CN104387489A - 一种具有降血糖作用的白子草酸性均一多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有降血糖作用的白子草酸性均一多糖的制备方法及应用，将白子草原料干燥粉碎，10倍石油醚脱脂后，经95wt.%乙醇溶液提取后的药渣，用100℃的水热提2次，每次2小时，提取液用无水乙醇沉淀多糖，得粗品，粗品经木瓜蛋白酶-Sevag法除蛋白，再过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱，以NaCl浓度0、0.1、0.3mol·L^-1进行梯度洗脱，流速2.5mL·min^-1，收集0.3mol·L^-1NaCl洗脱液真空浓缩，透析后得到白子草酸性均一多糖（GDAPs），可与药学上适用载体混合，制备具有降血糖作用的药物。本发明白子草酸性均一多糖得率高，降血糖药效活性高，制备方法简单，具备显著的经济和社会效益。

Description

一种具有降血糖作用的白子草酸性均一多糖的制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有降血糖作用的白子草酸性均一多糖的制备方法及应用。

背景技术

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是最常见的慢性病之一，是由于遗传和环境因素相互作用，引起胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，其中以高血糖为主要标志。随着人们生活水平的提高，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。糖尿病在中国的发病率达到2%，据统计，中国已确诊的糖尿病患者达4000万，并以每年100万的速度递增。

白子草为菊科菊三七属植物白子菜Gynura divaricata (L.)DC.的干燥叶，又名白背三七、白东枫等。性味咸微辛、寒，有毒，具有清热，舒筋，止血，祛痰之功效，其作为地方药材被收录于《福建省中药材标准》(2006版) [胡勇, 李维林, 林厚文, 等. 白背三七地上部分降血糖作用研究. 西南林学院学报, 2007, 27(1): 55-58]。民间以其地上部分广泛用于治疗糖尿病、高血压病、高脂血症等，具有良好的效果。研究表明白子草总多糖具有较好的降血糖活性[姜曼花, 胡剑卓, 邱文高, 等. 白背三七多糖和黄酮降血糖及耐缺氧作用. 中国医院药学杂志, 2009 (13): 1074-1076]。但目前的技术提取率低，严重影响到其广泛应用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有降血糖作用的白子草酸性均一多糖的制备方法及应用，白子草酸性均一多糖得率高，降血糖药效活性高，制备方法简单，具备显著的经济和社会效益。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有降血糖作用的白子草酸性均一多糖的制备方法包括以下步骤：

（1）前处理：取白子草的干燥叶粉碎后，过20目筛，得白子草粗粉，加10倍量的石油醚，加热回流提取2次，每次2 h，抽滤，取残渣烘干，加入10倍量的95wt.%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，抽滤，将滤渣烘干备用；

（2）提取：称取步骤（1）处理过的白子草滤渣，加20倍量水，100℃水浴中加热回流提取2次，每次2 h，过滤，回收滤液，将滤液浓缩至适量，加3倍量的95wt.%乙醇溶液，放置过夜，离心，收集沉淀物，加入无水乙醇搅拌混匀，静置30-60 min，4000 r·min^-1离心15 min，取沉淀物，重复脱水2次，加入丙酮搅拌混匀，静置30-60 min，离心10 min，所得沉淀物40℃减压干燥得粗多糖；

（3）木瓜蛋白酶-Sevag法去蛋白：将步骤（2）的粗多糖配制成10 mg·mL^-1的多糖溶液，调pH值为6.0，加入多糖溶液体积2%的木瓜蛋白酶，60℃水浴中酶解4 h，反应完全后沸水加热10 min，离心，上清液经Sevag法脱蛋白，反复多次，直到无明显的蛋白产生为止；

（4）DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析：称取步骤（3）所得白子草多糖3.0 g，加入60 mL蒸馏水充分溶解后离心，上清液作为上样液；打开DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱底端出口使柱内液面降至柱床表面后关闭，吸去柱内多余上清液，开始上样，用NaCl溶液进行梯度洗脱，以NaCl浓度0、0.1、0.3 mol·L^-1进行梯度洗脱，流速2.5 mL·min^-1，收集0.3 mol·L^-1NaCl洗脱液真空浓缩，透析后得到白子草酸性均一多糖GDAPs。

制得的白子草酸性均一多糖，与药学上适用载体混合，制备具有降血糖作用的药物。

本发明的显著优点在于：白子草酸性均一多糖得率高，降血糖药效活性高，制备方法简单，具备显著的经济和社会效益。

附图说明

图1是白子草多糖的洗脱曲线。

具体实施方式

本发明工艺所用的药材炮制方法是经实验比较而得出，提取溶剂种类和浓度、提取方法、药材粉碎目数等经过正交设计研究而成，保证了所得到的白子草酸性均一多糖得率高。并考察了其降血糖药效活性。

其研究步骤和详细数据如下：

一、白子草酸性均一多糖的提取及纯化

1．白子草多糖的提取

（1）选用白子草药材，鉴定为菊科菊三七属植物白子菜Gynura divaricata (L.)DC.的干燥叶，药材的性状特征、粉末特征、理化性质应符合福建省中药材标准（2006年版）“白子草”项下的内容。

（2）前处理 取白子草的干燥叶粉碎后，过20目筛，得白子草粗粉。称取白子草粗粉，加10倍量的石油醚，加热回流提取2次，每次2 h。抽滤，回收上清液，残渣于烘箱内50℃烘干备用。

称取上述处理过的残渣加入10倍量95%乙醇，回流提取2次，每次2 h。抽滤，将残渣于烘箱内50℃烘干备用。

（3）提取 称取已预处理的白子草残渣，置于提取器中，加20倍量水，于100℃水浴中加热回流提取2次，每次2 h，过滤，回收滤液，将滤液浓缩至适量，加3倍量95%乙醇，沉淀多糖，放置过夜，离心，收集沉淀物，沉淀物加入无水乙醇搅拌混匀脱水，静置30-60 min，4000 r·min^-1离心15 min，取沉淀，重复脱水2次，再用丙酮搅拌混匀，静置30-60 min，离心10 min，得沉淀。40℃减压干燥得粗多糖。

白子草酸性均一多糖的纯化

（1）木瓜蛋白酶-Sevag法去蛋白  精确配制10 mg·mL^-1的多糖溶液，调pH值为6.0，加入多糖溶液体积2%的木瓜蛋白酶，在水浴温度60℃酶解4 h，反应完全后沸水加热10 min，离心，上清液经Sevag法脱蛋白，反复多次，直到无明显的蛋白产生为止。

（2）DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析   离子交换柱层析是由于层析填料对不同种类多糖的吸附作用的不同，使多糖中各组分达到分离。离子交换法分离多糖时，多糖在交换剂上的吸附力与多糖的结构有关，在阴离子交换剂上，通常吸附力随多糖分子中酸性集团的增加而增加。DEAE-Sepharose Fast Flow为阴离子交换剂，此方法适合于分离酸性多糖、中性多糖和粘多糖。在离子交换填料上，酸性多糖易被吸附，中性多糖则不被吸附，然后分别用离子强度不同的洗脱液将酸性多糖洗脱下来。

1）预处理 量取DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换树脂100 mL，用蒸馏水反复洗涤，再用0.3 mol·L^-1 NaOH溶液500 mL浸泡30 min，适当搅拌后，用大量蒸馏水洗至中性；再用0.3 mol·L^-1盐酸溶液500 mL浸泡30 min，适当搅拌后，用大量蒸馏水洗至无氯离子，用硝酸银溶液跟踪检测直到没有白色沉淀。

2）装柱与平衡 将预处理好的填料置于烧杯中，并加入约1倍柱床体积的蒸馏水，用玻璃棒搅匀，随即沿着贴紧柱内壁(2.6×5.2 cm)的玻璃棒，缓缓倒入已架好并底端出口关闭且底端装有部分蒸馏水的层析柱中，静置约30 min。打开层析柱底端出口，吸取多余的柱内上清液，继续添加悬浮液，直至沉积高度为26.0 cm。在装柱过程中要注意观察防止柱床流干。

3）上样洗脱 称取白子草多糖3.0 g，加入60 mL蒸馏水充分溶解后离心，上清液作为上样液。打开柱底端出口使柱内液面降至柱床表面后关闭，吸去柱内多余上清液，开始上样。以NaCl浓度0、0.1、0.3 mol·L^-1进行梯度洗脱，流速2.5 mL·min^-1，自动部分收集器收集，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟踪检测，测定481 nm波长处的吸光值，直到没有多糖检出。横坐标为洗脱管数，纵坐标为吸光值，绘制洗脱曲线。洗脱结果见图1，合并C尖峰洗脱液，真空浓缩，透析72 h，冷冻干燥，得到白子草酸性多糖组分（GDAPs）。并进行Sephacryl S-300HR凝胶柱层析分析，显示GDAPs为均一多糖。用间羟基联苯法测得GDAPs的纯度为90.9%。

二、白子草酸性均一多糖降血糖药效实验

1. 实验动物  

SPF级ICR小鼠，体重18-22 g，雄性，80只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，在福州总医院药学科动物实验室进行饲养和试验。

实验材料

盐酸二甲双胍片（江苏苏中药业集团股份有限公司）；格列本脲片（天津太平洋制药有限公司）；链脲佐菌素(STZ)（Sigma）；超氧化物歧化酶(SOD)测试盒及丙二醛(MDA)测定试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）；Optium血糖/血酮仪及配套试纸（美国雅培公司）；AU-2700全自动生化分析仪（Olympus公司出品）。

实验方法

（1）糖尿病动物模型的建立

将80只雄性ICR小鼠饲养一周后，抽取10只作为正常对照组，普通饲料喂养，其余70只用于造模。参考文献报道建立大鼠糖尿病模型。用高糖高脂饲料（配方为：10.0%猪油，25.0%蔗糖，3.5%胆固醇，2.0%胆酸盐，59.5%普通饲料）喂养20 d。禁食不禁水12 h后，用0.1 mmol·L^-1、pH 4.2~4.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液配制2％链脲佐菌素(STZ)溶液（临用时配制），给予小鼠腹腔注射50 mg·kg^-1 STZ，24 h后剪尾取血检测血糖，以连续3天测定血糖>11.1 mmol·L^-1判断为造模成功的小鼠。

（2）实验分组与给药

取糖尿病模型造模成功的小鼠60只随机分为6组，除正常对照组外，其它6组分别为模型对照组，二甲双胍组（200 mg·kg^-1·d^-1），GDAPs高剂量组（60 mg·kg^-1·d^-1），GDAPs中剂量组（37 mg·kg^-1·d^-1），GDAPs低剂量组（15 mg·kg^-1·d^-1）。各组小鼠均灌胃给药，空白对照组和模型对照组灌胃0.9%氯化钠注射液，在实验过程中空白对照组给予普通饲料，其余5组小鼠给予高糖高脂饲料，2次/d，持续21 d。

（3）禁食血糖含量测定

在试验第0、7、14、21 d，每组小鼠禁食不禁水12 h后从小鼠尾部静脉采血，用拜安捷血糖仪测定血糖的含量。

（4）指标检测

第21 d禁食血糖测完后，将小鼠用戊巴比妥钠(15 mg·kg^-1)进行麻醉，心脏采血3~5 mL，血样放入预冷的离心机中3000 r·min^-1离心15 min，采集上清液血清，-80℃下保存。按照南京建成生物工程研究所SOD和MDA试剂盒说明书测定血清中SOD和MDA的含量。剖取肝脏，用0.9%氯化钠注射液洗干净后，并按照肝糖元测定试剂盒说明书测定肝糖元含量。

（5）统计学分析

实验数据均用SPSS13.0软件进行统计学处理，各项指标结果以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验, 以P＜0.05为有统计学显著差异性。

结果

（1）GDAPs对糖尿病小鼠血糖的影响 

由表1可知，小鼠腹腔注射链脲佐菌素后，血糖显著升高，均大于>11.1 mmol·L^-1，说明糖尿病小鼠模型造模成功。给药前，模型对照组、阳性对照组、GDAPs低、中、高剂量组糖尿病小鼠的血糖水平，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。连续给药7 d后，与模型对照组比较，二甲双胍组小鼠血糖水平显著降低（P＜0.05），而GDAPs低、中、高剂量组小鼠血糖水平呈下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；给药14 d后，二甲双胍组和GDAPs高剂量组（60 mg·kg^-1）与模型对照组相比小鼠血糖水平显著降低（P＜0.05），血糖值分别为13.6±4.3和18.9±2.8 mmol·L^-1；而给药21 d后，GDAPs低、中、高剂量组都可显著降低小鼠血糖水平，并呈剂量依赖性（P＜0.05）。综合来看，在STZ诱导的糖尿病小鼠试验中，GDAPs剂量为60 mg·kg^-1时具有良好的降血糖作用。

表1 GDAPs对糖尿病小鼠血糖水平的影响（±s，n=10）

注a：与正常对照组比较，*P＜0.01；b：与模型对照组比较，^# P＜0.05，^## P＜0.01

（2）GDAPs对糖尿病小鼠肝脏氧化能力的影响 

由表2中血清SOD活力检测结果可知：模型组糖尿病小鼠血清中的SOD活性显著低于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，给予二甲双胍和GDAPs处理后小鼠血清中的SOD活性显著提高（P＜0.05），特别是60 mg·kg^-1的GDAPs（435.17±21.63 U·mg^-1）具有更好的治疗效果，在改善SOD活性方面优于二甲双胍（423.37±26.15 U·mg^-1）。表2中血清MDA含量检测结果显示，模型组糖尿病小鼠血清中MDA含量显著升高，二甲双胍组和GDAPs高、中剂量组可显著降低小鼠血清中MDA含量（P＜0.05），GDAPs 60 mg·kg^-1剂量组MDA含量低于二甲双胍组，但无显著性差异（P＞0.05）；以上结果表明，白子草酸性多糖GDAPs 60，37 mg·kg^-1时对STZ所诱导的糖尿病小鼠抗氧化能力增强，从而可能对糖尿病的进一步发展起到防治的作用。

表2 GDAPs对糖尿病小鼠SOD、MDA的影响 （±s，n=10）

   注a：与正常对照组比较：^* P＜0.01；b：与模型对照组比较：^# P＜0.05，^## P＜0.01

（3）GDAPs对糖尿病小鼠肝糖原的影响

   由表3可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠肝脏中肝糖原含量显著降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，二甲双胍可显著升高小鼠肝脏中肝糖原的含量（P＜0.05）；GDAPs高剂量组可显著升高小鼠肝脏中肝糖原的含量（P＜0.05），GDAPs中、低剂量组具有升高小鼠肝脏中肝糖原含量的趋势，但无统计学差异（P＞0.05）。

表3 GDAPs对糖尿病小鼠肝糖原的影响（±s，n=10）

注a：与正常对照组比较，^* P＜0.01；b：与模型对照组比较，^# P＜0.05

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

Claims (2)

1.一种具有降血糖作用的白子草酸性均一多糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）前处理：取白子草的干燥叶粉碎后，过20目筛，得白子草粗粉，加10倍量的石油醚，加热回流提取2次，每次2 h，抽滤，取残渣烘干，加入10倍量的95wt.%乙醇溶液，回流提取2次，每次2 h，抽滤，将滤渣烘干备用；

（2）提取：称取步骤（1）处理过的白子草滤渣，加20倍量水，100℃水浴中加热回流提取2次，每次2 h，过滤，回收滤液，将滤液浓缩至适量，加3倍量的95wt.%乙醇溶液，放置过夜，离心，收集沉淀物，加入无水乙醇搅拌混匀，静置30-60 min，4000 r·min^-1离心15 min，取沉淀物，重复脱水2次，加入丙酮搅拌混匀，静置30-60 min，离心10 min，所得沉淀物40℃减压干燥得粗多糖；

（3）木瓜蛋白酶-Sevag法去蛋白：将步骤（2）的粗多糖配制成10 mg·mL^-1的多糖溶液，调pH值为6.0，加入多糖溶液体积2%的木瓜蛋白酶，60℃水浴中酶解4 h，反应完全后沸水加热10 min，离心，上清液经Sevag法脱蛋白，反复多次，直到无明显的蛋白产生为止；

（4）DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析：称取步骤（3）所得白子草多糖3.0 g，加入60 mL蒸馏水充分溶解后离心，上清液作为上样液；打开DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱底端出口使柱内液面降至柱床表面后关闭，吸去柱内多余上清液，开始上样，以NaCl浓度0、0.1、0.3 mol·L^-1进行梯度洗脱，流速2.5 mL·min^-1，收集0.3 mol·L^-1NaCl洗脱液真空浓缩，透析后得到白子草酸性均一多糖GDAPs。

2.一种如权利要求1所述的方法制得的白子草酸性均一多糖，与药学上适用载体混合，制备具有降血糖作用的药物。