结构。

本发明还提出上述环橄榄树脂素的制备方法。

根据本发明的第一方面实施例的环橄榄树脂素，具有如下结构式：

根据本发明实施例的环橄榄树脂素，至少具有如下有益效果：本发明方案的环橄榄树脂素是构型为7S，8S，8’S的(+)-环异橄榄树脂素，本发明得到的该构型的环橄榄树脂素是首次在杜仲中进行分离纯化的新的构型的环橄榄树脂素化合物，该化合物具有神经保护作用，在预防和治疗神经损伤性疾病领域有良好的应用前景。

根据本发明的第二方面实施例的制备方法，包括以下步骤：取杜仲树皮进行提取，对提取物进行富集和分离，得到纯化的化合物环橄榄树脂素。

根据本发明的一些实施例，所述提取为使用水回流提取法。

根据本发明的一些实施例，所述富集和分离包括使用大孔树脂、硅胶柱层析和高效液相色谱方法进行。

根据本发明的一些实施例，所述富集和分离具体包括以下步骤：

S1、将所述提取物通过大孔树脂HPD-100用100％到5％的乙醇进行梯度洗脱，得到70％乙醇洗脱物；

S2、将上述70％乙醇洗脱物通过硅胶柱层析用(100：0～50：50)体积比的CH₂Cl₂：MeOH进行洗脱，收集CH₂Cl₂：MeOH体积比(100:5～100:10)范围之间的洗脱液，再次进行硅胶柱层析用(100：0～100：10)体积比的CH₂Cl₂：MeOH进行洗脱，收集得到CH₂Cl₂：MeOH体积比(100：7～100：9)范围之间的洗脱液；

S3、取最后得到的上述洗脱液用半制备高效液相色谱柱进行分离纯化，流动相为(22～28)％的乙腈水溶液梯度洗脱，收集15.6min左右出峰时间的产物即得。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的电子圆二色谱实验的ECD谱图；

图2为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的质谱图(HRESIMS)；

图3为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的红外谱图；

图4为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的氢谱图；

图5为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的碳谱图；

图6为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的DEPT135谱图；

图7为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的¹H-¹H COSY谱图；

图8为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的HSQC谱图；

图9为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的HMBC谱图；

图10为本发明实施例2中(+)-环异橄榄树脂素的NOESY谱图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

常规实验和仪器：光学旋转使用仪器Jasco model 1020polarimeter(Horiba，Tokyo，Japan)测定；ECD光谱使用仪器Applied Photophysics spectrometer(Chirascan，New Haven，USA)测量；HRESIMS数据由仪器Agilent 1290UPLC-6545accurate mass Q-TOF(Agilent Technologies，CA，USA)测定；核磁测定以四甲基硅烷(TMS)为内标物使用仪器Bruker AV-600MHz spectrometer(Bruker，Karlsruhe，Germany)；分析高效液相色谱使用仪器Agilent 1200unit equipped with a DAD detector，分离柱为YMC Pack ODS-ARP-18column(5μm，250×4.6mm，YMC Co.Ltd.，Kyoto，Japan)；半制备高效液相色谱使用Agilent 1100unit equipped with a VWD detector，分离柱为YMC Pack ODS-ARP-18column(10μm，250×10mm，YMC Co.Ltd.，Kyoto，Japan)；薄层色谱分析使用硅胶为GF-254(青岛海洋化工厂，青岛，中国)；柱层析采用大孔树脂HPD-100(中国河北沧州邦吸附技术有限公司)、硅胶(中国青岛海洋化工厂23号200-300目)、Sephadex LH-20(TOYOPEARL TOSOH，日本东京)；所有溶剂均为分析级(科隆化学试剂)；HT-2622细胞购自上海生物科学研究院(中国成都，股份有限公司)。

植物材料：用于下述实施例提取分离使用的植物材料为杜仲树皮，采集于2017年中国湖南省张家界市，植物标本(20170408)保存于中南大学湘雅医院，该植物由中南大学湘雅医院刘韶教授鉴定。植物材料不限于此，其他产地的杜仲树皮均能作为材料。

实施例1：化合物的提取和分离

1)使用水回流提取方法提取杜仲干燥树皮10公斤两次，然后将水溶液在真空条件下进行浓缩，得到萃取物(500g)；

2)通过大孔树脂柱层析的方法分离纯化萃取物，用大孔树脂HPD-100充分吸附萃取物，使用流动相为EtOH-H₂O(体积比从100:0到5:95)进行梯度洗脱，梯度洗脱比例依次为100％、85％、70％、50％、30％和10％浓度的乙醇水溶液，依次收集不同部分洗脱液；

3)收集70％乙醇部分进行浓缩后进一步通过硅胶柱层析分离，使用流动相为CH₂Cl₂-MeOH(体积比从100:0到50:50)进行梯度洗脱，梯度洗脱比例依次为CH₂Cl₂-MeOH的体积比100:0、100:5、100:10、100:15、100:20、100:25和50:50，分段收集洗脱液，得到7个部分(按洗脱顺序依次为部分1-7)；

4)取上述部分3通过硅胶柱层析进行分离，使用流动相为CH₂Cl₂-MeOH(体积比从100：0到100：10)进行梯度洗脱，梯度洗脱比例依次为CH₂Cl₂-MeOH的体积比100:0、100:2、100:5、100:8和100:10，分段收集洗脱液，得到5个部分(按洗脱顺序依次为部分3.1-3.5)；

5)取上述部分3.4通过半制备高效液相色谱(HPLC)进行分离，使用流动相为CH₃CN-H₂O(0～30min，22％～28％)，得到目标化合物(2.2mg，t_R＝15.6min)。t_R为目标化合物的出峰时间，收集主峰部分。

实施例2：化合物的结构鉴定

一、理化性质测定：

目标化合物为一种白色固体，理化性质鉴定如下：

1)旋光度：[α]25D+12.5(c 0.20，MeOH)；

2)紫外：HPLC-UV(CH₃CN-H₂O)λmax:201nm，283nm；

3)电子圆二色谱：ECD(c 0.41mM，λ_max(Δε)：209(+7.96)，221(+2.28)，224(+2.41)，240(-0.68)，249(+0.25)，275(-1.04)，293(+2.77)nm；ECD的谱图如附图1所示，图中，Exptl.2表示(+)-环异橄榄树脂素的ECD实验值，Calcd.2(7R,8S,8’S)表示S构型的(+)-环异橄榄树脂素的ECD计算值。

4)质谱：HRESIMS m/z 399.1420[M+Na]⁺，calculated for C₂₀H₂₄O₇Na，399.1420；质谱图如附图2所示。

5)红外：红外图谱如附图3所示。

6)核磁：¹H NMR和¹³C NMR数据(DMSO-d₆)如下表1所示，其中氢谱¹H NMR的谱图如附图4所示，碳谱¹³C NMR谱图如附图5所示，DEPT135谱图如附图6所示；

表1.目标化合物氢谱和碳谱数据

^aRecorded in CD₃OD,600MHz for ¹H and 150MHz for ¹³C,δin ppm。

二、结构解析：

1)核磁质谱结果分析：

根据HRESIMS结果m/z 399.1420[M+Na]⁺，计算值为C₂₀H₂₄O₇Na，399.1420。从上表1和氢谱(附图4)、碳谱(附图5)的核磁结果指出该化合物与(+)-环橄榄树脂素(Abe etal.1988)具有相同的平面结构。唯一的不同在于C-7和C-8位的构象不一致，可以从H-7和H-8的耦合常数看出(Tran et al.2016)。耦合常数(J_7-8＝6.0Hz)表明该构型是赤式构型，从NOESY二维谱中H-7/H-8，H-9和H-2/6的相关性更进一步证明了这一点。通过NOESY二维谱中H-7/H-9'b和H-8/H-9'b的相关性可以证明H-8和H-8'为苏式构型。根据Loike和Ayres的综述(Tran et al.，2016)，在(7R)-aryltetralin lignans的ECD光谱中，在290nm附近显现正的科顿效应(Cotton Effect，CE)，在270nm附近显现负的科顿效应(Cotton Effect，CE)，而(7S)-aryltetralin lignans呈现相反的模式。因此，目标化合物的绝对构型为7R、8S、8’S，且进一步被计算ECD的结果所证实，如附图1所示。由于，目标化合物是(+)-环橄榄树脂素((+)-cycloolivil)的C-7的一个差向异构体，所以命名为(+)-环异橄榄树脂素((+)-epicycloolivil)。

上述化合物¹H-¹H COSY的结果如附图7所示，HSQC的结果如附图8所示，HMBC的结果如附图9所示，NOESY的结果如附图10所示。

2)ECD计算分析：

为了进一步确定化合物的绝对构型，在mPW1PW91/6-311G*(IEFPCM)理论水平上进行了ECD计算(TDDFT)。根据吉布斯自由能计算出的ECD数据得出波尔曼兹平均值。使用软件SpecDis v1.71模拟ECD曲线，sigma/gamma值为0.35eV(Bruhn et al.2013)。通过ECD曲线(蓝移21nm)计算得到的其绝对构型4S与试验光谱图(如附图1所示)一致。所有DFT计算均使用Gaussian 09软件包完成(Frisch et al.2016)。

3)目标化合物结构：

从上述理化性质的推导得出目标化合物的结构和C原子位置(图中标记的C原子位置与上述实施例中提及的碳原子位置编号对应相同)如下所示：

本方案的环橄榄树脂素是构型为7S，8S，8’S的(+)-环异橄榄树脂素，得到的该构型的环橄榄树脂素是首次在杜仲中进行分离纯化的新的构型的环橄榄树脂素化合物，该化合物具有良好的研究和应用前景。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.环橄榄树脂素，其特征在于，具有如下结构式：

2.根据权利要求1所述的环橄榄树脂素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取杜仲树皮进行提取，对提取物进行富集和分离，得到纯化的环橄榄树脂素。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述提取为使用的是水回流提取法。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述分离包括使用大孔树脂、硅胶柱层析和高效液相色谱方法进行分离的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述分离包括以下步骤：

S1、将所述提取物通过大孔树脂HPD-100用100％到5％的乙醇进行梯度洗脱，得到70％乙醇洗脱物；

S2、将上述70％乙醇洗脱物通过硅胶柱层析用(100：0～50：50)体积比的CH₂Cl₂：MeOH进行洗脱，收集CH₂Cl₂：MeOH体积比(100:5～100:10)范围之间的洗脱液，再次进行硅胶柱层析用(100：0～100：10)体积比的CH₂Cl₂：MeOH进行洗脱，收集得到CH₂Cl₂：MeOH体积比(100：7～100：9)范围之间的洗脱液；

S3、取最后得到的上述洗脱液用半制备高效液相色谱柱进行分离纯化，流动相为(22～28)％的乙腈水溶液梯度洗脱，收集15.6min左右出峰时间的产物即得。

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