CN110563563B

CN110563563B - 一种查耳酮类化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN110563563B
Application number: CN201910817253.0A
Authority: CN
Inventors: 彭芙; 熊亮
Original assignee: Sichuan University; Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Sichuan University; Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: CN110563563A

Abstract

本发明提供了一种查耳酮类化合物及其制备方法和用途。具体提供了式I所示的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药、或其代谢产物，其中，R₁～R₁₁各自独立地选自氢、C₁～C₆烷基、卤素、羟基、氨基、C₁～C₆烷氧基。本发明查耳酮类化合物具有良好的抗肿瘤效果，特别是对于乳腺癌细胞的增殖具有显著抑制作用，能够有效用于治疗和/或预防乳腺癌。本发明查耳酮类化合物为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物，特别是抗乳腺癌的药物提供了一种新的选择，具有良好的市场前景。

Description

一种查耳酮类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及化学医药领域，具体涉及一种查耳酮类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

鸡血藤药材为豆科(Leguminosae)植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤茎，为传统的活血化瘀中药，具有活血补血，调经止痛，舒筋活络的作用，临床上用于月经不调，痛经，经闭，风湿痹痛，麻木瘫痪，血虚萎黄。现代研究表明，鸡血藤的提取物和次级代谢产物能够抑制肿瘤细胞生长。其中，黄酮类成分是鸡血藤的明确活性成分，已报道的黄酮类型有黄酮类、二氢黄酮类、异黄酮类、异黄烷类、二氢黄酮醇类、查耳酮类等。

尽管众多研究表明鸡血藤总黄酮表现出的多种药理活性，包括防治心脑血管疾病、改善血液系统疾病、抗肿瘤作用及抗菌等作用。但是，对于从鸡血藤药材中分离的具体化合物，特别是具体化合物相关活性研究尚少。因此，从鸡血藤药材中分离提取出新的查耳酮类化合物并且研究其相关活性具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种查耳酮类化合物及其制备方法和用途。

本发明提供了式I所示的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药、或其代谢产物：

其中，R₁～R₁₁各自独立地选自氢、C₁～C₆烷基、卤素、羟基、氨基、C₁～C₆烷氧基。

进一步地，R₁～R₁₁各自独立地选自氢、C₁～C₃烷基、卤素、羟基、氨基、C₁～C₃烷氧基。

进一步地，所述化合物如式II所示：

其中，R₁～R₁₁各自独立地选自氢、C₁～C₃烷基、卤素、羟基、氨基、C₁～C₃烷氧基。

进一步地，所述化合物的结构式如下：

本发明还提供了一种前述的化合物B的制备方法，步骤如下：

A.取鸡血藤干燥饮片，95％乙醇加热回流提取，减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位；所述水的温度为不小于50℃；

B.取步骤A所得的鸡血藤乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，依次以二氯甲烷：甲醇＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、3:1、0:100(v/v)为洗脱剂进行梯度洗脱，取二氯甲烷-甲醇50:1(v/v)时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，Rf为0.40～0.90的相似流份，得F₄；

C.取步骤B所得的F₄，经正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇＝5:5:1(v/v/v)为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)，Rf为0.70～0.80的相似的流份，得F_4-5；

D.取步骤C所得的F_4-5，经反相Sephadex LH-20柱色谱，以80％甲醇水溶液为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(v/v)，Rf为0.35～0.40的相似的流份，得F_4-5-4；

E.取步骤D所得F_4-5-4，经薄层色谱制备，以石油醚：乙酸乙酯＝3：1(v/v)为展开剂，三次展开，分离得到化合物B。

进一步地，

步骤A中，所述95％乙醇用量为鸡血藤干燥饮片的6倍(v/w)；所述提取为提取3次，每次提取时间为3h；

和/或，步骤B中，所述梯度洗脱条件如下：

和/或，步骤C中，所述组分F₄为4.2g时，收集所述洗脱剂石油醚：二氯甲烷：甲醇＝5:5:1(v/v/v)的体积为0.16L；

和/或，步骤D中，所述组分F_4-5为0.6g时，收集所述洗脱剂80％甲醇水溶液的体积为0.10L。

本发明还提供了前述的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备抗肿瘤药物中的用途；所述肿瘤为乳腺癌。

本发明还提供了一种药物，它是以前述的化合物、或其立体异构体、或其盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明查耳酮类化合物具有良好的抗肿瘤效果，特别是对于乳腺癌细胞的增殖具有显著抑制作用，能够有效用于治疗和/或预防乳腺癌。本发明查耳酮类化合物为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物，特别是抗乳腺癌的药物提供了一种新的选择，具有良好的市场前景。

本发明中，碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀C_a～C_b烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基，因此，例如，C₁～C₆烷基是指包含1～6个碳原子的烷基。又例如，前缀C_a～C_b烷氧基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷氧基，因此，例如C₁～C₆烷氧基是指包含1～6个碳原子的烷氧基。

本发明中v/v和v/v/v均是指体积比，单位为mL/mL和mL/mL/mL；v/w是指体积质量比，单位为mL/g。

本发明中95％乙醇是指浓度为95％的乙醇水溶液。

本发明化合物B不仅可以从鸡血藤中分离得到，也按照化学领域中常规的方法取代而制得，例如克莱森-施密特反应途径等。

本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明式B化合物的HRESIMS图。

图2为本发明式B化合物的¹H-NMR图。

图3为本发明式B化合物的¹³C-NMR图。

图4为本发明式B化合物的IR图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

1)药材

鸡血藤药材于2013年6月购于四川新荷花中药饮片股份有限公司，经成都中医药大学中药鉴定教研室龙飞博士鉴定为豆科崖豆藤属植物密花豆(Spatholobus suberectusDunn)的干燥藤茎。

2)试剂

柱层析硅胶，200～300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；

薄层层析硅胶G、GF₂₅₄和H(化学纯)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；

中压液相色谱仪：Búchi Gradient Former B-687，Rp C₁₈，43-60μm；

Welch Ultimate XB-C₁₈(10×250mm，5μm)半制备型柱；

Sephadex LH-20葡聚糖凝胶，购于瑞典Amersham公司；

GF₂₅₄硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；

石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析纯试剂，购于成都科龙化工试剂厂。

3)主要仪器

Agilent 1220高效液相色谱仪(美国安捷伦)；

Waters Synapt G₂HDMS高分辨飞行时间质谱(美国Waters)；

Bruker-AVIIIHD-600、Bruker-AVIIIHD-600核磁共振仪(瑞士Bruker)；

Agilent Cary 600FTIR红外光谱仪(美国安捷伦)；

Shimadzu UV-260紫外-可见分光光度仪(日本Shimadzu)；

安东帕MCP 200旋光测定仪(奥地利安东帕)；

BP211D十万分之一电子天平(瑞士Sartorius)；

R-210旋转蒸发器(瑞士BUCHI)；

DZG-6050型真空干燥箱(上海森信)。

实施例2、本发明化合物B(7-hydroxy-2',5-dimethoxychalcane,7-羟基-2',5-二甲氧基查耳烷)的制备

1)成分的分离纯化

①药材的提取：取鸡血藤干燥饮片15kg，鸡血藤干燥饮片6倍量(v/w)的95％乙醇加热回流提取3次，每次提取3小时，提取后减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用热水(热水温度不小于50℃)混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位。

②采用硅胶柱色谱(200～300目，2.5Kg，14×150cm)对所得的鸡血藤乙酸乙酯部位进行色谱分离，以不同体积比的二氯甲烷-甲醇(100:0～0:100)为流动相(洗脱剂)进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表1，洗脱液经薄层色谱检测，合并组成相似的流份：取二氯甲烷-甲醇体积比为50:1时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)薄层展开，Rf为0.40～0.90的相似流份，得F₄。

表1硅胶柱色谱的洗脱条件

表1的洗脱条件是按照不同体积比的洗脱剂从上到下的顺序依次收集相应体积的洗脱液，例如鸡血藤乙酸乙酯部位为100g，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:0时，收集5L；洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝100:1时，收集10L；依次类推。故步骤②中“取二氯甲烷：甲醇＝50:1时的洗脱液”是经过表1中在其上方的三种洗脱剂洗脱且收集相应洗脱体积后，收集洗脱液为取二氯甲烷：甲醇＝50:1时的洗脱液30L。

③F₄正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：二氯甲烷：甲醇＝5:5:1(v/v/v)为洗脱剂，其中，组分F₄为4.2g时，收集0.16L洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝2:1(v/v)，Rf为0.70～0.80的相似的流份，得F_4-5。

F_4-5经反相Sephadex LH-20柱色谱，以80％甲醇水溶液为洗脱剂，其中，组分F_4-5为0.6g时，收集0.10L洗脱液。得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(v/v)，Rf为0.35～0.40的相似的流份，得F_4-5-4。

F_4-5-4经薄层色谱(展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(v/v)，三次展开)制备分离得到化合物B。

化合物B为白色粉末，易溶于二氯甲烷、甲醇、丙酮等有机溶剂。IR光谱(图4)显示有3405、2918、2849、1597、1240、750cm^-1。图1中，HR-ESI-MSm/z 293.1154[M+Na]⁺提示分子式为C₁₇H₁₈O₃(calcd for C₁₇H₁₈O₃Na,293.1154)，不饱和度为9。根据图2中化合物B的¹H NMR谱信号，可看出化合物B具有与A相似的两个苯环取代系统(1,2,4-三取代，1',2'-邻二取代苯环)；此外，化合物B有一个二取代双键[δ_H6.76(d,16.0Hz)和6.32(m)]，有1个明显的亚甲基信号[δ_H3.47(d,7.0Hz)]；两个甲氧基[δ_H 3.81(s),3.83(s)]信号，数据见表2。结合DEPT和¹³C NMR谱(图3)，化合物B共有17个碳信号，在δ_C 33.1ppm有1个CH₂碳信号，在δ_C 55.4、55.4ppm有两个甲基碳信号，在δ_C 98.9～130.2ppm之间共11个碳信号，其中包括9个CH信号，2个季碳信号，在δ_C 155.2～158.3ppm之间共三个季碳信号(见表3)，以上信号说明化合物B为1个查耳烷类化合物。在¹H-¹H COSY谱中根据质子相关体系，可得到H-2/H-3/H₂-4、H-8/H-9和H-3'/H-4'/H-5'/H-6'相关片段。在HMBC谱中，H-3与C-4,C-5a,C-1'相关，H-4与C-2,C-3,C-5,C-5a有相关，H-9与C-4,C-5,C-7，且OMe-5与C-5有相关，所以确定A环的甲氧基连接在5位上，羟基连在7位上；H-2与C-4,C-2',C-6'相关，OMe-2'与C-2'有相关，证明其B环的甲氧基连在2'位上。最终，确定化合物B的结构，命名为7-羟基-2',5-二甲氧基查耳烷。

因此，本发明新化合物的化学结构得到了确定，如式B所示：

进行核磁共振氢谱(¹H-NMR)：Bruker-AVIII HD-500spectrometer测定，数据见表2。

表2化合物B的¹H NMR(500MHz)核磁数据

(测定溶剂：^a CDCl₃；δ：ppm；J：Hz)

no.	B<sup>a</sup>
		1	-
2	6.76d(16.0)
		3	6.32m
4	3.47d(7.0)
		5	-
5a	-
		6	6.42d(2.0)
7	-
		8	6.25dd(8.0,2.5)
9	7.02d(8.0)
		1'	-
2'	-
		3'	6.85d(8.0)
4'	7.17t(8.0)
		5'	6.89t(7.5)
6'	7.42d(7.5)
		7-OMe	-
5-OMe	3.81s
		2'-OMe	3.83s

进行核磁共振碳谱(¹³C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表3。

表3化合物B的¹³C NMR(150MHz)核磁数据

(测定溶剂：^a CDCl₃；δ：ppm；J：Hz)

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1、本发明异黄烷类化合物的抗肺癌A549活性试验

①、细胞接种

用0.25％胰酶消化对数生长期的细胞。用含10％FBS的RPMI-1640培养基培养配成单细胞悬液。采用细胞计数板计数，将状态良好的A549肿瘤细胞接种于96孔板，使细胞密度为4×10³个/mL，每孔加入细胞悬液100μL，置于37℃，5％CO₂培养箱内培养24h。

②、药物处理

样品(化合物B)从100μM开始，用培养基梯度稀释样品，2倍稀释，设置5个药物浓度，每个浓度做复孔测试。以浓度为100、50、25、12.5、6.25μM每孔加药100μL，每个浓度设3个复孔，重复3次。阴性对照组为含有适量DMSO的培养基溶液，空白对照组为不含细胞的培养基和溶媒。将96孔板放回培养箱，37℃作用72h。

③、显色及抑制率的计算

72h作用完毕后，避光条件下每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，继续温育培养4h后，弃掉上清液，每孔加入150μL DMSO，置于摇床上慢速振摇10min，使甲瓒充分溶解后，用酶标仪测量570nm波长处的OD值，按下列公式计算增殖抑制率。

采用抑制率的计算公式进行计算，抑制率＝(1-待测OD值/空白组OD值)×100％。通过重复三次试验，计算得到3次抑制率的平均值，得到本发明实施例2所得化合物B在100μM时对肺癌细胞无明显抑制作用。

上述结果表明，本发明的查耳酮类黄酮化合物B，对A549肺癌细胞的增殖无具有显著的抑制活性，不能够用于治疗和/或预防肺癌。

实验例2本发明异黄烷类化合物的抗乳腺癌MDA-MB-231活性试验

①、细胞接种

用0.25％胰酶消化对数生长期的细胞。用含10％FBS的DMEM细胞培养基培养配成单细胞悬液。采用细胞计数板计数，将状态良好的MDA-MB-231肿瘤细胞接种于96孔板，使细胞密度为4×10³个/mL，每孔加入细胞悬液100μL，置于37℃，5％CO₂培养箱内培养24h。

②、药物处理

③、显色及抑制率的计算

采用抑制率的计算公式进行计算，抑制率＝(1-待测OD值/空白组OD值)×100％。通过重复三次试验，计算得到3次抑制率的平均值，得到本发明实施例2所得化合物B在100μM时对乳腺癌细胞的抑制率为30.89％。

上述结果表明，本发明的查耳酮类黄酮化合物B，对乳腺癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，能够用于治疗和/或预防乳腺癌，具有良好的临床应用前景。

综上，本发明查耳酮类化合物具有良好的抗肿瘤效果，特别是对于乳腺癌细胞的增殖具有显著抑制作用，能够有效用于治疗和/或预防乳腺癌。本发明查耳酮类化合物为临床上筛选和/或制备抗肿瘤药物，特别是抗乳腺癌的药物提供了一种新的选择，具有良好的市场前景。

Claims

1.一种化合物B的制备方法，其特征在于：步骤如下：

A.取鸡血藤干燥饮片，95%乙醇加热回流提取，减压浓缩，得到鸡血藤提取物，将其用水混悬，采用乙酸乙酯萃取，减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取部位；所述水的温度为不小于50℃；

B. 取步骤A所得的鸡血藤乙酸乙酯部位经硅胶柱层析，依次以体积比为100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、3:1、0:100的二氯甲烷：甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，取二氯甲烷：甲醇的体积比为50:1时的洗脱液，利用薄层色谱，收集展开剂为体积比为2:1的石油醚：乙酸乙酯，Rf为0.40~0.90的流份，得F₄；

C.取步骤B所得的F₄，经正相Sephadex LH-20柱色谱，以体积比为5:5:1的石油醚：二氯甲烷：甲醇为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为体积比为2:1的石油醚：乙酸乙酯，Rf为0.70~0.80的流份，得F_4-5；

D. 取步骤C所得的F_4-5，经反相Sephadex LH-20柱色谱，以80%甲醇水溶液为洗脱剂，得到的洗脱液利用薄层色谱，收集展开剂为体积比为3：1的石油醚：乙酸乙酯，Rf为0.35~0.40的流份，得F_4-5-4；

E. 取步骤D所得F_4-5-4，经薄层色谱制备，以体积比为3：1的石油醚：乙酸乙酯为展开剂，三次展开，分离得到化合物B；

所述化合物B的结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤A中，所述95%乙醇用量与鸡血藤干燥饮片的体积质量比为6mL/g；所述提取为提取3次，每次提取时间为3h；

和/或，步骤B中，所述梯度洗脱条件如下：

和/或，步骤C中，所述组分F₄为4.2 g时，收集所述洗脱液体积为0.16 L；

和/或，步骤D中，所述组分F_4-5为0.6 g时，收集所述洗脱液体积为0.10 L。