CN111110708B - 金针菇提取物在制备治疗动物糖尿病产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了金针菇提取物在制备治疗动物糖尿病产品中的应用。本发明公开的金针菇提取物为金针菇碱提取物、金针菇水洗脱物或金针菇NaCl洗脱物。各提取物的制备方法如下：用碱性溶液提取金针菇，收集提取液，得到金针菇碱提取物；将金针菇碱提取物进行DEAE‑纤维素离子交换柱层析得到金针菇水洗脱物；DEAE‑纤维素离子交换柱层析包括：用水洗脱，收集洗脱液，得到金针菇水洗脱物；将金针菇碱提取物进行DEAE‑纤维素离子交换柱层析得到金针菇NaCl洗脱物；DEAE‑纤维素离子交换柱层析包括：用水洗脱，然后用NaCl水溶液洗脱，收集洗脱液，得到金针菇NaCl洗脱物。实验证明，本发明的金针菇提取物具有降血糖效果。
Description
技术领域
本发明涉及生化制药领域中，金针菇提取物在制备治疗动物糖尿病产品中的应用。
背景技术
糖尿病(DM)是一种以高血糖为特征且伴有多种并发症的代谢性疾病，对人类的生命健康造成了严重的危害。2015年国际糖尿病联盟的统计数据表明，全球糖尿病患者可达4.25亿人。根据病因的不同，糖尿病可分为1型糖尿病(胰岛素依赖型)、2型糖尿病(非胰岛素依赖型)、妊娠糖尿病、特殊类型的糖尿病如单基因糖尿病等。随着经济的发展、人们生活水平的日益提高以及生活方式的改变，糖尿病的发病率呈现逐年上升的趋势。糖尿病已成为除恶性肿瘤、心脑血管疾病之外的第三大疾病，其中2型糖尿病患者更是占糖尿病患病总数的90％。目前糖尿病的治疗药物，如磺脲类药物，ɑ-淀粉酶抑制剂，噻唑烷二酮类药物，美格列脲类药物和双胍类药物等已经使用了十几年，均具有不同程度的副作用，无法达到理想的治疗效果，并且这些传统药物的长期使用对患者的生理和心理健康造成无法磨灭的伤害。不良反应、不良副作用和合成药物的巨大成本迫使科研工作者寻找一种价格低和副作用小的天然降血糖药物，因此开发和利用天然食品作为一种新型口服降血糖药物、保健品或功能性食品刻不容缓。
食用真菌含有丰富的多糖、生物碱、多肽等活性营养物质。某些食用真菌还是珍贵的药用植物资源之一。随着越来越多食用真菌药理作用的明确，一系列由药用真菌研发制备的药物逐渐用于临床治疗，如银蜜片，以银耳耳基粉、天麻蜜环菌粉成片，用于治疗冠心病、慢性支气管炎、神经衰弱等症状；冠脉乐片，以层卧孔菌粉成片，用于治疗冠心病、心绞痛及心律不齐等症状。我国药用真菌资源不仅十分丰富，而且还是我国中医药的传统组成成分，但其开发和利用方面仍存在不足。由此可见，研发天然药用真菌作为药物具有广阔的应用前景。
金针菇[Flammulina velutipes(Curtis)Singer]又名冬菇、朴菇、毛柄金钱菌,隶属担子菌门、伞菌纲、伞菌目、泡头菌科、金钱菌属，是一种在秋冬与早春栽培的亚洲特有食、药兼用菌。多年来在科学研究方面多为注重金针菇的免疫调节、抗氧化、抗肿瘤活性；在专利创新方面多为注重金针菇的食品加工及种植栽培技术；在保健食品及药物方面对金针菇的关注大多基于调节免疫及肠道功能，如无限极牌儿童口服液(金针菇型)，都极少注意到金针菇在降血糖方面的药用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗糖尿病。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了金针菇提取物在制备治疗动物糖尿病产品中的应用；所述金针菇提取物为金针菇碱提取物、金针菇水洗脱物或金针菇NaCl洗脱物；
所述金针菇碱提取物按照包括如下D1)的方法制备：
D1)用碱性溶液提取金针菇，收集提取液，除去所述提取液中的盐得到所述金针菇碱提取物；
所述金针菇水洗脱物按照包括如下D2)的方法制备：
D2)将所述金针菇碱提取物进行DEAE-纤维素离子交换柱层析得到所述金针菇水洗脱物；所述DEAE-纤维素离子交换柱层析包括：用水洗脱，收集洗脱液，得到所述金针菇水洗脱物；
所述金针菇NaCl洗脱物按照包括如下D3)的方法制备：
D3)将所述金针菇碱提取物进行DEAE-纤维素离子交换柱层析得到所述金针菇NaCl洗脱物；所述DEAE-纤维素离子交换柱层析包括：用水洗脱，然后用NaCl水溶液洗脱，收集洗脱液，除去所述洗脱液中的盐得到所述金针菇NaCl洗脱物。
上述应用中，所述D1)包括：
D11)用水提取所述金针菇，收集非液体部分，得到金针菇水提残渣；
D12)利用所述碱性溶液提取所述金针菇水提残渣，得到所述金针菇碱提取物。
其中，所述金针菇水提残渣可为干燥的金针菇水提残渣。所述干燥可在40℃下烘干。
上述应用中，所述碱性溶液可为NaOH溶液。所述NaOH溶液的浓度可为0.25M～1.25M，如0.5M。所述NaOH溶液可为NaOH水溶液。
D1)中料液比可为1g:(10mL～50mL)，如1g:20mL。
D1)中利用所述碱性溶液提取所述金针菇水提残渣可在25～100℃(如80℃)下进行。利用所述碱性溶液提取金针菇水提残渣的时间可根据实际提取情况确定，也可多次重复进行。在本发明的一个实施例中，利用所述碱性溶液提取所述金针菇水提残渣重复3次，每次提取时间为3小时。
上述应用D1)中，除去所述提取液中的盐可通过中空纤维超滤系统进行。所述中空纤维超滤系统的滤膜孔径为3KD。
上述应用D3)中，所述NaCl水溶液中NaCl的浓度可为0.25～0.5M(如0.3M)。
上述应用D3)中，除去所述洗脱液中的盐可通过中空纤维超滤系统进行。所述中空纤维超滤系统的滤膜孔径可为3KD。
上述应用中，所述金针菇碱提取物、所述金针菇水洗脱物或所述蜜环菌NaCl洗脱物均可为液体、半固体或干燥后得到的固体。所述干燥可通过浓缩冻干进行。
上述应用中，所述金针菇可为金针菇子实体。
上述应用中，所述金针菇碱提取物可含有23％的甘露糖、59.4％的葡萄糖、6.1％的半乳糖、10.2％的木糖和1.3％的岩藻糖，％为摩尔百分比。
所述金针菇水洗脱物可含有43.8％的甘露糖、11.9％的葡萄糖、26％的半乳糖、17.9％的木糖和0.5％的岩藻糖，％为摩尔百分比。
所述金针菇NaCl洗脱物可含有19.2％的甘露糖、0.7％的葡萄糖醛酸、53.8％的葡萄糖、11.5％的半乳糖、8.3％的木糖和6.6％的岩藻糖，％为摩尔百分比。
所述金针菇提取物在治疗动物糖尿病中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了用于治疗动物糖尿病产品，所述产品的活性成分为所述金针菇提取物。
本发明还提供了所述金针菇提取物的制备方法，所述方法为下述M1)-M3)中的任一种：
M1)所述金针菇提取物为所述金针菇碱提取物，所述金针菇碱提取物的制备方法包括所述D1)；
M2)所述金针菇提取物为所述金针菇水洗脱物，所述金针菇水洗脱物的制备方法包括所述D2)；
M3)所述金针菇提取物为所述金针菇NaCl洗脱物，所述金针菇NaCl洗脱物的制备方法包括所述D3)。
本发明还提供了由所述金针菇提取物的制备方法制备的金针菇提取物。所述金针菇提取物为所述金针菇碱提取物、所述金针菇水洗脱物或所述蜜环菌NaCl洗脱物。
本发明中，所述产品均可为药物或保健食品。
本发明中，所述动物可为哺乳动物，如小鼠。在本发明的一个实施例中，所述哺乳动物为糖尿病小鼠。
本发明中，治疗糖尿病的效果可通过血糖水平来体现。
实验证明，本发明的金针菇提取物可以治疗糖尿病：施用了金针菇碱提取物、金针菇水洗脱物和蜜环菌NaCl洗脱物这三种金针菇提取物中任一种的动物血糖水平均显著低于未施用金针菇提取物的糖尿病动物，表明，可用本发明的金针菇提取物治疗糖尿病。本发明的金针菇提取物的提取率与热水浸提法相比有所增高，热水浸提法提取率为0.47％，本发明金针菇提取物的提取率为0.77％，均相对于金针菇鲜菇子实体。本发明增添了金针菇资源的开发和利用，并且所得金针菇提取物在研制具有口服降血糖作用的药物或保健食品方面具有可行性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
C57BL/6小鼠：江苏集萃药康生物科技有限公司。
实施例1、金针菇提取物具有降血糖的作用
1、金针菇提取物的制备
1.1金针菇水提残渣的制备
称取4000g金针菇鲜菇子实体，加入32L蒸馏水(料液比为1g:8mL)，浸泡过夜。然后置于100℃提取4h，过滤，收集提取液(记为提取液1)和残渣(记为残渣甲)；向残渣甲中加入10L蒸馏水，于100℃提取2h，过滤，收集提取液(记为提取液2)和残渣，将该残渣于40℃烘干即得到金针菇水提残渣，备用，所得金针菇水提残渣为230g。合并提取液1和2，真空减压浓缩至2.5L，离心(4000rpm(3200rcf)，10min)，收集上清液，向上清液加入95％(体积比)乙醇水溶液醇沉，使乙醇终浓度为65％(体积比)，静置过夜，然后离心(4000rpm(3200rcf)，15min)，收集沉淀，依次用95％(体积比)乙醇水溶液、无水乙醇洗涤，真空干燥得金针菇水提取物18.8g，提取率为0.47％。提取率(％)＝金针菇水提取物的质量(g)/金针菇鲜菇子实体的质量(g)×100％。
1.2碱溶性金针菇总多糖的制备
称取200g步骤1.1的金针菇水提残渣，加至4L 0.5M NaOH水溶液(料液比为1g:20mL)中后于80℃提取3h，得到混合物，将该混合物利用300目纱布过滤，分别收集滤液(记为提取液1)和滤渣(记为滤渣1)；向滤渣1中加入4L 0.5M NaOH水溶液后于80℃提取3h，得到混合物，将该混合物利用300目纱布过滤，分别收集滤液(记为提取液2)和滤渣(记为滤渣2)；向滤渣2中加入4L 0.5M NaOH水溶液后于80℃提取3h，得到混合物，将该混合物利用300目纱布过滤，收集滤液(记为提取液3)。合并提取液1-3，得到混合液，用浓盐酸调节混合液的pH至7，得到金针菇提取液。
对金针菇提取液利用膜孔径为3KD的中空纤维超滤系统除盐，随着提取液被泵输送过膜表面，截留液连续通过循环流路而回流，而透过物被弃去，经硝酸银溶液检测透过物和截留液中均不含氯离子证明提取液除盐完全，收集截留液得到除盐后提取液。最终物质所处的溶液环境是中性水溶液。
将除盐后提取液于60℃减压浓缩至1.2L后离心(4000rpm(3200rcf)，15min)，收集上清液冷冻干燥即得到金针菇碱提取物(记为AFVP)，200g金针菇水提残渣得到AFVP26.8g，提取率为13.4％(相对于金针菇水提残渣)，相对于金针菇鲜菇子实体的提取率是0.77％，4000g的金针菇鲜菇子实体热水浸提后所得残渣烘干后质量是230g,称取其中200g烘干后的金针菇水提残渣进行提取，所得AFVP为26.8g，AFVP质量(g)/金针菇水提残渣质量(g)×100％＝13.4％，AFVP质量(g)/金针菇鲜菇子实体的质量(g)×230/200×100％＝0.77％。
1.3中性糖和酸性糖的制备
称取10g步骤1.2得到的AFVP，加至蒸馏水中，磁力搅拌过夜，使AFVP充分溶解，得到AFVP浓度为20mg/ml的液体，将该液体于4000rpm(3200rcf)下离心15min，收集上清液(记为AFVP上清液)，将所得AFVP上清液利用DEAE-纤维素离子交换柱(7.5×30cm，Cl-型)进行分级，所用DEAE-纤维素为上海恒试化学试剂有限公司产品，该离子交换柱的柱体积为1000ml，具体操作方法如下：
首先将DEAE-纤维素用蒸馏水浸泡3-7天至充分溶胀，挤压除去水分，分别用0.5MNaOH水溶液和0.5M HCl水溶液处理1小时，用蒸馏水洗至pH值为7。将预处理过的DEAE-纤维素装入体积为1000ml(9.8cm×30cm(直径×高度))的玻璃层析柱中，得到DEAE-纤维素离子交换柱。将DEAE-纤维素离子交换柱分别利用蒸馏水、2M NaCl水溶液、蒸馏水以13ml/min的流速平衡2倍柱体积后，利用AgNO3水溶液(10mg/ml)定性测定层析柱流出液中是否含有NaCl以确定层析柱是否平衡好，以流出液中不含有NaCl为准。将所得AFVP上清液以13ml/min的流速匀速上样，待样品上完后，以相同流速13ml/min进行洗脱：
先用蒸馏水洗脱，至洗脱液经苯酚-硫酸法检测无颜色反应，即洗脱液中无糖，收集洗脱液，将该洗脱液减压浓缩和冷冻干燥即得到金针菇水洗脱物(记为AFVP-N)；再用0.3M NaCl水溶液洗脱，至洗脱液经苯酚-硫酸法检测无颜色反应，即洗脱液中无糖，收集洗脱液，将该洗脱液经3000Da透析袋透析除盐，透析液为蒸馏水，于室温下透析24h,用AgNO3溶液(10mg/ml)定性检测至无白色沉淀产生即不含NaCl为准，即得到透析产物，将透析产物减压浓缩和冷冻干燥即得到金针菇NaCl洗脱物(记为AFVP-A)。
2、金针菇提取物的组分的检测
经过苯酚硫酸法测得AFVP和AFVP-N的总糖含量分别为78.4％和87.0％，间羟基联苯法测得AFVP的糖醛酸含量为0.9％，AFVP-N中未检测出糖醛酸，AFVP-A中的糖醛酸含量为0.6％。以上总糖含量、糖醛酸含量均指质量百分比。
苯酚硫酸法的检测步骤如下：
6％苯酚溶液：将150g苯酚置于100m L蒸馏水中进行溶解，密闭且用锡纸避光，得到60％苯酚母液，放置于4℃冰箱中保存备用，使用前按照1:9的比例添加蒸馏水稀释得到6％苯酚溶液。
100μg/m L葡萄糖标准溶液的配制：在称量纸上称取10mg葡萄糖粉末，并转移至于小烧杯中，加入10mL蒸馏水溶解，转移至l00 mL容量瓶中，冲洗烧杯内壁后液体转移至容量瓶中，滴加蒸馏水至刻度线凹液面最低处，得到100μg/mL的葡萄糖标准溶液，于4℃冰箱棕色瓶内避光保存，以备使用并标记配制日期。所用葡萄糖为上海源叶生物科技有限公司产品，货号B21882。
标准曲线的制作：依次使用移液枪取100μg/m L的葡萄糖标准溶液0μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl加入不同试管中，各试管均补加蒸馏水补至1mL。每一个浓度梯度上包含有3组平行以减小误差，向每支试管内加入浓度6％苯酚溶液500μl并摇匀，再加入浓硫酸2.5m L，快速摇匀试管内液体，静置冷却约30min，使用分光光度计于490nm处测定各试管内溶液光吸收值。以葡萄糖的含量为横坐标轴，纵坐标轴为490nm处光吸收值，绘制糖含量标准拟合曲线。
样品总糖含量测定：将待测样品配成浓度为60μg/m L的待测溶液，将1m L待测溶液加入到试管中，再加入6％苯酚溶液500μl并摇匀，再加入浓硫酸2.5m L，快速摇匀试管内液体，静置冷却约30min，使用分光光度计于490nm处测定各试管内溶液光吸收值。将待测溶液的光吸收值代入糖含量标准拟合曲线方程式之中，便可求得待测样品中总糖的含量。
间羟基联苯法的检测步骤如下：
氨基磺酸溶液的配制：用称量纸称取3.9g氨基磺酸，并转移至5mL蒸馏水中待其完全溶解，向溶液中缓慢滴加饱和的氢氧化钾水溶液，轻微震荡以便使氨基磺酸全部完全溶解，静止冷却，温度达到室温后，继续滴加氢氧化钾饱和水溶液，使其pH达到2.5时，再采用10m L容量瓶进行定容，得到氨基磺酸溶液，室温环境下保存。
间羟基联苯溶液配制：配制10m L浓度为0.5％(质量比)NaOH溶液，将15mg间羟基联苯溶于NaOH溶液中，得到间羟基联苯溶液，置于冰箱4℃环境棕色瓶内保存。
半乳糖醛酸标准溶液配置：用称量纸称取D-半乳糖醛酸10mg，转移至烧杯中并加入10mL蒸馏水使其溶解，转移至l00 mL容量瓶内，冲洗烧杯内壁后液体转移至容量瓶内，加水至刻度线附近，滴加蒸馏水至刻度线凹液面最低处，得到0.1g/L半乳糖醛酸标准溶液。所用半乳糖醛酸为上海源叶生物科技有限公司产品，货号B21894。
半乳糖醛酸的标准曲线的制作：分别使用移液枪吸取0.1g/L半乳糖醛酸标准溶液0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL到各试管中，加入蒸馏水至溶体总体积1mL。每个浓度梯度设置三组平行以减小误差，向每只试管内加入40μl氨基磺酸溶液并震荡，而后加入2.5m L浓硫酸，再次振荡使试管内液体混合均匀，将各组试管转移至100℃热水浴中，进行20min反应，取出试管后立即用冷水冲洗，使其降至室温。冷却后向各支试管内滴加40μl间甲基联苯溶液，并振荡使其液体混合均匀，静置20-30min后，于525nm波长处进行比色。以每管半乳糖醛酸含量为横坐标轴，以525nm处的吸光值做为纵坐标轴，绘制半乳糖醛酸标准拟合曲线。
测定样品中的糖醛酸含量：配制浓度为100μg/m L的待测样品水溶液，取样400μl于试管中，采取标准曲线制作一致的实验操作方式，在525nm条件下测定各组光吸收值，计算样品光吸收数值的平均值并代入标准曲线拟合方程，根据拟合曲线方程，计算待测样品中糖醛酸含量。
采用高效液相色谱(HPLC)检测AFVP、AFVP-N、AFVP-A的单糖组成，检测步骤如下：
称取2mg待测样品置于玻璃小瓶中，加入1ml 2M盐酸-甲醇溶液(即盐酸溶于甲醇中使其浓度为2M)充N2封管，在80℃的条件下水解8h后用氮吹仪吹干，再加入1ml 2M三氟乙酸水溶液，在120℃条件下封管水解1h，冷却后将水解产物转移到蒸发皿中，然后向水解产物中反复加入无水乙醇水浴蒸除三氟乙酸。加入0.5ml 0.3M NaOH水溶液和0.5ml PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)试剂于蒸发皿中(PMP是还原糖衍生化较为有效的试剂之一)，从溶解后的样品中取出100μl于1.5ml EP管中，在70℃条件下水浴30min，分别加入50μl蒸馏水和0.3M HCl溶液终止反应，充分混匀后加入1ml二氯甲烷充分震荡以萃取出剩余的PMP试剂，离心(10000rpm，5min)吸去二氯甲烷层，保留水层，反复萃取三次。用0.22μm滤膜过滤后进行单糖检测。
高效液相色谱分析单糖组成条件：
仪器：Shimadzu LC-10AT VP高效液相色谱仪，附紫外检测器。
色谱柱：DIKMA InertsiL ODS-35μm 150×4.6mm。
检测温度：35℃。
洗脱液：由PBS磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.0)与乙腈混合得到，其中PBS(0.1M，pH7.0)与乙腈的体积比分别为82.2％和17.8％。
流速：1.0ml/min。
结果如表1所示，表1中“—”表示不含有该物质。
表1、金针菇提取物的单糖组成(％，摩尔百分比)
3、金针菇多糖降血糖
将100只4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为10组(每组10只)，分别进行以下处理：
第1至5组连续喂食普通饲料8周后，作为正常小鼠模型进行进一步的给药。其中，第1组，灌胃等体积的生理盐水4周，作为正常小鼠空白对照。第2组，降糖药物二甲双胍(Met)(Aladdin，M107827)溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周，作为正常小鼠阳性对照。第3组，AFVP溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周。第4组，AFVP-N溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周。第5组，AFVP-A溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周。
第6至10组连续喂食高脂饲料(60％脂肪含量的饲料)8周后，作为糖尿病小鼠模型(空腹血糖高于200mg/dl)进行进一步的给药。其中，第6组，灌胃等体积的生理盐水4周，作为高血糖小鼠空白对照。第7组，降糖药物二甲双胍溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周，作为高血糖小鼠阳性对照。第8组，AFVP溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周。第9组，AFVP-N溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周。第10组，AFVP-A溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周。
各组小鼠每天灌胃一次，每次灌胃的液体体积均相等。
每天上午9点用血糖仪(强生，OneTouch UltraEasy)检测各组小鼠空腹血糖，结果以mean±SD表示，利用SPSS统计软件，进行ANOVA-one way统计学分析。如表2所示。
表2中，显著性分析结果“#”表示第6组小鼠血糖与第1组小鼠血糖相比，###，p<0.001，说明成功得到了糖尿病小鼠，可以作为糖尿病小鼠模型；显著性分析结果“*”为给药的各组糖尿病小鼠血糖与第6组小鼠血糖间的比较，***，p<0.001。结果显示，与第6组相比，第7-10组的小鼠血糖均显著下降，表明，AFVP、AFVP-N、AFVP-A均具有明显降低小鼠血糖的效果，均可以作为降血糖药物。
表2金针菇多糖对糖尿病小鼠血糖的影响
对比例、
按照中国专利ZL 201610381719.3中的方法，将清洗后的金针菇粉碎后与水混合,金针菇与水的料液比为1g:7mL，在90℃恒温水浴下提取6h，倒出提取液，加入2％活性炭于60℃水浴脱色2h后，用离心机以4000r/min离心15min，抽滤，提取液于60℃水浴中浓缩，浓缩至原体积的1/4～1/5后，用体积分数为90％乙醇沉淀，室温沉淀过夜，离心得到的提取物放于蒸发皿中在60℃水浴上蒸干，获得金针菇提取物，将所得金针菇提取物记为AFV。
按照实施例1的方法检测AFV的总糖质量含量，得到其总糖质量含量为67.4％，低于实施例1的AFVP(其总糖质量含量为78.4％)。按照实施例1的方法检测AFV的单糖组成，各单糖及其摩尔百分比分别为Glc(葡萄糖)62.0％，Gal(半乳糖)21.5％，Man(甘露糖)14.6％，Fuc(岩藻糖)1.9％。实施例1的AFVP单糖组成特征为含有59.4％葡萄糖、23.0％甘露糖、10.2％木糖、6.1％半乳糖及1.3％岩藻糖，％为摩尔百分比。
按照实施例1步骤3的方法检测AFV的降血糖情况，将20只4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为2组(每组10只)，即第11组和第12组，分别进行以下处理：
第11组连续喂食普通饲料8周后，作为正常小鼠模型进行进一步的给药，将AFV溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周。
第12组连续喂食高脂饲料(60％脂肪含量的饲料)8周后，作为糖尿病小鼠模型(空腹血糖高于200mg/dl)进行进一步的给药，AFV溶于生理盐水后以50mg/kg/d剂量连续灌胃4周。
各组小鼠每天灌胃一次，每次灌胃的液体体积均相等，且与实施例1步骤3相等。
每天上午9点用血糖仪(强生，OneTouch UltraEasy)检测各组小鼠空腹血糖，结果以mean±SD表示，利用SPSS统计软件，进行ANOVA-one way统计学分析。如表2所示。
结果显示，AFV也具有降血糖效果，但其效果不如本发明的AFVP、AFVP-N和AFVP-A。
Claims (4)
1.金针菇提取物在制备治疗动物糖尿病产品中的应用；所述金针菇提取物为金针菇碱提取物；
所述金针菇碱提取物按照包括如下D11)和D12)的方法制备：
D11)用水提取金针菇，收集非液体部分，得到金针菇水提残渣；
D12)利用碱性溶液提取所述金针菇水提残渣，得到金针菇提取液；将所述金针菇提取液除盐，收集除盐后的提取液即得到金针菇碱提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述碱性溶液为NaOH溶液。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述金针菇为金针菇子实体。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述动物为哺乳动物。
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| 丛朋.碱溶性金针菇多糖的分离纯化与结构分析.《中国优秀硕士学位论文全文数据库》.2018,(第5期),第E057-7页，尤其是摘要，第11页2.1碱溶性金针菇多糖的提取，第19页2.1离子交换层析分级，第23页最后一段. * |
| 碱溶性金针菇多糖的分离纯化与结构分析;丛朋;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20180515(第5期);第E057-7页，尤其是摘要，第11页2.1碱溶性金针菇多糖的提取，第19页2.1离子交换层析分级，第23页最后一段 * |
| 金针菇多糖抗2型糖尿病作用的研究;李卉等;《吉林化工学院学报》;20161130;第33卷(第11期);第32-35页，尤其是第32页摘要，左栏最后一段，右栏第1段 * |
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