CN107522594B - 一种倍半萜化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了式Ⅰ所示的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物。其中，取代基R1～R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基中的某些特定基团，或相邻碳原子的两取代基组合成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基；试验结果表明，本发明化合物具有较好的舒张血管作用，为临床上筛选和/或制备舒张血管药物提供了一种新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及一种倍半萜化合物及其制备方法与应用。
背景技术
广藿香药材来源于唇形科(Lamiaceae)刺蕊草属(Pogostemon)植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth的干燥地上部分，作为传统的芳香化湿中药，其具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑的作用，临床中常用于治疗湿浊中阻，脘痞呕吐，暑湿倦怠，腹痛吐泻等症。目前，国内外有少量学者对广藿香倍半萜成分进行研究，报道的化合物数量将近30个，类型包括：(1)广藿香烷及其重排产物。广藿香中具有代表性的化学成分主要为广藿香醇型，其次为重排产物α-广藿香烯型，β-广藿香烯型和δ-广藿香烯型；(2)愈创木烷型化合物。
随着对广藿香化学成分的报道逐渐增多，特别是倍半萜类化合物，被视为广藿香中的主要成分类型，同时也是广藿香油的主要组成部分。值得关注的是Ichikawa K等发现广藿香提取物和百秋李醇具有类似钙离子拮抗剂的作用，百秋李醇对K+诱导肠平滑肌和Ca2 +诱导的胸主动脉血管环的收缩均具有一定抑制作用，其EC50分别为5.95×10-5mol/L和4.7×10-5mol/L。除百秋李醇以外，广藿香中的其他倍半萜类化合物在舒张血管的研究方面鲜有报道。因此，从广藿香药材中分离提取出新的化合物并且以此为基础发现活性物质，具有重要的现实意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种倍半萜化合物及其制备方法与应用。
本发明提供了式Ⅰ所示的化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物：
其中，当R7为甲基，R2、R3为甲基、羟基时；R1、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，但不同时为氢，或相邻碳原子的两取代基组合成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基；
当R7为甲基，R2、R3形成双键，R1为羟基时；R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，但不同时为氢，或相邻碳原子的两取代基组合成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基；
当R7为甲基，R2、R3形成双键时；R1为氢、卤素、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，或相邻碳原子的两取代基组合形成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基；
当R2、R7为甲基，R1、R3所连碳原子形成双键时；R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，但不同时为氢，或相邻碳原子的两取代基组合形成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基；
当R2、R7为甲基时；R1、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，或R1、R3、R4、R5、R8、R9、R10、R11、R12相邻碳原子的两取代基组合形成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基；
当R7为甲基，R2、R3、R6各自独立地选自氢、卤素、氨基、C2—C6的烷基或C1—C6的烷氧基时；R1、R4、R5、R8、R9、R10、R11、R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，或相邻碳原子的两取代基组合形成双键，或R4、R5、R9、R10、R11、R12同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基；
当R2、R3、R7、R8各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C2—C6的烷基或C1—C6的烷氧基时；R1、R4、R5、R6、R9、R10、R11、R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，或相邻碳原子的两取代基组合形成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基。
进一步地，R1、R2、R7～R12各自独立地选自羟基或C1—C6的烷氧基。
进一步地，R3为甲基或与R2形成双键。
进一步地，所述式Ⅰ化合物如式Ⅱ所示：
其中，R1～R12均具有权利要求1中所述的含义。
进一步地，R1、R12所连碳原子形成为双键，R3选自C1—C4的烷基。
进一步地，上述化合物如式A所示：
进一步地，上述化合物如式B所示：
进一步地，上述化合物如式C所示：
进一步地，上述化合物如式D所示：
进一步地，上述化合物如式E所示
一种制备上述化合物的方法，步骤如下：
a1、取广藿香药材，水蒸气蒸馏提取，干燥除水，得广藿香挥发油；
b1、取步骤a1所得的广藿香油，采用硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的相似流份，得F1；
c1、取步骤b1所得的F1，上反相中压柱色谱，依次以甲醇:水＝50:50、65:35、80:20、90:10为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为甲醇：水＝80:20时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的相似流份，得F1-d；
d1、取步骤c1所得的F1-d，经正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：三氯甲烷：甲醇＝5:5:1为洗脱剂，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的流份，得F1-d-2；
e1、取步骤d1所得的F1-d-2，经重结晶后，分离得式A所示化合物，以及母液M；
f1、取步骤e1所得的母液M，经硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、30:1、20:1为洗脱剂，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝20:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚:乙酸乙酯＝12:1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，分离得到式E所示化合物；
或者，
a2、取广藿香药材，水蒸气蒸馏提取，干燥除水，得广藿香挥发油；
b2、取步骤a2所得的广藿香油，采用硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2；
c2、取步骤b2所得的F2，上反相中压柱色谱，依次以甲醇:水＝50:50、65:35、80:20、90:10为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为甲醇：水＝90:10时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2-d；
d2、取步骤c2所得的F2-d，经反相柱色谱，以85vol％甲醇为洗脱剂，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2-d-3；
e2、取步骤d2所得的F2-d-3，经反复硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝20:1、15:1、10:1为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得到F2-d-3-B；
f2、取步骤e2所得的F2-d-3-B，经制备薄层色谱法，其展开剂为正己烷:乙酸乙酯＝5:1，Rf为0.45～0.6，再经反相半制备液相色谱，以65％甲醇水溶液为洗脱剂，保留时间为tR＝52.4min，分离得式B所示化合物；或者，取步骤e2所得的F2-d-3-B，经制备薄层色谱法，其展开剂为正己烷:乙酸乙酯＝5:1，Rf为0.45～0.6，再经反相半制备液相色谱，以65％甲醇水溶液为洗脱剂，保留时间为tR＝46.5min，分离得式C所示化合物；
或者，
a3、取广藿香药材，水蒸气蒸馏提取，干燥除水，得广藿香挥发油；
b3、取步骤a3所得的广藿香油，采用硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，得F1；
c3、取步骤b3所得的F1，上反相中压柱色谱，依次以甲醇:水＝50:50、65:35、80:20、90:10为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为甲醇：水＝80：20时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，得F1-e；
d3、取步骤c3所得的F1-e，经正相柱色谱，以石油醚：三氯甲烷：甲醇＝5:5:1为洗脱剂，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：丙酮＝8:1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，得F1-e-1，F1-e-1再通过制备薄层色谱的方法，其展开剂为石油醚：丙酮＝8:1，Rf为0.45～0.6，分离得式D所示化合物。
优选地，
步骤a1、a2、a3中，所述水蒸气蒸馏提取的时间均为16～20h；
和/或，步骤b1、b2、b3中，所述梯度洗脱的条件均为：
和/或，步骤c1、c2、c3中，所述梯度洗脱的条件均为：
和/或，步骤d1、d3中，所述正向柱色谱为Sephadex LH-20柱色谱，所述洗脱剂石油醚：三氯甲烷：甲醇＝5:5:1的体积为0.65L；
步骤d2中，所述反向柱色谱为Sephadex LH-20柱色谱，所述洗脱剂85vol％甲醇的体积为0.65L；
和/或，步骤e1中，所述重结晶是利用100％甲醇；和/或，所述重结晶的次数为3次；
步骤e2中，所述梯度洗脱的条件如下：
步骤f1中，所述梯度洗脱的条件如下：
上述化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备舒张血管药物中的应用。
本发明提供了一种药物，它是以上述化合物、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
试验结果表明，本发明化合物具有较好的舒张血管作用，为临床上筛选和/或制备舒张血管药物提供了一种新的选择。
本发明中：
C1～C6烷基是指含有一个至六个碳原子的直链或支链的烃链。
卤素为氟、氯、溴或碘。
本发明“相邻碳原子的两取代基组合成双键”是指取代基R1～R12所连的碳原子的任意两相邻碳原子形成的环内双键。
本发明“同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基”是指化合物I中含有两个以上取代基的碳原子处可为双键或羰基，此处双键时环外双键。
本发明中，例如“当R7为甲基，R2、R3为甲基、羟基时；R1、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，但不同时为氢，或相邻碳原子的两取代基组合成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基”，是指：R7为甲基，R2、R3为甲基、羟基的情况下，R1、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，但不同时为氢，或满足位于相邻碳原子上的取代基R1、R4、R5、R6、R8、R9、R10、R11、R12中的两取代基组合成环内双键，或具有两个取代基的碳原子形成环外双键或羰基；所述“但不同时为氢”排除的是：当R7为甲基，R2、R3为甲基、羟基，可能存在的某两个相邻碳原子的两取代基组合成双键，可能存在的某碳原子的两个取代基形成双键或羰基时，还存在的其它全部取代基同时为氢的化合物。
上述R1～R12分别或同时选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，或相邻碳原子的两取代基组合成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基；本发明化合物可以化合物A～E为原料，按照化学领域中常规的方法取代而制得，例如，烷基的卤代反应等。
同时，由于R1～R12分别或同时选自氢、卤素、羟基、氨基、C1—C6的烷基或C1—C6的烷氧基，或相邻碳原子的两取代基组合成双键，或同一碳原子的两个取代基形成双键或羰基；均属于短链的烷基及较小基团的取代，它们的结构接近，性质类似，本领域技术人员在化合物A～E的基础上，利用有机合成的常规方法，如：取代反应、延长碳链的反应等，可以容易地得到式Ⅰ和式Ⅱ所示化合物；本领域技术人员根据本发明说明书记载的全部技术内容，同时结合公知常识，就能够概括得出本发明式Ⅰ所示化合物及其可作为舒张血管药物。
本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明式A化合物的HRESIMS图；
图2为本发明式A化合物的1H-NMR图；
图3为本发明式A化合物的13C-NMR图；
图4为本发明式B化合物的HRESIMS图；
图5为本发明式B化合物的1H-NMR图；
图6为本发明式B化合物的13C-NMR图；
图7为本发明式C化合物的HRESIMS图；
图8为本发明式C化合物的1H-NMR图；
图9为本发明式C化合物的13C-NMR图；
图10为本发明式D化合物的HRESIMS图；
图11为本发明式D化合物的1H-NMR图；
图12为本发明式D化合物的13C-NMR图；
图13为本发明式E化合物的HRESIMS图；
图14为本发明式E化合物的1H-NMR图；
图15为本发明式E化合物的13C-NMR图；
图16为本发明化合物C对苯肾上腺素诱导大鼠主动脉的舒张作用图：其中，横坐标为浓度的对数，纵坐标为收缩率(％)，百秋李愈创木醇C(Patchouliguaiol C)是指本发明目标化合物。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
1)药材
广藿香药材于2012年11月采自广东省阳春县广藿香种植基地，经成都中医药大学中药鉴定教研室龙飞博士鉴定为唇形科刺蕊草属植物广藿香(Pogostemon cablin(Blanco)Benth.)的全草。2)试剂
柱层析硅胶，200～300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
薄层层析硅胶G、GF254和H(化学纯)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
中压液相色谱仪：Búchi Gradient Former B-687，Rp C18，43-60μm；
Agilent Zorbax SB-C18(9.4×250mm，5μm)半制备型柱；
Sephadex LH-20葡聚糖凝胶，购于瑞典Amersham公司；
GF254硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；
石油醚、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析纯试剂，购于成都科龙化工试剂厂。
3)主要仪器
Agilent 1220高效液相色谱仪(美国安捷伦)；
Waters Synapt G2HDMS高分辨飞行时间质谱(美国Waters)；
Bruker-AVIIIHD-600核磁共振仪(瑞士Bruker)；
傅里叶变换红外光谱仪：Nicolet 5700红外光谱仪(美国Thermo公司)；
X-单晶衍射仪：Bruker APEXⅡDUO双光源单晶衍射仪；
Shimadzu UV-260紫外-可见分光光度仪(日本Shimadzu)；
安东帕MCP 200旋光测定仪(奥地利安东帕)；
BP211D十万分之一电子天平(瑞士Sartorius)；
R-210旋转蒸发器(瑞士BUCHI)；
DZG-6050型真空干燥箱(上海森信)。
实施例1本发明化合物A(百秋李愈创木醇A，Patchouliguaiol A)的制备
1)成分的分离纯化
①药材的提取：取干燥的广藿香药材地上部分40kg，采用大型的改良水蒸气蒸馏装置进行提取，时间为16～20h，收集得到挥发油，然后用无水硫酸钠干燥除水，最终得到广藿香挥发油215g。
②采用硅胶柱色谱(200～300目，5Kg，20×150cm)对广藿香挥发油(215g)进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯(100:0～0:100)为流动相进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表1，洗脱液经薄层色谱检测，合并组成相似的流份，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的相似流份，得F1。
表1硅胶柱色谱的洗脱条件
表1的洗脱条件是按照不同体积比的洗脱剂从上到下的顺序依次采用相应体积的洗脱剂进行洗脱，例如挥发油为215g，以石油醚：乙酸乙酯＝100:0为洗脱剂，收集10L；再以石油醚：乙酸乙酯＝100:1为洗脱剂，收集22.5L；依次类推。故步骤②中“取石油醚：乙酸乙酯＝10:1时的洗脱液”是经过表1中在其上方的四种洗脱剂洗脱后，收集洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时的洗脱液26.5L。本发明其它洗脱条件的解释与本表格类似，不再一一赘述。
③F1(8.5g)通过反相中压液相色谱以50～100％甲醇溶液进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表2，得到F1-a～F1-k共11个洗脱部分；当洗脱剂为甲醇：水＝80:20时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的相似流份，得F1-d，F1-d部分经正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：三氯甲烷：甲醇＝5:5:1为洗脱剂，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的流份，得F1-d-2；F1-d-2析出结晶，经体积分数为100％甲醇反复重结晶3次，分离得到式A所示目标化合物(43mg)。
表2反相中压液相色谱的洗脱条件
表2的洗脱条件是按照不同体积比的洗脱剂从上到下的顺序依次采用相应体积的洗脱剂，例如组分F1为8.5g，洗脱剂为甲醇：水＝50:50时，收集1L；洗脱剂为甲醇：水＝65:35时，收集2.4L；依次类推。本发明其它洗脱条件的解释与本表格类似，不再一一赘述。
2)目标化合物的鉴定
化合物A为无色块状结晶，[α]2 D 5-133.3(c 0.20,MeOH)。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z259.1675[M+Na]+，提示分子式为C15H24O2(calcd for C15H24O2Na,259.1674)，见图1。根据图2中化合物A的1H NMR谱显示的信号，可归属于1个三取代双键[δH 5.56(brs)]、1个双取代的末端双键[δH 4.66(brs)and 4.61(brs)]、1个连氧的次甲基[δH 4.35(dddd,J＝7.2,6.0,1.8,1.2Hz)]、2个活泼OH质子[δH 3.64(d,J＝6.0Hz)and 3.38(s)]、3个甲基[δH 1.68(s),1.38(s),and 1.03(d,J＝7.2Hz)],以及多个脂肪族亚甲基和次甲基(δH 0.90and2.85ppm)(见表3)。结合图3中13C NMR和DEPT谱显示15个碳信号(表4)，归属于3个甲基、4个亚甲基(包括1个末端双键亚甲基)、5个次甲基(包括1个双键次甲基和1个含氧次甲基)以及3个季碳(包括2个双键季碳和1个连氧季碳)，以上信号说明化合物A为1个小分子双环倍半萜。以上信号表明化合物A为一个典型的愈创木烷倍半萜，且C-7位连接的为异丙烯基。进一步通过2D NMR数据分析，确定取代基的位置。
化合物A的1H-1H COSY谱显示H-2/H-3/H-4/H-5/H2-6/H-7/H2-8/H2-9、H-3/OH-3、H-4/H3-14的相关信号，揭示出1个连续的质子偶合体系。HMBC谱中，H-2与C-1、C-3、C-4、C-5、C-10相关；H-3与C-1、C-2、C-14相关；OH-3与C-2、C-3、C-4相关，表明三取代双键位于C-1＝C-2位，仲醇羟基[δH 3.64(d,J＝6.0Hz)]取代于C-3位。通过OH-10与C-1、C-9、C-10、C-15相关的HMBC信号，确定C-10位取代一个OH[δH 3.38(s)]。此外，H2-12和H3-13同时与C-7和C-11相关证明异丙烯基位于C-7位。
化合物A的相对构型通过NOESY谱确定。H-3和H3-14相关；H-5和H-4、H-6a、H-7、OH-10相关；H-7与H-6a和H-8a相关；H3-15与H-8b相关，说明OH-3,H-4、H-5、H-6a、H-7、H-8a和OH-10位于环系的同侧；而H-3、isopropenyl-7、H-8b、H3-14和H3-15位于另外一侧。最终，采用X-射线单晶衍射分析(Cu Kα辐射)确定了化合物A的绝对结构，为(-)-(3S,4R,5S,7R,10R)-愈创木烷-1,11-二烯-3,10-二醇，并命名为百秋李愈创木醇A(Patchouliguaiol A)。
因此，本发明新化合物的化学结构，包括绝对构型得到了确定，如式A所示：
3)进行核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表3。
表3化合物A的1H NMR(600MHz)核磁数据
(测定溶剂：a acetone-d6；b CDCl3；δ：ppm；J：Hz)
4)进行核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表4。
表4化合物的13C NMR(150MHz)核磁数据
(测定溶剂：a acetone-d6；b CDCl3；δ：ppm；J：Hz)
| no. | A<sup>a</sup> | B<sup>a</sup> | B<sup>a</sup> | D<sup>b</sup> | E<sup>b</sup> |
| 1 | 157.9 | 61.8 | 84.4 | 146.1 | 136.6 |
| 2 | 129.9 | 27.3 | 74.0 | 127.4 | 197.1 |
| 3 | 81.7 | 31.6 | 41.4 | 39.8 | 133.7 |
| 4 | 49.7 | 49.5 | 32.8 | 37.6 | 171.7 |
| 5 | 46.8 | 84.3 | 54.6 | 49.0 | 49.3 |
| 6 | 37.5 | 41.4 | 31.9 | 35.1 | 35.9 |
| 7 | 50.8 | 42.0 | 49.7 | 42.2 | 51.0 |
| 8 | 30.5 | 31.4 | 38.0 | 41.5 | 30.8 |
| 9 | 42.8 | 43.2 | 32.9 | 75.3 | 37.9 |
| 10 | 71.5 | 72.6 | 154.7 | 149.5 | 151.0 |
| 11 | 152.5 | 154.0 | 152.5 | 151.8 | 150.8 |
| 12 | 108.8 | 107.8 | 108.6 | 108.9 | 109.5 |
| 13 | 20.8 | 20.1 | 20.5 | 20.8 | 20.6 |
| 14 | 13.4 | 15.2 | 16.8 | 15.9 | 16.8 |
| 15 | 28.5 | 32.7 | 111.9 | 111.4 | 20.6 |
实施例2本发明化合物B(百秋李愈创木醇B，Patchouliguaiol B)的制备
1)成分的分离纯化
①药材的提取：按照实施例1中步骤①的提取方法得到广藿香挥发油215g。
②按照实施例1中步骤②的洗脱方法，回收溶剂得到31个洗脱部分；当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2。
③F2(10.8g)通过反相中压液相色谱以50～100％甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，具体洗脱条件见表5，得到F2-a～F2-f共6分洗脱部分；当洗脱剂为甲醇：水＝90:10时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2-d，F2-d部分经反相Sephadex LH-20柱色谱，以85％甲醇水为洗脱剂，收集洗脱液，根据薄层追踪，分离得到4个亚组分(F2-d-1～F2-d-4)，例如，组分F2-d-3的收集具体为：利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2-d-3；F2-d-3经反复硅胶柱色谱法分离得到2小部分(F2-d-3-A～F2-d-3-B)，例如，组分F2-d-3-B的收集具体为：按照表6进行梯度洗脱，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得到F2-d-3-B。F2-d-3-B经制备薄层色谱法，展开剂为正己烷:乙酸乙酯＝5:1，Rf为0.45～0.6，再经反相半制备液相色谱，以65％甲醇水溶液为洗脱剂，保留时间为tR＝52.4min，分离得化合物B(3.6mg，tR＝52.4min)。
表5反相中压液相色谱的洗脱条件
表6硅胶柱色谱梯度洗脱的条件
2)目标化合物的鉴定
化合物B，无色结晶，易溶于甲醇、乙醇、正己烷等有机溶剂。[α]2 D 0-12.2(c＝0.20,Me OH)。IR光谱显示有羟基(3374cm-1)和双键(1707cm-1)的吸收。
图4中，HR-ESI-MS m/z 261.1829[M+Na]+提示分子式为C15H26O2(calcd.forC15H26O2Na261.1830)，不饱和度为3。根据图5，1H NMR谱中可以看出三个明显的甲基信号，包括1个双峰δH 0.89(3H,d,J＝7.2Hz)，2个单峰δH 1.70(3H,s),1.15(3H,s)。结合1H NMR和图6的13C NMR数据提供信息(见表3、表4)可以看出，化合物B是化合物A的类似物，区别在于化合物B少了一个双键取代，多了两个氢，提示化合物B可能是化合物A的C-14-C-15双键被氢化。在HMBC谱中，OH-5与C-1,C-4,C-5,C-6相关，OH-10与C-1,C-9,C-10,C-15相关,在COSY谱中根据质子相关体系，可得到H-1/H2-2/H2-3/H2-4/H3-14与H2-6/H-7/H2-8/H2-9相关片段，进一步确证两个OH分别连接在C-5和C-10。
为进一步确定化合物B的绝对构型，进行了ROESY谱的测定。在ROESY谱中，OH-5与H-4,H-7相关，H-7与H-8a,H-9b相关，H-8a与OH-10相关；H-9b与OH-10,H-1相关；H-2a与H3-14,H3-15相关；H3-15与H-9a相关，可知H-1与H-4,OH-5,H-7,OH-10为α构型，而H3-14与H3-15为β构型。为进一步确定该化合物的绝对构型，获得了化合物B的单晶，结合X-射线单晶衍射以及计算ECD的方法确证化合物B的结构为(1S,4S,5R,7R,10S)-愈创木烷-5,10-二醇，命名为百秋李愈创木醇B(Patchouliguaiol B)。
因此，本发明新化合物的化学结构，包括绝对构型得到了确定，如式B所示：
核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表3。核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表4。
实施例3本发明化合物C(百秋李愈创木醇C，Patchouliguaiol C)的制备
1)成分的分离纯化
①药材的提取：按照实施例1中①的提取方法得到广藿香挥发油215g。
②按照实施例2中步骤②的方法，得到F2。
③F2(10.8g)通过反相中压液相色谱以50～100％甲醇水溶液为流动相梯度洗脱，具体洗脱条件见表5，得到F2-a～F2-f共6分洗脱部分；当洗脱剂为甲醇：水＝90:10时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2-d，F2-d部分经反相Sephadex LH-20柱色谱，以85％甲醇水为洗脱剂，收集洗脱液，根据薄层追踪，分离得到4个亚组分(F2-d-1～F2-d-4)，例如，组分F2-d-3的收集具体为：利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2-d-3；F2-d-3经反复硅胶柱色谱法分离得到2小部分(F2-d-3-A～F2-d-3-B)，按照表6进行梯度洗脱，例如，组分F2-d-3-B的收集具体为：当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得到F2-d-3-B。F3-d-3-B经制备薄层色谱法，展开剂为正己烷:乙酸乙酯＝5:1，Rf为0.45～0.6，再经反相半制备液相色谱，以65％甲醇水溶液为洗脱剂，保留时间为tR＝46.5min，分离得化合物C(20.1mg，tR＝46.5min)。
2)目标化合物的鉴定
无色晶体(甲醇)；碘显黄色，喷10％硫酸乙醇溶液在105℃下显紫红色；由HRESIMSm/z259.1685[M+Na]+可确定分子式为C15H24O2Na。
红外光谱中可以看出具有明显的OH信号(3425cm-1)和双键信号(1642cm-1)。
化合物C与化合物A NMR和图7中HR-ESI-MS数据高度相似，说明其为化合物A的同分异构体。结合图8、图9，对比两者的1H NMR和13C NMR数据，发现化合物C没有A中的三取代双键(Δ1(2))，同时，化合物C中的一个末端双键亚甲基[δH 4.65(brs)and 4.59(brs)；δC154.7and111.9]替代了化合物A中的单峰甲基(Me-10)(表3和表4)。这提示在化合物C中存在1个环外双键(Δ10(15))和1个1,2-邻二醇结构。以上推测得到了2D NMR数据的证实，尤其是OH-1与C-1、C-2、C-5、C-10的HMBC相关；OH-2与C-1、C-2、C-3的HMBC相关；以及H2-15与C-1、C-9、C-10的HMBC相关信号。因此，化合物的平面结构确定为愈创木烷-10(15),11-二烯-1,2-二醇。
在NOESY谱中，OH-1与OH-2、H-4、H-5相关；H-4与H-5、H-7相关；H-6a(H-eq,brd,J＝13.8Hz)与H-5、H-7相关，说明邻二醇OH处于顺式，与H-4、H-5、H-6a和H-7处于同侧。此外，H-2与H3-14、H-6b(H-ax,ddd,J＝13.8,12.0,10.8Hz)相关也印证了上述推测。由于多次尝试结晶均未获得良好晶体，故选择改良Mosher’s法进行绝对构型确定。将化合物分别与(R)-(-)-α-甲氧基苯乙酸[(R)-(-)-α-MPA]和(S)-(+)-α-甲氧基苯乙酸[(S)-(+)-α-MPA]反应，生成相应的酯化产物H-(R)-MPA和H-(S)-MPA，计算H-(R)-MPA和H-(S)-MPA的1H NMR化学位移差值(δR-δS)。进一步利用MPA-Mosher’s酯化经验规则，确定C-2为S构型。化合物鉴定为(+)-(1S,2S,4S,5S,7R)-愈创木烷-10(15),11-二烯-1,2-二醇，命名为百秋李愈创木醇C(Patchouliguaiol C)。
因此，本发明新化合物的化学结构，包括绝对构型得到了确定，如B所示：
核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表3。核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表4。
3)化合物C的(R)-和(S)-MPA酯的制备测定，方法和数据如下。
取化合物2mg，加入(R)-MPA或者(S)-MPA(10mg)，再依次加入EDCI(10mg)和DMAP(8.0mg)，然后以3mL无水的重蒸二氯甲烷溶解，在室温条件下放置过夜。通过薄层色谱检视，反应物经制备液相色谱法(90％MeOH in H2O)分离得到产物C-R-MPA和C-S-MPA。通过1HNMR和1H-1H gCOSY谱，分析C-R-MPA和C-S-MPA对应的化学位移差值Δδ，参考MPA方法使用规则，得到C-2位为S构型，1H NMR(Acetone-d6,600MHz，见表7)。
表7化合物的(R)-和(S)-MPA衍生物数据(δin ppm)
Data were measured in Acetone-d6
实施例4本发明化合物D(百秋李愈创木醇D，Patchouliguaiol D)的制备
1)成分的分离纯化
①药材的提取：按照实施例1中①的提取方法得到广藿香挥发油215g。
②按照实施例1中步骤②的方法，得到F1。
③F1(8.5g)通过反相中压液相色谱以50～100％甲醇溶液进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表2，得到F1-a～F1-k共11个洗脱部分；当洗脱剂为甲醇：水＝80：20时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，得F1-e；F1-e部分经正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：三氯甲烷：甲醇＝5:5:1为洗脱剂，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：丙酮＝8:1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，得F1-e-1，F1-e-1再通过制备薄层色谱的方法，其展开剂为石油醚：丙酮＝8:1，Rf为0.45～0.6，得到目标化合物(1.1mg)，即得式D所示化合物。
2)目标化合物的鉴定
化合物D的波谱数据表明其也为一个愈创木烷型倍半萜。根据图10可知，高分辨质谱HR-ESI-MS给出分子式C15H22O，比化合物C多一个不饱和度。除了2个末端双键(Δ10(15)andΔ11(12))信号以外，化合物C的1H NMR和13C NMR谱还显示出一个三取代双键[δH 5.87(dd,J＝4.8,2.4Hz)；δC 146.1and 127.4](表3和表4)。同时，图12中，化合物D的13C NMR谱只显示一个连氧碳信号(δC 75.3)，结合化合物的分子式，推断分子中存在一个羟基，尽管图11的1HNMR中未显示活泼质子信号。在HMBC谱中，H-2与C-3、C-4、C-5、C-10相关；H-9与C-1、C-7、C-8、C-10、C-15相关；H2-15与C-1、C-9、C-10相关，结合1H-1H COSY中H-2/H-3/H-4/H-5/H2-6/H-7/H2-8/H-9的质子偶合片段，确定C-1＝C-2/C-10＝C-15为共轭双键，且OH取代于C-9位。
在NOESY谱中，H-5与H-4、H-7相关，表明三者处于α取向；而H-9与H-8a、H-8b相关；H-7只与H-8a相关，表明H-9位于β-equatorial取向，这也与H-9的偶合常数相吻合(brd,J＝6.0Hz)。采用ECD的方法，通过对比计算ECD与实测ECD，确定化合物D的绝对构型为4S,5S,7S,9R。因此化合物D鉴定为(-)-(4S,5S,7S,9R)-愈创木烷-1,10(15),11-三烯-9-醇，命名为百秋李愈创木醇D(Patchouliguaiol D)。
因此，本发明新化合物的化学结构，包括绝对构型得到了确定，如式D所示：
核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表3。核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表4。
实施例5本发明化合物E(百秋李愈创木醇E，Patchouliguaiol E)的制备
1)成分的分离纯化
①药材的提取：按照实施例1中①的提取方法得到广藿香挥发油215g。
②按照实施例1中步骤②的方法，得到F1。
③F1(8.5g)通过反相中压液相色谱以50～100％甲醇溶液进行梯度洗脱，具体洗脱条件见表2，得到F1-a～F1-k共11个洗脱部分；当洗脱剂为甲醇：水＝80:20时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的相似流份，得F1-d，F1-d部分经正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：三氯甲烷：甲醇(5:5:1，v/v)为洗脱剂，收集洗脱液，根据薄层追踪，分离得到7个亚组分(F1-d-1～F1-d-7)，例如，组分F1-d-2的收集具体为：利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的流份，得F1-d-2；F1-d-2析出结晶，经甲醇反复重结晶后，取母液M，母液M经硅胶柱色谱分离，以石油醚：乙酸乙酯＝(100:0～90:10)为流动相梯度洗脱，具体洗脱条件见表8，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝20:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚:乙酸乙酯＝12:1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，分离得到式E所示目标化合物(3.3mg)。
表8硅胶柱色谱的洗脱条件
2)目标化合物的鉴定
根据化合物E的波谱数据，推断其也为一个愈创木烷倍半萜。根据图13，HRESIMS揭示分子式为C15H20O，含有6个不饱和度，说明分子中有4个不饱和基团。结合图14、图15，仔细分析化合物E的1H NMR、13C NMR、DEPT数据，确定分子中有一个酮羰基(δC 197.1)，且同时与一个三取代双键(δH 6.04；δC 133.7and 171.7)和一个四取代双键(δC 136.6and 151.0)共轭(表3和表4)。以上推测得到了HMBC信号的证实：H-3与C-1、C-2、C-4、C-5相关；H3-15和H2-9与C-1、C-10相关。此外，化合物E的1H NMR显示三个甲基均为去屏蔽的单峰信号，提示它们均取代于双键上。以上波谱数据确定化合物E的平面结构为愈创木烷-1(10),3,11-三烯-2-酮。H-5和H-7的相对关系根据两者的NOESY相关信号确定，进一步采用计算ECD的方法，确定了化合物E的绝对构型为5S,7R,命名为百秋李愈创木醇E(Patchouliguaiol E)。
因此，本发明新化合物的化学结构，包括绝对构型得到了确定，如式E所示：
核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表3。核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AVIII HD-600spectrometer测定，数据见表4。
以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1舒张血管试验
1)实验材料：
①药物
受试化合物用DMSO配置成1×10-2mol/L的贮备液，-10℃保存。阳性药物(甲磺酸酚妥拉明)用生理盐水配置。
②动物
SD大鼠，清洁级，雌雄不拘，体重200～240g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供。生产质量合格证号：SCXK(川)2008-11。
③试剂
甲磺酸酚妥拉明，中国药品食品检定研究院。
Krebs-Henselei营养液(K-H液)：组成(mM):NaCl,120；KCl,4.6；KH2PO4,1.2；MgSO4,1.2；NaHCO3,25；glucose,10；CaCl2,2.5，pH 4.8。
二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，500ml/瓶，购于成都科龙化工试剂厂。
④实验仪器
电子天平(ESJ120-4型，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)；
肌张力传感器(JH-2型，中国北京航天医学工程研究所)；
生物机能试验系统(BL-420F型，成都泰盟科技有限公司)；
离体组织器官恒温灌流系统(HV-4型，成都泰盟科技有限公司产品)。
2)实验方法：
①血管环的制备
SD大鼠脱臼处死后迅速开胸，剪下胸主动脉降支，置于盛有4℃充有混合氧气(95％O2和5％CO2)的K-H液体中，冲洗血管血迹，剔除周围脂肪和结缔组织，用手术刀切成3～4mm长的血管环。标本的端用不锈钢钩垂直悬吊于血管平滑肌浴槽中，另一端与肌张力换能器连接，使用生物机能实验系统记录血管环张力的变化。浴槽中K-H液保持37℃，持续通以95％O2和5％CO2混合气体，给予标本张力1g平衡1.5～2h，每15min换液一次。
②化合物对苯肾上腺素(Phe)所致的主动脉环收缩反应的影响
在主动脉血管环稳定后，加入Phe(1μM)，待血管稳定收缩后，加入不同剂量的化合物，以甲磺酸酚妥拉明为阳性对照，加入药物达到坪值后的血管张力幅度与Phe诱发的血管环的最大收缩之间的比率反应血管张力的变化。
③实验结果和评价
通过比较发现，实验中主要观察记录了药物浓度为2.5×10-7mol/L、7.5×10- 7mol/L、2.5×10-6mol/L、7.5×10-6mol/L、2.5×10-5mol/L时的张力变化，可以观察到化合物对Phe诱发的主动脉血管收缩有明显的舒张作用，经过Graphpad prism 5统计分析，本发明化合物的EC50值分别为5.42μM，其结果见图16，阳性药的EC50值为66.02nM。
EC50，半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect，EC50)是指能引起50％最大效应的浓度；EC50是评价药物安全的重要指标，其中LD50/ED50、TD50/ED50、TC50/EC50等统称为治疗指数，在评价药物的安全性时，通常其值越大越安全。
试验结果表明，本发明化合物具有较好的舒张血管作用，为临床上筛选和/或制备舒张血管药物提供了一种新的选择。
Claims (5)
1.式C所示的化合物、或其药学上可接受的盐：
2.一种制备式A所示化合物、式B所示化合物、式C所示化合物、式D所示化合物、式E所示化合物的方法，其特征在于：步骤如下：
a1、取广藿香药材，水蒸气蒸馏提取，干燥除水，得广藿香挥发油；
b1、取步骤a1所得的广藿香油，采用硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的相似流份，得F1；
c1、取步骤b1所得的F1，上反相中压柱色谱，依次以甲醇:水＝50:50、65:35、80:20、90:10为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为甲醇：水＝80:20时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的相似流份，得F1-d；
d1、取步骤c1所得的F1-d，经正相Sephadex LH-20柱色谱，以石油醚：三氯甲烷：甲醇＝5:5:1为洗脱剂，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.60的流份，得F1-d-2；
e1、取步骤d1所得的F1-d-2，经重结晶后，分离得式A所示化合物，以及母液M；
f1、取步骤e1所得的母液M，经硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、30:1、20:1为洗脱剂，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝20:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚:乙酸乙酯＝12:1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，分离得到式E所示化合物；
或者，
a2、取广藿香药材，水蒸气蒸馏提取，干燥除水，得广藿香挥发油；
b2、取步骤a2所得的广藿香油，采用硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2；
c2、取步骤b2所得的F2，上反相中压柱色谱，依次以甲醇:水＝50:50、65:35、80:20、90:10为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为甲醇：水＝90:10时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2-d；
d2、取步骤c2所得的F2-d，经反相柱色谱，以85vol％甲醇为洗脱剂，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得F2-d-3；
e2、取步骤d2所得的F2-d-3，经反复硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝20:1、15:1、10:1为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，Rf为0.45～0.60的相似的流份，得到F2-d-3-B；
f2、取步骤e2所得的F2-d-3-B，经制备薄层色谱法，其展开剂为正己烷:乙酸乙酯＝5:1，Rf为0.45～0.6，再经反相半制备液相色谱，以65％甲醇水溶液为洗脱剂，保留时间为tR＝52.4min，分离得式B所示化合物；或者，取步骤e2所得的F2-d-3-B，经制备薄层色谱法，其展开剂为正己烷:乙酸乙酯＝5:1，Rf为0.45～0.6，再经反相半制备液相色谱，以65％甲醇水溶液为洗脱剂，保留时间为tR＝46.5min，分离得式C所示化合物；
或者，
a3、取广藿香药材，水蒸气蒸馏提取，干燥除水，得广藿香挥发油；
b3、取步骤a3所得的广藿香油，采用硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，得F1；
c3、取步骤b3所得的F1，上反相中压柱色谱，依次以甲醇:水＝50:50、65:35、80:20、90:10为洗脱剂进行梯度洗脱，当洗脱剂为甲醇：水＝80：20时，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝8：1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，得F1-e；
d3、取步骤c3所得的F1-e，经正相柱色谱，以石油醚：三氯甲烷：甲醇＝5:5:1为洗脱剂，利用薄层色谱法，收集其展开剂为石油醚：丙酮＝8:1，Rf为0.45～0.6的相似的流份，得F1-e-1，F1-e-1再通过制备薄层色谱的方法，其展开剂为石油醚：丙酮＝8:1，Rf为0.45～0.6，分离得式D所示化合物；
其中，式A所示化合物为
式B所示化合物为
式C所示化合物为
式D所示化合物为
式E所示化合物为
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤a1、a2、a3中，所述水蒸气蒸馏提取的时间均为16～20h；
和/或，步骤b1、b2、b3中，所述梯度洗脱的条件均为：
和/或，步骤c2中，所述梯度洗脱的条件为：
和/或，步骤d1、d3中，所述正向柱色谱为Sephadex LH-20柱色谱，所述洗脱剂石油醚：三氯甲烷：甲醇＝5:5:1的体积为0.65L；
步骤d2中，所述反向柱色谱为Sephadex LH-20柱色谱，所述洗脱剂85体积％甲醇的体积为0.65L；
和/或，步骤e1中，所述重结晶是利用100％甲醇；和/或，所述重结晶的次数为3次；
步骤e2中，所述梯度洗脱的条件如下：
步骤f1中，所述梯度洗脱的条件如下：
4.权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐在制备舒张血管药物中的应用。
5.一种药物，其特征在于：它是以权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
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