CN116622003A - 一种中药物质基础的发现制备及其降糖降脂用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药物质基础的发现制备及其降糖降脂用途，该中药物质基础为炒莱菔子中的一种级份多糖，通过石油醚脱脂、水提、90％醇沉获得粗多糖、水复溶、40％醇沉除杂、60％醇沉获得目标多糖的方法制备得到。活性研究表明，该多糖组分具有明显的降糖降脂作用；而作为对比，生莱菔子中60％醇沉组分并未发现明显的降糖降脂作用。该研究结果从一定程度上说明了莱菔子炒制处理的必要性和重要性。因此，本发明提供的炒莱菔子来源的多糖具有开发成降糖和/或降脂药物的前景。
Description
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种中药物质基础的发现制备及其降糖降脂用途。
背景技术
莱菔子RaphaniSemen是十字花科植物萝卜RaphanussativusL.的干燥成熟种子，收录于《中国药典》2020年版一部，具有消食除胀和降气化痰的功效，临床常用于治疗消化系统疾病和高血压等。目前从莱菔子中分离纯化、鉴定的化合物主要为硫苷及其降解产物、生物碱、苯丙素及其衍生物、黄酮、萜类、甾体等。多糖也是莱菔子中不可忽视的一种成分，莱菔子的部分功能与其多糖组分有关。
莱菔子在临床上多以清炒后入药，但炒制对其所含多糖的影响研究较少。敖茂宏等探讨了炮制方法对莱菔子多糖含量的影响，发现炒莱菔子中的多糖含量为4.66％，生莱菔子中的多糖含量为3.47％，方差分析表明，炒莱菔子和生莱菔子中多糖含量有极显著性差异(中药材莱菔子炮制前后多糖含量的比较研究，广东农业科学2010年第8期)。
遗憾的是，没有研究公开过炒制对莱菔子所含多糖活性的比较研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种中药物质基础的发现制备及其降糖降脂用途，该中药物质基础为炒莱菔子所含有的级份多糖。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种炒莱菔子中的多糖，通过如下方法制备：
取炒莱菔子粉末适量，加入适量石油醚，加热回流进行脱脂处理；回收石油醚，残渣挥发至无醚味，加入适量蒸馏水进行微波提取，提取液减压浓缩加入无水乙醇调至乙醇体积分数为90％，低温静置过夜，离心收集沉淀，水复溶后冷冻干燥，得到炒莱菔子粗多糖；
取炒莱菔子粗多糖适量，加适量水配制成多糖溶液，添加无水乙醇至溶液中乙醇体积分数达到40％，低温静置过夜，离心取上清液，继续添加无水乙醇至溶液中乙醇体积分数达到60％，低温静置过夜，离心收集沉淀，用水复溶后冷冻干燥即得。
优选地，离心条件均为4000r/分钟离心10分钟。
优选地，微波提取功率为280W，时间为25分钟。
优选地，脱脂和提取的料液比均为1kg:10L。
上述多糖在制备降糖和/或降脂药物中的应用。
上述多糖在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
有益效果：
本发明从炒莱菔子中制备得到一种60％醇沉组分，活性研究表明，该多糖组分具有明显的降糖降脂作用。作为对比，生莱菔子中60％醇沉组分并未发现明显的降糖降脂作用。该研究结果从一定程度上说明了莱菔子炒制处理的必要性和重要性。
附图说明
图1为各组小鼠的体质量情况(n＝10)；注：与同时间空白组相比，#表示差异显著，P<0.05；与同时间模型组相比，*表示差异显著，P<0.05；
图2为各组小鼠的空腹血糖情况(n＝10)；注：与同时间空白组相比，#表示差异显著，P<0.05；与同时间模型组相比，*表示差异显著，P<0.05；
图3为各组小鼠灌胃干预6周后OGTT及曲线下面积(n＝10)；注：与同时间空白组相比，#表示差异显著，P<0.05；与同时间模型组相比，*表示差异显著，P<0.05；
图4为各组小鼠灌胃干预6周后FINS含量及HOMA-IR(n＝10)；注：与同时间空白组相比，#表示差异显著，P<0.05；与同时间模型组相比，*表示差异显著，P<0.05；
图5为各组小鼠灌胃干预6周后血脂四项情况(n＝10)；注：与空白组相比，#表示差异显著，P<0.05；与模型组相比，*表示差异显著，P<0.05；
图6为各组小鼠灌胃干预6周后附睾脂肪细胞形态情况(n＝10)；注：与空白组相比，#表示差异显著，P<0.05；与模型组相比，*表示差异显著，P<0.05。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
1、材料与试剂
生莱菔子和炒莱菔子均购自北京仟草中药饮片有限公司(产地：安徽)，经北京中医药大学万瑾毅副教授鉴定为十字花科植物萝卜RaphanussativusL.的干燥成熟种子，凭证样本存放于北京中医药大学。高脂饲料(货号D12492)购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购自美国Sigma-Aldrich公司。胰岛素测定试剂盒(放免法)购自北京北方生物技术研究所。血清胰岛素(FINS)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。ACCU-CHEKPerforma血糖仪和配套试纸购自德国Roche公司。
2、实验动物
健康C57BL/6雄性小鼠，6周龄，体质量约20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养在北京中医药大学中医药研究院实验动物中心，SPF环境，饲养环境的温度始终保持在20-25℃，相对湿度控制在50％-60％，每天光照和黑暗交替，交替时间为12小时。预适应1周后，小鼠随机分组开始实验。
二、实验方法
1、生、炒莱菔子多糖制备
取生莱菔子、炒莱菔子粉末各2000g，加入固液比为1:10(kg:L)的石油醚，40℃回流1小时进行脱脂处理。回收石油醚，残渣挥发至无醚味。加入固液比为1:10(kg:L)的蒸馏水进行微波提取，微波提取参数为：微波功率280W，提取时间25分钟；提取液减压浓缩(旋转蒸发仪，水浴40℃)至5L，冷却后加入无水乙醇调至乙醇体积分数为90％，4℃低温静置过夜，离心收集沉淀(4000r/分钟离心10分钟)，水复溶后冷冻干燥，分别得到生莱菔子粗多糖和炒莱菔子粗多糖。
取生莱菔子粗多糖、炒莱菔子粗多糖适量分别加蒸馏水配制成质量分数为10％的多糖溶液，添加无水乙醇至溶液中乙醇体积分数达到40％，4℃低温静置过夜，离心取上清液(4000r/分钟离心10分钟)，继续添加无水乙醇至溶液中乙醇体积分数达到60％，4℃低温静置过夜，离心收集沉淀(4000r/分钟离心10分钟)，用水复溶后冷冻干燥分别得到生莱菔子60％醇沉组分(SLFZP-60)、炒莱菔子60％醇沉组分(CLFZP-60)。
2、糖尿病小鼠造模及给药
健康雄性C57BL/6J小鼠，预适应1周后，随机选取10只小鼠作为正常对照组，喂以普通饲料，其他小鼠喂以高脂饲料。4周后，禁食不禁水12小时，腹腔注射100mg/kg链脲佐菌素。待72小时后，剪尾采血测量血糖，当小鼠空腹血糖值>11.1mmol/L且出现多饮、多食、多尿现象视为糖尿病模型造模成功。随机选取40只造模成功的糖尿病模型小鼠随机分为模型组、SLFZP-60组(400mg/kg)、CLFZP-60组(400mg/kg)和二甲双胍组(150mg/kg，阳性药)，每组10只小鼠。给药按灌胃1天1次，干预6周。对照组和模型组小鼠给予等体积蒸馏水灌胃。
3、小鼠体质量测定
给药前测定小鼠随机体质量，给药后每天测定1次，记录小鼠体质量变化情况。
4、小鼠空腹血糖测定
灌胃期间第0、1、2、3、4、5、6周禁食12小时后剪尾静脉取血测量空腹血糖。
5、口服葡萄糖耐量测试(OGTT)
灌胃干预6周后，撤去小鼠饲料，更换垫料，禁食不禁水。12小时后，采取小鼠尾尖采血法检测血糖值，记为空腹血糖值G0(0min)。之后对小鼠以2.0g/kg的剂量灌胃25％葡萄糖溶液，从第一只小鼠灌胃结束开始计时，于每只小鼠灌胃后30min，60min，90min，120min检测其血糖值，记为G30、G60、G90和G120，通过计算曲线下面积表达评估OGTT变化情况：AUC0-120min＝1/2×[(G0+G30)×0.5+(G30+G60)×0.5+(G60+G90)×0.5+(G90+G120)×0.5]。
6、血清胰岛素水平测定
实验结束时，对各组小鼠进行眼眶取血，制备血清，根据ELISA试剂盒操作流程测定血清胰岛素(FINS)水平。并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，即HOMA-IR＝空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(μU/mL)/22.5。
7、小鼠血脂四项测定
实验结束时，采用美国贝克曼全自动生化仪AU5800检测小鼠血清样本的血脂四项指标，即总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL)。
8、小鼠附睾脂肪细胞形态测定
实验结束时，解剖各组小鼠，分离附睾脂肪，取部分附睾脂肪于4％多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片，用苏木精-伊红染色，光镜下观察。
9、数据处理
数据以平均值±标准差的形式表示，采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05认为两组实验数据差异具有统计学意义。
三、实验结果
1、生、炒莱菔子多糖对糖尿病小鼠体质量的影响
从图1可知，在实验期间正常对照组小鼠体质量逐渐增长，而糖尿病模型组小鼠体质量呈现显著的下降趋势，出现了糖尿病典型的消瘦现象。相比模型组，生莱菔子多糖组(SLFZP-60组)小鼠体质量下降趋势类似区别不大，而炒莱菔子多糖组(CLFZP-60组)和二甲双胍组小鼠体质量下降幅度出现不同程度的减少，到干预第6周时，CLFZP-60组、二甲双胍组小鼠体质量与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)。由此可见，生、炒莱菔子多糖对糖尿病小鼠体质量降低作用差异较大，炒莱菔子多糖可有效缓解糖尿病小鼠的体质量降低，而生莱菔子多糖在此方面作用不明显。
2、生、炒莱菔子多糖对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
由图2可知，正常对照组小鼠空腹血糖水平较低且总体比较稳定，糖尿病模型组小鼠的空腹血糖在造模成功后维持在较高水平。与模型组相比，生莱菔子多糖组(SLFZP-60组)小鼠空腹血糖略有降低但差异不大，而炒莱菔子多糖组(CLFZP-60组)和二甲双胍组小鼠的空腹血糖总体表现降低趋势，在干预第5周时已显著低于模型组(P<0.05)。由此表明，炒莱菔子多糖可以明显降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，而生莱菔子多糖降空腹血糖活性弱。
3、生、炒莱菔子多糖对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响
口服糖耐量即机体对葡萄糖的耐受情况，可判断胰岛β细胞对血液中血糖调节能力的强弱。OGTT曲线下面积(AUC)反映的是机体利用和清除葡萄糖的程度，当AUC增大则说明机体对葡萄糖的耐受能力下降，反之能力升高。如图3所示，正常对照组的血糖水平随着时间的延长变化平缓，糖尿病模型组小鼠血糖在前30min内迅速升高，在达到峰值后呈下降趋势，而血糖水平一直较高。相对模型组，生莱菔子多糖组(SLFZP-60组)小鼠血糖在30min到达顶峰后下降较为缓慢，而炒莱菔子多糖组(CLFZP-60组)和二甲双胍组小鼠血糖值在60min后出现急剧下降的趋势。根据AUC计算，糖尿病模型组显著高于正常对照组(P<0.01)，与糖尿病模型组相比，SLFZP-60组有降低但差异不大，CLFZP-60组和二甲双胍组呈现显著性降低(P<0.05)。因此，炒莱菔子多糖可以在一定程度上提高糖尿病小鼠的口服糖耐量且恢复情况较好，相对而言生莱菔子多糖对糖尿病小鼠口服糖耐量影响较低。
4、生、炒莱菔子多糖对糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响
胰岛素是胰岛β细胞分泌的、唯一能够降低血糖的激素，对调节血糖具有重要作用。图4展示了灌胃干预6周后各组小鼠FINS含量及HOMA-IR情况。糖尿病模型组小鼠相比正常对照组其FINS含量和HOMA-IR显著升高(P<0.05)，说明模型组小鼠存在胰岛素抵抗现象。相对于模型组，生莱菔子多糖组(SLFZP-60组)小鼠FINS含量和HOMA-IR虽有降低，但无明显差异，而炒莱菔子多糖组(CLFZP-60组)和二甲双胍组小鼠的FINS含量和HOMA-IR均显著低于模型组(P<0.05)。上述结果表明炒莱菔子多糖可有效减轻糖尿病小鼠的胰岛素抵抗，而生莱菔子多糖在糖尿病小鼠胰岛素抵抗改善方面作用较差。
5、生、炒莱菔子多糖对糖尿病小鼠血脂的影响
经灌胃干预6周后各组小鼠血脂四项的情况如图5所示。糖尿病模型组小鼠相对正常对照组其血清TC、TG、LDL和HDL水平显著升高(P<0.05)，表明糖尿病小鼠已出现血脂升高的异常状态。与模型组相比，生莱菔子多糖组(SLFZP-60组)小鼠的血清TC、TG和LDL水平稍低于模型组但不明显，HDL水平几乎无差异，而炒莱菔子多糖组(CLFZP-60组)和二甲双胍组小鼠血清TC、TG、LDL水平显著降低(P<0.05)，HDL水平略有降低。因此，炒莱菔子多糖具有明显的降血脂作用，而生莱菔子多糖降血脂活性低。
6、生、炒莱菔子多糖对糖尿病小鼠附睾脂肪的影响
实验结束时，对各组小鼠的附睾脂肪进行苏木精-伊红染色，光镜结果如图6所示。灌胃干预6周后，糖尿病模型组小鼠的附睾脂肪细胞明显大于正常对照组。与模型组相比，生莱菔子多糖组(SLFZP-60组)小鼠附睾脂肪细胞尺寸差异不大，炒莱菔子多糖组(CLFZP-60组)和二甲双胍组小鼠附睾脂肪细胞显著较小(P<0.05)。由此表明，炒莱菔子多糖可明显降低糖尿病小鼠附睾脂肪细胞尺寸，而生莱菔子多糖对此几无活性。
综上，本发明从炒莱菔子中制备得到一种60％醇沉组分，该多糖组分具有明显的降糖降脂作用。作为对比，生莱菔子中60％醇沉组分并未发现明显的降糖降脂作用。该研究结果从一定程度上说明了莱菔子炒制处理的必要性和重要性。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (6)
1.一种炒莱菔子中的多糖，其特征在于，通过如下方法制备：
取炒莱菔子粉末适量，加入适量石油醚，加热回流进行脱脂处理；回收石油醚，残渣挥发至无醚味，加入适量蒸馏水进行微波提取，提取液减压浓缩加入无水乙醇调至乙醇体积分数为90％，低温静置过夜，离心收集沉淀，水复溶后冷冻干燥，得到炒莱菔子粗多糖；
取炒莱菔子粗多糖适量，加适量水配制成多糖溶液，添加无水乙醇至溶液中乙醇体积分数达到40％，低温静置过夜，离心取上清液，继续添加无水乙醇至溶液中乙醇体积分数达到60％，低温静置过夜，离心收集沉淀，用水复溶后冷冻干燥即得。
2.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：离心条件均为4000r/分钟离心10分钟。
3.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：微波提取功率为280W，时间为25分钟。
4.根据权利要求1所述的多糖，其特征在于：脱脂和提取的料液比均为1kg:10L。
5.权利要求1～4任一所述的多糖在制备降糖和/或降脂药物中的应用。
6.权利要求1～4任一所述的多糖在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
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